（预防兽医学专业论文）应用微卫星dna标记研究普氏原羚遗传多样性.pdf

中文摘要 普氏原羚( p r o c a p r ap r z e w a l s k i o 是中国特有的濒危物种，开展该物种的保护 遗传学研究是实施普氏原羚拯救工程的基础工作。本文应用微卫星标记来研究普 氏原羚遗传多样性，主要研究内容如下： 一、不同普氏原羚粪便保存方法比较：通过将普氏原羚的粪便在野外分别采 取6 0 干燥后低温保存，7 5 乙醇保存，1 0 0 乙醇保存，直接低温( 保温箱中 加生物冰袋) 保存。结果表明，短期内都均可得到高质量的d n a ，而用1 0 0 乙醇 保存粪便d n a 的时间更为长久。同时，建立了一种从粪便中有效提取d n a 的方法。 该方法具有高灵敏度、操作简单、非损伤等特点，解决了珍稀濒危物种难于取样， 无法进行大规模研究的难题。探讨了一种既能使野外采集的粪便样品d n a 保存完 好，又方便带回实验室用于分子水平研究的粪便保存方法。 二、普氏原羚哈尔盖亚种群遗传多样性分析：利用牛、羊的4 0 对微卫星引 物在哈尔盖地区4 3 个粪便样品中扩增，筛选出1 2 对具有高度多态性的微卫星 1 物对哈尔盖种群遗传多样性进行研究。1 2 对微卫星引物在4 3 只普氏原羚基因组 d n a 中共检测到9 4 个等位基因，平均有效等位基因数介于9 3 8 5 8 4 3 8 6 7 。说 明微卫星两侧序列具有高度保守性，而核心序列具有高度多态性，是适合于在物 种间相互扩增的。筛选到的1 2 对微卫星位点在普氏原羚d n a 基因组中的多态信 息含量值介于0 8 8 4 1 0 8 0 2 6 之问，说明检测的位点均为高度多态性。1 2 对微 卫星位点的平均观察基因杂合度为0 8 4 8 3 ，从核基因角度揭示该研究种群具有 丰富的遗传多样性。 三、普氏原羚主要亚种群遗传多样性分析：最后以采集于青海湖的天峻、鸟 岛、哈尔盖、青海湖火车站、元者和湖东的6 个普氏原羚亚群体为研究对象，进 行了1 2 对微卫星位点的遗传参数分析。结果表明：天峻、鸟岛相对与其他种群 分化时间较长，遗传距离最小为哈尔盖种群和元者种群。在聚类分析中，元者种 群与湖东种群以很小的遗传距离首先被聚为一类，然后是青海湖火车站种群与哈 尔盖种群被聚为一类，天峻种群和鸟岛种群自成一类。普氏原羚总遗传变异的 4 9 8 来源于种群之间的遗传变异，9 5 0 2 属于种群内的遗传变异。普氏原羚种 群的n m = 4 7 7 3 6 1 ，说明有较高的基因流。种群两两之间湖东和元者种群问有 丰富的基因流，天峻和鸟岛之间的基因流最少。 关键词：普氏原羚：微卫星；粪便保存；遗传多样性 a b s t r a c t t h ep r o c a p r a p r z e w a l s k i ii sa l le n d a n g e r e ds p e c i e sd i s t x i b u t i n go n l yi nt h ec h i n a t h ec o n s e r v a t i o no ft h es p e c i e s g e n e t i cr e s e a r c hi st h eb a s i sf o rt h ei m p l e m e n t a t i o n o fp r o j e c t sp r o c a p r ap r z e w a l s k i ir e s c u ew o r k t h i se s s a ye x p l o r e su s i n gm i c o s a t e l l i t e d n a st os t u d yt h eg e n e t i cd i v e r s i t y ，a n di t sm a j o rc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： t h ec o n t r a s ta m o n gd i f f e r e n tm e t h o d so ff e c e sp r e s e r v a t i o n ：t h em e t h o d sa r e t h a tf e c e sw a sr e s p e c t i v e l ys t o r e di nt h ef i e l dd u r i n gc o l l e c t i o na tal o wt e m p e r a t u r e a f t e rd r y i n ga t6 0 ，s t o r e di n7 5 e t h a n o l ，s t o r e di n1 0 0 e t h a n o la n dd i r e c t l y s t o r e da tal o wt e m p e r a t u r e ( i nt h ea t t e m p e r a t o ra d d e dt h eb i o l o 西c a li c eb a g ) ， t h er e s u l ts h o w e dt h a td n ac o u l db ee x t r a c t e ds u c c e s s f u l l yf r o mt h ef e c e si na s h o r ts t o r i n gp e r i o dw i t ha n yo ft h e s em e t h o d s w h a t sm o r e ，t h ed n a s a m p l es t o r e d i n10 0 e t h a n o lc o u l db el o n g l i m es t o r e d a tt h es a m et i m e ，t h em o d i f i e dd n a e x t r a c t e dm e t h o dw a sar e l i a b l em e t h o dt oo b t a i nh i 曲q u a l i t yd n af r o mt h e p r o c a p r ap r z e w a l s l n if e c e ss a m p l e s i te s t a b l i s h e dac o n v e n i e n tm e t h o dt os a v et h e c o l l e c t e sf e c e si nt h ef i e l da n dt r a n s p o r tb a c kt ot h el a b o r a t o r yf o rd n a a n a l y s i s a n d w ec o u l du s et h e s em e t h o d si no t h e re n d a n g e r e ds p e c i e sf o rt h e i rg e n e t i cs t u d i e s t h ca n a l y s i so f g e n e t i cd i v e r s i t yo f t h eh a e r g a ip o p u l a t i o n ：1 2h i g hp o l y m o r p h i c m i c r o s a t e l l i t el o c iw e r es c r e e n e df r o m4 0m i c r o s a t e l l i t el o c id e r i v e df r o mc a t t l ea n d s h e e pb yp c ri n4 3p r o c a p r ap r z e w a l s k i if e c e ss a m p l e sw h i c hw e r ec o l l e c t e da t h a e r g a ia r e ai nq i n g h a ip r o v i n c e i nt h e s e1 2l o c i 9 4a l l e l e sw e r ef o u n da n dt h e e f f e c t i v en u m b e ro fa l l e l e ( n e 、r a n g e df r o m9 3 8 5 8t o4 3 8 6 7 t h ep o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o nc o n t e n t ( p i c lv a l u ea tt w e l v em i c r o s a t e l l i t er a n g e df r o m0 8 8 4 1t o0 8 0 2 6 t h ea v e r a g en u m b e ro fg e n e t i ch e t e r o z y g o u s i t y ( h e ) i s0 8 4 8 3 t h er e s u l t sr e v e a l e d t h a tt h eh a e r g a ip o p u l a t i o nt o o ko nah i g hl e v e lo f g e n e t i cd i v e r s i t y t h ea n a l y s i so fg e n e t i cd i v e r s i t yo ft h em a i np o p u l a t i o n s ：t h ep r e s e n ts t u d yw a s p r e s e n t e do n1 2m i c r o s a t e l l i t el o c ia n a l y s e so fs i xp o p u l a t i o n ss a m p l e sc o l l e c t e df r o m t i a n j u n ，h a e r g a i ，b i r di s l a n d ，t h er a i l w a ys t a t i o no fq i n g h a il a k e ，y u a n z h ea n d h u d o n g t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r ew a sal o n gd i v e r g e n tt i m e sb e t w e e nt i a n j u n 、 a n db i r di s l a n d ，g e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e nt h eh a e r g a lp o p u l a t i o na n dy u a n z h e p o p u l a t i o ni st h es m a l l e s t t h eu p g m ac l u s t e ra n a l y s i sc l u s t e r e dt h eb l a c kl i n eo f y u a n z h ep o p u l a t i o na n dt h eh u d o n g p o p u l a t i o nl i n ew e r ec l u s t e r e da tf i r s t ，t h e nt h e b l a c kl i n eo fh a e r g a ip o p u l a t i o na n dt h er a i l w a ys t a t i o no fq i n g h a il a k ep o p u l a t i o n l i n e ，b u tt i a n j u na n db i r di s l a n da r cs i n g l ep o p u l a t i o n t h e r ew a sh i g hl e v e lo fg e n e j l f l o wa m o n gt h e s i xp o p u l a t i o n s t h ed i s t a n c eb e t w e e nh u d o n gp o p u l a t i o na n d y u a n z h ep o p u l a t i o nw e r eu n s t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a m o t h e rp o p u l a t i o nw a ss i g n i f i c a n t b e t w e e nh u d o n gp o p u t a t i o na n dy u a n z h ep o p u l a t i o na l et h eh i g h e s tg e n eb l o w b e t w e e nt i m a j u np o p u l a t i o na n db i r di s l a n dp o p u l a t i o na l et h el o w e s tg e n eb l o w k e yw o r d s ：p r z e w a l s l a 0g a z e l l e ；m i c r o s a t e l t i t e ；f a e c a lp r e s e r v a t i o n ；g e n ed i v e r s i t y i 论文缩略词表 缠堕塑主塞鱼 夔塞鱼 一一一 h a e 醋酸 a c e t i ca c i d a m p 氨苄青霉素 a m p i c i l l i n a d过硫酸铵 a m m o n i u mp e r s u l f a t e b d碱基对 b a s ep a i r s d n a脱氧核糖核菅酸d e o x y n u c l e o s i d e a c i d s s r s 简单重复序列s i m p l es e q u e n c er e p e a t s d n t p脱氧核糖核苷三磷酸d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h o s p h a t e e b 溴化乙锭 e t h i d u mb r o m i d e e d t a乙二二胺四乙酸 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t a t i ca c i d f s t杂合性基因多样度的比率 r a t i o s o f g e n e d i v e r s i t i e s o f h e t e r o z y g o s i t e s h h基因杂合度 g e n eh e t e r o z y g o s i t y n e 有效等位基因数 e f f e c t i v e n u m b e ro f a l l e l e s p c r多聚酶链式反应p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p i c多念信息含量p o l y m o r p h i s m i n f o r m a t i o nc o n t e n t p r ok 蛋白酶kp r o t e i n a s e k q 等位基因频率 a l l e l ef r e q u e n c i e s r a p d随机扩增多态性 r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r f l p限制性片段长度多态性 r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a f l p 扩增片段长度多态性a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s n p 单核苷酸多态性分子标记 s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s s l p简单序列长度多态 s i m p l es e q u e n c el e n g t hp o l y m o r p h i s m u p g m a 非加权配对算术平均法进行u n w e i g h t e dp a i r g r o u p m e t h o d u s i n g 聚类分析 a r i t h m e t i ca v e r a g e s d s十二烷基苯磺酸钠 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e t ete缓冲液trise d t ab u f f e r f e m e dn ，n ，n ，n7 一四甲基乙二胺n ，n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e ! ：! !三堑! 薹氢茎圣缝三堕垒z 虫! 兰罂型! 墨i 璧! ：磐! ! 垫竺! 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材割。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名 务脚 时间： 2 0 0 6 年b 月f 调 关于论文使用授权的说明 本人完全了解湖南农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁楹，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意湖南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守l l t t 办 i , g ) 研究生签名 导师签名 给帅 j 到驭 时问： 2 0 0 6 年b 月f 佣 时间：2 0 0 6 年6 月f 2 日 第章综述 1 濒危动物遗传多样性的研究 1 1 濒危动物遗传多样性的丧失 野生动物是自然界赋予人类的宝贵遗产，是人类赖以生存的自然环境的重要 组成部分。由于人类经济活动的不断加剧，特别是现代工农业生产的飞速发展， 盲目利用自然资源，大面积砍伐森林和延伸农业耕地等社会行为，已严重地毁坏 了自然资源和生态系统的平衡，并由此而引发的一系列恶化，如土地荒漠化和沙 化、全球气候反常、环境污染、生物多样性严重丧失和新型传染病的爆发等，使 许多野生动物因受到不同程度的胁迫而住残存于片段化的生境中由于种群隔离、 基因交流中断以及严重的近亲繁殖，许多物种已处于严重濒危的境地。 遗传多样性是指种内基因的变化，包括同种显著不同的群体间或同一群体内 的遗传变异，遗传多样性的丰富程度决定了物种对环境变化的适应能力和进化潜 力。遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性与物种多样性 的基础。遗传多样性的丰富程度决定了物种对环境变化的适应能力和进化潜力 “3 。种群遗传结构的研究，主要是评估珍稀物种种群问和种群内的遗传变异水平、 分布及其产生的遗传多样性变异水平。因为在自然种群中，种群数量下降和生境 片段化会明显地改变种群遗传结构，增加近亲繁殖和遗传漂变，导致遗传异质性 和基因多样性一代代丧失，从而使物种适应环境的能力下降，因而通过评估遗传 变异水平，保护工作者能够估计有效种群大小、鉴定种群间迁移和基因流程度， 检测种群间杂交和基因渗透等情况，这些参数对制定合适的保护策略将起着十分 重要的作用”1 。 动物遗传多样性的丧失在野生动物中是很严重。人为活动的增加引起生境破 坏和破碎，导致随机交配的大种群分割成互相隔离的小种群。小种群的数量少， 往往导致近交繁殖、遗传漂变等而使遗传多样性进一步枯竭。3 。因此，最大限 度地保护自然环境，保护野生动物，是我们人类迫在眉睫的共同任务。在濒危物 种的遗传保护中，不仅要注意减少遗传变异性丧失，重要的还要保护现有物种的 基因库，及物种生存的环境。在濒危物种，特别是高度特化的单型种的研究和保 护中，我们必须充分重视物种的遗传多样性和遗传结构。 1 2 濒危种群中遗传多样性检测方法 随着生物技术的发展和日益完善，遗传变异性的检测手段己日趋多样化，从 不同的角度揭示物种的遗传组成，遗传变异性检测方法主要有：形态标记、细胞 标记、生化标记和分子标记四种。近三十年来主要采用生化和分子标记技术研究 濒危动物的遗传变异性。同功酶电泳技术分析是从蛋白质水平反映物种的变异 性。很多学者利用这一技术研究濒危小种群等的遗传变异性、个体间的遗传差异 等。随着8 0 年代d n a 的p c r 技术的出现，越来越多的分子生物学技术应用于 遗传变异性的检测，尽管很多学者认为r a p d 方法作为一个分子检测尚存在很 多缺陷，但近年来仍有很多学者利用这种方法来检测动物种群的遗传变异性。线 粒体d n a 可以提供有关群体遗传结构的丰富信息，便于进行群体分析，同时严 格的母系遗传方式，使m t d n a 成为可靠的分子遗传标记；高等动物m t d n a 基 因排列顺序高度保守，其基本序列进化速度却是单拷贝核d n a 的5 1 0 倍。因 此，很多学者通过线粒体d n a 控制区的序列变异，分析高等脊椎动物的遗传变 异和遗传分化。z a b e a u 等。1 于1 9 9 2 年提出了一种新的遗传多态标记方法即扩增 片段长度多态性技术，并已逐渐运用于动物的遗传多态检测。近些年来，微卫星 多态检测己大量地运用于濒危动物种群及生境隔离种群的遗传变异性检测及遗 传分化的研究中。运用多种方法对实验种群和野外种群的遗传变异性进行比较研 究的结果表明微卫星多态检测是最敏感的方法。根据发表的研究情况来看微卫星 位点的多态检测方法可能是未来进行遗传多样性检测的最主要手段之一“1 。 1 3 遗传多样性研究在动物保护中的应用 种群遗传结构的研究主要评估濒危物种种群间和种群内的遗传变异水平、分 布及其产生的遗传多样性。因为在自然种群中，种群数量下降和生境片段化会明 显地改变种群遗传结构，增加近亲繁殖和遗传漂变，导致遗传异质性和基因多样 性一代代地丧失，从而使物种适应环境的能力下降。因而通过评估遗传变异水平， 保护工作者能够估计种群水平上的近亲繁殖程度、有效种群大小、亲系鉴定、种 群间迁移和基因流程度、检测种群间杂交和基因渗透等情况。这些参数对制定合 适的保护策略将起着十分重要的作用。具有保持物种的进化潜力，才能真正达到 保护的目的。因为遗传多样性是物种具有进化潜力的物质基础，如果遗传多样性 贫乏，则该物种在环境变迁中易受到致命的打击。 遗传多样性的研究一直是进化理论的基础，是群体生物学和进化生物学的核 心。遗传多样性也是遗传分析的基础，包括染色体连锁图到基因图谱直至全序列 分析。群体遗传学的理论和连锁图谱曾为各种生物育种方案的确定做出了贡献。 分子标记大大加快了育种进程，以及对病原鉴定、疾病诊断，尤其是遗传病的诊 断。遗传多样性的研究也可为濒危物种的保护提供理论依据，更好地保护物种多 样性。 2 微卫星d n a 在濒危动物保护中的应用 建立濒危物种有效保护策略的一个首要条件就是要获得有关精确的遗传多 样性及遗传结构的信息。由于微卫星具有数量多、在基因组内分布均匀、多态性 信息丰富、易于检测“，同时在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析， 具有操作简单、快速、准确等优点被作为优良的遗传标记而得到广泛应用。利用 微卫星分子标记技术可以从本质上揭示物种遗传变异及其变异规律，预测种群 的生存力”3 ，从而制定相应的管理措施。 随着提取d n a 技术的不断提高，可以从更多的材料如毛发、粪便、精细胞、 微量的血液、牙齿、骨骼和标本等获得微量d n a 。而以p c r 为基础的微卫星分析， 其最大优点是对模扳d n a 的要求较低5 1 。仅需要几百个碱基对，所以纳克量或部 分断裂的d n a 都能得到有效地分析“1 。微卫星标记越来越多的应用于那些缺乏遗 传关系信息的濒危动物的研究”。下文介绍近年来微卫星标记在濒危动物种群 遗传结构分析、基因流程度、种群进化史、物种的判定、种群数量调查、亲缘关 系等方面的应用。 2 1 种群遗传结构分析 遗传结构是指基因或基因型在空间和时间上的非随机分布，种群的遗传结构 包括种群内的遗传变异和种群间的遗传分化。对遗传结构及其影响因子的研究是 探讨生物适应意义、物种形成过程及其进化机制的基础。研究物种遗传变异不仅 能够深入了解该物种现在和过去的进化历史，而且能探明其遗传多样性现状和进 化潜力，制定有效的保护策略和措施必须建立在对遗传结构充分了解的基础上 ”1 。微卫星d n a 是进行种群遗传结构和遗传多样性研究的有效的分子标记。 m i c h a u e 和h a r d f 通过使用6 个微卫星位点检测了1 5 5 个欧洲貂( m u s t e l a l u t r e o l a ) ，结果表明生活在欧洲东北部的貂遗传多样性最高，而生活在欧洲西 部的貂遗传多样性低。由此推测生活在欧洲东南部和西部的种群可能经历过瓶颈 效应，西部地区由于隔离造成一定的近亲繁殖。亚平宁山脉的岩羚羊似u p i c a p r a p y r e n a i c ao r n a t a ) 是一种极度濒危的生活在山上的有蹄类动物，大约有8 0 0 只生活 在意大利的亚平宁山脉中部，r i t a 。1 用6 0 个来自家牛和鹿的微卫星引物检测出1 0 个多态性位点，为该种群低的遗传多样性提供了证据，是受严重的种群瓶颈效应 影响的结果。黄磊和王义权“”用8 个微卫星座位对扬子鳄野生对照群体、宣，h f l 代与f l 代饲养群体共3 9 个个体进行了研究。结果显示扬子鳄野生群体与饲养群体 无明显的遗传差异，应作为一个整体进行保护。两者的遗传多样性都明显偏低且 水平相当，由此推测目前扬子鳄饲养种群遗传多样性贫乏的主要原因是近数十年 来野生种群的严重衰退，而建群者效应对饲养种群的遗传多样性并无明显影响。 a n n a $ 口e r i c ”用1 0 个微卫星座位对南非境内非洲象( 三o x o d o n t aa f r i c a n a ) 研究发 现，a d d o 种群因受到瓶颈效应以及随后的遗传漂变作用的严重影响，目前遗传 多样性水平已很低，而k r u g e r 种群在经历瓶颈之后个体数量恢复较快，且与其他 种群有较明显的基因交流，其多样性水平相对较高，但仍低于乌干达境内的非洲 象种群。北大西洋的脊美鲸( e u b a l a e n ag l a c i a l i s ) 种群数目从1 1 世纪1 2 0 0 0 头减少 到本世纪的3 0 0 头左右，w a l d i c k “”用1 6 个微卫星位点检测这个种群下降的遗传多 样性，并与近缘物种( ea u s w a l 打) 相比，等位基因频率( a ) 和杂合度( h ) 均显著偏 低( p o 5 ) ，最高的是位 点b m l 3 4 1 ，多态信息含量为o 8 8 4 1 ，最低的是位点t g l a 5 4 ，为o 7 1 8 0 ，平均 为o 8 0 2 6 。由此可知，哈尔盖地区的普氏原羚种群内部具有较高的多态信息含量。 而且所有的位点多态信息含量大于0 7 ，说明检测的位点均为高度多态性，属于 理想的遗传标记。因此利用这1 2 对多态性引物对普氏原羚的种群研究有着很高 的利用价值。 2 7 固定指数 多数杂交有机体的多态基因位点符合h a r d y w e i n b e r g 平衡规律，导致偏离 这个规律的主要原因是一些生态因子的干扰，对此用一反映种群配子相互关系的 参数，即固定指数来检测。表9 是哈尔盖地区的普氏原羚的固定指数结果。不难 发现，许多位点上都是非零f 值( f o ) ，表明哈尔盖地区的普氏原羚种群的稀有 等位基因面临着丢失的危险。 表91 2 个微卫星位点在哈尔盖地区普氏原羚中所检测等位基因的固定指数 t a b l e9 f i x a t i o n i n d e x o f t w e l v e m i c r o s a t e l l i t e l o c i t o p r o c a p r a p r z e w a l s k i i o f h a e r g a i 续上表 3 讨论 3 1 微卫星的多态性与保守 生 迄今为止，通过互联网检索几个主要的基因数据库以及相关文献，很少发现 有关普氏原羚微卫星d n a 的报道。本研究在洪艳云“”、易湘蓉”研究的基础上， 利用1 2 对多态性微卫星位点对青海湖普氏原羚种群进行遗传研究。因此，本研 究采用与普氏原羚亲缘关系比较近的非洲靡羚、绵羊和牛的4 0 对微卫星引物， 对普氏原羚的基因组d n a 进行扩增，成功的筛选出1 2 对微卫星引物对青海湖哈 尔盖地区的普氏原羚进行了个体识别和分子保护遗传学研究。 微卫星由核心序列和两侧的侧翼序列所构成。侧翼序列使微卫星特异地定位 于染色体某一部分，核心序列重复数的差异则形成微卫星高度的多态性。若某个 体基因组中一对同源染色体相对位置( 即侧翼序列相同) 上的重复单位数相等，该 个体在该微卫星位点的基因型是纯合的；若重复单位数不等，则表现为杂合型。 因此，微卫星的检测可用互补于侧翼序列的寡核苷酸作为引物，对d n a 模板进 行p c r 扩增，利用同位素标记放射自显影或聚丙烯酰胺凝胶银染检测扩增产物， 根据结果来判断个体的基因型。微卫星的核心重复序列的变异与侧翼序列在不同 动物基因组中的同源性，这种看起来既“矛盾”又“统一”，既“保守”又“进 化”的现象，不仅表明微卫星具有作为遗传标记的独特特性，同时也从侧面反映 了生物多样性“”1 。本研究就是利用微卫星的这种特性进行普氏原羚遗传多样性研 究以及种群分析，不仅达到了研究的目的，而且进一步证实了微卫星的保守性和 多态性。 目前在国内外没有提出微卫星选择的统一标准，一般都是取决于等位基因数 目多少的原则。b a r k e r ”1 在全球家畜品种间遗传距离测定草案的建议中提出的微 卫星选择标准是：每个微卫星位点的等位基因数目应不少于4 个，以便使每个位 点的有效等位基因数大于2 ，从而减少遗传距离估计的标准误差。从本章研究中， 我们可以看出，1 2 个微卫星位点在哈尔盖地区种群中检测到9 4 个等位基因，平 均每个位点达到7 8 3 3 个等位基因，有效等位基因数是6 5 1 0 5 。这1 2 个微卫星 位点在两个种群中检测出来的等位基因数均大于4 ，有效等位基因数也均大于2 。 因此利用这1 2 个微卫星位点对哈尔盖地区普氏原羚进行种群分析、比较性遗传 研究是很合适的。 3 2 微卫星与个体识别 利用微卫星位点进行个体识别时，由于微卫星两端的侧冀序列是保守的单拷 贝序列，因此我们根据微卫星位点基因型串联编码，设计以所有的多态性微卫星 位点为一组，以个体各位点为基因串联编码，经比较，微卫星位点完全相同的情 况下，就认定为一个个体或同卵双生，所有位点中有一个位点不同则为不同个体 “。有关文献表明。“：t l ( 基因杂合度) 大于或等于0 7 的遗传标记为高鉴别遗 传体系。本研究中所利用的1 2 对微卫星引物的基因杂合度基本都在0 7 以上。 因此，我们可以利用这1 2 对微卫星引物组成的高鉴别遗传体系对普氏原羚小种 群进行个体识别、种群数量的估计、种群动态的研究，以达到更好地保护普氏原 羚的目的。 3 3 微卫星与遗传多样性 遗传杂合度又称基因杂合度，一般认为是衡量群体遗传多样性的一个最适参 数，杂合度的高低反映了各种群的纯合度由小到大的变化。位点多态信息含量是 位点等位基因频率和数目的变化函数，反映着位点变异程度的高低。同时多态信 息含量也是指在某一家系中可以利用位点多态性作为遗传标记进行基因连锁分 析的概率。有效等位基因数，可以作为群体遗传变异的一个测度，反映位点等位 基因间的相互影响，说明群体的变异情况。从本章研究中可以发现，位点的有效 等位基因数、基因杂合度和多态信息含量呈一定的正相关性。也就是说，位点的 有效等位基因数越多，基因杂合度和多态信息含量也随着增加。而基因杂合度与 多态信息含量则呈现完全正相关性。 微卫星相对于传统的血型、蛋白质多态标记具有更高的多态性，由此计算的 结果应该较高。如杨澜。3 1 研究中国5 个地方山羊品种的遗传多样性时得到各个品 种的基因杂合度均大于0 7 7 ，其相应的多态信息含量均大于o 7 4 。而哈尔盖的 普氏原羚的平均基因杂合度介于0 7 6 2 6 0 8 9 3 4 之阀，平均为0 8 2 7 5 ；多态信 息含量基本都在0 7 1 8 0 0 8 8 4 1 之间，平均为0 8 0 2 6 。说明哈尔盖地区的普氏 原羚种群内部具有较高的杂合度和较高的多态信息含量。由此可知该研究种群中 具有丰富的遗传多样性。 4 结论 1 本次实验成功的从绵羊、非洲糜羚和牛有多态性的4 0 对微卫星引物筛选 出1 2 对在普氏原羚也有多态性的引物，并摸索出成功用于微卫星研究的p c r 扩 增的条件。 2 首次应用1 2 个微卫星位点在哈尔盖地区普氏原羚的4 3 个粪便样品中共 检测到9 4 个等位基因，平均7 8 3 3 个。对4 3 个粪便样品进行个体识别，认定这 4 3 个样品中具有3 9 个不重复个体。检测到韵平均有效等位基因数介于4 3 8 6 7 - - 9 3 8 5 8 ；基因杂合度介于0 7 6 2 6 o 8 9 3 4 之间；多态信息含量为0 8 0 2 6 0 8 8 4 1 ；许多位点上都是非零f 值( f 0 ) 。 第四章应用微卫星d n a 标记进行普氏原羚 六个种群的保护遗传学分析 种群间和种群内的遗传变异的分布信息对于确定濒危物种进化显著单元 ( e v o l u t i o ns i g n i f i c a n to n i t s ，e s u ) 和管理单元( m a n a g e m e n tu n i t s ，m u s ) 非 常重要，这方面的信息可以指导保护工作朝向遗传独特种群9 。现在，普氏原羚 在青海湖湖畔仅存小的孤立种群。而且，仅鸟岛种群在鸟岛国家自然保护区中得 到了保护。为了拯救普氏原羚，蒋志刚、陈立伟、魏万红、李迪强、刘丙万、王 秀磊等“”1 对昔氏原羚的保护现状、致危因子、分布、生境、种群生存力和社 群行为等进行了多年研究。然而，对普氏原羚遗传现状方面的研究工作开展较少 仅雷润华5 ”用线粒体标记对鸟岛、元者、尕海和湖东一克图种群间遗传差异进行 了研究，洪艳云6 ”研究了湖东种群、易湘蓉嘲1 研究了鸟岛种群内遗传信息。 为了确立保护遗传单元和了解哈尔盖地区、青海湖火车站、天峻县库尔玛乡、 元者、鸟岛、湖东种群间和种群内目前的遗传差异、基因流等。本文选用了1 2 对微卫星引物对普氏原羚六个亚种群进行分子生物学研究。 1 材料 1 1 供试样品 本次实验共采集了普氏原羚粪便1 2 8 份，其中2 1 份来自于天峻、2 l 份来自 于鸟岛、4 3 份来自于哈尔盖、1 3 份来自于青海湖火车站、1 4 份来自于元者、1 6 份来自于湖东。 1 2 主要试剂和仪器( 同上章) 1 3 方法( 同上章) 2 结果与分析 采用p o p g e n e 3 2 版软件以及s a s 8 5 版对青海湖六个地区的普氏原羚种群进 行保护遗传学分析，哈尔盖种群的数据来源于上章节。 2 。1 群体内的遗传结构分析 群体内各位点等位基因数和等位基因频率是各群体遗传结构的反映，统计每 个群体的检测到的等位基因数、有效等位基因数和各等位基因的基因频率( 见表 1 0 表1 2 ) 。 表1 01 2 个微卫星位点在6 个不同群体中的等位基因频率 坠! ! ! ! ! 垒! 堡! ! 堑四! ! ! ! i 壁垫! 坠! e ! 艘! ! ! ! ! ! ! ! ! 些! ! ! 坐! ! 翌! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 位点天峻鸟岛哈尔盖青海湖火车站元者湖东天峻 续上表 s m h c c m n $ 6 4 m n s 6 1 0 ”a e l 3 3 b m 0 6 6 1 9 40 2 8 5 70 0 0 0 00 1 9 7 70 3 0 7 70 1 4 2 90 1 2 5 0 1 8 20 1 4 2 90 0 7 1 40 1 1 6 3 0 1 5 3 80 1 0 7 10 1 2 5 0 2 1 1 0 0 0 0 00 3 0 9 50 ，1 2 7 90 ，1 9 2 30 1 0 7 1 0 1 2 5 0 2 0 50 0 4 7 60 0 9 5 2 0 0 2 3 30 0 0 0 00 0 3 5 70 0 3 1 2 2 0 10 0 0 0 00 0 0 0 00 0 9 3 00 1 9 2 30 1 0 7 10 2 1 8 8 1 9 70 0 0 0 00 3 5 7 10 1 8 6 0 0 1 5 3 80 2 1 4 30 2 1 8 8 1 9 3o 1 6 5 7o 0 0 0 00 0 5 8 10 1 5 3 80 1 0 7 1 o 0 9 3 8 1 8 90 0 4 7 60 0 4 7 6 0 0 5 8 10 0 0 0 00 1 0 7 10 0 6 2 5 1 8 50 0 4 7 60 0 4 7 600 3 4 90 0 0 0 00 0 7 1 4 0 0 0 0 0 1 8 10 5 0 0 00 0 7 1 40 2 6 7 4 0 2 6 9 2o 1 7 8 60 1 2 5 0 1 7 70 t 9 0 5 0 0 7 1 40 1 5 1 20 0 3 8 50 0 7 1 40 1 2 5 0 2 0 90 0 9 5 20 1 4 2 90 0 9 3 00 0 3 8 5 0 1 0 7 10 0 9 3 8 2 0 10 ，1 1 9 00 1 9 0 5 0 2 0 9 30 2 3 0 80 1 4 2 90 2 1 8 8 1 9 70 0 0 0 00 3 3 3 30 1 7 4 40 1 1 5 4 0 1 4 2 90 1 5 6 2 1 9 10 1 1 9 00 2 6 1 9 0 1 6 2 80 1 9 2 30 2 1 4 30 1 8 7 5 1 8 30 ，2 3 8 10 0 0 0 00 0 6 9 80 2 6 9 20 0 7 1 4 0 0 9 3 8 1 7 70 1 4 2 90 0 7 1 4 0 1 5 1 20 1 1 5 40 1 4 2 90 1 8 7 5 1 7 3 0 2 8 5 7 0 0 0 0 00 1 3 9 50 1 1 5 4 0 1 7 8 60 0 6 2 5 2 7 50 0 2 3 80 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 0 0 00 1 0 7 l0 0 0 0 0 2 7 10 1 6 6 7 0 2 6 1 90 2 6 7 40 4 2 3 10 1 7 8 60 2 1 8 8 2 6 70 1 4 2 90 1 1 9 00 1 3 9 50 0 3 8 5 0 1 0 7 10 1 2 5 0 2 6 30 0 0 0 00 2 3 8 10 1 2 7 9 0 1 5 3 90 1 4 2 90 1 5 6 2 2 5 90 0 7 1 4 0 2 6 1 90 1 6 2 80 2 3 0 8 0 1 0 7 10 1 5 6 2 2 5 50 2 1 4 30 0 0 0 00 1 3 9 5 0 0 3 8 50 1 7 8 6 0 1 5 6 2 2 5 10 3 8 1 00 1 1 9 0 0 1 6 2 80 0 3 8 5 0 1 7 8 60 1 8 7 5 1 7 3 0 0 0 0 00 0 0 0 0 0 0 6 9 8 0 0 0 0 00 o 0 0 00 0 0 0 0 1 7 1 0 0 0 0 00 1 1 9 00 0 0 0 0 0 ，0 7 6 9 0 0 7 1 40 1 5 6 2 1 6 70 0 0 0 0 0 2 3 8 1 0 0 8 1 4 0 1 1 5 40 1 4 2 9 0 0 9 3 8 1 6 1 0 0 0 0 00 2 1 4 30 0 6 9 8 0 2 6 9 20 1 4 2 90 1 5 6 2 1 5 7 0 3 3 3 30 ，0 4 7 60 2 0 9 3 0 。1 5 3 80 。1 7 8 60 1 8 7 5 1 4 9 0 1 4 2 90 2 3 8 10 1 1 6 3 0 0 0 0 00 1 4 2 9 0 0 0 0 0 1 5 30 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 5 40 1 0 7 10 0 0 0 0 1 4 3 0 1 4 2 90 1 4 2 90 1 7 4 4 0 1 1 5 4 0 0 7 1 40 0 9 3 8 1 3 90 2 1 4 3 0 0 0 0 f ) 0 ，1 5 1 2 0 0 7 6 9o 0 7 1 4 0 1 5 6 2 1 3 3 0 1 6 6 70 0 0 0 00 1 2 7 9 0 0 7 6 9 0 0 7 1 40 1 5 6 2 1 5 4 0 1 1