（物理化学专业论文）胆固醇和蛋白质对模拟细胞膜的稳定性影响研究.pdf

摘要 摘要 细胞膜般是由4 0 5 0 的磷脂、糖脂等类脂和5 0 6 0 的蛋白质组成。双分 子层、囊泡、胶束等常用做研究细胞膜的膜模拟剂。囊泡是由两个双亲分子定向 单层尾对尾地结合成封闭单分子双层所构成的外壳，和壳内包藏的微水相构成。 它可分为两种类型：由天然的或合成的磷脂所组成的囊泡( 脂质体) 和由双亲分 子自组装形成的囊泡。囊泡由于制备相对简单，对脂质体进行修饰，可以使其获 得某些与生物体相似的性质，因此囊泡是研究和模拟生物膜的最佳体系。 g e m i n i 表面活性剂是由联接基以共价键将两个两亲分子单体联接而成的， 它代表了一类新型表面活性剂。大量的研究表明联接基的性质( 长度、柔韧性和 化学结构) 最终决定了g e m i n i 表面活性剂在溶液中的性质。因而在学术上以及 工业上，都对它产生浓厚的兴趣。本文所研究的季铵盐型g e m i n i 表面活性剂是 以( c h 2 ) s 为联接基的季铵盐型g e m i n i 表面活性剂。 本文以卵磷脂形成的囊泡模拟细胞膜，以t r i s 缓冲体系模拟细胞膜所处的环 境，并根据细胞膜的组成添加胆固醇和蛋白质以构建一种模拟细胞膜的模型。实 验通过l b 膜分析仪研究胆固醇、卵磷脂、牛血清蛋白( b s a ) 在气一液界面的 行为及相互作用力，并结合停流装置、动态光散射技术和透射电子显微镜等方法 研究g e m i n i 表面活性剂破坏卵磷脂囊泡的过程，以及胆固醇、b s a 对卵磷脂囊 泡稳定性的影响。论文的研究主要分为两部分： 第一部分是胆固醇对卵磷脂囊泡稳定性的影响。混合单分子膜的过剩面积小 于零表明胆固醇和卵磷脂是相互吸引的。z e t a 电位的测量也说明带正电的胆固醇 和带负电的卵磷脂之间存在相互吸引的静电作用力。动力学结果表明胆固醇的添 加使卵磷脂囊泡更不易被g e m i n i 表面活性剂破坏，这是因为：表面活性剂嵌入 到囊泡的双分子层中，与带负电的卵磷脂囊泡发生静电作用，从而使囊泡结构的 双分子层厚度改变，胆固醇的加入，与卵磷脂的极性头部和脂肪酸尾部发生作用， 使卵磷脂囊泡的双分子层更加密集，并使囊泡表面的负电性减弱，不利于双子表 面活性剂在囊泡表面的吸附和嵌入。 第二部分是b s a 对卵磷脂囊泡稳定性的影响。在不同比例下，混合单分子 膜的过剩面积都小于零，表明b s a 和卵磷脂是相互吸引的。z e t a 电位的测量显 示b s a 的加入对卵磷脂囊泡的表面电位没有多大影响，说明b s a 和卵磷脂之间 l 摘要 是疏水作用起主导而不是静电作用。动力学结果表明b s a 的加入使卵磷脂囊泡 更不易被g e m i n i 表面活性剂破坏，这是因为b s a 与卵磷脂囊泡具有疏水相互作 用，b s a 能够定位于卵磷脂囊泡膜相中，而b s a 在膜相中的定位使囊泡膜相的 疏水性降低，这样g e m i n i 表面活性剂更不易进入到囊泡的双分子层中。 关键词：卵磷脂囊泡；混合单分子膜；膜模拟 a b s t r a c t a b s t r a c t c e l lm e m b r a n ei sm a d eu po f4 0 5 0 l i p o i da n d5 0 - 6 0 p r o t e i n b i l a y e r 、v e s i c l e a n dm i c e l l ea r eg e n e r a lm e m b r a n es i m u l a t i o nr e g e n t s v e s i c l ei sc o m p o s e do fc r u s t w h i c hf o r m sf r o mc l o s e du n i m o l e c u l e - b i l a y e rt h a tc o m b i n e dw i t hm o n o l a y e r so ft w o a m p h i p h i l i cm o l e c u l e si nt a i l t o - t a i lo r i e n t a t i o n a l l y ，a n dm i c r o h y d r o f a c i e st h a t i s c o n t a i n e dw i t h i nt h ec r u s t i tc a nb es o r ti n t ot w ot y p e s ：l i p o s o m em a d eu po fn a t u r a l o rc o m p l e xl e c i t h i na n dv e s i c l em a d eb ys e l fa s s e m b l yo fa m p h i p h i l i cm o l e c u l e s b e c a u s eo fs i m p l ep r e p a r a t i o n ，a sw e l la ss o m e t h i n gc a nb ed o n et ol i p o s o m e ，v e s i c l e i st h eb e s ts y s t e mt os t u d ya n ds i m u l a t eb i o l o g i cm e m b r a n e g e m i n is u r f a c t a n t sa r em a d eu po ft w oa m p h i p h i l i cm o i e t i e sc o v a l e n t l yc o n n e c t e d b yas p a c e rg r o u p ，a n dr e p r e s e n tan e wc l a s so fs u r f a c t a n t s a c c o r d i n gt ol o t s o f p a p e r s ，t h en a t u r eo ft h es p a c e rg r o u p ( 1 e n g t h ，f l e x i b i l i t y ，c h e m i c a ls t r u c t u r e ) h a sb e e n s h o w nt ob eo ft h eu t m o s ti m p o r t a n c ei nd e t e r m i n i n gt h es o l u t i o np r o p e r t i e so f a q u e o u sg e m i n is u r f a c t a n t s s ot h e y a r ea t t r a c t i n gc o n s i d e r a b l ei n t e r e s ti nt h e a c a d e m i ca n di n d u s t r i a lc o m m u n i t i e sw o r k i n go ns u r f a c t a n t s i nt h i sa r t i c l e ，w es t u d y ak i n do fg e m i n is u r f a c t a n t s q u a t e r n a r ya m m o n i u mg e m i n ic o n n e c t e db yt h es p a c e c h a i no f ( c h 2 ) s i nt h i sa r t i c l e ，w ec o n s t r u c t e dac e l lm e m b r a n es i m u l a t i o nm o d e lb ya d d i n g c h o l e s t e r o la n db s at ol e c i t h i nv e s i c l e t h em e c h a n i s mo fs t r u c t u r et r a n s f o r mo f v e s i c l ew a se x p l o r e dt h r o u g ht e m t h em i x e dm o n o l a y e r sa tt h ea i r w a t e ri n t e r f a c e w e r ei n v e s t i g a t e du s i n gl a n g m u i rb a l a n c et e c h n i q u e w ea l s or e s e a r c h e dt h ee f f e c to f c h o l e s t e r o la n db s ao nt h es t r u c t u r et r a n s f o r mo fl e c i t h i nv e s i c l eb yt h em e t h o d so f k i n e t i ca n dd y n a m i cl i g h t s c a t t e r i n g t h e r ea r et w os e c t i o n si nt h i sa r t i c l e ： f i r s t l y ，w es t u d yt h ee f f e c to fc h o l e s t e r o lo nt h es t a b i l i t yo fl e c i t h i nv e s i c l e t h e n e g a t i v ee x c e s sa r e ao ft h em i x e dm o n o l a y e ra n dt h ee x p e r i m e n to fz e t ap o t e n t i a l s h o w e dt h a tt h e r ew a sm u t u a la t t r a c t i o nb e t w e e nc h o l e s t e r o la n dl e c i t h i n t h ek i n e t i c r e s u l ta l s os h o w e dt h a tc h o l e s t e r o lc o u l ds t a b i l i z el e c i t h i nv e s i c l e t h er e a s o nw a st h a t p o s i t i v e l yc h a r g e dg e m i n is u r f a c t a n ti n t e r c a l a t e di n t ot h eb i l a y e ro fn e g a t i v e l y c h a r g e dl e c i t h i nv e s i c l ea n d r e d u c e dt h et h i c k n e s so fb i l a y e ro fl e c i t h i nv e s i c l e t h e p o s i t i v e l yc h a r g e dc h o l e s t e r o lc o u l dd e c r e a s et h es u r f a c en e g a t i v ep o t e n t i a l a n d i n f l u e n c eg e m i n is u r f a c t a n ti n s e r ti n t ot h es u r f a c eo fv e s i c l e s e c o n d l y ，w es t u d yt h ee f f e c to fb s ao nt h es t a b i l i t yo fl e c i t h i nv e s i c l e t h e i i i a b s t r a c t n e g a t i v ee x c e s sa r e ao ft h em i x e dm o n o l a y e ra n dt h ee x p e r i m e n to fz e t ap o t e n t i a l s h o w e dt h a tt h em a i nf o r c eb e t w e e nb s aa n dl e c i t h i nv e s i c l ew a sh y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o nr a t h e rt h a ne l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n t h ek i n e t i cr e s u l ts h o w e dt h a tl e c i t h i n v e s i c l em i x e d 、杭t l lb s aw a sh a r d e rt ob ed i s r u p t e db yg e m i n is u r f a c t a n t t h er e a s o n w a st h a tt h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nb e t w e e nb s aa n dl e c i t h i nv e s i c l eh e l p e db s a l o c a t e di nt h eb i l a y e ro fv e s i c l e ，w h i c hd e c r e a s e dt h eh y d r o p h o b i c i t yo ft h eb i l a y e r s o i tw a sm o r ed i f f e r e n tf o rg e m i n is u r f a c t a n tt oe n t e ri n t ot h eb i l a y e ro fv e s i c l e ，w h i c h m e a n tt h a ti tw a sm o r ed i f f e r e n tt od i s r u p tl e c i t h i nv e s i c l e k e y w o r d s ：l e c i t h i nv e s i c l e ；m o n o l a y e r ；m e m b r a n es i m u l a t i o n i v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ： 年月 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“ 或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人： 年月日 第一章前言 第一章前言 11 囊泡 囊泡( v e s i c l e ) 是表面活性剂分子在水溶液中形成的具有封闭双层结构的分 子有序组合体之一【”。由天然磷脂所形成的囊泡通常也称为脂质体( 1 i p o s o m e ) 。 一般囊泡由两亲分子进行定向单层 疏水基对疏水基的结合构成封闭性 双层外壳，其壳内包藏着微水相， 从结构上看可分成两类，即单室和 多室囊泡( 见图1 1 ) 。单室囊泡只 有一个封闭双层包裹者水相，多室 a b 图1 1 单室囊泡( a ) 与多室囊泡( b ) 囊泡则由多个双亲分子封闭双层成同心球式的排列，不仅中心部分而且各个双层 之间都包含水嘲。 囊泡的形状多为大致球形、椭球形或扁球形，也曾观察到管状囊泡嘲。囊泡 的太小一般为3 咻1 岬，据报道，也有达到2 0 i i m 的巨形囊泡1 。由于囊泡与 细胞膜的结构非常相似，所以一直 作为生物膜模型和发展仿生技术的 模拟体系而得到广泛的研究嘲。化 学家则为囊泡所能提供的多种特定 的反应环境所吸引，希望通过它来 实现和控制某些化学反应。囊泡可 将亲水溶质包容在它的中心部位及 极性基层之间的区域，疏水溶质则 在各个两亲分子双层的碳氢基夹层 之中，这就使对环境极性有不同要 求的成分各得其所，而且有相互接 触进行反应的机会阁1 2 是一个单 室囊泡及其所能提供的九个反应环 境的示意图”埘。 岳c 亚匝三| 兰玉丘云蛋一， _ - - - - - - - - - - 。- - - _ 增忡撒r l 增 图1 2 囊泡溶液的9 个区域 图下方标注各区域极性大小，区域 5 的极性箍小 第一章前言 脂质体是人类最早发现的囊泡体系。s t o e c k e n i u s l 9 】在1 9 5 9 年发现磷脂在水中 会溶胀形成多层结构。1 9 6 5 年b a n g h a m 等将干磷脂分散于水中制得了多室囊 泡，这标志着人工制备囊泡研究的开始。1 9 7 7 年k u n i t a k e 等【1 1 】首次以全人工合 成表面活性剂双十二烷基二甲基溴化铵制得了囊泡，带动了这一方面研究工 作的迅速发展。从此，囊泡便在生命科学及许多高新技术领域的研究中扮演着重 要角色。 1 1 1 囊泡的制备 囊泡的制备一般包括三个步骤：首先是脂质体原料的水合和非均质囊泡的形 成，然后将囊泡均质化，最后将脂质体分离或分散到相应的介质中。制备囊泡的 方法有多种，比较传统的有溶胀法、注射法和超声法。 ( 1 ) 溶胀法 溶胀法【1 2 1 是最简单的制备囊泡的方法，它是让双亲化合物在水中溶胀，自发 形成囊泡。例如，将磷脂溶液涂于锥形瓶内壁，待溶剂挥发后形成磷脂膜附着在 瓶上。然后加水于瓶中，磷脂膜便自发卷曲，形成囊泡进入溶液中。 ( 2 ) 注射法 将成膜类脂物质及脂溶性物质( 如药物) 共溶于有机溶剂中( 乙醇或乙醚) ， 然后将此溶液用注射器缓慢加入蛰 5 0 - - 6 0 。c 的缓冲溶液中，不断搅拌至溶剂全部 蒸发为止，即可制得脂质体。由这两个方法制备成多室囊泡和( 或) 单室囊泡。在 相变温度以上时，对多层囊泡进行超声，则形成单室囊泡，其直径为3 0 - - - - 6 0n l n ， 囊泡的壁厚一般为5n i l l 左右，每个囊泡含有8 0 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 0 个表面活性剂分子。 注射法中常使用乙醚、氯仿和乙醇来溶解两亲化合物，因而有乙醚注射法、 氯仿注射法和乙醇注射法。本文制备囊泡的方法就是采用乙醇注射法，将两亲化 合物( 本文为卵磷脂) 制成乙醇溶液，然后注射到水中，待乙醇挥发后就可以形 成囊泡。相反的操作也是可以的，即将水注射到到磷脂的乙醇溶液中，再除去乙 醇，也能制备囊泡。 ( 3 ) 超声法 有的双亲分子不能自发形成囊泡，但可以在超声条件下形成。这样制备的囊 泡多为大小不一的多室囊泡。将其压过孔径由大到小的系列聚碳酸酯膜，可以得 到尺寸较小和分散性较好的多室囊泡。另外，多室囊泡经凝胶过滤或经挤压小孔 可得到单室囊泡【2 1 。 2 第一章前言 脂质体制备过程中应注意几个问题【1 3 】：首先，应注意脂质体的稳定性，脂质 体的稳定性与膜质材料的相转变温度有密切的联系，氢化卵磷脂比不饱和卵磷脂 有更高的相转变温度，因而制得的脂质体稳定性好。 其次，不同制备方法制得 得脂质体形状和大小均不同。用溶胀法制得的是多层脂质体，经过凝胶过滤或经 挤压过小孔，可以得到尺寸较小和多分散性较小的多室囊泡【1 4 1 甚至单室囊泡【15 1 ， 但是这样一来，将导致囊泡组分的流失；注射法的条件温和，易制得完整，单分 散的单室大脂质体，但残余溶剂较难除尽；超声法制得的脂质体容易出现结构缺 陷。另外，在制备的过程中，还要解决脂质体的富集与分离和脂质体的分析等问 题。 1 1 2 囊泡的性质 ( 1 ) 稳定性 囊泡分散液与胶团溶液不同，它不是均匀的平衡体系，而是表面活性剂的有 序组合体在水中的分散体系，其分散相的尺寸在胶体分散的范围。它只是具有暂 时的稳定性，有的可以稳定几周，甚至几个月。这是因为形成囊泡的物质在水中 的溶解度很小，迁移的速度很慢。而且，相对于层状结构，囊泡结构具有熵增加 的优势。已经发现，多室囊泡越大越稳定。有时也可以采用可聚合的表面活性剂， 在形成囊泡后进行聚合，以增强囊泡的稳定性【1 6 1 。 ( 2 ) 包容性 囊泡的一个重要特性是能够包容多种溶质。它可以按照溶质的极性把它们包 容在不同部位17 】( 如图1 2 ) 。一般地，较大的亲水溶质包容在它的中- l i , 部位。 小的亲水溶质包容在它的中一t l , 部位及极性基层之间的区域，即各个“水室”之中。 疏水溶质则在两亲分子双层的碳氢链夹层之中。本身就具有两亲性的分子，例如 胆固醇、脂蛋白之类的化合物，可插到定向的双层中形成混合双层。这种包容作 用是囊泡多种应用的基础，能使囊泡具有同时运载水溶性和非水溶性药物的能 力。 1 1 3 囊泡的表征【1 8 】 囊泡的表征有很多方法，如透射电镜、光散射法、葡萄糖捕获法以及流变学 方法等。 ( 1 ) 透射电镜 透射电镜是最直观的一种方法，利用这种方法可以直接得到各种囊泡的照 3 第一章前言 片，其缺点是费用高且操作复杂。 ( 2 ) 光散射法 光散射法的操作相对简单得多，它分为静态光散射和动态光散射，可以与透 射电镜相结合，在确认囊泡存在的前提下，准确地给出其半径，并可以跟踪监测 其变化。在越来越多的自发形成囊泡的报道情况下，光散射可以通过粒径的变化 确认囊泡的存在。 ( 3 ) 葡萄糖捕获法 葡萄糖捕获法可以测定出囊泡的增溶量。 ( 4 ) 流变法 流变法可以通过胶束、囊泡和虫状胶束流变性质的差别反映其结构的变化。 2 细胞膜模拟 21 细胞膜模拟概述 图13 流体镶嵌型的生物膜模型 细胞膜一般是由4 0 - 5 0 的磷脂、糖脂等类脂和5 0 6 0 的蛋白质组成。生物 膜是细胞内膜和细胞外膜的统称，此外还包括高等动物体内的复合膜。按照 s i m g e r 和n i c o l s o n 提出的流体镶嵌模型【1 9 1 ( 见图1 3 ) 由磷脂和糖脂等类脂构 成的双分子层是生物膜的基本骨架，而蛋白质则包埋于磷脂基质中，可以从两侧 表面嵌入或穿透整个双层分子，起着渗透屏障的作用。双分子层的每个磷脂分子 第一章前言 都可以自由横向移动，其结果使双分子层具有流动性、柔韧性、高电阻性及对高 极性分子的不通透性。因此，生物膜结构不是僵硬、静止的，而是动态、流动的 结构【2 0 】。 膜模拟化学主要研究胶束、单分子层、双分子层、囊泡、主客体系和聚离 子等有序组合体的特性和应用，是近年来迅速发展起来的- - i - j 新兴科学，是化学、 物理学、生物学基础边缘学科和多种工程技术的汇合点。早在6 0 年代初，m u l l e r p 等h i 2 1 1 在水溶液成功形成自组装平板类脂双层膜( p l a n a rb i l a y e rl i p i dm e m b r a n e ， 简称b l m 膜) ，这种膜与细胞膜的组成和结构相似，因此可作为细胞膜的模型用 于各种研究。b l m 膜与后来相继出现的各种模拟细胞膜( 包括l b 膜，支撑的 b l m 膜) 为我们提供了研究细胞膜的有效手段。进行细胞膜模拟的研究具有如 下意义： 第一，有助于认识许多生命现象，对膜结构的认识还可为物理学的发展作新 的启迪。 第二，研究在比较简单的体系中模拟膜为媒介的过程，并以此为基础，开发 这种新型化学的实际应用。我们可以利用胶束、单分子层、双分子层、囊泡、主 客体系和聚离子这些统称为膜模拟剂的物质来组成底物、改变微环境和反应性、 以及用作载体。目前已经应用于反应性控制、光化学太阳能的转换和贮存、分子 的识别和输运、药物胶囊化、以及为底物和酶提供独特的环境1 2 】。如今，随着膜 模拟化学的发展，反胶束、囊泡和聚离子等还广泛应用于制各各种结构的纳米功 能材料中【2 2 1 。 1 2 2 细胞膜模拟系统 膜模拟剂分为两类：( 1 ) 由表面活性剂组成，起主体作用；( 2 ) 在聚合物主干 上有电离基团。其中由表面活性剂和磷脂等两亲分子在溶剂中分散、聚集的分子 有序体占主要部分，其各组合有序体的组织结构如图1 4 所示。图中各种结构都 是简单化了的。实际上，目前还没有一个模型能完美到如实地模拟出复杂膜集合 体。表面活性剂是由疏水和亲水两部分组成的两亲分子。极性头基之间的排斥和 碳氢链之间的缔合的相反力导致表面活性剂在水中的聚集。当水溶液中表面活性 剂的浓度超过i 临界胶束浓度( c m c ) 就在溶液中形成胶束，随着浓度增加依次形 成球状胶束、棒状胶束和液晶相；在非水溶剂中，若有痕量水存在，表面活性剂 之间的偶极一偶极及离子对相互作用的结果形成反胶束。若增加水的浓度，将形 s 第一章前言 成较大的聚集体。如果水的浓度进一步增加，开始出现油包水微乳。将表面活性 剂的有机溶液铺展在水面上，则在空气一水的界面形成单层；若将单分子层转移 到固体支持物上就可形成多分子层。合适的表面活性剂能够形成双层，双层有两 类：第一类，在小针孔的口上形成平的类脂黑膜( b l m ) ：第二类，封闭的双 层囊泡，由类腊膨胀形成。所有的这些有序组合体的形态差别很大，水溶胶柬具 有直径4 - 1 0 r i m 的球体，反相胶束具有类似的大小，微乳和囊泡要大一些，它们 的直径分别为5 - 5 0 0 n m 和3 0 - 1 0 0 0 n m 另外它们的稳定性也各不相同，胶束、微 乳和囊泡在它们形成后可保持稳定几个星期，在相近的条件下，单分子层可保持 同样长的时间然而b l m 很少能延续超过二三个小时，此外相变也是单分子层、 b l m 和囊泡的一个重要性质。 照遴严 一j = = 瓠 单层 耱瓤l ! 鳓 球形般京幢状腔京 反胶柬 图1 4 不同介质中表面活性剂的自组装体结构简略图2 i 上述这些有序组合体作为膜模拟剂，具有如下特性：( 1 ) 使反应物增溶、浓 集、分隔、组织化和定域化；( 2 ) 保持质子和域反应物的梯度；( 3 ) 改变量子效率； ( 4 ) 改变电离势；( 5 ) 改变氧化和还原电势；( 6 ) 改变离解常数：( 7 ) 影响有方向 性的电子取代：( 8 ) 改变光物理途径和速率；( 9 ) 改变化学途径和速率：( 1 0 ) 使 反应物、中间物、过渡态及产物稳定；( 1 1 ) 把产物( 电荷) 分开；( 1 2 ) 它们本身 是化学稳定的、光学透明的、光化学非活性的。当然，不是全部模拟物都满足所 6 第一章前言 有这些功能或者对所有的应用提供独特的介质。 1 2 3 生物膜模拟模型 生物膜的模拟是研究生物膜的一个重要的必不可少的手段。生物膜的通透 性、膜上各类脂的作用以及脂与蛋白质的相互作用等都需要通过人工膜的研究来 得到阐明。利用人工膜可以避免生物体系中的许多复杂的相互作用关系，实验的 结果比较容易分析。不过作为生物膜模型的人工膜，应当具备以下特点： l 、化学组成和厚度与天然膜相似； 2 、能有效地分开两种不同的水相； 3 、具有结构和化学的两侧不对称性； 4 、易于操作，能用来研究膜的向量功能，例如传递等。 显然，囊泡具备以上特点，囊泡是研究和模拟生物膜的最佳体系。不过除 了囊泡之外还有两种常用来做生物膜模拟的模型： ( 一) 平面双层膜： 平面双层脂膜特别适合于研究膜的电化学性质。双层脂膜的主要优点在于 膜电位、p h 梯度、离子强度上的研究，它的主要缺点是膜面积太小，在它的平 均寿限时间内能通过的物质太少，不易精确分析。在操作的技术上，由于双平面 膜很薄，因此防震是实验操作中的一个颇为关键的问题2 3 1 。 ( 二) 磷脂与蛋白质重组合形成功能膜： 重组合的研究包括三方面：把生物膜溶解；分离与鉴定膜蛋白；从磷 脂与蛋白质重组合形成与天然膜结构和功能一致的人工膜。如果重组合成功，这 些研究就可以说明脂蛋白质相互作用、各蛋白质组分之间的相互关系以及它们 在膜内的分布情况。 1 3 本论文研究的目的和意义 胆固醇作为细胞膜中的必要成分，其与磷脂的结合研究引起了广泛关注，特 别是关于胆固醇与磷脂在气液界面的复合膜的研究成为近年来的热点1 2 4 五8 】。研 究发现了胆固醇的浓缩效应【2 9 1 ，大量的文献研究胆固醇的) j n ) k 对甘油磷脂膜或鞘 磷脂膜的影响【3 0 3 4 1 。牛血清蛋白( b o v i n es e r u ma l b u m i n ，简写b s a ) 是牛血清 中的主要蛋白质，其含量约占血清中蛋白质总量的一半，在血液中参与维持渗透 压以及物质运输等功能，是人们最早发现并对其进行研究的蛋白质之，它性质 7 第一章前言 比较稳定，在分子生物学和细胞生物学等方面得到了广泛的应用【3 5 4 1 1 。g e m i n i 表面活性剂是一种新型的表面活性剂【4 2 1 ，具有更高表面活性，能更有效的降低溶 液的表面张力，更容易聚集生成胶团，具有较低的k r a f t 点，优良的润湿性能， 与其它表面活性剂复配可以产生更大的协同效应，因此越来越引起各国研究工作 者的重视【4 3 4 7 】。脂质体常用于模拟细胞膜为媒介的过程。通过电子显微镜4 8 4 9 1 、 核磁共振【5 0 。5 、荧光f 5 2 - 5 3 1 、红外【5 4 】、动态光散射5 5 1 等方法，脂质体的形态和组 分【5 6 】、相变【5 7 - 5 8 1 ( 相变温度、相变浓度、相变动力学、添加物对相变的影响) 、 电学性质【5 9 】( 主要是跨膜电位) 、分子动力学6 0 石1 1 、渗透性【6 2 1 ( 底物跨越双层的输 运) 等都得到细致的研究。 鉴于以上物质的重要性及研究热点，在本论文中，以卵磷脂形成的囊泡模拟 细胞膜，以t r i s 缓冲体系模拟细胞膜所处的环境，并根据细胞膜的组成添加胆固 醇和牛血清蛋白以构建一种模拟细胞膜的模型，通过g e m i n i 表面活性剂对卵磷 脂囊泡的破坏作用，研究胆固醇、牛血清蛋白( b s a ) 对模拟细胞膜稳定性的影 响。本文以纯卵磷脂囊泡、添加胆固醇的卵磷脂囊泡、添加b s a 的卵磷脂囊泡 体系为研究对象，通过l b 膜分析仪研究混合单分子膜在气一液界面的形成，以 探讨各物质问的作用力，同时还结合停流法、动态光散射技术、透射电镜等方法 考察胆固醇和b s a 对模拟细胞膜( 卵磷脂囊泡) 稳定性的影响，更加完整地研 究了以g e m i n i 表面活性剂一脂质体为模型的细胞膜模拟体系。 在本论文中，模拟细胞膜即卵磷脂囊泡，在以后的章节中，为了表述的方便， 都用卵磷脂囊泡代替。 8 第二章理论部分 第二章理论部分 2 1 单分子膜 2 1 1 单分子膜的尢a 等温曲线 单分子膜是指在界面上形成的具有一个分子厚度的有序排列薄膜，当前研 究最多的是空气水界面。把某些两亲分子铺展在水面上，便自动形成单分子膜。 硬脂酸是典型的两亲分子，硬脂酸分子的一端是亲水基团，另一端是疏水的烷基 长链。当表面浓度较高时，硬脂酸分子在水面上紧密排列，分子的亲水基向下伸 入水中，疏水链朝向空气，如图2 1 所示。 h 本h 图2 1 硬脂酸的分子结构、模型示意图。删 为了得到单分子膜，首先将成膜分子溶解于适当的溶剂中，配成一定浓度的 极稀溶液，典型的溶液浓度是0 1 1 0m g m l 。要求所用溶剂既与成膜分子不起 化学反应，铺展时也不溶于水，同时还要有挥发性。常用的溶剂有氯仿、正己烷、 环己烷、乙醚、苯、以及它们的混合物等。溶剂的挥发性应合适，如果溶剂挥发 太快，单分子膜来不及扩散，引起成膜分子不均匀分布。然后，用微量注射器将 适量溶液均匀地滴加在亚相表面上，溶液立即向外扩展。静置一段时间，待溶剂 挥发掉，在亚相表面就形成单分子膜脚。6 6 1 。亚相的组成、p h 值、离子强度等对 单分子膜的质量和性质有着显著影响。高纯度的超纯水，具有很高的表面张力( 在 9 第二章理论部分 2 0 ( 2 时水的表面张力约为7 3 m n m ) ，是最常用的亚相。当铺展面积很大时，相 邻分子间距离较大，分子间相互作用力很弱，表面压约为零。开始压缩障条，随 着滑障的移动，单分子膜的面积也随之减小，分子的表面密度增大，表面压随之 发生明显变化。在压缩过程中，单分子膜发生几次相转变，这些相转变可以从表 面压与每分子平均所占面积曲线( 即兀_ a 等温线) 看出。7 c a 等温曲线是在恒定温 度下表面压力随平均分子面积的变化而变化的曲线。表面压力的测量则是通过一 个位置传感器来完成。若吊片的长度是l ，则膜对吊片所施之力是兀l 。若膜将吊 片推动d x 距离，则所作之功是7 c l d x 。设l c m 2 干净水面的表面自由能是丫o ，而单 分子膜的表面自由能是丫，因吊片移动d x 后膜的面积增加了l d x ，故此体系的自 由能减少了“o q ) l d x ，这就是体系所作的功，则 - 量 z 譬 兀l d x = ( 丫。一丫) l d x 7 r 呷旷叮 【2 1 】 【2 2 】 该式的物理意义是指表面压是膜分子对单位长度的吊片所施加的压力，其数 图2 23 0 ( 2 时十五酸在纯水亚相单分子膜的兀一a 等温曲线1 6 7 i 1 0 第二章理论部分 值等于水的表面自由能与单分子膜表面自由能的差值，即兀是纯液体的表面张力 和铺上膜后的表面张力之差。弘a 等温曲线是对l a n g m u i r 单层膜的热力学测量。 单层膜中发生的热力学相变会通过平台，转折点等在兀一a 等温曲线中反映出来。 图2 2 是典型的7 c a 等温曲线，它反映了表面活性剂在气液界面压缩时可 能出现的相变过程。曲线有几个性能迥然不同的区域，每个部分相对膜内的一个 特定的相，在压缩过程中，单 分子层经历几次相变。开始 时，每个有机分子在水面上占 有比自己本身大得多的面积， 水面上分子不多，呈“气态 ， 叫气态膜。气态膜中大多数分 子平躺在表面上，彼此没有作 用力，分子可自由浮动，如图 2 3 ( a ) ，气态膜受压缩就转 化为液态膜，随着膜压的增 大，水面上分子被压缩而“液 化”，成为液态膜。液态膜阶 叫：卜v - ( 卜删 a b c 图2 3 单分子膜中分子状态示意图i 娼 段分子开始在水面上定向，部分疏水链倾斜与水面朝向空气，可能弯曲或呈“l ” 状构型排列，亲水基和部分疏水链吸附在水面上，如图2 3 ( b ) 。在气态膜和液态 膜中间还存在一个过渡过程，表现为兀a 曲线上的平台。经过这个平台，兀会随 着表面积减少而迅速上升。继续增大膜压时，分子将紧密排列，表现出固态膜的 性质，单分子层的分子尽可能靠近，分子垂直或以某一角度倾斜于水平面，如图 2 3 ( c ) ，此时膜的压缩性很低，分子间有很强的键键相互作用，分子紧密排列在 一起，弘a 曲线几乎呈垂直状态，随着膜进一步压缩，7 c a 曲线出现拐点或断裂， 单分子层随即坍塌。在x - a 曲线中，如果把曲线固相段外延到零表面压，与横坐 标相交于某一点，这点的数值就是固相区单分子的平均占有面积，也称为分子极 限面积。继续压缩处于固相段的有效面积，会导致单分子膜的破裂，此时的压力 称为崩溃压，它是表征一个两亲化合物成膜性能好坏的重要标志。 2 1 2 混合膜表面过剩面积及相关参数 基于混合单分子膜组分之间相容性的相互作用，可以类比不完全相容、部 1 1 第二章理论部分 分相容或不相容。通过相同表面压下的混合单分子膜的面积与非混合、纯组分单 分子膜的面积得到过剩面积如叫： a e = = 4 2 - ( a i x i + 4 置) 【2 3 】 式中a 1 2 是混合单分子膜中每个分子所占平均面积，a i 、a 2 是相同表面压 下组分l 和2 单独铺展单分子膜平均占有面积，它们部由对应的兀a 等温线获得， x l 、x 2 是组分1 、2 在混合膜中的摩尔分数。 根据过剩面积缸，可以判断混合膜中各物质之间的作用力m 7 1 】： 若如= o ，表现为混合膜中异种分子之间的相互作用与它们各自相同分子 之间的相互作用相同，两物种为理想混合或者完全不相容； 若如 0 ，与同种分子之间的相互作用相比，混合膜中异种分子之间主要 表现为相互排斥。 另外，根据过剩面积，可以计算混合单分子膜的混合表面过剩自由能g 斧： g 孑：7 心1 乒 幽】 若g 孑= o ，表示混合膜中异种分子理想混合或完全不互溶；若嘭 0 ，则表示相互排斥。 混合表面过剩自由能曙= 何时- t a s u 。由于混合打乱了单分子膜排列分 子的规整性，所以是一个熵增加的过程，a s m o 有利于混合；因此，g 孑的正 负取决于删0 的正负和大小，表明异种分子在单分子膜中的混合是焓驱动过程。 2 2 囊泡的破坏 囊泡的破坏与囊泡的形成是个相对应的过程。如果把胶团一囊泡的形成过程 模拟为生物学中生物膜的重新组合，那么囊泡一胶团的破坏过程就可以模拟为细 胞膜的分解。在囊泡体系中加入表面活性剂、助溶物或是降低溶液的离子强度， 都有可能会促使囊泡向胶团转变。另外，温度、p h 值也会对这一转变过程产生 影响。 1 2 第二章理论部分 2 2 1 表面活性剂的影响 在这方面研究较多的是卵磷脂囊泡与表面活性剂的相互作用，研究表明，不 论是阴离子型【7 2 - 7 3 、阳离子型或是非离子型【7 5 琊1 的表面活性剂都会对囊泡造成 破坏，并与之形成混合胶束。不同类型的表面活性剂与卵磷脂囊泡作用的研究结 果表明随着表面活性剂浓度的升高，体系呈现出四个阶段的变化( 如图2 4 ) ， 在表面活性剂浓度较低的范围内，囊泡是单分散的，而散射光的变化不大，即图 中i 阶段。随着表面活性剂浓度的增加，引起囊泡的融合，这时散射光会突然升 高，阶段。当囊泡吸附表面活 性剂达到饱和后，囊泡开始破坏， 生成混合胶束( i i i 阶段) ，直至 体系中没有囊泡的存在，全为混 l 合胶束( i v 阶段) 。鲁 对于由阴阳离子复配而成的暑 囊泡而言，一般来说它的两个组 分都不会单独形成囊泡，以一定 比例复配后才会形成，并随两组 分的摩尔比的改变呈现出胶束 ( 或沉淀) _ 囊泡一胶束( 或沉淀) 的变化。 2 2 2 温度的影响 图2 4 加入c 1 2 e 8 后，卵磷脂囊泡体系散 射光随c 1 2 e 8 浓度的变化1 7 卅 有关这方面的研究较少【7 9 。8 1 1 ，但是为数不多的研究同样表明，在高于某个临 界温度时，可以形成囊泡，而低于这个温度囊泡就会破坏。例如黄建滨等【8 2 1 从浊 度、光散射、差热等方面，对阴阳离子复配体系d e a b s d s ( 十二烷基三乙基溴 化铵十二烷基硫酸钠) 进行了研究。结果表明体系从胶束到囊泡转折的温度范 围为3 0 到5 0 。当低于3 0 时，形成的是粒径约为2 5a m 的胶束，其中以 柱状胶束为主并含有少量球状的胶束。当温度高于3 0 时，体系丌始出现粒径 大约1 0 0a m 的聚集体，经过电镜证实这时开始产生囊泡结构，同时，体系的多 分散指数( p o l y d i s p e r s i t yi n d e x ) 变大，反映出体系中的聚集形态不是单一的。 继续升温，高于4 0 时，开始形成多层囊泡，到5 0 时胶束几乎完全转变成囊 泡。而这种形态随温度的变化是可以重复的，多次的升温到降温，体系都会经历 1 3 第二章理论部分 从囊泡的形成到破坏。 l a d a v l e r e 9 3 i 发现在囊泡体系中加入聚合物时，如果温度不同，则囊泡一胶团 转变的中间态也不同( 如图25 ) 。 译，+ 、器 夕= ：。 群卷 赣瓣 譬翟哪”强 u 如黾州捶融弋 一囊 裁然 ”獬 镣删 l “m 5 跨秘 m ，x d 硼l 皓 罔2 5 两种温j ! ! ：下囊泡破坏过程机理的模型假设忡i 2 2 3p h 的影响 对于不同的体系很多研究”琊i 都发现p h 会影响到囊泡的形卷甚至破坏。 j o h n s s o n u l 等研究了p h 对以糖苷为头基的g e m i n i 表面活性荆体系的影响( 如图 2 6 ) 。结果表明在p h 为60 56 时，是囊泡到胶柬的转变范围，并通过光敦射 的数据计算出此时形成的胶束为柱状胶束。同时实验还表明在这个浓度范围内， 体系的单分散性最差，从几个纳米到一百多纳米的离子都存在。这些结果表明， 这个范围内是胶束和囊泡共存的区域。而在6 0 67 范围内，粒径大约为1 6 0 n m 1 4 第二章理论部分 并且单分散性很好。当p h 高于7 5 时，体系可以由原来已经聚结的囊泡重新分 散，并且p h 在7 5 到1 1 整个范围内，都是很好的单分散的囊泡体系。对另外几 种糖苷类g e m i n i 表面活性剂的研究都表明降低溶液的p h 值时，会引起囊泡的 破坏，而形成胶