（果树学专业论文）番木瓜果胶裂解酶基因的克隆.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是在指导教师的指导下通过 我的努力取得的成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和 致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成 果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示 了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 林受 日期：& 咖6 占缈 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。留 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名 指导教师亲笔签名： 污趁穑 日期：0 膨多莎1 0 日期：a 。，占占f o 福建农林大学硕士学位论文 摘要 番木瓜是番木瓜科( c a f i c a c e a e ) 番木瓜属( c a r i c al ，) 植物，是热带、亚 热带重要果树之一。鉴于番木瓜果实耐贮性差，成熟后在短时间内便迅速软化， 甚至腐烂，因此提高番木瓜果实耐贮性一直是学者们的研究热点。迄今为止，在 这一方面的研究以a c c 氧化酶( a c o ) 、a c c 合成酶( a c s ) 为主要对象，但 对于与果实细胞壁降解密切相关的一些酶还未作深入的研究。本文以番木瓜果肉 为材料，通过同源克隆分离出具有抗软化等功能的果胶裂解酶( p l ) 基因，以 构建植物表达载体，为培育耐贮番木瓜新品种奠定基础。主要结果和结论如下： 1 建立了番木瓜总r n a 提取和纯化的方法 改良的t r i z o l 法采取在提取裂解液中加入1 0 的无水乙醇、用氯仿抽提2 次、改用l i c i 来沉淀r n a ，经过多次实验并与其他三种方法对比证明，该方法 能够有效地去除果肉中的有机酸、酚类物质、蛋白质和多糖等杂质，获得纯净、 完整的r n a 样品，可以直接用于后续的r t - p c r 和r a c e 反应。 2 采用r t - p c r 克隆了番木瓜果肉p l 基因e d n a 片段 以番木瓜c d n a 为模板，设计特异引物，经p c r 扩增得到5 9 6b p 的序列， 所得核苷酸序列通过b l a s t 分析，发现与草莓、拟南芥、芒果、葡萄等果胶裂解 酶基因的相似性都较高，均在7 9 一8 2 之间。该核苷酸序列编码长1 7 7 a a 的 蛋白质。 3 采用染色体步移技术克隆了番木瓜p ld n a 片段 以番木瓜d n a 为模板，采用染色体步移技术，得到了1 1 3 8b p 的p l 基因的 核苷酸序列。经b l a s t 分析，发现与芒果、草莓等的同源性较高，在7 8 以上。 所得到的核苷酸序列的o r f 包含7 2 1 个核苷酸，将其翻译成蛋白质，得到全长 为2 4 0a a 的氨基酸序列。将氨基酸序列的分析结果绘成进化树，从进化树可以 看出，番木瓜果肉的p l 与芒果、草莓的p l 聚成类，而与芭蕉、葡萄、辣椒 的p l 则属于不同基因家族。 关键词：番木瓜：果胶裂解酶：基因克隆；核苷酸序列：蛋白质序列 福建农林夫学硕- ：学位论立 a b s t r a c t p a p a y a ，c a r i c ap a p a y a ，i sam e m b e ro f t h ef a m i l yc a r i c a c e a e a n do n eo ft h em o s t i m p o r t a n tt r o p i c a la n ds u b t r o p i c a lf r u i tt r e e s b e c a u s et h ep a p a y ai sv e r y e a s y t o s o f t e no re v e nr o t t e ni nas h o np e r i o do ft i m ea f t e rm a t u r e m a n ys c i e n t i s t sh a v eb e e n f o c u s i n go nt h es t u d yo nh o wt oi m p r o v et h ep r e s e r v e dq u a l i t yo ft h ep a p a y a t od a t e ， h o w e v e r , m o s to ft h er e s e a r c h e sw e r eo n l yc o n c e n t r a t e do nt h ea c co x i d a s e ( a c o ) a n da c cs y n t h e s i s ( a c s ) ，a n dn oc o m p l e t ew o r kh a sb e e nd o n ei nr e l a t i o nt ot h e e n z y m e sw h i c hc a np l a yi m p o r t a n tr o l e si nc e l lw a l ld e g r a d a t i o na n df r u i ts o f t e n i n g t h ep e c t a t el y a s e ( p l ) g e n e ，t h a tc a nr e s i s ts o f t e n i n g ，w a sc l o n e df r o mt h ep u l po f p a p a y a , a n di t se x p r e s s i o nv e c t o r so fp l a n tr e c o m b i n a n tc a nb ec o n s t r u c t e df o r b r e e d i n gn e wv a r i e t i e sw h i c hm i g h th a v ef a v o r a b l ep r e s e r v i n gq u a l i t y + t h em a j o r r e s u l t sa r es u m m a r i z e da sf 0 1 1 0 w ： 1 d e v e l o p m e n to fan o v e lm e t h o df o r e x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no ft o t a lr n a a ni m p r o v e dt r i z o lm e t h o dw a su s e df o rr n a e x t r a c t i o n ，b ya d d i n g10 ( v ，v ) a b s o l u t ee t h a n o li nt h ee x t r a c t i o nb u f f e r , e x t r a c t i n gt w i c ew i t hc h l o r o f o r m ，a n d p r e c i p i t a t i n gr n au s i n gl i c i a f t e rc o m p a r i e dt h em e t h o d so ft r i z o lw i t hc t a b a n ds d s ，an o v e lm e t h o df o r r e m o v i n gt h ei m p u r i t i e ss u c h a s p o l y p h e n o l i c s ， p o l y s a e c h a r i d e sa n do r g a n i ca c i d sf r o mp a p a y ap u l p sw a sd e v e l o p e d a n dt h ep u r e a n di n t a c tr n aw a so b t a j n e d 2 c l o n i n go ft h ec o n s e n g u $ r e g i o no fp lg e n eb yr t - p c i l t h e5 9 6b pc o n s e n s u ss e q u e n c e so fp lg e n ew h i c he n c o d e sa p r o t e i no f17 7a m i n o a c i dw a sc l o n e df r o me d n a r e v e r s e - t r a n s c r i p t e df r o mr n a b l a s ts h o w e dt h a tt h e n u c l e o t i d es e q u e n c eh a sh i g hi d e n t i t i e s 州t ht h a to fp lg e n eo fe a n a n a s s ad u c h a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，m a n g i f e r ai n d i c ala n dh t i sv i n i f e r al t h ei d e n t i t i e sw e r e 7 9 - 8 2 3 c l o n i n go ft h es e q u e n c eo f5 t e r m i n a li nt h ep lg e n eb yc h r o m o s o m ew a l k i n g t h e1 1 3 8b pp lg e n ef r a g m e n t ，w i t ha7 2 1b po r f e n c o d i n g2 4 0a m i n oa c i d ，w a s o b t a i n e db yc h r o m o s o m ew a l k i n g b l a s ts h o w e dt h a ti th a sh i g hi d e n t i t i e sw i t ht h a to f 2 福建农林大学硕士学位论文 p lo fe a n a n a s s ad u c h a n dm a n g i f e r ai n d i c al t h e i d e n t i t i e sw e r ea l la b o v e7 8 t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a sd r a w na c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fa l i g n m e n t sf o rt h e s e q u e n c e so ft h ea m i n oa c i d so fp l si np l a n t sw i t hd n a m a ns o f l u 。a r e t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ep l so f c a r i c ap a p a y al ，m a n g i f e r ai n d i c al a n df a n a n a s s ad u c h w e r ec l u s t e r e di n t oo n eg r o u p ，a n dm u s ac o c c i n e aa n d r v i t i sv i n 碾r “l a n d c a p s i c u m f r u t e s c e n sl w e r ea n o t h e rg r o u p k e y w o r d s ：p a p a y a ( c a r i c ap a p a y al ) ；p e c t a t el y a s e ( p l ) ；g e n ec l o n i n g ；n u c l e o t i d e s e q u e n c e ；p r o t e i ns e q u e n c e 塑堡垒竺查兰堡! ：兰生堡兰 一 缩写词表 缩写词中文名称 英文全称 a a氨基酸 a m i n oa c i d a m p 氨苄青霉素a m p i c i l l i n b d碱基对 b a s ep a i r s c d n a c 1 a b d e p c d n t p e b e d t a h i p t g l b l a - p c r m r n a o d o i t f p c r p v p p 互补d n a 十六烷基三甲基溴化铵 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷酸 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 小时 异丙基硫代一b - 1 3 一半乳糖苷 l b 培养基 接头介导的p c r 信使r n a 光密度 开放阅读框架 聚合酶链式反应 聚乙烯聚吡咯烷酮 r p m 每分钟转数 r t - p c r反转录p c r s d s t a q c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d c e t y lt r i m e t h y la m m o n i u mb r o m i d e d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 1 l o u r i s o p r o p y l 一1 t h i o b - d g a l a c t o s i d e l u r i a b e l t a l l im e d i a l i n k e ra d a p t o rp c r m e s s e n g e rr n a o p t i c a ld e n s i t y o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y v i n y lp o l y p y r r o l i d o n e r o t a t i o n a ls p e e di nr e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c f i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 十二烷基硫磺酸钠 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e d n a 聚合酶 t h e r m u s a q u a t i u s ( d n ap o l y m e r a s e ) 兰：! 型! 二堡：! ：壑：! 二堕! 堡二! ：兰塾萱蔓 ! 苎翌兰婴! ：堡：! 婪竺2 ：i ：垫! ! ! ：! ：里墨坐型! ! 坦1 4 福建农林大学硕士学位论义 第一章前言 一、番木瓜研究进展与现状 番木瓜( c a r i c a p a p a y a l ) 是番木瓜科( c a r i c a c e a e ) 番木瓜属( ( 0 ，i c a 三) 多年生肉质草本植物，是著名的热带、亚热带水果之一，是一种速生快长的双子 叶大型半草本果树，其产量高，果实色美味鲜，富含糖和维生素既可果食，又 可入菜煲汤，常食可益脾健胃助消化，医用价值商。目前，番木瓜的研究主要有 以下几方面： 1 番木瓜性别分化研究 番木瓜是典型的亚雌雄异株，有雌株、雄株和两性株。由于它性别的多念性 使得它成为研究植物性别分化和决定的模式植物。国内外对番木瓜性别决定机制 和分子标记的研究很多。国外学者利用r a p d 、a f l p 、d a f 、r f l p 等分子标记 技术寻找番木瓜的性别连锁基因，这些分子标记只出现在雄株和两性株中却不 出现在雌株中( m ae t a l ，2 0 0 1 ，2 0 0 2 ；s o m s r ie t a l ，1 9 9 8 ；l i ue l a l 2 0 0 3 ) 。此外， 番木瓜( 3 0 个月) 根、茎、叶的蛋白质含量雌株高于雄株( d u t t a ，1 9 8 9 ) ；n a i d i e t a l ( 1 9 9 0 ) 对番木瓜总r n a 和组蛋白分析发现，r n a 含量和组蛋白的水平雌 株高于雄株，雌株有相对较高的代谢状况，为鉴定番木瓜幼苗的性别提供依据。 但番木瓜性别决定机制至今仍未弄清，性别决定基因还没克隆出来，因此，对于 番木瓜性别的研究还有待于进一步深入。 2 抗病番木瓜的育种 环斑病对于番木瓜几乎是毁灭性的打击，是其生产上重要的限制因素。由于 番木瓜种内没有抗病资源，利用亲缘关系较远的属问抗病资源进行杂交得到的远 缘杂种不可育，难以得到后代，因此，番木瓜的抗病育种主要集中在转基因育种 上。1 9 8 9 年康奈尔大学j o h ns a n f o r d 首先用基因枪法把环斑瘸外壳蛋白基因转入 番木瓜，接着该基因被转入到夏威夷s o l o 栽培种s t m s e t ，筛选到的转基因植株在 田间攻毒实验中表现出强抗病能力。目前p r v 弱株系的应用已取得了一定的成 功，并且还得到了p r v - r n a 核酶转基因植株和p r v - c p s n 转基因植株。田间 攻毒试验表明绝大多数的转基因植株对p r v 的侵染表现不同程度的延缓能力， p r v - c p - s n 转基因植株对p r v 的抵抗能力最强( 周鹏等) 。1 9 9 7 年，美国f d a 福建农林大学硕j 二学位论文 组织批准夏威夷和康奈尔大学联合申请的转番木瓜p r s v ( p a p a y ar i n g p o tv i r u s ) 病毒外壳蛋白基因的抗病番木瓜进入商业化生产( f d a ，1 9 9 7 ) 。番水瓜是第一 个被批准进入商业化生产的抗病转基因植物( j o h n z a k o u re t a l ，1 9 9 8 ) 。如今，番 木瓜已成为生物技术在果树应用和抗病育种应用的模式植物( m a n s h a r d tr me t a l 1 9 8 9 ) 。 3 提高番木瓜贮藏期的研究 番木瓜可周年挂果。五月中旬开花的番木瓜，其果实发育可分为五个阶段： 开花后约1 1 0d ( 果皮绿色，果肉白色) ；开花后约1 2 0d ( 果肉变黄) ；丌花后约 1 3 5d ( 果皮变黄) ；开花后1 4 5d 左右( 采收成熟期) ：开花后1 5 0d ( 食用成熟 期) 。用于鲜食的番木瓜应充分成熟才能显示其特有的风味，而软化是果实达到 食用成熟期的关键因素之一( d k p a le t a l ，1 9 8 7 ) 。1 8 以上，果实变黄的同时 伴随着果实的成熟，之后便迅速软化，甚至腐烂，易受细菌或真菌感染，因此番 木瓜的货架寿命短。 番木瓜为呼吸跃变型果实，当出现类似呼吸高峰的乙烯高峰时，果实便进入 成熟阶段。a c c 氧化酶基因、a c c 合成酶基因是与乙烯合成密切相关的两个酶。 分析这两个基因，利用反义技术将它们转入番木瓜，以期提高果实的贮减期和商 品价值一直是学者们的研究热点。迄今，已克隆出与果实成熟软化有关的a c c 氧化酶基因、a c c 合成酶基因和p g 基因( 多聚半乳糖苷酶基因) ( c h e ne t a l , 2 0 0 1 ；l i ne ta t , 1 9 9 7 ) ，并且成功将a c c 氧化酶基因转入番木瓜，i f 在进行用间 试验中( l i ne ta t , 1 9 9 7 ；s o n ge ta l ，2 0 0 1 ；c h e ne ta l ，2 0 0 1 ) 。此步b m a n s h a r d tr me la l 报道将正义和反义翻译的a c c 合成酶基因转入番木瓜中，其转基因的植株在夏威 夷和澳大利亚的温室进入田间实验。 总之，至今对于番木瓜的研究已取得了一些可喜的成果。但是，提高番木瓜 果实贮藏期的研究都是从乙烯合成途径中的关键酶入手，还未从根本上解决番木 瓜果实成熟后迅速软化的问题。 二、果实成熟软化的研究进展 果实硬度是指果肉抗压力的强弱程度，可作为果实成熟的判断标准之一。果 实软化时在细胞壁中发生的最显著的变化是果胶物质溶液化，同时伴随着细胞壁 中胶层的溶解和初生壁的破坏。表现在外观上是果实硬度下降，质地变软，这是 果实成熟的最显著的变化之一。研究认为果实的软化与果胶酶及纤维素酶、半纤 6 福建农林入学硕， j 学位论文 维素酶等的活性直接相关，果实在成熟过程中酶的活性是基因活化表达的结果。 1 ，果实成熟软化过程中细胞及细胞壁主要成分的生化变化 果肉质地是果品最重要的属性之一。它不仅与果实的食用品质有关，而且还 是果实贮藏品质的一个重要指标。果实中可食部分是由厚壁细胞所包围的薄壁细 胞组成的。薄壁细胞间通过一层不定形的与细胞壁毗邻的中胶层粘在一起。中胶 层主要是由果胶物质组成。当中胶层中果胶物质以原果胶为主时，细胞问粘合力 大：而以可溶性果胶和果胶酸为主时，细胞间的粘合力便降低。果实成熟时由于 果胶等粘合物质的分解，细胞分区逐渐消失而失去膨压，导致果实软化( 陆胜明 等，2 0 0 1 ) 。果实成熟过程中果胶等多糖成分经过复杂的生化变化，最终对果品 质地产生影响。 1 ，1 果胶 果实软化是果实成熟衰老过程中的一个重要方面，很多果实成熟时都伴随着 果胶的变化，主要表现在成熟果实中可溶性果胶含量上升以及果胶的平均分子量 显著下降( a s h r a f a n dk h a n ，1 9 8 1 ) 。果胶质骨架的甲基酯基团的裂解使果胶链的长 度降低，大大提高了果胶溶解性( c a r p i t a a n d g i b e a u t1 9 9 3 ) 。鳄梨的原果胶随着 水溶性果胶的出现而下降，总果胶的去酯化从8 5 下降至4 5 。对大久保桃和 燕红桃的研究结果表明，随着果实的成熟软化，果肉硬度明显下降，原果胶含量 显著降低，而水溶性果胶含量增加。苹果、猕猴桃、梨的研究也有类似的结果。 甜樱桃成熟过程中随果实软化，总果胶、水溶性果胶、草酸溶性果胶均增加，而 盐酸溶性果胶( 原果胶) 降低。凝胶和超离分析结果表明，除交联断裂外，半乳 糖骨架( 主链) 也降解。果胶的降解在成熟的后期尤为集中，并与果实品质退化 有关( d a w s o ne ta 1 , 1 9 9 2 ；h u b e ra n do d o n o g h u e 1 9 9 3 ) 。 1 2 半纤维素 与成熟有关的半纤维素结构的修饰在番茄、辣椒、草莓和瓜类中已有报道。 虽然细胞壁半纤维素的数量改变很小，凝胶过滤和色谱分析的结果表明，半纤维 素聚体大小在这些果实成熟期间显著下降( g r o s se ta l ，1 9 8 6 ：h u b e r 。1 9 8 3 ) 。 半纤维素结构改变可能是果实质地变化的重要决定因子，但半纤维素转变的生化 基础目前尚不清楚。 1 3 纤维素 塑堕坐苎查兰堡! ：兰竺堡苎一 纤维素常与木质、角质、栓质以及果胶等组成复合纤维素，这种复合纤维素 对果实有保护作用。超微结构观察的结果表明，成熟的鳄梨、梨和节果的细胞壁 纤维明显溶解( p e s i se ta ，1 9 7 8 ) ，在体外可通过真菌纤维素酶的处理而再在 现( b e na r i ee ta ，1 9 7 9 ) 。 1 4 淀粉 淀粉在果实成熟软化过程中发生降解。海沃德猕猴桃果实采后在2 0 条件 下， 1 3d 内淀粉含量从7 6 降至1 5 ，淀粉快速降解与果实快速软化的时i 嘲 相吻合。因此，认为淀粉的快速水解是造成果实在第一阶段硬度下降的主要原因。 2 果胶酶的研究进展 果实的成熟软化过程是一个非常复杂的过程，其间有多种酶和蛋白的参与。 在不同果实中起主导作用的水解酶有所不同，且在果实的不同发育阶段酶的作用 也存有差异。果胶酶主要包括：多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 、果胶酯酶( p e ) 、果 胶裂解酶( p l ) 。 2 1 多聚半乳糖醛酸酶( p g ) 的研究进展 多聚半糖醛酸酶( p o l y g a l a c t u r o n a s e ，p g ) 有外切酶( e x p g ) 和内切酶 ( e n d o - p g ) 两种。e x - p g 使多聚半乳糖醛酸从链端逐个开始水解，而e n d o - p g 则可从分子中间割断多聚半乳糖醛酸链( 段学武等， 2 0 0 1 ) 。植物在发育的不同 时期相关的p g s 是由多基因家族编码的，各基因家族成员分别调节不同时空的 表达。大多数果实中存在e x - p g 和e n d o - p g ，番木瓜果实成熟过程中，p g 的活 性从内果皮到外果皮逐渐表现，靠近内果皮部分最大，既有e x - p o ，又有 e n d o - p g 。但有些果实中不存在e n d o - - p g 或e n d o - p g 含量低于检测水平，如苹 果、柿( b a r t l y ，1 9 7 8 ；c u t i l l a se la l ，1 9 9 3 ) 。e x - p g 存在于果实发育的早期和成熟 期，而e n d o - p g 在果实成熟的后期占绝对优势( 段学武等，2 0 0 1 ) 。从植物克隆得 到的序列来看，p g s 还是存在一些高度保守的区域，特别是在p g 酶的羧基末端 部分的二个保守区域。酶的催化功能可能归功于这一高度保守的区域( h a d f i e l d a n db e n n e t t , 1 9 9 8 ) 。 2 0 世纪6 0 年代初h o b s o n 指出多聚半乳糖醛酸酶( p g s ) 与番茄果实软化密 切相关( h o b s o n ，1 9 6 5 ) ，之后的研究证明该酶是一种细胞壁蛋白，它可以催化果 胶分子中- ( 1 ，4 ) 一聚半乳糖醛酸的裂解，从而参与果胶的降解，促进果实软 福建农林太学硕j 。学位论文 化( c r o o k aa n dg r i e r s o n 。1 9 8 3 ) 。目前大多数研究证实，果实的软化与p g 活性增 强直接相关，并认为在节果、桃、番茄、香蕉等果实成熟软化过程中，p g 起主 要作用。 目前通过分子水平调控p g 基因的表达有两种方法，一种是通过反义r n a 技术对p g s 进行负调控，另一种是通过插入失活，使p g 基因不能表达。1 9 8 8 年s m i t h 等将p gc d n a 5 端的7 3 0b p 片段反向插入，接上c a m v3 5 s 启动子和 n o s 基因3 末端，构建一个反义融合基因，将其导入b i n1 9 ，再转入农杆菌 l b a 4 4 0 4 ，用来转化番茄茎段，结果在叶片和果实中都发现了反义p gc d n a ， 其p g 酶活性只有正常植株的1 0 。而s h e e h y 等( 1 9 8 8 ) 也将p gc d n a 的反义 表达载体转入番茄中，但他们用来构建反义基因的p gc d n a 片段长度为1 6 0 0 b p ，包含有p g s 开放阅读框架，因此所得到的转基因果实在成熟各阶段m r n a 和p g s 的水平也大大降低。叶志彪等( 1 9 9 6 ) 也获得了p g 反义c d n a 克隆转化 的番茄植株，其果实表现为p g 活性特异性降低，但果实的其他特性无明显变化。 鞠戎等( 1 9 9 4 ) 将p g 反义r n a 转入丽春番茄，获得了4 0 株转基因植株，若干 株系中p g 活性不同程度下降，其中一个株系3 # ，p g 酶活性下降了9 3 。以上 实验均表明了外源p g 基因的反向导入有效地抑制了内源p g 基因的表达。获得 的转基因植株为以后研究p g 对果实成熟软化的影响，进而培育耐贮减、品质好 的株系奠定了基础。 尽管大多数研究证明p g 在果实的软化中起重要作用，但也有一些实验表明， p g s 对于果实成熟软化并不是必要的。在反义p gm r n a 转基因番茄纯合子后代的 果实 p gr n r n a 的积累受阻，p g s 活性下降9 9 ，果胶的降解被抑制，但果实仍 能正常成熟，反义转基因果的软化与野生型相比只有微小的差异：p g 反义r n a 专地抑f 5 l j p g s 的活性，而对乙烯、番茄红素的合成，果胶酯酶和蔗糖酶的活性 都没有明显的影响( s m i t h ，1 9 8 8 ；s m i t he la l , 1 9 9 0 ；s h e e h ye la l , 1 9 8 8 ) 。番茄完熟 突变体r 加中并不缺乏p g 基因，但p g 基因的转录受到严重抑制，与f 常型果实相 比，其成熟过程中m r n a 的水平、p g 活性仅为正常型果实的l ，不能正常成熟 软化( d e l l a p e n n ae ta l1 9 8 9 ；g i o v a n n o n ie la t , 1 9 8 9 ) 。将一个p g 结构基因连接在受 乙烯诱导的e 8 启动子后面导x r i n 突变体番茄中，转基因番茄纯合子后代果实经 乙烯处理后，果实中p g 基因的表达、p g s 活性、果胶的降解虽都能恢复到野生型 番茄的水平，但果实仍不能成熟变软，果实成熟的其他特性如色素的积累、乙烯 的合成也未改变( g i o v a n n o n ie t a l , 1 9 8 9 ) ，表明p g 对果胶的降解不足阻诱导果实的 9 福建农林大学硕l 学位论义 完熟，也说明p g s 并不是果实软化唯一的决定因素。 2 2 果胶酯酶( p e ) 的研究进展 果胶酯酶( p e c t i n e s t e r a s e ，p e ) 更容易作用于脱酯化果胶，因此，p e 在决定 p g 降解果胶的程度上起重要作用。由于该酶的作用，使果肉组织对p e 更为敏感 ( 生吉萍等，2 0 0 0 ) 。p e 活性变化与作用在不同种类、不同品种的果实中表现 不同。许多果实中，p e 活性随果实成熟而升高，造成多聚半乳糖醛酸甲酯水解。 h o b s o n 发现，正常成熟的番茄在成熟后期的红色果实中p e 活性最高。番木瓜 c o o r g h o n e yd e w 中的p e 活性在开花后1 4 0 天前保持恒定，以后随着果肉变软， 酶活性急剧上升( d k p a le t a l ，1 9 8 7 ) 。在香蕉果实成熟中p e 活性保持不变。而 海夏早桃和白云桃在成熟早期，p e 活性随果实硬度下降略有减弱，但在果实成 熟后期p e 活性却又增强。因此认为p e 对果实软化也可能起调节作用，但有关p e 在果实成熟软化方面作用的直接证据还不多，需进一步研究。果胶甲酯酶的生理 意义可能在于为p g 作用准备底物，对果胶物质的降解起辅助作用。应用反义r n a 技术，将p e 基因导入番茄，使酶活性降低l o ，可溶性果胶减少成熟过程不受 干扰，但果胶的高度甲酯化明显影响了果胶代谢，改善了果实的品质。 2 3 果胶裂解酶( p l ) 的研究进展 果胶裂解酶( p e c t a t el y a s e s ，p l ) 或称为果胶酸裂解酶，是一种能降解植物细 胞壁，导致植物组织软化甚至死亡的一种解聚酶( c a r p i t aa n dg i b e a u t ，19 9 3 ) ，它能 催化聚半乳糖醛酸q - ( 1 ，4 ) 键的断裂，但不是通过水解的方式，而是通过8 _ 消除的方式，即通过对删源子上的基团进行去除或转移，形成为双键的反应 ( w i l l a t se ta l ，2 0 0 1 ) 。果胶裂解酶作用于半乳糖醛酸的第5 位的肛碳原子，使p 碳原子上的h 转移到了糖昔键的氧原子上，糖苷键断裂，在半乳糖醛酸的c _ 4 和c 一5 之间形成t x 2 键( 张德有等，2 0 0 3 ) 。目前，对果胶裂解酶基因的研究主 要集中在微生物上，而植物的p l 基因研究尚处于起步阶段。 2 3 1 微生物中的果胶裂解酶 1 9 6 0 年，a e b e r s h e i m 等首先在商品酶制剂p e e t i o n l r - 1 0 中发现了果胶裂解 酶。许多微生物中都存在果胶裂解酶( p l ) ，其氨基酸序列的同源性从2 7 到8 0 不等。在微生物中，产生p l 的主要是曲霉菌和镰孢菌，从黑曲霉已克隆到6 个 p l 编码基因，即p e l a 、p e l b 、p e l c 、p e l d 、p e l e 和p e l f ，其中p e l a 和p e l d ，即 0 福建农林大学硕i 学位论文 p li 和p l 】i 是分别编码商品果胶酶v l t r a z m 的两种主要p l 。从茄镰孢豌疆专化 型分离到4 个e n d o - p l 基因，即p e l a 、p e l b 、p e l c 、p e l d ( l i e t z k ee ，a 1 1 9 9 4 1 9 9 6 ) 。 p e l a 编码的e n d o - p la 前体蛋白分子量为2 9k d a ，成熟蛋白分子量2 6k d a ， p l = 8 3 ，最适p h = 9 4 ：p e l b 编码的p lb 分子量为2 5 6k d a ，最适p h = 10 0 ，与 p l a 的a a 序列有6 5 同源性，p l a 和p l b 与其他果胶酶无明显同源性。p e l c 编码的p l c 分子量2 3 3k d a ，与p l a 有血清关系，a a 序列有5 1 相同，最适 p h = 9 5 ，活温5 5 c 。p e l d 编码的p ld 分子量2 4 5k d a ，成熟蛋白分子量2 2 7 k d a ，a a 序列与p l a 、p l b 、p l c 分别有4 9 、4 4 、6 5 的相似性。番茄尖镰 孢编码p l l 的基因与茄镰孢豌豆专化型的p e l a 、p e l b 、p e l c 和p e l d 基因分别有 8 9 、6 7 、5 5 和5 6 相同。菌源果胶裂解酶在钙离子存在的情况下，解聚细 胞壁的半乳糖醛酸，破坏植物组织的整体性，使许多双予叶植物的薄壁细胞组织 软化，从而导致严重的病害。 细菌的果胶裂解酶序列与真菌的果胶裂解酶、植物花粉蛋白质和植物花柱蛋 白质有一定的相似性。迄今为止，人们已了解了果胶裂解酶基因家族中五个成员 的三维空间结构，包括p e l c 。这些蛋白质折叠成特殊的被称为b 一平行螺旋的结 构基序，有两个能使果胶质脱甲基化的p l 也属于这一家族( m a y a n se ta l ， 1 9 9 7 ；v i t a l ie ta l ，1 9 9 8 ) 。该家族p l 具有从平行的b 螺旋核心向外突出的环。p l 的结构因环的构造和大小的不同而有所不同，但其基本结构还是一样的。这可从 b s p e l 中钙离子结合位点序列的相似性及具有水解活性的b 螺旋一侧突出的环的 定点突变等的研究中得到证实( k j t a e t a l l 9 9 6 ) 。环的结构的不同使得所产生的蛋 白质在酶的活性和软化的性质上有微小的区别。对p e l c 的研究表明它有两个功 能区，当p h = 7 时，这两个功能区并不是折叠的，且有极强的相互作用，在高的 p h 或是低的p h 情况下这样的相互作用减弱( k a m e ne ta l ，2 0 0 0 ) 。然而p e l c 这样 的晶体结构仅仅有一个暴露的功能区。此外，对ec h r y s a n t h e m i p l 也有了初步 的认识，它与p e l c 家族1 中的酶有同样的平行的b 螺旋结构，有着同样的活性， 但是基因序列却大不相同。 由植物病原菌分泌的p l 似乎具有共同的酶学机制，但起作用的氨基酸活性 中心却还未能准确定位。有研究认为，三个精氨酸残基参与p l 的钙调作用，他 们认为精氨酸在消除过程中能够诱发质子的转移，从而使多聚半乳糖醛酸降解 ( s e a v e t t a e t a t , 1 9 9 9 ) a 2 3 2 植物中果胶裂解酶基因的分子生物学研究进展 福建农林大学碗卜学位论文 高等植物中首先报道了在花粉中发现了p l 的两个同源基【大j ( w i n g e l a l ，1 9 8 9 ) ，这两个基因的序列类似于欧文氏杆菌的p l 基因，在番茄成熟的花药和 花粉中大量表达。此后，又有关于在番茄花柱引导组织和几种植物的花粉粒中表 达的p l 同系物的报道( k u l i k a u s k a sa n dm c c o r m i c k ，1 9 9 7 ) 。功能研究表明，花粉包 括花粉壁中的p l 能够促进花粉管的萌发、伸长，同时降解柱头表面的角质膜， 使花粉管顺利到达胚囊( t a n i g u c h ie la l ，1 9 9 5 ；w uye la l ，1 9 9 6 ) 。 d o m i n g u e z p u i g j a n e r 等( 1 9 9 7 ) 首次报道了p l 基因的转录与果实成熟软化 有关。他们通过m r n a 差异显示筛选，从香蕉果实e d n a 文库中克隆出一条编 码与果胶裂解酶同源的e d n a 片段( b a n l 7 ) 。由b a n l 7 推导出的氨基酸序列与 从花粉和e r w i n i a 属植物病原菌中得到的累胶裂解酶有很高的同源性，病原菌p l 被证明了可以分解植物细胞壁果胶物质，这种相似性表明b a n l 7 可能在果实成 熟过程中的果实软化方面起作用。c a “对于体外p l 的活性是必要的，有三个a s p 残基参与菌源p l 的钙调作用，在b a n l 7 中也发现该保守区。c a 卜结合位点周围 是两个不变的a r g 残基和一个p r o 残基，它们组成果胶结合位点。该结构办存在 于b a n l 7 及花粉和花柱的p l 中。这表明所有上述蛋白质，就像菌源p l 一样， 可能折叠成一种p 平行螺旋结构并具有c a 2 + 依赖的果胶降解活性。b a n l7 的表 达和其他成熟特异基因一样，是在成熟起始时由乙烯的跃变型增加来调控的。 b a n l 7m r n a 在呼吸跃变峰处达到最高水平，此时组织结构变化已丌始，m r n a 的积累模式与p g 相似，这也暗示了b a n l 7 蛋白在果实软化过程中的细胞壁降解 作用。b a n l 7 中的信号肽和一个潜在的糖基化作用位点表明它可能进入分泌旁路 并且成为胞外基质的一部分( 张德有，2 0 0 2 ) 。 早期想证明番茄中存在p l 的实验失败，然而，随着番茄表达序列标签( e s t ) 和c d n a 文库的建立，发现在成熟的番茄中p l 同源基因大量地表达。随后，在香 蕉、草莓、葡萄上都报告分离得至q t p l 基i 困( d o m i n g u e z p u i g i a n e re ta 1 1 9 9 7 ；m e d i n a - s u 矗r e ze t a l , 1 9 9 7 ；p i l a t z k e - w u n d e r l i c ha n dn e s s l e r 2 0 0 1 ：m a r t n - r o d r i g u e z ，2 0 0 1 ) 。在香蕉成熟过程中有两个p l 同源基因( p e l1 和p e l l i ) 同 时作用，他们在果肉、果皮中的表达量不尽相同，几，表达水平较高。将n ， 转化酵母，获得了具有活性的p l 蛋白质。更为重要的是，m a r t n r o d r i g u e z ( 2 0 0 1 ) 首次直接从植物组织中获得具有活性的p l 蛋白质，并且随着香蕉成熟，果肉中 p l 的含量逐渐增加。另外，从草莓中获得的p l 基因序列也在酵母中表达得到了 有活性的蛋白质( m e d i n a - e s c o b a re t a l ，1 9 9 7 ) 。最近，通过反义技术已成功地抑 福建农林大学硕士学, t ；t j 2 3 z 制了p l 基因在草莓果实中的表达，即在绿果成熟时抑制p lm r n a i 女译成蛋白质， 最大限度地抑制了由自变红成熟过程中伴随的果实软化现象( j i m 6 n e z b e r m 6 d e z e la l ，2 0 0 2 ) 。 三、本研究的意义、内容及技术路线 1 本研究的意义 有关番木瓜果实成熟与软化的分子生物学研究，前人已经做了大量工作， 主要是从果实成熟过程中乙烯形成的机理入手，克隆与果实成熟软化有关的a c c 氧化酶基因、a c c 合成酶基因和p g 基因( 多聚半乳糖苷酶基因) ，并成功地将a c c 氧化酶基因和a c c 合成酶基因转入番木瓜中，但却未见到其转基因果实较正常果 实耐贮的报道。 本研究在前人研究的基础上，从番木瓜成熟果实的迅速软化入手克隆与果 胶质降解密切相关的果胶裂解酶基因，为通过反义遗传转化抑制果实软化进程， 为解决番木瓜果实货架寿命短提供了一条新的遗传改良途径。 2 本研究的内容 1 ) 番木瓜基因组d n a 和果肉总r n a 提取方法的建立。 2 ) 采用染色体步移及r a c e 方