（微生物学专业论文）ds9701d2菌株phb解聚酶的纯化及性质研究.pdf

摘要 聚b 一羟基丁酸酯( p h b ) 是许多细菌非平衡生长状态下积累的碳源、能源 储藏物，它作为一种新型的可生物降解材料，不仅具有与化学合成塑料相似的物 理机械特性，还具有完全的生物降解性以及较好的生物相容性，成为国内外生物 材料领域的研究热点。 环境中广泛分布有可降解胞外p h b 的微生物种类。对于细菌降解岫的 研究已经比较深入，而对于真菌降解p h b 的生物学性质及环境影响因素缺乏了 解。本项工作主要是从一株可高效降解p h b 的青霉的发酵液中分离纯化其p h b 解聚酶，对其进行酶学性质及蛋白质基本结构的研究，主要结果如下： 1 青霉( 尸p n i c 肌“ms p ) d s 9 7 0 1 d 2 菌株分泌p m 解聚酶的最高峰出现在 9 6 h 。发酵液经过超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、s e p h a c r y ls - 1 0 0h r 层析后，分离 纯化得到p 王b 解聚酶，纯化倍数为4 5 7 ，回收率为9 7 。利用s d s p a g e 电泳 鉴定酶蛋白的纯度。 2 p 髓解聚酶的酶学性质：酶促反应的最适温度和最适p h 分别为3 0 和 5 o 。酶在温度4 5 以下和p h5 o 一6 o 范围内稳定。金属离子n a 十、k + 对p h b 解聚酶的活性有明显的促进作用，而z n 2 + 、m 9 2 十、c u 2 + 、f e 2 + 对该酶有抑制作 用。通过双倒数作图法求得该酶的k m 值为o 6 9g l 。质谱仪测得p h b 解聚酶酶 促降解p h b 的产物主要是二聚体，而菌株发酵终产物主要是3 髓单体。 3 酶蛋白的相对分子质量为4 6 8k d a ，等电点为7 6 。其氨基酸组成为： 天冬氨酸( a s p ) 1 4 1 ；谷氨酸( g l u ) 9 1 ：丝氨酸( s e r ) 5 5 ；组氨酸( h i s ) 3 8 ；精氨酸( a 唱) 3 2 ；甘氨酸( g l y ) 7 5 ；苏氨酸( t 1 1 r ) 9 5 ：脯氨酸 ( p r 0 ) 5 9 丙氨酸( a 1 a ) 8 4 ；缬氨酸( v a l ) 7 2 ；甲硫氨酸( m e t ) 2 6 ； 异亮氨酸( e ) 4 9 ；亮氨酸( l e u ) 7 o ；苯丙氨酸( p h e ) 4 5 ；赖氨酸( l y s ) 4 1 ；酪氨酸( 1 n ) 5 1 。 4 应用c d 光谱检测蛋白质的二级结构，a 螺旋、b 转角和任意卷曲分别 占4 7 9 ，2 3 1 ，2 9 0 。 关键词：聚- b - 羟基丁酸酯( p h b ) ；生物降解；p h b 解聚酶 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东北师范大学或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 函盔睦日期：趔( 。五： 学位论文版权使用授权书 本学位沦文作者完全了解东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 东北师范大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和磁盘， 允许论文被查阅和借阅。本人授权东北师范大学可以将学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学 位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名 日期 燃 邀 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 指导教师签名：二! 塾塑畦 日期：圭掣鼻z 电话： 邮编： 引言 塑料作为人工合成的高分子材料，由于它具有良好的成型、成膜性、绝缘性、 耐酸碱、耐腐蚀性，低透气、透水性以及易于着色、外观鲜艳等特点，从2 0 世 纪5 0 年代开始，随着石油化工的发展而得到迅速发展，成为一类与生活息息相 关的材料，广泛用于家电产品、汽车、家具、包装用品、农用薄膜等许多方面。 它和钢材、木材、水泥并列为材料领域的四大支柱。到目前为止，世界塑料年产 量已达1 亿2 千万吨，我国每年产量也超过5 0 0 万吨。但其固有的不可降解性却 使大量的塑料废弃物对环境造成严重的污染，而且由于目前废弃塑料的回收利用 率很低，又造成资源的巨大浪费。据报道，每年倾八海洋的废塑料有数十万吨， 陆地上的更是难以计数，危害剧烈。传统的以末端治理为主的塑料垃圾处理方法 虽然能在一定程度上减轻塑料垃圾的污染，但代价昂贵，且易造成二次污染。生 存环境的压力迫使人们探索可降解塑料替换石化合成塑料的可能性。 1 、可降解塑料的种类 可降解塑料分为光降解塑料、生物崩坏性塑料和完全生物降解塑料。 光降解塑料是在塑料中引入光增敏基团或加入光敏性物质，使其在吸收太阳 紫外光后引起光化学反应，从而使塑料大分子链断裂成为小分子i _ j 。但是能降解 为小分子化合物进入生态循环的塑料只是极小部分，绝大部分塑料只是逐步崩解 变为碎片或者粉末，因而对生态环境带来更大的潜在危害。另外由于受紫外线强 度、地理环境、季节气候等因素的制约较大，降解速率很难捧制，使其应用受到 定限制。 生物崩坏性塑料是一种不能完全生物降解塑料，通常尾在通用塑料中混入一 定量的淀粉或脂肪族聚酯等具有生物降解性的物质【2 j 。此类塑料主要优点是可使 朋通用塑料的加工工艺和设备，从而降低生产成本。缺点是降解不完全，大部分 聚烯烃无法降解，只是崩裂成碎片残留在自然中难以回收处理。 完全生物降解塑料是一种具有优良的使用性能，废弃后可被环境微生物完全 分解，最终被无机化而成为自然界中碳素循环的一个组成部分的高分子材利，包 括：天然高分子材料( 如纤维素、木质素、淀粉等) ；化学台成高分子材料( 如 聚乳酸、聚己内醅、聚乙= 醇等) ：微生物发酵合成高分子材料( 如聚羟基烷酸 酯) 。其中，聚羟基烷酸酯( p h a ) 具有高溶点、高结晶度、及商分子量等性质， 而且耐慧外线，不易引起炎症，生物相容性好，完全不古重金属等有毒物质，是 极“洁净”的塑料，因此成为替代石化合成塑料的最有潜力的材料p j 。 极“洁净”的塑料，因此成为替代石化合成塑料的最有潜力的材料p j 。 2 、聚羟基烷酸酯( p h a ) 简介 2 1p h a 的结构 p h a 骨架结构为d 一( 一) 一羟基链烷酸单体( 图1 ) 。已有1 5 0 余种羟基烷酸( h a ) 被证实是微生物聚酯的组成成分h5 1 。 叶。一奠一锄2 ，m 量首 叶o c l l ( c h 2 ) m e i _ r r _ h ，c l c l l ；f 1 - 3 ；n = 1 0 0 一3 0 0 0 0 图1p h a 的结构通式 其中m = 1 ，2 或3 ，但是大多数情况下m = 1 ，即3 羟基烷酸( 3 h a ) 。n 为循环 链节数；r 则代表侧基，多为不同链长的正烷基，也可以是支链的，不饱和的或 带取代基的烷基。随r 基团、共聚单体、链的长短以及羟基的位置( 如3 ，4 ，5 一) 而异可形成不同的p h a ，如r 为甲基时聚合物是聚羟基丁酸( p h b ) ，r 为乙基 时聚合物是聚羟基戊酸( p h v ) 。根据单体的组成可将其分为3 类：第1 类为短链 脂肪酸共聚体，含c 3 c 5 单体，如p h b ( p o l y - 3 一h y d r o x y b u t y r a t e ，聚3 一羟基丁酸酯) ； 第2 类为中链脂肪酸共聚体，含c 6 c 1 4 单体，如p h o ( p o l y - 3 - h y d r o x y o c t a n o a t e ， 聚3 羟基辛酸酯) ；第3 类为两种或两种以上的单体之间形成的共聚物，如 p 船v ( p o l y - 3 - h y d r o x y b u t y r a t e - c 0 - 3 - h y d r o x y v a l e r a t e ，3 一羟基丁酸酯与3 一羟基戊酸 酯的共聚物) 。 2 2 p h a 的理化性质 纯净的p h a 通常为白色，它们的分子量随产生菌、培养条件以及提取方法 不同而异，但一般在5 0 ，0 0 0 l ，0 0 0 ，0 0 0d a 之间。倘若因培养条件与提取方法致使 p h a 的分子量低于2 0 ，0 0 0 ，其热塑性能便受到很大影响。p n 作为一类聚合物， 它们的物理学性质既有通性，也因单体的多样性和碳链的长短而有所差异。p h a 的熔点和玻璃化温度与通用塑料是较为接近的，但随着脂肪酸链的增长，其熔点 与玻璃化温度均随之降低。p h b 的结晶度较高，表现出较大的硬度与脆性；而 p h b v 由于掺入3 h v ，结晶度与聚丙烯相近，柔韧性也较好。p h a 的机械力学 性质，包括杨氏模数、抗拉强度、缺口冲击强度都与聚丙烯接近。此外p h a 具 有与通用石化塑料同样的光学活性与压电性。这些性能都表明p h a 具有塑料的 通性。 纯净的p h b 是一种高度等规立构硬而脆的晶体物质。p h b 分子结构的高度 立体规控性，决定了p h b 分子的特殊溶解性。p h b 不溶于水、甲醇、乙醇、丙 酮、醚、已烷、稀释无机酸等，部分溶于二氧六环、甲苯、辛醇、吡啶，而溶于 氯仿、二氯乙烷、二氯乙酸、三氟乙醇、二甲基甲酸胺、茨酮、三油酸甘油酯、 冰醋酸等。但由于p h b 的化学结构简单规整，因而性脆，应用范围受到限制。 2 3 p l m 的生理作用 p h a 是细菌胞内的一种碳源和能源的储备物，它对于细菌适应外界环境的 变化及维持生存具有重要的意义1 6 j 。有些细菌胞内的p h a 还可以减缓细胞内重 要成分一r n a 和蛋白质在饥饿条件下的降解，从而可以增加细菌对不利生存环 境的抵抗能力【7 1 。另外在某些芽胞杆菌属中，尽管孢子的形成并不必需p h b ，但 p h b 可以作为孢子形成时的能源和碳源从而增加这些菌的生存机会。此外，p h b 还可以为某些固氮菌属的包囊形成提供必要的碳源和能源。 近来发现p h b 也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存 在于原生质膜中【8 ：而在真核生物中，则在线粒体和微体膜中的比例为最多。相 比于胞内的高分子量的聚合物，存在于膜上的p h b 分子较小，只有1 0 0 一2 0 0 个 单体。对这种小分子p h b 的研究表明，它可能起着膜上的离子通道的作用【9 】。 最近，在人的血细胞中也发现较多的这种小分子p h b 【l 。这对于利用p h b 来包 裹药物进行定向定量释放以及p h b 在医疗方面的应用提供了理论上的依据【l ”。 2 4 p h a 颗粒体 在相差显微镜下可观察到p h a 在细胞内是以内含物( 即颗粒体，看上去似 亮小体，直径1 0 0 一5 0 0 n m ) 形式储存，可占细胞干重的高达9 0 【1 2 1 4 】。胞内p h a ( 即所谓的天然p h a 颞粒) 处于一种无定形状态，有很大的流动性，分布无规 律【3 】。天然p h a 颗粒具有一层由蛋白质和磷脂构成的表面层，该表面层对物理 或化学胁迫敏感。当p h a 颗粒被分离到细胞外时，这层表面层被破坏，p h a 趋 向有规律的排列，聚合体结晶并采用种有序的螺旋结构( 图2 ) 【1 5 ，1 6 1 。 3 、p h a 的合成 3 1 合成p h a 的主要微生物 最初是1 9 2 5 年由法国巴斯德研究所的l e m o i g n e 在巨大芽孢杆菌( 肋c j 眦 m f 朋耙，f 堋) 中发现呻】，并于1 9 2 7 年首次从细胞中分离出来。能产生p h a 的 微生物分布较广，包括光能和化能自养及异养菌，计9 0 多个属中的3 0 0 余种微 生物。目前研究较多的微生物有：产碱杆菌属( 4 f c 口f 咖 甜) 【1 8 】，假单胞菌属 ( 砌h o 脚邪) 【1 9 】，甲基营养菌( 拓砌如，唧矗班) 【2 0 ，2 ”，固氮菌属( 砌向施沈，) 和红螺菌属( 矗 d 如印护f f 删) 以及基因工程菌层c 。腻【2 4 也7 等。表l 列出了 图2p h a 的物理状态 a ：p h a 合成细菌细胞的电镜照片；b ：天然p h a 颗粒的切面示意图，其具有一层由蛋白 质和磷脂构成的表面层；c ：表面层被破坏的部分结晶化的p h a ；d ：由表面活性剂包被的 p h a 颗粒的切面示意图。 产生p h a 的部分细菌属名。 根据培养条件的区别，一般将p h a 合成菌分为两种类型：第一类是需要以 n ，p ，m g ，o 或s 等基本元素为营养限制因子方能大量合成p h a 的细菌【2 踟；第二类 细菌合成p h a 过程中不需要营养限制因子，而是在菌体生长过程中合成并积累 p h a 。罗氏真养产碱杆菌、甲基营养型单胞菌和其它许多细菌属于第一种类型， 而棕色固氮菌突变株和带有真养产碱杆菌p h a 合成操纵子的重组大肠杆菌属于 第二种类型1 2 只”j 。 3 2 p h a 的合成途径 微生物合成p h a ，可以说是微生物脂类物质代谢的一部分。多聚羟基烷酸 的代谢与其它脂质，如脂肪、磷脂等的代谢密切相关，但代谢步骤与途径在共同 基础上又有所不同，最主要的区别步骤是羟基化与多聚体合成。纵观各种p h a 产生菌合成多聚羟基烷酸的代谢，我们看到一些p h a 产生菌以碳水化合物作为 基质，一些以脂肪或脂肪酸作为基质，而另一些则以烷烃、醇类等作为碳源与能 源物质，其合成p h a 的代谢途径自然会有很大的区别。但是也有相同与相似的 规律，那就是都遵循脂类代谢的程序，先形成酰基化合物，均要进行羟基化，最 后聚合为大分子聚合物。其中研究得最透彻的是p h b 的合成。 表l产生p h a 的细菌属名 用于p h b 生物合成的碳源有糖类、有机酸、乙醇和二氧化碳等多种含碳化 合物，这些碳源在细胞内通过各种途径转化为乙酰c o a 。在微生物细胞内乙酰 c o a 积累过剩时将转变成p 耶。0 p p e o p l e s 等在对许多细菌的研究中发现，由 乙酰c o a 合成p h b 是通过三酶合成途径，三酶即b 一酮硫解酶、依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶和p h b 合成酶。当碳、氮丰富时，微生物正处于旺盛生 长期，乙酰c o a 优先进入t c a 循环，用于产生能量及合成氨基酸，结果游离出 大量辅酶a ，后者抑制b 一酮硫解酶活性，阻碍了p 聃的生物合成。而当氮被 限制时，蛋白质合成停止，细菌生长也停止，t c a 循环中产物过剩，乙酰c o a 量增加，游离的辅酶a 下降，b 一酮硫解酶活性显现出来，p 髓合成开始。 p h b 的合成途径【6 】主要有三步：由0 酮硫裂解酶催化乙酰c o a 生成乙 酰乙酰c o a ；乙酰乙酰c o a 在依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶的作用下 被还原成d ( ) 3 羟丁酰c o a ；由p 皿合酶催化单体d ( ) 3 羟丁酰c o a 聚合 形成p h b 。在真养产碱杆菌( ae “打印矗甜) 中乙酰乙酰c o a 在依赖n a d h 的乙 酰乙酰c o a 还原酶的催化下首先形成l ( + ) 一3 一羟丁酰c o a ，然后被两个烯酰水合 酶作用转化为d - 型异构体，最后聚合生成p h b 。 3 3 细菌发酵合成p h a 英国i c i 公司经过1 5 年的努力，率先于1 9 8 2 年采用真养产碱杆菌小批量生 产出了商品名为b i o p 0 1 的生物可降解塑料【3 ”。根据p h b 生物合成机制，用微生物 生产p 册般采用两阶段培养法，即先利用碳和氮，快速增殖菌体，然后在限氮 情况下合成聚酯。l a f f e r 用氢细菌和真养产碱菌在c 0 2 ，h 2 ，n h 4 _ ，p 0 43 。的无机盐 培养基中生长，细胞量随时间延长而增加，当n h 4 + 耗尽时，蛋白质合成停止，p h b 合成开始，4 0 小时后p h b 积累量达菌体干重的7 0 以上。 微生物生产的聚酯是可以完全被生物的酶分解利用的热塑性塑料。如果产 品价格能与合成塑料相当，那么作为生物分解性塑料将有很大发展。目前商用 p h a 成功生产的限制因素之一是其生产所需碳源的成本，据计算，生产一吨p h a 需三吨葡萄糖，用不经提纯的糖生产p i a ，可以降低成本，但如果用分离了的甜 菜糖蜜培养，聚酯生成量明显减少。甜菜糖蜜中含有8 1 8 4 ( w w ) 干物质( 其中 5 0 5 2 是蔗糖) ，l o 一2 7 含氮化合物，9 1 0 无氮化合物，1 1 一1 2 灰分。真养 产碱菌的突变株可以利用麦芽提取物、玉米浆及没提取糖的甜菜和甘蔗糖蜜生产 聚酯，可能是糖蜜中含有可促进p h a 生产的附加因子。所以可以用糖厂生产的废 糖液作为附加成分( 而非主要底物) 来提高p h a 产量。改革p h a 的提取工艺，也 是降低生产成本的新途径。 3 4 构建基因工程菌合成p i i a 目前引入真养产碱菌p h b 合成酶基因的重组大肠杆菌是最成功的基因工程 菌。由于基因工程茵具有生长迅速，培养基原料来源广，可利用廉价原料和废弃 物来大量产生p 衄，从而降低生产成本等突出优点，受到人们的关注。1 9 8 7 年， d e n n i s 成功地从4 p “f ，印向淞中克隆到合成p h b 的基因，并转入e ，中。他们还 发现一种重组ec o f f 突变株，细胞比正常细菌细胞大1 0 倍。虽然p h b 产量平均较 低，只有约7 0 左右，但e c o f f 突变株可以直接利用各种碳源，如葡萄糖、蔗糖、 乳糖、木糖等，选择廉价的底物，且易培养，进一步降低了成本。i c i 公司在1 9 8 9 年利用d e l l l l i s 组建的工程菌生产的p 皿占菌体干重的8 0 以上。为了降低提取成 本，许多国家相继投入了大量的人力和财力。比较有代表的是奥地利维也纳大学 在组建工程大肠杆菌的同时引入热敏噬菌体溶解基因，使细菌易裂解释放p h b ， 这一成果的最大特点是可降低提取成本，为推向市场打下基础。 在生枝动胶菌和真养产碱杆菌中，b 一酮硫解酶基因( p h b a ) 和依赖n a d p h 的乙酰乙酰c o a 还原酶基因( p h b b ) 紧密相连。用真养产碱杆菌h 1 6 负向突变株互 补方法确定，p h b c 基因编码p h b 合成途径中的第三个酶p h b 合成酶，三个基因 的顺序p h b c p h b a _ p h b b ，它们有一个共同启动子位于上游。 3 5 利用转基因植物生产p h a 1 9 9 2 年美国科学家首次进行了植物生产p h b 的尝试：将c 心3 5 s 启动子 控制的直p “帅 淞p h b 合成途径中的p h b b 、p h b c 导入拟南芥菜中，并利用植 物本身的酮硫裂解酶合成了一定量的p h b ，颗粒大小、形状与细菌中相似【3 ”， 虽然p h b 合成量很少，转基因植株生长却严重受阻，p l b 颗粒在胞质、液泡甚 至核内出现，但在质体内不存在。s o m e r v i l l e s 小组于1 9 9 4 年改进了策略，将p h b 定位于质体【3 3 3 4 】，质体中富含乙酰c o a ，而且质体内可容纳大量淀粉，暗示着 同样可以贮存大量的p h b 。他们分别在p h b b 、p h b a 、p h b c 基因上连入一段编 码豌豆叶绿体r u b i s c o 小亚基转移肽的d n a 片断，将表达产物定位于质体，通 过杂交手段将三个基因在同一株拟南芥菜中表达，结果p h b 累计量高达干重的 1 4 ，而且转基因植株发育正常。 4 、p h a 的降解 p | l a 生物降解分为胞内p h a 降解和胞外p h a 降解。胞内降解是合成细菌自身 内源贮存物的活性降解( 转移) ，促胞内p h a 降解的酶是胞内p a 解聚酶。相反 的，胞外降解是非必需合成微生物分泌胞外p h a 解聚酶来利用外源性聚合体。胞 外聚合体的来源是合成细胞死亡及溶解后释放的p h a 。 4 1p 卧的胞内降解 4 1 1 胞内p h a 颗粒的结构和特征 胞内p h a 颗粒是非晶态的且表面有一层由蛋白和磷脂构成的表面层【3 5 ，36 1 ， 该表面层可通过加入化学物质如溶剂、清洁剂、碱而被破坏或去掉聊 ，物理胁 迫如反复冻融或反复离心同样可导致胞内p h a 颗粒变性f 38 1 。小心破碎细胞( 弗 氏压碎器或酯解) 之后通过密度梯度离心纯化颗粒可避免p h a 的变性。 颗粒表面层的蛋白的主要片段由相对小的两亲性聚肽构成，该聚肽据推测 位于非水溶性聚合体核心与亲水性胞质之间，具有稳定结构的功能，该结构蛋白 被称作p h a i n s ，与p h a 颗粒有高亲和性 3 9 】，p h a i n s 也参与p h a 合成和降解的调 节m 】。表面层还含有一些与聚合体合成( p h b 合酶) 及聚合体降解( 胞内p 耶 解聚酶) 有关的蛋白。 4 1 2 胞内p h a 解聚酶的分析系统 胞内p h a 解聚酶对自然的非晶态形式的聚合物具有专一性，而胞外p h a 不 是这些酶的底物。因此，任何非晶态形式的p h a 都适合胞内p h a 解聚酶的分析。 获得非晶态p h a 的最好办法是纯化自然状态的p h a 颗粒。生枝动胶菌、食油假 单胞菌、真养产碱菌的胞内p h a 颗粒含有一种重要的内源性p h a 解聚酶可吸附 颗粒体表面。因此，如果在合适条件下培养胞内p h a 颗粒具有缓慢但重要的自 溶速率1 4 ”。但胞内p h a 颗粒可从重组有p h a 生物合成基因的大肠杆菌菌株中 分离。因为大肠杆菌没有任何p h a 解聚酶基因，所以重组大肠杆菌的胞内p h a 颗粒没有任何内源性自溶活性1 4 2 】。 另一种准备非晶态p h a 的方法是通过将可溶于氯仿的聚合体与水在清洁剂 ( s d s 、胆酸酯、油酸酯) 存在下乳化后蒸发去溶剂制成p h a 乳液【4 3 】。得到的 p h a 乳液( 人工p h a ) 可保持非晶态很长时间且是一种许多胞内p h a 解聚酶和 部分胞外p 姒解聚酶的合适底物。但是，值得注意这种p h a 乳液具有不含d h a s i n 蛋白的人工表面层。而这些活性蛋白对聚合体的可进入性及降解性有影响，因此 人工颗粒的解聚酶活性无法与天然p h a 颗粒相比。获得胞内p h a 解聚酶底物的 还可以通过在表面活性剂( 如油酸酯) 存在下通过脂酶或蛋白酶分离p h a 颗粒 h 4 】。需强调的是由人工颗粒决定的胞内p h a 解聚酶活性的生理关联还不确定。 胞内p h a 解聚酶活性可由以下方法测定：( 1 ) 比浊法，即在缓冲液中光密 度值的减少：( 2 ) 滴定法，即p h 值下降的无缓冲液水环境中为保持恒定的p h 值所加入的n a 0 h 量。比浊法实行起来快速、简易且能在微量滴定读出器中自 动测量，但它对实验错误如颗粒体的人工结合、光密度值的改变、由于颗粒体直 径在反应中的变化引起的表面区域变化等敏感，不能直接将光密度值减少程度与 被水解的酯键数目联系起来。滴定法比较复杂、费时且需要在蒸馏水中施行( 由 于酶稳定性的问题) ，但它可提供被水解酯键数目的定量数据。由3 h b 脱氢酶或 高压液相层析获得产物如3 h b 或3 h b 寡聚体的方法可行，但大量寡聚体难溶于 水且不能定量测定。3 h a 寡聚体通常对热、酸、碱敏感，因此反应混合物不能 被这些物质中止除非实行了合适的控制寡聚体稳定性的方法。 4 1 3 胞内p h a 解聚酶的生化及分子生物学性质 第一项对胞内p h b 降解的生化研究由m e r r i c k 和d o u d o r o 任完成 3 8 l ，由巨大 芽孢杆菌分离的胞内p h b 颗粒被用作解聚酶实验的底物。深红红螺菌胞内p h b 解聚酶己被纯化【4 5 j 。它由一条3 5 k d a 的多肽构成，其最适p h 值为9 ，最适温度 为5 0 。纯化酶对胞外p h b 无活性且对对硝基酰酯无脂酶、蛋白酶、酯酶活性。 深红红螺菌的胞内p h b 解聚酶的克隆基因的序列分析表明该酶与其胞外解聚酶 具有高同源性。 从真养产碱菌分离的胞内p h b 颗粒自溶速率相比深红红螺菌粗提物的水解 速率低两个数量级，胞内p h b 解聚酶活性的最适p h 值为7 。目前真养产碱菌的 胞内p h b 解聚酶的d n a 序列已报导【4 6 j 。d n a 推导的氨基酸序列( 4 7 1 3 k d a ) 不含 脂酶序列且与深红红螺菌的胞内p h b 解聚酶无相似性。胞内p h b 解聚酶基因敲 除变异体自溶活性降低。结论是该基因部分负责于p h b 转移而真养产碱菌中存 在其他目前还未知的解聚酶同功酶【4 2 】。 目前，已发现脱氮副球菌胞内p h b 解聚酶基因与p h b 合成酶基因p i l a c 相 邻但相反方位【4 ”。杂合基因表达产物可水解人工蛋白酶及油酸酯处理的p h b 颗 粒。d n a 推导的氨基酸序列与深红红螺菌的胞内p h b 解聚酶无相似性但与真养 产碱菌的胞内p h b 解聚酶具有高度相似性。 食油假单胞菌的胞内p h 0 颗粒的自溶已被描述1 4 8 。其最适p h 为8 。被丝氨 酸酯酶抑制剂抑制表明胞内p h a 解聚酶的活性中心与胞外p h a 解聚酶及其他丝 氨酸酯酶有关。p h a 解聚酶基因p h a z 定位于两p h a 合成酶基因( p h a c 】及p h a c 2 ) 之间。因此，很可能两合成酶基因间的开放阅读框代表胞内p h o 解聚酶基因。 推导的氨基酸序列含潜在的脂酶序列( g v s w g ) 但与任何胞内短链p h a 解聚酶无 同源性。 4 2p 卧的胞外降解 p h a 胞外降解有两种机制，一种是在无菌条件下通过水解进行。这种机制 对于p h a 在医疗方面的应用( 如作为药物的缓适载体、手术缝线等) 特别重要。 在自然环境中，是另一种机制一酶降解机制。影响胞外p h b 降解的因素较多，包 括环境类型、温度、微生物种群及活力、塑料制品的状态等。通常情况下，p h b 厌氧降解比有氧降解快【4 9 1 。y d o i 等【5 0 】认为在一定范围内p h b 的降解速度与温 度正相关，其降解分为两个阶段：第一阶段，分子量下降；第二阶段，在分子量 下降至1 3 0 0 0 后开始腐蚀。高海军等【5 l 】认为p h b 膜越薄，降解率越高。本实验 室的研究表明p h b 的降解首先发生在p h b 表面的非晶部分，当密度低、松散的 非晶部分降解后，p h b 结晶表面形成很多的自由端基，从而导致p h b 的结晶表 面形成非晶过渡层，p h b 结晶逐渐被破坏直至完全降解。因而p h b 膜的结晶温 度高时结晶规整性好，相应的降解速率低f 5 2 】。 4 2 1 胞外p h a 降解菌株 4 2 1 1 脆外p h a 降解菌株的分离 利用胞外p h a 作为唯一碳源及能源的微生物能在含作为唯一碳源及能源的 聚酯及一些环境( 如土壤、污泥) 中物质的无机盐溶液中富集。这种方法一般能 在一定实验条件下富集倍增时间短的微生物种类，但这些种类不一定是自然界最 高效降解p h a 的。一种更适合评估p h a 降解菌株分布的方法是将从生态系统中 提取的物质稀释后涂平板于固体琼脂培养基，该培养基表面铺有一层作为唯一碳 源及能源的由胞外p h a 制成的不透明表层。胞外p h a 降解菌株分泌胞外p h a 解聚酶，该酶水解胞外聚合体为水溶性产物，其特征是水解后在菌落周围出现明 显的透明圈。这种方法可在需氧、厌氧或摇瓶条件下进行以选择需氧型、厌氧型 或微需氧型微生物。 遗憾的是仅有部分短链p h a ( p h a s c l ) 如p h b 能制成变性颗粒的乳浊液。许 多其他的p h a 如中等链p h a ( 王，h a m c l ) 形成似胶状聚集体而不能直接运用透 明圈法。含有染料的p h a m c l 的无机盐琼脂平板已成功运用于p h a m 吼降解细菌 的分离口”。一项重大进展是通过p h a 乳浊液发展达到的m 】，该乳浊液呈乳状 且能运用于更灵敏的透明圈法。能表达聚b 一羟基辛酸酯( p h o ) 解聚酶活力的 细菌在含p h o 乳浊液的琼脂平板上生长。透明圈直径的大小及不透明程度的区 别是由于p h o 解聚酶基因的突变及表示方法的灵敏性。h o r o w i t z 与c o w o r l 【e r s 研究了其他制备乳浊液的方法【5 “，方法如下：将p h a 溶于氯仿，加入表面活性 剂，与水经过超声处理达到乳化，再经过透析或蒸发去掉溶剂就可得到混浊、稳 定的被表面活性剂包被的p h a 颗粒悬浮液，即人工p h a 颗粒。 4 2 1 2 胞外p h a 降解菌株的特征 各种生态环境如土壤、污泥、堆肥、海水等广泛分布有可降解胞外p h a 的 微生物。最早关于p h b 降解的研究是s c l l l e g e l 学院的c h o w ( 1 h u r y 于1 9 6 3 年进 行的【5 7 】，他分离到一株高效降解p h a 的假单胞菌，遗憾的是该菌株未能得到妥 善的保存。之后研究者从环境中筛选到很多株能降解p h a 的细菌1 5 8 删并进行了 深入的研究，概要见表2 。p h a 降解菌株可根据其降解聚酯的种类不同而区分。 大多数描述过的细菌只能专一性降解p h a s c l 或p h a m c l 【6 2 j 。但是有些细菌显现 出降解聚酯的广泛性，其可利用广泛的聚酯，包括p h a s c l 及p h a m c l 。此类细 菌可合成不止一种p 认解聚酶，该解聚酶也可根据底物是p h a s c l 或p h a m c l 而区别。 相比之下，对于能降解p h b 的真菌的研究比较缺乏，而事实上土壤中真菌 的生物量超过细菌并且降解速度快于细菌，它们很可能在降解p h b 的过程中担 任重要角色，就如它们在土壤系统中对于有机物分解占据主导地位一样。因此， 对于p h b 降解真菌的研究正日益得到重视。目前分离到的9 5 种p h b 降解真菌 主要是无鞭毛类( a m a s t i g o m y c o t a ) 扣。，其所占比例高达9 7 ，其中，担子菌 ( b a s i d i o m ”o t a ) 、半知菌( d e u t e r o m y c o t a ) 、子囊菌( a s c o m y c o t i n a ) 、接合菌 ( z y 9 0 m y c o t a ) 分别占4 8 ，2 7 ，1 9 ，2 ，这说明高等真菌是环境中p h b 降解菌株的主要组成部分。但是到目前为止，还未能分离到能降解p h a m c l 的真 菌。本实验室从污泥中分离到1 6 株p 耶降解真菌，经鉴定其中1 4 株为青霉，1 株为曲霉，一株为毛霉【b ”。 1 0 表2细菌p h a 解聚酶的生化及分子生物学特征 4 2 2 胞外p h a 解聚酶的生化特征 微生物分泌胞外p 皿解聚酶来利用外源性聚合体，酶对r 构型的3 h b 聚 酯具有专一性【66 1 ，酶以内式作用于羟基端的第二、三个酯键网，酶促降解的终 产物为仅含单体或单体、二聚体的混合物或寡聚体的混合物。 许多细菌的p h b 解聚酶已被纯化和鉴定( 细节见表1 ) 。研究最深入的p h a 降解细菌是勒氏假单胞菌。它属于b 亚基型蛋白细菌。它在p h a 降解细菌中是 独特的，因为它能合成至少7 种胞外p h a 解聚酶( p h a z l 至p h a z 7 ) ，其中6 种 可降解胞外p h a ，另外一种胞外p h a 解聚酶对非晶态p h a 具有专一性，在p h a 水解作用中两种或两种以上的p h a 解聚酶之间互相合作，它们针对不同链长的 分子有不同的底物专一性和k 。值。降解菌株中一种聚合物水解酶具有几种同功 酶，此性质在降解聚合物如纤维索、几丁质中也具有。 而自从1 9 9 1 年b r u c a t o 从绳状青霉( a n f c f 胁“聊 雕缸“m a t c c 9 6 4 4 ) 中 纯化到第一个真菌p h b 解聚酶以来删，只有9 种真菌p h b 解聚酶f 6 8 郴】被纯化( 细 节见表3 ) 。 表3 真菌p h b 解聚酶的生化特征 多数p h b 解聚酶具有以下共同特征：( 1 ) 相对分子质量较小( 小于7 0 k d a ， 大多数的p h a 解聚酶的相对分子质量为3 0 5 0 ) a ) ，并且大部分的解聚酶仅由 一条多肽链构成；( 2 ) 稳定性在不同的条件下f 如：p h 、温度、离子强度等) 都比 较高；( 3 ) 属于丝氨酸水解酶家族，会被丝氨酸水解抑制物如二异丙基氟磷酸 ( d f p ) 或磺酰基衍生物所抑制；( 4 ) 对二硫苏糖醇( d t t ) 敏感，表明活性部 位有二硫键的存在，它在酶形成三级结构中起重要作用；( 5 ) 就目前所知多数酶 不与阴离子交换剂结合但与疏水性物质有很强的亲和力，因此许多纯化方案都包 括疏水性层析步骤。 勒氏假单胞菌和真菌的p h b 解聚酶糖基化，含有n 一乙酰葡萄糖胺和葡萄 糖。虽然糖基化作用并不对酶的活性起主要作用，但它能提高胞外酶对高温和其 他微生物蛋白酶水解作用的抵抗能力 7 ”。在没有水的条件下( 如在有机溶剂 中) p h a 解聚酶能催化相反的化学反应( 如酯的合成作用) ”“。 4 2 3 胞外p h a s c l 解聚酶的分子生物学及功能分析 到目前为止已有1 9 种细菌胞外p h b 解聚酶的基因( p h a z ) 被克隆和分析 ( 表1 ) 。所有酶由以下结构域组成： 一条由2 2 至5 8 个氨基酸构成的信号肽。该信号肽对于分泌多肽穿过细胞质膜 是必须的，并在分泌过程中被其肽酶清除。 催化结构域( c d ) ，位于蛋白质的氮末端，由三种十分保守的氨基酸即丝氨酸、 天冬氨酸、组氨酸组成c d 的活性中心。丝氨酸是脂酶五肽序列 g l y x 舱l - s e r _ x a a 2 g l y 的组成成分。根据三种氨基酸的排列顺序可将c d 分为 两种：硪s s e r - a s p h i s ( c d l ) ；s e r - a s p - h i s h i s ( c d 2 ) 。氨基酸定位诱变实验 表明该催化三联体对酶活性是必须的1 7 。 连接子，连接c d 与碳末端的底物结合结构域( s b d ) 。己在p h b 解聚酶中发 现三种连接子：苏氨酸富集区域( 1 h ) ；纤连蛋白m 型指纹结构( f n 3 ) ； 似钙粘着蛋白序列( c a d ) 【7 9 】。连接子的缺失导致酶失活，但连接子的互换不 影响酶活 8 0 】，这些发现支持一种假说，即连接子对于在c d 与s b d 之间提供 一定距离是必须的，但连接子本身的性质并非十分重要。 底物结合结构域( s b d ) ，s b d 由4 0 至6 0 个氨基酸组成，主导结合p h b | ：8 i 】。 s b d 分为两种类型，但h i s 4 9 、蛔4 、c y s 2 对两种s b d 都是保守的。 4 2 4 胞外p h a m c l 解聚酶的分子生物学及功能分析 相对于大量已鉴定的p h a s c l 解聚酶来讲，到目前为止只有少量p h a m c l 解聚酶被描述。荧光假单胞菌g k l 3 的p h o 解聚酶是唯一被纯化和进行分子水 平研究的【6 2 1 。荧光假单胞菌的p h 0 解聚酶与p h a s c l 解聚酶有明显区别：它对 p h a m c l 及可溶性酯如对硝基苯酯具有专一性，而不能水解p h b 或其他p h a s c l 。 该酶不被d d t 或e d t a 抑制且不依靠c a 2 + 或其他二价阳离子。目前，从似黄单 胞菌中分离出的一种p h a l 解聚酶可水解一种由3 羟基5 苯氧戊酸盐及2 8 的3 羟基7 苯氧庚酸盐构成的共聚酯【8 2 】，该酶不能水解p h 氏c l ，对p h o 的水 解活性也没检测到。另一种具胞外p h a m c l 水解活性的细菌是c o m 锄o n a s s p p 3 7 c 1 8 ”，它显示出高p h o 解聚酶活性及低p 珊解聚酶活性。细菌是合成两 种针对不同底物p h a s c l 和p h a m c l 的解聚酶还是一种对两种底物都适用的解聚 酶还未知。 由荧光假单胞菌g k l 3 的克隆p h o 解聚酶基因推导的氨基酸序列与p h a s c i ， 解聚酶除了脂酶序列( g l y x a a i - s e r l 7 2 一x a a 2 - g l y ) 旁的狭小区域、a s p 2 2 8 及h i s 2 6 0 残基之外无同源性。从这些氨基酸的定位诱变可证实它们对酶活很重要而且它们 可能构成催化三联体( 丝氨酸水解酶) 。有趣的是，催化三联体氨基酸( s e 1 7 2 、 a s p 2 2 8 、h i s 2 6 0 ) 定位于蛋白的碳末端，这与已知的所有p h a s c l 解聚酶不同。据 假定，蛋白的氮末端构成聚合体结合部位。p h o 解聚酶基因的p c r 诱变及对p h o 解聚酶活性受损但仍具有对硝基辛酸盐水解活性正常水平的变异株的选择支持 此假说。3 0 株变异株的d n a 测序揭示多数变异位于成熟蛋白的氮末端( 氨基酸 1 6 5 ) 峭。特别的是l e u l 5 、p h e 5 0 、p h e 6 3 附近的氨基酸是热点，因为在任意分离 的1 6 株变异株中这些或附近的氨基酸变异。因为这些变异株的p h o 解聚酶的酯 酶活性无太大改变，所以假定这些氨基酸与酶结合底物有关。 下( 如浓度、p h 等) 的降解情况，对于降解机制进行初步探讨。关于p h b 降解 菌的分离及鉴定方面的报道甚少，特别是能降解p h b 的真菌方面的研究在国外也 很少。而突变的高产菌株对生产应用具有一定的价值和意义。 本论文采用诱变后高效降解p i b 的菌株作为材料，分离纯化其p h b 解聚酶， 并深入研究其各种酶学性质，旨在为p h b 产品的应用和开发高效降解p h b 的微 生物制剂奠定理论基础。 一、实验材料与方法 1 1 实验材料 1 1 1 菌株来源 青霉( p p 耙f f f f h 埘s p ) ，编号为d s 9 7 0 1 ，d 2 ，为东北师范大学微生物研究室 保藏菌株。 1 1 2 聚b 羟基丁酸酯( p 耶) 由中国科学院微生物研究所提供，是由微生物发酵合成的白色粉末，熔点 1 7 3 8 ，相对分子质量7 3 1 1 0 6 。 1 2 培养基( w v ) p h b 0 1 5 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 5 ，n h 4 c l0 1 ，c a c l 2 2 h 2 0o 0 0 0 5 ， k h 2 p 0 4o 5 5 4 ，n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 01 1 9 4 ， p h6 8 。 1 3 酶活的测定( 比浊法) 1 3 1p h b 悬浮液的制备 8 7 】 将p h b 粉末溶于氯仿，所得溶液与十二烷基磺酸钠溶液混合，混合液经超 声处理5 m i n ，制得p h b 乳化液，7 5 加热9 0 m i n 除去氯仿，得到p h b 悬浮液。 1 3 2 酶活测定及酶活单位定义【8 8 。9 0 1 以p h b 为底物，用分光光度法测定p h b 解聚酶活力。取3 r n lp h b 悬浮液 置于3 0 恒温水浴，待温度平衡后加入一定量的酶液，反应2 0 m i n 后，于6 5 0 m 波长下测其光吸收( 降低) 。以蒸馏水代替酶液做空白对照。 一个酶活单位定义为：每分钟引起光吸收降低o 0 0 1 ( a 6 5 0 。) 单位所需的酶 量。 1 4 蛋白质的测定方法 按f o l i n _ 酚( l o 、r y ) 方法测定，以酪蛋白为标准蛋白。 1 5 菌株产酶高峰期的测定 将活化后的菌株接种到以p h b 粉末为唯一碳源的液体培养基中，置2 8 恒 温摇床振荡培养，摇床转数l o or m i n 。每天分别取一定量的发酵液于4 。c 、 1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n 除去菌丝体，取上清液进行酶活和蛋白含量的测定。 1 6 酶的分离纯化( 所有操作均在4 下进行) 【s s ，9 2 1 1 6 1 粗酶液的制备 经9 6 h 发酵后的5 0 0 0 m l 发酵液于4 、1 2 0 0 0 。g 离心3 0 m i n ，弃去沉淀，上 清液经双层滤纸过滤后即为粗酶液。 1 6 2 超滤浓缩 根据分子量大小，使用超滤膜( 截留分予1 0 0 0 0 ) 超滤浓缩。 1 6 3 硫酸铵分级沉淀 在搅拌条件下，缓慢向浓缩粗酶液中加入洲h 4 ) 2 s 0 4 粉末至3 5 4 0 饱 和度，静止过夜，4 、1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n ，弃去沉淀，去除部分杂蛋白沉淀。 在去杂后的上清液中继续添加( n h 4 ) 2 s 0 4 粉末至7 0 饱和度，静止过夜，4 、 1 2 0 0 0 g 离心3 0 m i n ，收集沉淀，即为盐析粗酶。 1 6 4 透析脱盐 用l om mh a c - n a a c ( p h = 5 0 ) 缓冲液 含1 5m ( n h 4 ) 2 s 0 4 1 溶解盐析获得的 粗酶，装入透析袋中，对蒸馏水透析，用b a c l 2 检查s 0