（生物化学与分子生物学专业论文）大肠杆菌eftu多蛋白复合体的研究.pdf

摘要 细藏延伸因子t u ( e l o n g a t i o nf a c t o r t u ，e f t u ) 是一种高丰度蛋白，在蛋白质 生物合成的延伸过程中起到了关键性的作用。近年来，e f t u 却是作为一种新发 现的病原相关分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n s ，p a m p s ) 分子而 受到高度重视。作为一个具有高度保守性的菌细胞内的蛋自质，它是如何从细胞 内跨膜运动到细胞辨，并且被宿主细胞特异性地识别进焉弓l 发宿主的免疫反应 的。同时，在此过程中又有哪些膜蛋白起了重要的作用。这无疑具有着相当重要 的生物学意义。 试验首先采用n i - n t a 柱纯化和生物质谱技术，以模式大肠杆菌为试验材 料，发现了内膜蛋白m d t e 、外膜蛋白o m p f 和具有4 个跨膜片段的外膜蛋白 o m p a 与浆蛋白e f h 之间存在着蛋白质相互作用，形成了1 个多蛋白复合体， 被命名为e f - t u 多蛋自复合体。同时采用w e s t e r nb l o t t i n g 、f a r - w e s t e r nb l o t t i n g 和免疫共沉淀等技术，充分证实了上述结论。并提出了该多蛋盘质复合体的分子 结构模型。在此基础上，研究这4 种蛋自在胞浆中的结合情况。结果发现，他们 以e f - t u o m p a ，o m p f o m p a 和m d t e o m p a3 种两两结合的形式存在。 进一步探讨该复合体在细胞分泌性蛋白中的状态，发现该多蛋白质复合体缺少了 m d t e ，而以e f t u 、o m p a 和o m p f 蛋白复合体形式分泌至胞外。最后，对e f t u 多蛋白复合体与入单核臣噬细胞结合情况进行了研究，发现嚣f t u 、o m p a 和 o m p f 仍然以一个多蛋囱复合体的形式和细胞发生了相互作用，其中e 琴风和 o m p a 为直接结合分子。这些结果提示o m p a 和o m p f 在e f - t u 被宿主细胞识 别和引起免疫反应的过程中发挥了重要作用。 上述研究首次发现了e f - t u 多蛋白复合体，揭示了该复合体从胞浆至胞外 的形成和运输特征，阐明了其与动物细胞作用形式。这些研究结果对深入阐明 e f t u 瘸原相关分子模式的生物学功能具有主要作用。 关键词：e f - t u ；多蛋自复合物、o m p a 、o m p f 、m d t e a b s t r a c t e l o n g a t i o nf a c t o rt u ( e f - t u ) ，o n eo ft h em o s ta b u n d a n tp r o t e i n si ne s c h e r i c h i a c o t i , i sag u a n i n en u c l e o t i d e - b i n d i n gp r o t e i nt h a tp l a y sak e yr o l ei np r o t e i ns y n t h e s i s i ti sh i g h l yc o n s e r v e di na l lb a c t e r i aa n dl o c a t e di nc y t o p l a s m 。r e c e n t l y , i th a sb e e n r e p o r t e d a san e wp a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a rp a t t e r n ( p a m p ) m o l e c u l ei n a r a b i d o p s i sp l a n t s h o w e v e r , i n f o r m a t i o nr e g a r d i n g t oh o wt h ep r o t e i nm o v e df r o m c y t o p l a s mt ot h ee n v i r o n m e n ta n dr e c o g n i z e db yh o s tc e l l si sn o ta v a i l a b l e w l 嫩t h eu s eo fn i n t aa n dm a s ss p e c t r u mm e t h o d s ，am u l t i p l ep r o t e i n c o m p l e x ，n a m e de f t um u l t i p l ep r o t e i nc o m p l e x ，w a sd e t e r m i n a t e t h i sc o m p l e x c o n s i s t e do fo m p a ，o m p f ，m d t e ，a n de f - t ui nc e l lm e m b r a n e , r e s p e c t i v e l y , b e i n ga m u l t i - p a s sm e m b r a n ep r o t e i nw i t hf o u ro u tm e m b r a n ed o m a i n s ，a no u t e rm e m b r a n e p r o t e i n ；a ni n n e rm e m b r a n ep r o t e i na n das o l u b l ep r o t e i ni ne s c h e r i c h i ac o l i + f u r t h e r m o r e , t h er e s u l tw a sc o n f i r m e db yw e s t e r nb l o t t i n g , f a r - w e s t e mb l o t t i n ga n d c o - i p ，i n d i c a t i n gt h ef u l ls t r u c t u r eo fe f - t um u l t i p l ep r o t e i nc o m p l e x 。f u r t h e r m o r e ， t h r e ef o r m so f p r o t e i n - p r o t e i ni n t e r a c t i o n s ，e f t u + o m p a ，o m p f o m p a a n d m d t e o m p a , w e r ec h a r a c t e r i z e di nc y t o p l a s r nf o rt h i sm u l t i c o m p o n e n tc o m p l e x i ns e c r e t o m e ，t h i sc o m p l e xi n c l u d e do m p a ，o m p fa n de f - t u ，s u g g e s t i n gt h a tm d t e w a sn o tc o m p a n i e dw i t ht h eo t h e rt h r e ep r o t e i n so u to ft h ec e l l 。i m p o r t a n t l y , t h e e f - t um u l t i p l ep r o t e i nc o m p l e xi ns e c r e t o m ew a st h ec o m p o n e n t sb o u n dw i t hh u m a n m o n o c y t i c m a c r o p h a g ec e l l s ，i nw h i c ho m p aa n de f - t uc o u l dd i r e c t l yi n t e r a c t e d w i t ht h eh o s tc e l l s t h i si n d i c a t e st h a to m p aa n do m p fp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei n r e o r g a n i z a t i o no fe f - t ub yh o s tc e l l sa n d 也出f u r t h e ri m m u n er e s p o n s e s i ns u m m a r y , e f t um u l t i p l ep r o t e i n sc o m p l e xw a sr e p o r t e df o rt h ef i r s tt i m ei n p r e s e n ts t u d y f u r t h e r m o r e , t h ed i v e r s es t r u c t u r e sa n df u n c t i o n so ft h i sc o m p l e x a s s o c i a t e dw i t hi t sl o c a t i o n so fc y t o p l a s m ，c e l lm e m b r a n ea n ds e c r e t i v ep r o t e i n sw e r e c h a r a c t e r i z e d 。o u rf i n d i n g sh i g h l i g h tt h em e c h a n i s mo fe f - t uo u to ft h ec e l l sa n d a r eh e l p f u li na nu n d e r s t a n d i n go fe f t u - p a m p s k e y w o r d s ：e f t u ，m u l t i p l ep r o t e i n sc o m p l e x ，o m p a ，o m p f ，m d t e i i 厦门大学学位论文原创性声明 兹呈交的学位论文，是本人在导师指导下独立完成的研究成果。 本人在论文写作中参考的其他个人或集体的研究成果，均在文中以明 确方式标明。本人依法享有和承担由此论文而产生的权利和责任。 声明人( 签名) ：哲移 扣7 年g 月3 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人完全了解厦门大学有关保留、使用学位论文的规定。厦门大 学有权保留并向国家主管部f 1 或萁指定机构送交论文的纸质版和电 子舨，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学 校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索， 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适 用本规定。 本学位论文属于 1 、保密() ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密( 0 ( 请在以上相应括号内打“4 ”) 作者签名：锄日期：扣7 年g 月弓圈 导师签名：趴设日期：如7 年钼参圈 | 覆门大学矮士学霞论文：大瑟辑蘩e f - t u 多蛋自复合俸的研究 - 1 上_ j l 1 刖青 1 1 革兰氏阴性病原菌的危害性 细菌根据革兰氏染色可以分为革兰氏阴性细菌( c r a m 一) 及革兰氏阳性细菌 ( g r a m + ) 两大类。其中，许多与人类健康和生产相关的重要病原菌都属于革兰氏阴性 细菌，如能弓f 起肠道疾病的大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 及其各类型致病株、诱发伤 瑟感染的条件致病菌钢绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) 、传染病霍乱的病原体 霍乱弧菌( v i b r i oc h o l e r a e ) 和鼠疫的病原体鼠疫杆菌( y e r s i n i a p e s t i s ) ，引发痢疾常 见的志贺氏痢疾杆菌( s h i g d l ad y s e n t e r i a e ) 等。 许多革兰氏阴性菌造成的危害性是巨大的，历史上爆发的许多大规模的全球性 传染病的病原体都是革兰氏阴性菌。例如，引起烈性传染病鼠疫的病原菌鼠疫杆菌 ( y e r s i n i a p e s t i s ) ，其传染性强，病死率高，曾给人类造成极大的危害嘲。历史上曾 有3 次世界性大流行，第1 次在公元6 世纪，首先发生在地中海附近地区，流行几 乎遍及所有国家，持续5 0 年，死亡王亿人翻。第2 次发生于1 4 世纪，蔓延7 整个 欧洲，当时称之为”黑死病”，波及亚亳燃和非洲北部，死亡约4 0 0 0 万人。第3 次大流 行期间，流行于我国东北各省、内蒙古、沿海等地，死亡共达1 0 万人【2 1 。 又如已有1 8 0 多年流行历史的烈性肠道传染病霍乱，是由霍乱弧菌( v i b r i o c h o l e r a e ) 引起的【3 】。自1 8 1 7 年到1 9 2 3 年发生6 次古典型霍乱的大流行，全世界死 亡入数均超过千万。每次大流行都波及我国，第6 次大流行后到1 9 4 9 年，每年均有 流行，仅1 9 3 2 年据称就有2 0 0 0 万人感染，死亡4 0 万入。1 9 6 1 年开始的埃尔托霍乱 第7 次世界大流行，起自印度尼西亚，后波及五大洲的1 0 0 多个国家和地区，历时 3 0 多年仍未得到有效控制，给世界生命和财产造成严重损失。并且，霍乱并没有随 着卫生等生活环境的改善而消失【4 】，它的流行特点是爆发式的，开始在数个不同地点 同时发生，迅速传播流行可累及许多国家并持续多年。1 9 9 2 年霍乱的第8 次世界性 大流行中【5 1 ，0 1 3 9 霍乱弧菌弓l 起的新型霍乱席卷印度和孟加拉国的某些地区，至1 9 9 3 年4 月己报告十万余病人，也已波及包括我国的许多园家和地区。 其它还有由奈瑟氏脑膜炎双球菌( n e i s s e r i am e n i n g i t i d i s ) 7 1 起的流行性脑脊髓 膜炎，例如英国于1 9 9 6 年初爆发有史以来最大规模的流行性脑脊髓膜炎流行，已有 死亡病例；至1 9 9 7 年年初以来，非洲中部已经爆发脑脊髓膜炎疫情，已有万五千 人因罹患流行性脑脊髓膜炎而丧生；整个非洲大陛今年以来传出的流行性脑脊髓膜 厦门大学硕士学位论文；大肠抒菌e f t u 多蛋白复会体的磺究 炎病例已缝高达十西万强l 。而二十世纪9 0 年代，美国e 群脑膜炎球菌病( s c m d ) 爆 发越来越频繁f 7 】，当地s c m d 的发病率每年维持在大约0 5 1 0 万。同样是革兰氏嬲 性的沙门氏菌属s a l m o n e l l am e n i n g i t i s 也成为发展中国家的细菌性脑膜炎的最主要致 病菌之一【8 1 。此外，沙门氏菌属病原菌也能引发伤寒，如1 9 9 5 年，全球有1 6 0 0 0 万 人感染了伤寒，死亡6 0 万人。另外常见的痢疾杆菌志贺氏属也是革兰氏阴性病原体， 其中的福氏( s h i g e l z af l e x n e r i ) 痢疾杆菌能引发最具传染性的细菌性痢疾。全球每 年有超过一亿六千四百万的志贺氏细菌性痢疾病例，一百多万的死亡人数，并且大 多数来自发展中国家的儿童拶l 。 除了以上能弓l 发传染性或流行性疾病的革兰氏阴性菌癸，许多位子人体务部位 与人体代谢和机能密切相关的正常菌群都属予革兰氏阴性菌，如位于肠道的大肠杆 菌【l o 】，皮肤和鼻咽腔的绿脓杆菌( 即铜绿假单胞菌) i l l 】等，但是如果其生态比例失 调，以至机体某一部位的正常菌群中各细菌的比例关系发生数量和质量上的变化， 就成为条件致病菌使入患病：由于机体的防卫功能减弱，引起自身感染。例如皮肤 粘膜受伤( 特别是大面积烧伤) 、身体受凉、过度疲劳、长期消耗性疾病等，可导致 正常菌群的盘身感染；由予正常菌群寄屠部位的改交，发生了定位转移，也可引 起疾病。例如大肠杼莹进入腹腔或泌尿道，哥弓l 起腹膜炎、泌尿道感染【l 硪。另外， 革兰氏阴性细菌引起的疾病也普遍存在于其它各种生物，引发严重的疾病并导致巨 大的经济损失。如大肠杆菌引起的禽类败血症、沙门氏菌引起的鸡白痢、禽伤寒、 副伤寒等；在渔业中由气单胞菌、弧菌、爱德华氏菌等导致的疾病，每年都会导致 上百亿的经济损失【1 3 - 谰。 1 2 病原菌与宿主 疾病是病原微生物和宿主紧密相互作用的结果，只有深入了解病原微生物与宿 主相互佟用的分子机理才可能鉴定惠病原微生物的所有毒力基因、全面理解瘸原微 生物的致病机理和宿主的防御机制【15 1 ，进恧才能设计出新型、安全和有效的诊断、 治疗工具和疫苗【1 6 1 。 免疫系统是机体在长期进化中逐步形成的一套机制复杂的防御系统，包括天然 免疫和获得性免疫。天然免疫是机体抵御病原微生物感染的第1 道防线，是机体免疫 重要的组成部分，但是长期以来被认为是免疫应答的一种低等形式，不具有免疫 2 覆门大学硕士学位论文：丈瑟抒蘩e f - t u 多蛋自复会镄的研究 特异性和免疫记忆的特征。随着对免疫系统的深入认识，特别是模式识别受体的 发现，意识到天然免疫并不是简单地发挥菲特异吞噬、清除作用，而是涉及复杂的 抗原识别机制，与获得性免疫一样麓够正确区分“自己”和“j # 己”，著里进一 步调接获得性免疫。十几年前，免疫学家j a n e w a y 前瞻性地提出了模式识别理论， 认为机体存在模式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r ，p r r ) 特异地识别病原微生 物进化中保守的抗原分子， 即病原相关分子模式( p a t h o g e n a s s o c i a t e dm o l e c u l a r p a t t e r n s ，p a m p s ) 从而有效地监测病原微生物的入侵以及诱导机体免疫应答反应【l ”。 该分子模式是病原微生物共同的、高度保守的结构。现代分子生物学和遗传学理论 与技术的发展，正向、及向遗传学方法的运用，加深了对p r r ，p a m p 的认识，发现了从 细胞表面到缨胞核的信号转导途径有t o l l 样受体( t o l l 1 i k er e c e p t o r , t l r s ) 、各种蛋 白激酶家族、j a k 激酶信号转导子( j 肽s t a t ) 和核因子媳( n f k b ) 等信号转导通 路。其中，p a m p t r l 跨膜信号转导占据核心地位。 t o l l 样受体是一种模式识别受体，识别病原微生物进化中保守分子，如脂多糖 ( l p s ) 、胶聚糖、酵母多糖以及病原微生物的核酸等等。脂多糖受体t l r 4 是发现 的第一个t l r s ，目前已经陆续发现十余种+ t l r s 。t l r s 不仅在天然免疫系统中发挥 重要的作用，丽且还调节获得性免疫，是近年来免疫学一项重大进展。 表lt l r s 的主要醒体及其来源【1 8 ，1 9 】 受体配体配体来源 t l rl t l r2 t l r3 t l r4 三脂酰脂肽 肽聚糖 胞壁酸 非典型的脂多糖 糖肌醇磷脂 脂蛋白 酵母多糖 热休克蛋自7 0 双链心a p o l y l ：c l p s 紫杉醇 3 细菌，分枝杆菌 革兰氏阳性菌 革兰氏阳牲菌 革兰氏阴性菌 锥形虫 分枝杆菌 真菌 宿主 病毒 合成优合物 革兰氏阴性菌 植物 厦门大学硕士学位论文：大肠杆菌e f - t u 多蛋自复合体的研究 t l r5 t l r6 t l r7 t l r8 t l r9 t l rl o t l r1 1 ( 小鼠) t l r1 2 ( 小鼠) t 1 r1 3 ( 小鼠) f 蛋自 热休克蛋臼6 0 热休克蛋臼7 0 透明质酸的寡糖 硫酸z | l 千素的多糖成分 纤粘连蛋白 纤维蛋白原 鞭毛 二脂酰脂肽 胞壁酸 酵母多糖 咪唑并喹啉 洛索立宾 单链r n a 眯唑并喹啉 单链r n a c p g d n a 未知 尿路致病菌来源蛋白 肌动蛋白抑制蛋自 p r o f i l i n 样蛋自 来知 未知 呼吸道合胞病毒 宿主 宿主 宿主 宿主 宿主 宿主 细菌 支原体 革兰氏阳性菌 真菌 会成化合物 合成化合物 病毒 合成化合物 病毒 细菌或病毒 来知 尿路致病菌 寄生虫 未知 未知 高等植物与病原微生物的相互作用以病原微生物接触寄主植物开始，以植物产 生明显的抗病或感病反应两结束。在这一过程中，高等德物对病原物的识别及其隧藤 的信号传导是主线，它决定了植物抗病与感病的差异。植物和病原菌之间的相互作用 帆理一直是植物病理学的研究重点与热点课题。它们之间的互作关系可分为毒 亲和 性和亲和性两种 2 0 1 。尽管植物受到各种各样病原菌的侵袭，在自然界，不亲和性即 4 炭门大学硬士学位论文：大肠杼蕴e f 强多鬃鑫复会体的研究 抗病性仍相当普遍，而亲和性即感瘸性只是少数和例外，这主要与植物的多重防御 体系有关。植物对外界病原蓥的防御体系包括其鑫身固有麓和瘸原蔫诱导的2 种。 前者主要包括细胞壁的焦质、蜡质、木质素、特殊的气孔结构、小分子抗病物质( 如 毒性脂肪酸、酚类化合物、类萜与类黄酮类植保素以及有关的过氧化物酶、多酚氧 化酶与苯丙氨酸解氨酶等) 、种子固有的抗真菌蛋翻和能与真菌几丁质结合的凝集 素、破坏真菌细胞透性的蛋白质和核糖体失活蟹白等。而后一类属予植物第2 层防 御体系，只有当病原菌突破植物固有的第l 道防线时才起作用。病原菌诱导的防卫 系统又可分为局部和系统的抗病反应2 种。前者主要是指过敏反应，鄂当植物受j e 亲和性瘸原菌感染后，侵染部位细胞迅速死亡，使病原菌不易获取养分，同时又诱 导周围细胞合成抑制病原菌生长的物质，从丽限制了病原菌的增殖【2 1 1 。在过敏反应 过程中的细胞死亡，过去称为坏死，现在被认为是编程性细胞死亡【2 2 1 。而后者是建 立在前者基础之上的，又称系统获得抗性。它是指植物受病原菌侵染后局部的过敏 反应会产生一类信号分子，这种信号分子能诱发整个植株防卫基因的表达，从而使 植物对更多的病原菌产生抵抗作用。其特点是不出现局部抗性那样的枯斑，却熊抗 多种病原物弓| 起的病害【2 3 】。t 植物免疫应答进化所到达的最高级形式就是有一个离效防御体系能够抵御微生 物病原菌的潜在攻击，丽其中最主要的免疫应答被认为是病原相关分子模式引发的 免疫性( p a m p t r i g g e r e di m m u n i t y , p t i ) 并且已经可以识别微生物病原菌的很多共同 特征【2 孙。在该领域的研究中，k u n z e 等在2 0 0 4 年首次发现一个传统的胞内蛋白延 伸因子t u ( e l o n g a t i o nf a c t o rt u ，e f t u ) 作为一个新的病原相关分子模式引起了拟南芥 ( a r a b i d o p s i s 脯a l i a n a ) 的免疫应答。e f - t u 在维菌中是一令高度保守的蛋自，并且 已知其在大肠杆菌中n 末端被乙酰化，k u n z e 等同时还发现这乙酰化n 来端的头1 8 个 氨基酸能够完全地引起拟南芥的免疫应答【2 4 1 。2 0 0 6 年1 月，c e l l 杂志发表了c h i s h o l m 等关于植物免疫应答发生的综述性文章其中阐述了e f t u 的作用机制【2 5 1 。同年5 月， z i p f e l 等在进一步的研究中找到了拟南芥中e f t u 的受体蛋白( r e c e p t o r k i n a s e e s s e n t i a lf o re f t up e r c e p t i o n ，e f r ) ，其成果也被刊登在 c e l l 杂志上【2 6 】。然而， 接踵而来的问题就是微生物病原菌细胞质和细胞膜中的哪些蛋白在e f t u 的出膜机 制起了什么样的作粥? 它们在该病缀裙关分子模式巾又起了什么作用以及该瘸原相 关分子模式是否在动物中也同样存在昵? 。 厦门大学硕士学位论文：大肠杆菌e f - t 、l 多蛋白复合体的研究 1 3 外膜蛋白在病原发生中的作用 实验研究表明外膜蛋白在细菌的致病性方面具有重要作用【2 7 - 3 6 ，革兰氏阴性菌 的外壁明显不同于革兰氏阳性菌的蛋白质含量较低的肽聚糖层外璧，它在细菌胞质 膜( 内膜) 和肽聚糖的外侧还有外膜，包围整个细菌，是革兰氏阴性菌细胞壁成分中所 特有的结构，主要成分有磷脂、脂多糖、外膜蛋白等( 如图1 1 ) 。通过脂蛋白的n 端脂质锚定于外膜的外膜蛋白( o u t e rm e m b r a n ep r o t e i n s ，o m p s ) 是革兰氏阴性菌外膜 的主要结构，占其全部组成的5 0 左右【3 7 】，具有多种生物学功能，不仅在维持外膜结 构，保证物质运输，作为大肠菌素、噬菌体受体以及参与f 因子接合等方面具有重 要作用，而且在细菌与宿主的接触过程中扮演重要的角色，是一种重要的毒力因子。 黼 酬蝴一 i n n e r ( 恻m e m b r a n e 鼬 1 图1 1 大肠杆菌外围结构示意图。从里到外依次为细胞质、内膜、细胞周质 和外膜。外膜为不对称结构，位于细菌胞质膜( 内膜) 和肽聚糖的外侧，包围整个细 菌，是革兰氏阴性菌细胞壁成分中所特有的结构，其主要成分有磷脂、脂多糖、外 膜蛋白等，具有多种生物学功能1 3 引。 f i g1 - 1 s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h eec o l ie n v e l o p es t r u c t u r e n o t et h a tt h e o u t e rm e m b r a n ei sa na s y m m e t r i c a lb i l a y e rc o n t a i n i n gl p si nt h eo u t e rl e a f l e ta n d p h o s p h o l i p i d si nt h ei n n e rl e a f l e t l 3 引 o m p s 参与了菌体的多项生理功能，对于菌体的生长繁殖、环境适应能力、致 6 厦门大学颂士学位论文：太肠枵蘧e f - t u 多虽自复合体豹硗究 病性及耐药性等多个方面具有重要意义。对于瘸原微生物来说，如何完成侵袭、致 病过程以及如何适应宿主环境是首要蒋对的两个重要阀题。外膜蛋冬处于菌体的最 乡 层，在这两方面都具有重要的作用。对o m p s 的研究不仅有助我们加深对细藏生 命机理的了解，也有助于对微生物的利用及防治，尤其是对于许多病原微生物来说， 对其o m p s 的研究将有助于疫苗的开发及药物靶点发现。 近年来o m p s 与细菌致病机理和免疫机理的研究取得了很大进展。对o m p s 结构和功能的了解将有助于揭示o m p s 诱发保护反应的机制以及o m p s 在诱发免疫 应答时与免疫细胞的相互作用羹定基础。m c a t e e 等采用蛋盘质组学中生物信息学扫 描、单彝及双向电泳、免疫检测，秀结合质谱鉴定分别对擞e m o p h i l u si n f l u e n z a er d ) f l d - l e l i c o b a c t e r p y l o r i 基因组的外膜蛋白及其免疫原性进行了分析【3 9 】；r a h m a n 等在对 g o l d f i s h 的研究中发现a e r o m o n a sh y d r o p h i l a 的外膜蛋白能够激发宿主的免疫保护 性，另外他们在研究中发现f l a v o b a c 胞h u m p s y c h r o p h i l u m 的外膜组分同样也具有免 疫保护性嗍。本实验室的陈子瑁等通过免疫蛋白质组技术分析了嗜水气单胞菌 ( a e r o m o n a sh y d r o p h i l a ) 的外膜蛋白双向图谱，发现了8 个与免疫原性相关的蛋白， 经过质谱的鉴定，其中除了1 个外膜蛋自潋外还有3 个同处与终膜土的鞭毛蛋皇及其 他蛋白，提示这些蛋白可以做为疫苗的候选物。我困学者彭宣宪【4 2 】等还将s h i g e l l a f l e x n e r i2 a 抗血清分别与外膜蛋白和可溶性蛋白2 - d e 胶转染的n c 膜进行w e s t e r n b l o t t i n g ，结果显示有1 3 个免疫原性蛋白，外膜蛋白为7 个，可溶性蛋白有6 个，经过 质谱鉴定，其中1 2 个是新的免疫原性蛋白。 1 4 蛋白质相互作用 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达， 以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它筲以调控，介导 细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部 分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合体来发挥作用的 f 4 3 1 。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合 体的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相 互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验困的及条件选择不同的实施策略。研 壤门大学硕上学位论文：丈肠杆蓥嚣f t t l 多蛋白复含体懿壤究 究已知蛋自闽的相互作用人们关注的是蛋白闻能否发生结合，实验本身更趋向予验 证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实 验本身带来的假阴性或假阳性4 4 1 。蛋白质相互作用方面的研究方法主要可以分为生 物物理学方法、分子生物学方法、遗传学方法和生物信息学方法四大类【4 5 1 。 。 1 4 1 生物物理学方法 1 4 1 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀( c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ) 楚以抗体和抗原之闻的专一性作用为基 础的用于研究蛋自质相互作用的经典方法。是确定两种蛋自袋在完整缨胞内生理性 相互作用的有效方法。其基本原理是：细胞裂解液巾加入抗体，与抗原形成特异免疫 复合体，经过洗脱，收集免疫复合体，然后进行s d s p a g e 及w e s l e mb l o t t i n g 分析。 免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知 的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗 体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质a 或蛋白质g 琼脂糖微珠将复合体沉淀 下来，然后用s d s 。p a g e 鉴定。免疫共沉淀中设置菠确的对照非常重要，因为该方法 可麓出现假期性的概率比较赢，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺 失目的骚白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几剧4 6 1 ：( 1 ) 确保共 沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的 使用有勘于避免污染的产生。( 2 ) 要确保抗体的特异性。即在不表达抗原的细胞溶 解物中添加抗体后不会引起共沉淀。( 3 ) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中， 焉不是蠢子细胞的溶解彳+ 发生昀。这需要进行蛋自质翡定位来确定。 免疫共沉淀试验也同样不能保证沉淀的蛋白复合体是否为直接相互作用的两种 蛋白。例如e 1 a 与p 6 0 的共沉淀就是间接的相互作用。其实际上是e 1 a 与p 1 0 7 直接相 互作用，而p 1 0 7 与p 6 0 直接相互作用的结果【4 7 4 8 1 。与蛋白亲和色谱相比，免疫共沉淀 试验的灵敏度不够高。这与抗原浓度较低有关，但如果使抗原过量表达，又会破坏 相互作用的天然状态。 免疫共沉淀是检测蛋白质问相互作用的经典方法，也是较常用的方法 4 9 1 。它的 优点是：与蛋自亲和色谱一样，检测的产物是粗提物；抗原与相互作用的蛋龟以细 8 壤强大学矮圭学位论文：天扬拇聋e f t u 多蛋白复念体的研究 胞中相类似的浓度存在，避免了过量表达测试蛋白所造成的人为效应；蛋自以翻译 后被修饰的天然状态存在；复合体以天然状态存在。s c h a e r e r 与他的同事们利用免疫 共沉淀技术研究了g a b a a 受体蛋自与多功能蛋白g c l q r 之闻的相互作用【5 0 】，与酵母 双杂交试验得到的结果完全相同。 但这种方法有两个缺陷：是2 种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第 3 者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的器白是什么，以选择最后检测的 抗体，所以，着预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。为了解决 免疫沉淀的这些问题，本实验制备了高效价的抗体来提高其灵敏度，此外还加大蛋 自质a 或g 以及抗体的量，并将最后得到的蛋鸯进行浓缩，以便尽可能地褥到较清晰 的电泳条带。同时，结合f a r - w e s t e r nb l o t t i n g 等技术就可以弥 l 融支术的不足，来证 明两种蛋白质是否直接作用【5 。 1 4 1 2f a r - w e s t e r mb l o t t i n g f a r - w e s t e r n f 2 j 蝇初发明糟于3 2 p 标记的谷胱甘肽s 一转移酶( g s t ) 融合蛋宣表达 文库的筛选【爨，现在则用于检测蛋自质蛋自质相互作用【5 朝。最近a 年，f a r - w e s t e r n 还用予检测受体一配体相互作用以及相互作用蛋自文库的筛选。借助这种分析方法，。 使许多研究变成可能，如翻译后修饰对蛋白质，蛋白质相互作用的影响，用合成的多 肽作探针检测蛋白相互作用的序列、以及在无抗原特异性抗体的情况下识别蛋白藐“l 蛋白质相互作用。 f a r - w e s t e r n 印迹技术与w e s t e r n 印迹十分相似。在w e s t e r n 印迹中，运用抗体检测 转移膜上的相应抗原。在经典f a r - w e s t e r n 印迹中，运用经标记的或可被抗体检测的 “诱饵”蛋自检测转移膜上的“猿物”靶蛋自。用s d s p a g e ( 十二烷基磺酸钠聚丙烯 酰胺凝胶电泳) 或非变性p a g e 分离含有未知靶蛋白的样品( 通常为细菌裂解液) 然 后转膜。靶蛋白附于转移膜表丽时可以被检测到。转膜后，封闭膜，用一已知诱饵 蛋白( 通常用纯品) 进行探测。诱饵蛋白与靶蛋白反应后，运用该诱饵蛋白的特异 性检测系统即可检测出相应条带。 王4 。1 。3 表面等离子体共振 冒兹，表恧等离子体共振s u r f a c ep l a s m o nr e s o n a n c e ，s p 鼬技术已成为了当今 9 厦门大学硕士学位论文：大肠杆菌e f - t u 多蛋白复含体鲍磺究 一种全新的研究蛋白质之闻相互作用的手段 嗣。 表露等离子体共振s p r 生物传感器是利用表露等离子体共振现象和s p r 谱峰对 金属表瑟上电介质变化敏感的特点，通过将受体蛋囱固定在金属膜上，检测受体蛋自 与液相中配体蛋白的特异性结合。s p r 技术的特点是测定快速、安全、不需标记物 或染料及灵敏度高。其除了应用于检测蛋白质蛋白质外，还可检测蹑白质核酸及其 他生物大分予之间的相互作用，并且能对整个反应过程进行实时监测。因此，s p r 技术 在检测生物大分子特异性相互作用上比传统的方法更具优势，其对基础理论、医学诊 断及治疗等都具有十分重要的意义。 l 。4 1 3 荧光共振能量转移( f r e t ) 采用标签法检测和分离蛋白的方法虽然有效但也存在缺点，比如说分离蛋白标 签可以改变蛋白的溶解性并且不能在活体细胞中进行等【5 5 1 。荧光共振能量转移 ( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r , f r e t ) 是近年来迅速发展的一种新技术，其最 大的特点就是可以在活体细胞生理条件下对蛋白质问的相互作用进行实时的动态研 究，己成为现代蛋自质组学研究的有力工具。 l 。4 2 分子生物学方法 1 4 2 1 酵母双杂交系统 2 0 世纪8 0 年代中、后期，真核转录因子得到大量深入的研究【5 粥7 1 ，这类研究最 终促成了酵母双杂交系统的诞生。当时的研究发现，真核转录因子的d n a 结合区 ( d n a - b i n d i n gd o m a i n ，b d ) 和转录激活区( t r a n s c r i p t i o na c t i v a t i o nd o m a i n ，a d ) 在功能上和实质上都是可分耐5 3 删。b d 能把蛋自定位到基因组特定d n a 序列上，a d 能够使转录装置激活基因转录。b r e n t 和p t a s h n e 于1 9 8 5 年证实，将2 种不同蛋自的b d 与a d 重组，仍能产生有活性的转录因子。该实验进步说明了转录因子的特性。 后来，一些研究人员发现a d 和b d 不必在l 条多肽上【6 2 】。当这2 个区域单独存在时均 没有转录激活功能，但当它们在间上彼此联系时，则能够激活基因转录【6 3 】。f i e l d 和 s o n g 正是利用这一特性建立了酵母双杂交系统。转录激活因子在结构上是组件式的， 即这些舔子往往由2 个或2 个以上相互独立的结构域构成。g a l 4 蛋白是1 个基因转录 激活子( 由它激活转录的基因可以编码半乳耱营酶) 。它包括2 个分离的功能性结构 l o 厦门大学硕士学位论文：大肠释菌e f 一翔多蛋臼复合体酶研究 域：1 个能结合特异d n a 序列( u a s g ) 的n 末端结构域和1 个包含酸性区域0 9 c 末端结构 域，它是转录激活所必需的。双杂交系统是这样建立的：g a l 4 的d n a 结合结构域，与x 蛋白质融合；g a l 4 的激活结构域，与蛋白质y 融合；x 和y 形成一个蛋自渍复合体，重新 形成g a l 4 结构域酌邻近效应，即实现了转录因予功麓重建，导致u a s g 调控豹基因( 报 告基因) 开始转录。他们当附还用2 种已知的能与s n f l 和s n f 4 互作的酵母蛋白质检验 了这个系统，只有当2 个融合蛋白都出现在1 个细胞中时才能获得高的转录活性。 酵母双杂交的原理是将2 个目的鬣白分别与a d 和b d 融合产生新的融合蛋白，如 果这2 个目的蛋白能够互相作用，则该相互作用会促使a d 和b d 互相靠近而产生有活 性的转录因子，进而激活事先构建到酵母基因组中的报告基因的转录。在这以前，也 有许多生物化学方法用来研究蛋自旗间相互作用，僵都是在体外研究，该系统可以在 酵母这种生长迅速旦易操作的体系中研究真核细胞的蛋自质一蛋自质相互作用，虽透 过e d n a 文库筛选直接找到与未知蛋自质相互作用的蛋自基因。 酵母双杂交系统与其衍生系统的操作程序是类似的，其基本操作程序大体包括以 下几个步骤【嗍：选择合适酵母作为筛选未知蛋白的受体菌；诱饵蛋白表达质粒的构 建和鉴定；诱饵蛋白自身转录活性分析；猎物礞白c d n a 文库的构建；酵母双杂交 筛选与阳性克隆鉴定。这是筛选相互作用蛋白的基本步骤，如果需要利用双杂交进行 其他方面的研究可根据不同试验霉的进彳亍相应地调整。 酵母双杂交系统的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋融之闻的相互作用及 分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交系统检测蛋白之间的相 互作用具有以下优点：( 1 ) 作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子 的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。( 2 ) 检测在活细胞内进行，可以 在一定程度上代表细胞内的真实情况。( 3 ) 检测的结采可以是基因表达产物的积累 效应，因而可检测存在于蛋自质之间的微弱的或暂时的相互作用。( 4 ) 酵母双杂交系 统可采用不同组织、器宫、细胞类型和分化时期材料构建c d n a 文库，能分析细胞浆、 细胞核及膜结合蛋自等多种不网亚细胞部位及功能的蛋白。 酵母双杂交系统是分析蛋白蛋白问相互作用的有效和快速的方法，有多方面的 应用，但仍存在一些局限性。( 1 ) 双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核 内，而许多蛋白间的相互作用依赖予翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反 应在核内无法进行。另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋宙的辅助， 厦门大学硕士学位论文：大肠杆菌e f t u 多蛋白笈合体的研究 这限制了某些细胞外蛋自和细胞膜受体蛋自等的研究。( 2 ) 酵母双杂交系统的一个重 要的问题是“假阳性”。由于某些蛋白本身具有激活转录功能或在酵母中表达时发挥 转录激活作用，使d n a 结合结构域杂交蛋自在无特异激活结构域的情况下可激活转 录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋囱质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定 的复合体，从而引起报告基谶的表达，产生转瑕阳性”结果。 针对“假阳性”问题，研究者在实践中通过对酵母双杂交系统进行改进出现了双筛 选系统和假阳性显示分析法等。另外，近几年来已初步建立了哺乳动物双杂交系统，它 能更好地模拟细胞内环境，从而探明蛋白质相互作用的机理。同时，为了克服酵母双杂 交系统中存在的第1 个问题，这些年来，人们开始尝试使用其他蛋自的结构特点来建立 新的双杂交系统。予是，一些不依赖于转录因子活性的新型双杂交系统相继建立，如分 离的泛素系统、蛋白质片段互补分析、阻遏物夔构分析和s o s 恢复系统等。此后在 酵母双杂交系统基础上还发展出酵母单杂交系统、双诱饵系统、三杂交系统、哺乳 类双杂交系统等多种方法，并且还出现了用大肠杆菌做为替代的双杂交系统 6 翻。 1 4 2 2 噬菌体展示技术 噬菌体展示技术是一种噬菌体表面表达筛选技术，也是一种