（生物化学与分子生物学专业论文）利用噬菌体展示技术筛选与binol相结合的抗体.pdf

摘要 摘要 本课题主要针对于非自然金属酶的发展，建立一个便宜、简便的方法来生产高产量 的识别( r ) 一( s ) 一b i n o l 单链克隆抗体。 本实验利用新方法，以噬菌体展示技术把过渡金属作为小抗体片段，从而产生一种 新的人工合成的具有高效率、高稳定性和选择性的水溶性金属酶。 本实验把编码( r ) 一( s ) 一b i n o l 蛋白基因亚克隆到大肠杆菌表达系统中，以期获得高 效表达。通过噬菌体展示技术筛选出能结合( r ) 一( s ) - b i n o l 蛋白抗原的1 1 个抗体片段， 并对其进行测序分析。将c d r 区域和基因片断与数据库v b a s e 进行比较后得到了一种抗 体片段与抗原结合相互作用的三维模型。 通常在大肠杆菌中表达为融合蛋白，所以本实验通过选择不同的菌株、温度、融合 蛋白和重折叠策略实验，解决在大肠杆菌中的可溶性高效表达，使所有的抗体片段都作 为包含体表达。通过与细菌起始因子i f 2 的区域i 的融合导致抗体片段的高度表达，并 且能够获得与抗原高度亲和性的蛋白。 关键词：噬菌体文库展示技术；抗体库；单链抗体；联苯酚；配位体选择 ab s t r a c t a b s t r a c t t h i sp r o j e c ti sd e a l i n gw i t ht h ed e v e l o p m e n to ft h en o n n a t u r a lm e t a l l o e n z y m e s ，a n dm y w o r kw a sf o c u s e do ne s t a b l i s h i n ga l li n e x p e n s i v ea n de a s ym e t h o df o rh i g hl e v e lp r o d u c t i o no f s c f v ss e l e c t e da g a i n s t ( r ) - ( s ) 一b i n o l t h en e w a p p r o a c hh a sb e e np r o p o s e di nt h i se x p e r i m e n t ，p h a g ed i s p l a yt e c h n i q u ei s e x p l o i t e dt oi d e n t i f ys m a l la n t i b o d yf r a g m e n tc a p a b l eo fe n c a p s u l a t i n gt r a n s i t i o nm e t a l c o m p l e xi na ne n a n t i o s e l e c t i v ew a y ，t h e r e b yc r e a t i n gn e w a r t i f i c i a lw a t e rs o l u b l e m e t a l l o e n z y m e sw i t hh i g h e re f f i c i e n c y , s t a b i l i t ya n ds e l e c t i v i t y 。 i nt h i se x p e r i m e n tt h eg e n eo fe n c o d e d ( r ) 一( s ) - b i n o li sc l o n e di n t ot h ee c o l is y s t e m t og e th i g he f f i c i e n te x p r e s s i o n i nt h ep r e s e n tw o r k ，a n t i b o d i e sh a v eb e e ns e l e c t e da g a i n s t ( r ) 一( s ) 一b i n o l e l e v e ns e l e c t e da n t i b o d yf r a g m e n t sw e r es e q u e n c e d a n da l i g n e d c d r r e g i o n sw e r ec o m p a r e da n dt h eg e n es e g m e n t sw e r ei d e n t i f i e db yc o m p a r i s o nw i t ht h e d a t a b a s e ，vb a s e f i n a l l y , h o m o l o g ym o d e l l i n go f o n eo ft h ea n t i b o d yf r a g m e n t sh a sg i v e n a ni n s i g h ti n t ot h ei n t e r a c t i o n si n v o l v e di nt h eb i n d i n go ft h ea n t i g e n d i f f e r e n ts t r a t e g i e se m p l o y e dt om a n a g ee x p r e s s i o np r o b l e m si ng e n e r a le x p r e s s i o no f r e c o m b in a n tp r o t e i n si ne c o l iw e r et r i e do u ti na na t t e m p tt ow o r ko u tas o l u t i o nf o rh i g h l e v e lp r o d u c t i o no fa c t i v es c f v s v a r i o u sg r o w t ht e m p e r a t u r e s ，b a c t e r i a ls t r a i n s ，f u s i o n p a r t n e r sa n dr e f o l d i n gs t r a t e g i e sh a v eb e e nt e s t e d i na l le x p r e s s i o ns t r a t e g i e st h ea n t i b o d y f r a g m e n tw e r ep r e d o m i n a n t l ye x p r e s s e da si n c l u s i o nb o d i e s k e y w o r d s ：p h a g ed i s p l a y ；a n t i b o d yl i b r a r y ；s c f v ：b i n o l ；e n a n t i o s e l e c t i v 河北大学 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 北大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同 志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 作者签名： 日期：迎6 年厶月厶日 学位论文使用授权声明 本人完全了解河北大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅。学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年月曰解密后适用本授权声明。 2 、不保密囤。 ( 请在以上相应方格内打“”) 作者签名： 导师签名： 曰期：皇丝五年厶月l 日 日期：2 2 皇年上月上日 第1 苹前育 第1 章前言 1 1 人工金属酶 催化是现代科学技术中的一门重要技术，在现代化学工业中的许多部门起着重要作 用1 ，无论从制造业的原料、新能源的产生、环境保护，还是到医药安全等方面都有很 大影响。 近年来纯和配位体化合物市场广泛兴起，例如医药品。用于制备纯合配位体化合物 往往是利用磷配位体的过渡金属催化，但是这种催化方式有很多缺点：如水溶性差、复 合物稳定性弱和需要高催化剂的载体乜1 。近年来，酶的催化作用作为一种用来代替传统 不对称催化剂在生产实践中起到了重要作用，利用酶催化的益处是高催化效率、高定向 性、配位体高度纯化和高产量，此外，反应能在比较温和的环境中发生口3 。 表1 ：金属催化和酶供化正反对比 但是应用于人工化学合成工业时，酶催化也有很多缺点，如底物范围小、自然选择 的反应少。为了增加酶可以催化的自然反应可以进行酶的修饰嵋一1 ，通常利用基因编码 酶的基因突变的筛选和定位作用来达到h 刮。 利用蛋白质形成保护金属配位体复合物的保护罩来保护金属中心，可以产生一种 更高效率和更高稳定性的人工金属酶。根据所形成空间的大小和蛋白质外壳形状与大小 可以获得高选择性底物和在区域控制范围内的反映产物n 0 1 。 1 2 配位体选择抗体 本课题研究b i n a p ( 2 ，2 一b i s ( d i p h e n y l p h o s p h i n o ) 一1 ，l 一b i n a p h t h a l e n e ) 最早 于1 9 8 0 年由n o y o r i 合成1 ，是许多不对称金属催化反应中的一种有效的轴手性配位体， i 北人学理学硕1 “学位沧文 其中包括不刘称氢化作用“。但是它有个重要缺点是制备一种纯和配位体形式催化 所需成本较高。 抗体是利咱e 够特片性结合的小分千，大到蛋白质抗原，, j , g u 有机分子“”，这使 得卅以确定一种抗体或者抗体片断都只识别一利- b 】n a p 的配位体形式这可以使得利用 便直的外消旋混合物中种以配位体形式1 ，蛋白质形成溶液( 图1 ) 。另外还可以抗体片 断作为保护外壳，使得金属酶复合物史加稳定从n j 增强它的催化活性。这可以降低催化 成本或者少量的催化载体。 s o l u b l e n 呐0 d r 【r ) 8 i n a p p l e x 凹ib i n a p 的硝种小川形北坷抗体的讲刖，一刊- 乜n 抗仲彤成的仪护单自，可浒于水 * 种币溶十水从州6 e 啦；离州种十川的酣证体 由于b i n a p 的利用非常复杂，这里我们用它的模拟物b i n o l 。b i n o l 与b i n a p 结构非 常相似但是更加容易合成和修饰，具有更高的稳定性，且价格便宜“”( w 2 ) 。 对于b i n o l 的抗体利用噬苗体文库技术进行选择，在选择之前必须要固定化b i n o i , ， 固定是通过修饰一半1 1 勺亲水键与生物素连接，同时还具有较强的结合型，它能够结合四 个分子的锰霉索另外它还与聚乙烯塑料表面有高度的结合性。下图中说明了固定原理a ) 。 ( “1 等 h h m ) ( 0 0 m o 0 ) ( 第1 章前言 ( r ) 一b i n o l 的化学结构。b i n o l 足b i n a p 的模拟物： b ：i i l i l 定b i n o l 衍生物，为_ r 史好的模拟b i n a p ，b i n o l 的一个羟皋破取代1 。 1 3 噬菌体展示 近年来，噬菌体展示技术作为选择具有特殊功能或者亲和性的高聚肽或蛋白质的一 种技术，这个技术最早由g e o r g es m i t h 提出n 刖，用于丝状噬菌体蛋白质或多肽在融合噬 菌体表面表达，通常可以建立一个包含十亿或更多高聚肽的多肽文库，用来选择希望结 合或有特殊功能的蛋白质或多肽n9 2 叭。 1 3 1 丝状噬菌体 丝状噬菌体是由个大的噬菌体家族组成的可以利用菌毛作为接受子感染许多葛 兰氏阴性细菌，单链环状d n a 山杆状衣壳蛋白质包围。据有数千单个主要衣壳蛋白覆盖 在粒子的长端，有少量次要蛋白覆盖其尾部。与其他细菌不同，丝状噬菌体不融合或者 杀死宿主细胞瞳。 1 3 2m13 噬菌体 m 1 3 噬菌体包含6 4 k b 环状单链d n a ，基闪组标码1 1 种不同的蛋白质，有3 种蛋白质是 d n a 合成所必需的( p i i ，p v 和p x ) ，另外3 种是噬菌体组装和运输所必需的( p i ，p l v 和p x i ) ，还有5 种蛋白质形成噬菌体的辛t 状外壳环绕着基因组心“2 副。主要的衣壳蛋白 p v i i i 覆盖在粒子长端( 在野生型病毒中大约2 7 0 0 拷贝) ，次要衣壳蛋白p i i i 和p v i 覆 盖在尾部，只有3 - 5 拷贝；p v i i 和p l x 在另一端的尾部也是3 - 5 拷贝心棚( 图3 ) 。 0 - - - p i l l4 2 6 0 9u 8 。乏ap l x 3 6 8 1d a op v i1 2 3 5 0d a , r a m i ep v l i 3 6 3 0d 囊 一p v l h5 2 4 0 d a = = j s d n a6 4 0 8 d a 图3m 1 3 噬菌体：野生型菌株长约9 3 01 1 1 1 1 ，直径6 5n m 所有衣壳蛋白都可以作为噬菌体展示的融合部分，但是4 0 6 个氨基酸的p i i i 蛋白在 噬菌体展示中最常用 2 6 , 2 7 o 这个蛋白质由3 个区域n 1 ，o n 2 和c t 组成( 图4 a ) ，感染大 肠杆菌宿主( 图4 b ) ，c 木端，c t ，和瞄定因子p i i i 是病毒组装所必需的，n 2 吸附因子吸附f 菌毛，而n l 与细菌感受器t 0 1 a 相互作用使得噬菌体的s s d n a i l 孵t j 进入宿主细胞口 。 2 。百世i j t 臻，8 ，谢 7 7 j ”。“。最、 二= 二。二i = 3 吲d p i i i 区域的站构古打3 十部分n l 、n 2 盯坎窗台l l 氰醴的连接键所分开( g 1 y l 和o l y 2 ) ；b 感染大 肠杆自：堪染，f 始足mj - p 1 1 i 的n 2 ，f 茁毛的相互作用，释放n i ，n 2 相互忭厢，井e 与苗毛的相互作用使褂啦 苗体一j 细胞膜靠近n i 结合细葡感墅r o l a 使榭目体牿嗣自l 进 宿土原生质体删。 进入宿主细胞后，噬菌体d n a 成为舣链形式，作为模板表达所有的噬菌体蛋白质和 复制新的单链d n a 分于，然后组装成新的噬菌体粒子。新的噬菌体粒子在不溶解宿主细 胞的状态下释放出米“。 133 噬菌体展示系统 将外援d n a 导入噬菌体基因组的非主要区域不会影响d n a 的复制或者细菌的装配，这 个原理使得可以利用噬菌体作为克隆载体并且不同的噬菌体展示技术发展起来。 _ 种策略足蛋白质的基凶直接克隆到病毒基因组作为一种衣壳蛋白的融合部分在 噬菌体表胜示山= | 乏这个结果是形成多价展示，每一个表壳蛋白都展示了融合部分( 图 5 a ) 。 鬻器冬 髯 。， hl ，r 1 1 “ h 1 。 1 。 p 】n _ 十1 i”【l ao - - io l l v 。i q p 1 日i i i l “ l 目5 撕口质们t 萌”表叫表逃n ? 站千侧了中，收先出n p l l l 作为融台虽自 足多价展示：班白质基吲h 接克隆 到嘴苗体摧组中f 1 7 ，1 0 1 1 1 的融台雕 表逃 u 足h o s a i c m dc ；# q o l i i 基b i 的编鹤，一种作为u o s a l c & 示，男 4 淞憾 ，、 第l 章前言 一种作为融台班白质腱示：c 是单价展示：盘凸质的堆n 兜隆到帑也体中，利用帮助嘴自体进行台作转g 到宿主细胞 ，c 中帮助啦趋件摊供所需的班口质。 如果大量多肽展示出来会导致感染性降低，但是野生型衣壳蛋白的增加可以解决 这个问题。为了保持野生型衣壳蛋白的翻译。另外的衣壳蛋白拷贝作为融合蛋白可以滤 过性病毒基因无融合为一体。这使得噬菌体的衣壳蛋白一部分是野生型表达，另一部分 作为外源基因的融合蛋白表达( 图5 b ) 。 另外，基因可以克隆入噬菌体粒子克隆导体，例如含有大肠杆菌起始复制子和噬菌 体起始复制子，用于融合蛋白的衣壳基因抗生素基因和表达必需元件构成的小质粒。通 常是 a c 表达系统。1 “( 图6 ) 。为了得到可感染的噬菌体粒子，噬菌体粒子必须能和 帮助抗菌素共同被感染，例如m 1 3 k 0 7 和v c s m l 3 。 目6d i i e n 2 小n 目 噬菌体系统另外的特征是噬菌体粒子在细菌中既可溶解表达重组蛋白，也可表达 融合蛋白质，园此噬菌体粒子的组成可以展示外源蛋白，这是因为琥珀终止密码予( t a g 序y u ) 位于外源基因和衣壳基因之间，在大肠杆菌非抑制菌株中，例如h b 2 1 5 1 菌株t g 序列作为终止信号，因此决定重组蛋白质的可溶解表达，可以分泌到细胞周质，相反， 大肠杆菌菌株抑制菌株t g i ，t a g 密码子被编码成谷氨酸，因此融合蛋白被合成酬。 1 3 4 噬菌体展示的抗体片断 i34i 免疫球蛋白的结构 免疫球蛋白可以分为i g c ，i g m ，l e a ，i g d ；和i g e 5 种。i g c 分子是人类血清中含量最高的 一种免疫球蛋白，包含两个相同的重链和两个相同的轻链，并且通过二硫键和非共价键 结合m 1 ( 图7 ) 。 卜 二， ， uh 幽7a 为i g g 口勺结构“盎幽z 古冉# m 个拷蚰的阿神小同肚链，蓐链和轻链，轻链分为州个k ( 日空区和保守i x ) ， & 蕾链台有一个w 蹙匹( v 一) 和毒十保守区( g i g 2 和g 3 ) 。b 芷每个町坐m 台有3 个蕊业可变区称为c d r s ，是i 蚰 的抗原缩台位点 每一个重链和轻链分别包含4 个区域( 一个可变区v h ，3 个恒定区c h i 、c h 2 a n d c h 3 ) 和两个区域( 一个可变区v l ，一个恒定区c l ) 构成，名为免疫球蛋白折叠。两个d s h e e t s 折叠通过二硫键结合，构成这些免疫球蛋白的折叠o ”( 图1 1 ) 。 可变区的残基分为高度可变区称为c o m p l e m e n t a r i t yd e t e r m i n i n gr e g i o n s ( c d r s ) 或者非高度可变区称为f r a m e w o r kr e g i o n s ( f r ) t h ec d r s ( c d r i i i l 、c d r r h l 和c d r 3 h l ) 的v h 和v l 形成3 个能够定性抗原结合位点的环”3 。 在免疫系统中，抗体绵合位置的各种序列并没有直接的编码，重链可变区由v h - 片断、d 一片断和j 片断3 部分组成，c d r i 和c d r 2 是由v h _ 片断所编码，而c d r 3 则是由d 一 片断和j 一片断所产生，前两个c d r s 时被限制保守的，而c d r 3 的氏度和序列都是可变的“ 】 轻链可变区是山vx 和j 或vk 和jk 组成，包括3 1 个功能v 区、4 个功能j 区、 4 0 个功能v k 区和5 个功能区jk 。前两个c d r s 和c d r 3 的一部分是由vx 和vk 编码的，而 c d r 3 的剩余部分是出j 和j - k 编码的m ”。 基因片段的重组是由免疫系统b 淋巴细胞在其表而展示出来抗体，可以通过噬菌体 展示技术进行模拟忡1 。 13 42 抗体形式 噬菌体展示系统中有很多不同的抗体形式产生。a b 包括两个部分有二硫键问接这 两个部分，比较小的h 也由这两部分组成。通常这个分子不稳定，因为在这两条链之间 缺乏共价键或二硫键使之趋于分离。为了避免这个过程，一种称之为单克隆抗体s c f v 的 重组蛋白质产生了，这使得单克隆抗体在噬菌体展示技术更多的应用于抗体呻川 受 第1 章前言 1 3 4 3 抗体文库 一个噬菌体展示抗体文库是一个不同种类噬菌体克隆展示不同的抗体混合物。依照 不同抗体文库的种类，分别由1 0 6 1 0 11 中不同抗体展示出来n 引。目前，许多不同抗体文 库的产生，从免疫抗体文库到非免疫抗体文库甚至人工抗体文库产生“h 3 1 。 从噬菌体抗体文库中筛选：要获得大的噬菌体文库才能从中筛选到所需要的分子， 通常所用的过程称之为淘洗( b i o p a n n i n g ) 。在这个过程中，噬菌体文库暴露于固定化 抗原中，具有亲和作用的抗体被留下，而没有结合能力的粒子被沈脱下来，随后，结合 的粒子也被洗脱下来，并且经过大肠杆菌的扩增作用后进行下一轮的淘沈“卜删，下图是 淘洗过程中的总结( 图8 ) 。 i i 图8 淘洗过程：噬菌休文库拍：抗原表面暴兹能够捕萼大抗菌素粒予腱，j ；与抗原有柬和作用的抗体j ；断，没有结合的粒 予被洗脱下来，通过洗涤在另一轮筛选开始之前，经过火肠杆菌的扩增作用后进行下轮的淘洗，经过足够的筛选 循环，具自对抗原特殊抗性的噬菌体粒了最后分离。 一个成功的筛选过程表明最初的文库被缩减到了一个亚文库，使与特异性抗原有亲 和性的噬菌体抗体展示粒子富集起来。理想过程中，只需要一轮筛选。但是由于噬菌体 非特定性结合限制了每轮中富集的实现，因此，通常要经过2 4 轮的筛选才能获得咖1 。 一旦合适的抗原结合克隆被选择到，其性质山简单的序列所决定，结合性可以用e l i s a 技术来测定。最终，基因编码抗体片断可以亚克隆到一个合适的表达系统中用于襄达和 分离。 1 4 单克隆抗体的表达 单克隆抗体片断s c f v 是山抗原结合区通过间接键所连接，在表2 中提到了各种不同 s c f v 生产系统的优点和不足。 7 河北人学理学硕十学何论文 表2s c f v 表达系统 表达系统e a s eo fu p s c a li n g经济效应 m o l e c u l a r c l o n i n g ， 女口细胞啾， + + - + 昆虫细胞m 侧 + + + 植物细胞嘲前， + + + + + 酵母细胞s 。】 + + + + + + + 细菌【6 0 】 + + +十+ + + + 哺乳动物的细胞机制能够提供证确的免疫球蛋白的折叠然，但这个系统用于大量生 产过于昂贵。植物细胞在表中所示的作为人量生产抗体片段的表达系统有很多优点，例 如比较轻松并且成本较低，也不足之处，即植物细胞在表达和得到蛋白质以前的生长周 期很长。 昆虫作为一种比较高度的真核系统能够正确的折叠蛋白质，但是其缺点是高成本和 在得到重组蛋白d 订持续时间长。 酵母细胞的特征是微生物和真核细胞的联合体，也可适用于单克隆抗体的表达，比 较容易和便宜可以生长和为了正确折叠单克隆抗体的二硫键哺引。 1 4 1 重组蛋白在大肠杆菌中的表达 重组蛋白质表达中最常用的宿主细胞是革兰氏阴性大肠杆菌，因为它便宜，高密度 培养，培养既要求简单，又具有良好的遗传学性质，兼容的遗传工具，可用的突变异种 陆引，但是细菌系统还有潜在的缺点，如质粒在培养过程中易丢失，不同表达蛋白对宿 主的毒性，不同蛋白质的功能降低，蛋白质功能的丧失可能是由于大分子在细胞质过度 拥挤或者在表达工程中的伴侣量不足导致的折叠效率低下陋钆吲。导致大量降解得没有折 叠的蛋白质堆积，我们称之为包含体表达i n c l u s i o nb o d i e s 嘟s t 。 r 在图呻总结了很多种方法在太肠杆菌细胞的可溶解重组蛋白质的有效表达没有一 个统一的方法。因此，所选用的方法必须适用于个别蛋白质自身的性质。 ? 智= 怒翟怨：“ o、 嵩篙：= 冀”。i 黑“”。“m 1 5 p “l “a 冀? “”“”“”“ ，胡。，。毽、一。一一。 甏彩弋! 篓鬻募。 圈9 不同蛋白质的“人瞄杆茁巾的重自l 表让常常导数乜青仆埘，许多* 咧的策略可咀用米驻得可杵性虽白质， 包音体既可以通过韭形系新折叠也以通过修饰沫改变儿日的生白质或者岱自质的衰逃情况。 1 42 在大肠杆菌中表达单克隆抗体 单克隆抗体片断在大肠朴菌中表达，常因太肠杆菌的细胞质环境的减少引起形成包 含体不溶解，没有活性的抗件片断，只有单克隆抗体本质上报稳定的才能在原生质体中 虽然丢失了二硫键依然能成为有活性的形式嘲。 臻 毒哆 ，亓】，i e 人7 ：i 翟。7 ：7 叨 ? 7 ：f 市论文 幽1 0 免疫球缬【，j 的抗体j i 断町变区的拓扑图 抗体片断作为包含体表达，表达效率很高，与整体蛋白量相比可以高达3 0 - 5 0 口们， 重折叠策略能够使得抗体片断从包含体中重新恢复，但是恢复水平很低。这是因为在折 叠期间的蛋白质的大量聚集，也可通过改进折叠过程使重折叠作为一种策略来获得有活 性的s c f v m 3 1 4 3 可溶解表达 通常，单克隆抗体片段可溶性表达，抗体片断在细胞外周胞质分泌，并且二硫键也 在这里产生。但是大量的功能单克隆抗体产量一般很低，不适合于大量生产口。 有一些报告中阐述了一些可以从原生质体中大量可溶性单克隆抗体表达的方法。有 很多不同的菌株可以利用，f f , l 女h b i 2 1 ( d e 3 ) p l y s s 和o r i g a m i t mb 2 吖引，或者是抗体片 断与不同的融合片断融合，f f i 女h nu t i1i z a t i o ns u b s t a n c ep r o t e i na ( n u s a ) 、m a l t o s e b i n d i n gp r o t e i n ( m b p ) 不l l d s b c 口 7 7 3 。这些策略曾用于或者一些抗体片断也适用于所有的 单克隆抗体片段的可溶。h i 表达。单克降抗体片断具有独特的第一序列，所以产，七不同的 表达，一些可溶性表达，另外的可能不可溶表达，所以对于任何一种单克隆抗体的表达 策略都需要测试。 1 。4 4 合成正确折叠的单克隆抗体片断 一旦最佳的表达重折叠的条件建立，一个高度表达有活性的正确折叠的单克隆抗体 就能够获得。抗体片断折叠的测试是根据抗体抗原的识别性来进行的。 s 曲擅i 把 d e 把c 妯k l 。j d 州 a | i 姆。 8 0 ) ，v ，可以分为7 个v 。家族，v 基因片段分为1 0 个v 。基困家族，重链可变区的序列 片断既属于v 。l 家族定位6 9 组，也属于v 5 家族定位5 1 纽。只有h 1 2 不同，属于u 1 家族 定位4 6 组，所有的轻链可变区都属于v 1 家族，有3 个定位组c ，e 和g 。只有最后一个属 于v , 3 家族，定位1 组。 c d r i 。c d r 2 。c d r 3 。和c d r 3 大部分都是疏水的，c d r i 。和c d r 2 区域是高度亲水的只 有少数的芳香族和疏水氨基酸。然而，氨基酸的分类只能给出一个关于结合作用的线索， 这里氨基酸的三维空间安排是结台作用的一个重要特征。 从c d r 区域的氨基酸分类可以看到c d r i 和c d r 2 的重链、轻链保守区，而在c d r 3 l 中的 高度保守区，在1 1 个序列中有7 个序列的a - a w d d s l 完全相同( a i 、c 2 、e 9 、g 5 、h l l 、 d 9a n dg 3 ) ，而h 1 2c d r 3 。区域序列也可以识别a - a w d d s y f i i 和f 1 2 的c d r & 也是保 守的q s - y d _ s s ，而在长度和序列方面，c d r 3 有更大的变化区，这说明在这个区域中不 同的氨基酸序列也可以识别相同的抗原。 利用三维结构可以清晰看出，结合空问是高度疏水的，只有少数古有极性残基( a s h 3 3 、 a s n 3 6 和g i n 9 1 ) 朝向结合位置，所有的c d ri x 域都参与了结合，除去高度亲水的c d e 。、 芳香族和疏水氨基酸形成了结合空间，主型米源于c d r i a 和c d r 3 区域( c d r l n ：t y r h 3 2 和 3 2 第3 章结果与讨论 t r p h 3 3 ；c d r 3 ：a a h 9 9 和p r o h l o o b ；c d r 3 。：t y r l 9 3 、l e u l 9 5 b 和i l e l 9 7 ) ，只有少数例外， i l e h 5 0 ( c d r 2 | ) 和三个框架残基。 通常参与结合的残基都有高度的保守性，例如t y r h 3 2 、框架残基、t y r l 3 8 、t r p h 4 7 和 a l a t l 9 7 在所有的序列中完全保守，然而对应于这些位置的残基可以被具有相同性质的氨基 酸所取代，即疏水氨基酸或芳香族氨基酸。c d r 3 残基的a l a l l 9 9 和p r o h l o o b 有高度的变化 性，可以解释在c d r 3 。区域有长度和序列的变化，可能引起氨基酸的不同空间排列，因此改 变的氨基酸的位置朝向抗原。 尽管抗体片断的模型给出了一些关于结合b i n o l 相互作用的新观念，却没有得到可以 确切结合抗原相互作用的最终结论。 f “片断在大肠杆菌中表达的溶解性通过w il k i n s o n 和h a r r i s o n 在 b 主主乜；么丛! q 主璺曼堕：q 婪：璺虫! z 计算可以得到火约只有3 ，这说明在表达过程中会引起大量的积 累并且形成包含体，为了增加可溶性表达，构建了一个新的表达方式i f 2 ( i - i i i ) 融合f 1 1 。 在过去的上作畔j 显示细茼起始因子j f 2 与蛋白质的融合后可以增加蛋白质的溶解性( 1 0 到5 0 ) 。经过计算得到，细菌起始因子i f 2 ( i - i i i ) 融合f l l 后也可以增加蛋白质的溶解性 ( 2 1 ) 。i f 2 的n 木段与抗体片段的c 末端连接，所构建的融合蛋白质序列的全长和物理数 据都在附录8 中表示。 先前i f 2 ( i - 1 1 1 ) 作为融合片断表达，虽然在大肠杆菌中增强了其可溶性，但是并没有 测试到结合活性，更小的片断i f 2 ( i ) 在过去的实验中曾经显示了比i f 2 ( i i i i ) 更强的可 溶性，所以i f 2 ( i ) 更有可能表达可溶性有活性的蛋白质。经过w i l k i n s o n 和h a r r i s o n 的 计算，i f 2 ( i ) 的可能溶解性为1 7 。 3 7 。c 培养的菌株表达了大量的抗体融合蛋白质，与所计算的溶解度相同，大部分表 达是以不可溶性蛋白质表达的。在1 5 。c 表达过程中，表达水平明显下降，因为所有的表 达都是进行4 h 之后收状的。1 5 。c 表达更多地得到了可溶性蛋白质，在低温过程中，很多 因子影响形成正确的折叠，在这3 利，菌株中，低温并没有显示出更好的可溶性，表达延长 至2 4 h 后依旧显示了这个结果。 改变i p t g 的浓度通常可以影响表达水平和蛋白质表达的可溶性，较低的i p t g 浓度， 蛋白质合成速度比较慢，但是可能会增强目的蛋白质的溶解性和活性。然而本实验结果中， 改变i p t g 的浓度只看到了表达水平的改变，并没有增强蛋白质的可溶性。在几种所选用 河北人誓：理导：砀! tj 予! f 移论文 的i p t g 浓度中，0 5m mi p t g 看起来最适合表达所用。 在o r i g a m i wb 中表达2 4 h ，得到大量可溶性i f 2 ( i ) 一f 1 l p l i i ( i ) 片断，尤其是在1 5 。c 的表达过程中，但是延长表达时问通常会引起质粒丢失，氨卡青霉素变性，因此使目的蛋 白质不能证确表达，这里利用氨卡青霉素的类似物羧卡青霉素来代替，羧卡青霉素不仅保 留了氨卡青霉素的特性，并且长时间使用不会变性。 表达测试分别在1 5 。c 和3 7 。c 进行，i f 2 ( i ) 一c 2 和i f 2 ( i ) 一e 9 虽然有正确的插入， 但是在其表达过程中融合蛋白没有表达。i f 2 ( i ) 一a 1 分别在1 5 。c 和3 7 。c 表达，并且温 度较低情况下生成的蛋白质可溶解性高。而剩下的集中融合蛋白质，如i f 2 ( i ) - d 9 ， i f 2 ( i ) - f 1 1 和i f 2 ( i ) 一f 1 2 在无论高温还是低温情况下都表达为包含体。结果表明，s c f v 在大肠杆菌中不同的表达情况，即使在这几种s c f v 只有很少的序列变化，只有a 1 以溶解 形式表达。 经过对所得到的抗体片段的表达与活性测定，得到了具有活性的抗体片断a 1 、d 9 、f 1 1 和f 12 ，可用于一种手性配位体的筛选。 第4 章结语 第4 章结果 本实验利用噬菌体展示技术筛选了结合b i n o l 抗原的抗体。噬菌体展示技术用于识别 小抗体片断并能够产生具有更高水溶性，更高活性，更高稳定性和选择性的人工金属酶。 通过对所筛选的抗体片断d n a 序列测定和对比试验以及3 d 模型的模拟，得到了抗体与 b i n o l 抗原结合的特性。 在所筛选的1 1 种s c f v 中随机挑选了。株f 1 1 进行表达试验和蛋白质提取，并且通过 大量的实验，例如利用不同的表达菌株、融合蛋白或不同的生长条件，获得了比较容易、 高效、经济的方法用于大量生产有活性的单克隆抗体。 河北人学理学硕f ：学位论文 参考文献 【l 】r a s m u s s e nb s k u n s t i g ee n z y m e r a k t u e ln a t u r v i d e n s k a b ，2 0 0 3 ，6 ：2 4 2 7 【2 m o r t e n s e nk k ，s k r y d s t r u pt s p e r li n g - p e t e r s e nh u ，e ta 1 d en o v os y n t h e s i so fn o n n a t u r a lm e t a l l o e n z y m e s e m p l o y i n gp h a g ed i s p l a y j p r o j e c td e s c r i p t i o n ，2 0 0 3 ，12 ：2 310 2 315 【3 】m a ys w n e wa p p l i c a t i o n sf o rb i o c a t a l y s t s j c u r ro p i ni nb i o t e c h ，1 9 9 7 ，8 ：1 8 1 - 1 8 6 【4 】s k a n d e rm ，h u m b e r tn ，c o l l o tj ，e ta 1 a r t i f i c i a lm e t a l i o e n z y m e s ：( s t r e p t ) a v i d i n 硒h o s tf o r e n a n t i o s e l e c t i v eh y d r o g e n a t i o nb ya c h i r a lb i o t i n y l a t e dr h o d i u m d i p h o s p h i n ec o m p l e x e s j ja mc h e m s o c ，2 0 0 4 ，2 6 ：1 4 4 11 - 1 4 4 1 8 5 】p e n n i n gtm ，j e zj m e n z y m er e d e s i g n j c h e mr e v , 2 0 0l ，l0l ：3 0 2 7 - 3 0 4 6 【6 】r e e t zm t d i r e c t e d e v o l u t i o no fs e l e c t i v e e n z y m e sa n dh y b r i dc a t a l y s t s j t e t r a h e d r o n ，2 0 0 2 ，5 8 ： 6 5 9 5 6 6 0 2 【7 】r e e t zm t , j a e g e rk e e n a n t i o s e l e c t i v ee n z y m e sf o ro r g a n i cs y n t h e s i sc r e a t e db yd i r e c t e de v o l u t i o n j c h e me u rj ，2 0 0 0 ，6 ( 3 ) ：4 0 7 - 4 1 2 【8 r e e t zm t c o n t r o l l i n gt h ef n a n t i n s e l e c t i v i t yo fe n z y m e sb yd i r e c t e de v o l u t i o n ：p r a c t i c a la n dt h e o r e t i c a l r a m i f i c a t i o n s j p r o cn a t la c a ds c iu s a ，2 0 0 4 ，1 0 l ( 1 6 ) ：5 7 1 6 - 5 7 2 2 【9 】j a e g e rk e ，r e e t zm t d i r e c t e de v o l u t i o no fe n a n t i o s e l e c t i v ee n z y m e sf o ro r g a n i cs y n t h e s i s j c u r to p i n i nc h e mb i o l ，2 0 0 0 ，4 ：6 8 7 3 【10 】r a s m u s s e nb s ，p e d e r s e nj m ，e g e b j e r gj ，e ta 1 e n a n t i o s e l e c t i v ep r o t e i n s s e l e c t i o na n db i n d i n gs t u d i e s o fa n t i b o d i e sw i t haf f i n i t yt o w a r d sh y d r o p h o b i cb i n o ld e r i v a t i v e s j s u b m i t t e dt oe u rjo fc h e m ， 2 0 0 5 1 6 ：2 0 5 21 0 【1l 】m i y a s h i t aa ，t a k a y ah ，s o u c h it , e ta 1 2 ，2 b i s ( d i p h e n y i p h o s p h i n o ) l ，l b i n a p h t h y l ( b i n a p ) - an e w a t r o p i s o m e r i cb i s ( t r i a r y l ) p h o s p h i n e s y n t h e s i s a n di t su s ei nt h e r h ( 1 ) 一c a t a l y z e da s y m m e t r i c h y d r o g e n a t i o no f a - ( a c y l a m i n o ) a c r y l i ca c i d s j t e t r a h e d r o n ，1 9 8 4 ，4 0 ( 8 ) ：1 2 4 5 - 1 2 5 3 【l2 】n o y o r ir ，t a k a y ah b i n a p ：a ne f f i c i e n tc h i r a le l e m e n tf o ra s y m m e t r i cc a t a l y s i s j a c ec h e m r e s ，l9 9 0 ，2 3 ：3 4 5 3 5 0 【1 3 】 f r o s tb m a s y m m e t r i cc a t a l y s i s ：a ne n a b l i n gs c i e n c e j p r o cn a t la c a ds c iu s a ，2 0 0 4 ，1 0 1 ( 1 5 ) ： 5 3 4 8 5 3 5 5 【l4 】l ik ，c h e n gx ，h i ikk a s y m m e t r i cs y n t h e s i so f1 3 - a m i n oa c i da n da m i d ed e r i v a t i v e sb yc a t a l y t i c c o n j u g a t ea d d i t i o no f a r o m a t i ca m i n e s t on a l k e n o y l c a r b a m a t e s 【j 】e u rjo r gc h e m ，2 0 0 4 ，9 5 9 - 9 6 4 【15 】n e v a n e nt k ，s 6 d e r h