（微生物学专业论文）人血清白蛋白人白介素2融合蛋白的表达与发酵.pdf

摘要 摘要 白细胞介素2 ( i n t e r l e u k i n - 2 ，i l 2 ) 是分子量为1 5k d a 的糖蛋白，在体内由t 细 胞产生，通过促进t 细胞的增值，增强人体的免疫能力。为提高也2 在体内的半衰期， 实验室构建了携带有2 h s a 融合蛋白编码基因的质粒p p i h ，并在p i c h i ap a s t o r i s k m 7 1 中表达。本研究在此基础上，通过三种溶氧控制策略和甲醇诱导条件的改变，试 图在5 l 罐中，探索提高产物表达量的最优条件，结果证明已构建的pp a s t o r i s k m 7 1 p p m ，产物的最大表达量为4 4m g l ，该菌株生产潜力小。 构建了3 株不同宿主的i l 2 h s a 表达菌，pp a s t o r i sg s l1 5 p p i h 、p p a s t o r i s k m 7 1 p p m 、p p 伽幻，西s m d l1 6 8 p p i h 。对其诱导条件优化后，在各自的最优表达条件 下进行比较发现，g s l l 5 最适合表达i l 2 h s a 融合蛋白，其摇瓶表达量为3 1 4m g l ， 分别是k m 7 1 ，s m d l1 6 8 表达量的2 7 倍和2 9 倍。对三株菌的发酵上清进行w e s t e r nb l o t 验证，结果显示，8 1k d a 处的条带可以与h s a 和i l 2 两种抗体都发生免疫反应，且分 子量与理论计算相符，认为是完整的i l 2 h s a 蛋白。发酵清液经脱盐、冻于保存，取干 粉复溶后，用c t l l 一2 m t t 法测得粗蛋白的几2 生物学活性为1 0 5 x 1 0 6i u m g 。 最后根据密码子的偏爱性以及i l 2 的结构特性，本研究对天然i l 2 编码序列进行了 优化，用高频密码子替换其中低频密码子，并将第1 2 5 位游离c y s 点突变为a l a 。构建 了融合蛋白h s a i l 2 m 的表达菌p p a s t o r i sg s l1 5 p p h 3 z n ，对其诱导条件进行初步优化， 其摇瓶产量为1 4 4m g l 。发酵清液经脱盐、冻干保存，取干粉复溶后测得粗蛋白的2 生物学活性为1 5 1 1 0 0i u m g 。 关键词：自细胞介素2 ；i l 2 h s a 融合蛋白；表达宿主；密码子优化；点突变。 a b s t r a c t a b s t r a c t h u m a ni n t e r t e u l d n 一2 ( i l 一2 ) i sp r o d u c e db ytc e l l si nv i v o ，i ti sak i n do fg l y c o p r o t e i n w h i c hi sa b o u t15k d a i tc a l le n h a n c ei m m u n i t yc a s e st h r o u g hp r o m o t i n gt h er e p r o d u c t i o no f tc e l l si nh u m a nb o d y t h eh a l f - l i f eo fn a t i v e 一2i sa b o u t6 9r a i n i no r d e rt op r o l o n gt h e h a l f - l i f e ，t h ep l a s m i dp p i hw h i c hi n c l u d e st h ee n c o d i n gg e n eo fi l 2 h s aw a sc o n s t r u c t e d a c c o r d i n gt ot h er e s e a r c h , e x c h a n g i n gd i s s o v i n go x y g e na n dm e t h a n o lc o n c e n t r a t i o nw e r e t e s t e d ，ar e s u l tw a ss h o w e dt 1 1 a t 也em o s te x p r e s s i n gl e v e lo f 户p a s t o r i sk m 71 d p mi s4 4 m g l ，t h e r ei s1 2 0m o r ep o t e n t i a li nt h i st r a n s f o t r u a n t 耶1 e nt h er e c o m b i n a n tp l a s m i dp p i hw a st r a n s f o r m e di n t ot h r e ed i f f e r e n tk i n d so f h o s t s ，t h e yw e r epp a s t o r i sg s 1 15 ，pp a s t o r i sk m 7 1a n dp p a s t o r i ss m d l16 8 a f t e r 也e o r t h o g o n a lt e s t , i tc a nb es h o w e dt h a tt h eb e s te x p r e s s i n gh o s tw a sp p a s t o r i sg s115 n l e c o n c e r n t r a t i o no fi l 2 h s ai s314m g l w e s t e mb l o ts h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i n c o n t a i n e db o t hi l 一2a n dh s a t 1 1 em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep r o d u c tw a s81k d a w h i c hw a s r e a c h e dt h ee x p e c t e d a f t e rd e s a l t i n ga n df r e e z e c r y i n g ，t h eb i o a c t i v i t yo ft h ec r u d ep r o t e i n w a sc h e c k e db yc t l l 一2 m t tm e t h o da n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ef u s i o np r o t e i ni l 2 h s a c a ns t i m u l a t et h ed i v i s i o no fc t l l 2c e l l t h ei l 2b i o a c t i v i 时o ft h ec r u d ep r o t e i nw a s 1 0 5 1 0 0 g a st h ee n c o d i n gs e q u e n c eo ft h en a t u r eh u m a ni n t e r l e u k i l 2 2a n dt h ep r e f e r e n c ec o d o no f t h e p i c h 蛔p a s t o r i sw e r ea n a l y z e d 也em u t a n th u m a ni l 2g e n ew h i c hh a dc h a n g e d c y s t e i n e 一12 5i n t oa l a n i n ew a sd e s i g n e da n dc o m p o s e d t h er e c o m b i n a n tt r a n s f c i r m a n tp p a s t o r i sg s 115 p f m mw a sc o n s t r u c t e d t h ee x p r e s s i n gl e v e l a f t e ro r t h o g o n a lt e s ti s14 3 m e c l a f t e rd e s a l t i n ga n df r e e z e d r y i n g ，t h eb i o a c t i v i t yo ft h ec r u d ep r o t e i nw a sc h e c k e db y c t l l 一2 瓜i t tm e t h o d 们托i l 一2b i o a c t i v i t yo ft h ec r u d ep r o t e i nw a s1 51x10 0r u 1 n g k e y w o r d s ：h u m a ni n t e r l e u t d n 一2 ；f u s i o np r o t e i n i l 2 一h s a ；e x p r e s s i n gh o s t ；c o d o n o p t i m i z a t i o n ；s p o tm u t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 日 期： 盖盘丘4 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定i 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 人白介素2 概况 1 1 1 人白介素2 白细胞介素2 ( i n t e r l e u k i n 2 ，i l 2 ) 是由t 细胞受丝裂原或抗原刺激后而产生的一 种细胞因子，它在机体的免疫应答中起重要作用。1 9 7 6 年m o r g a n 等人【1 】用丝裂原( 植 物血凝素( p h a ) 、刀豆蛋白a ( c o n a ) 等) 刺激t 淋巴细胞产生一种因子，称t 细胞生长 因子( t c g f ) 。1 9 7 9 年国际淋巴因子专题会议统一命名为白细胞介素2 。1 9 8 3 年日本 学者克隆了i l 2 的基因，并成功表达。1 9 9 2 年美国f d a 首先批准r h i _ l 2 应用于临床。 天然人i l 2 在体内主要由活化的i 型辅助淋巴细胞( t h l 细胞) 分泌，分子量为1 5 5 k d a 的糖蛋白，等电点在6 6 - 8 2 2 。成熟的i l 一2 分子由1 3 3 个氨基酸残基组成【3 】，它 剪切掉了几2 前体n 端2 0 个氨基酸残基的信号肽，翻译后加工的过程还包括在5 8 位 和1 0 5 位半胱氨酸( c y s ) 之间形成二硫键，以及在第三位t h r 位点的糖基化。正确的 二硫键对于也2 活性的保持是必需的 4 】，但糖基化却与活性无关【5 1 。在生物学活性上， 也2 的氨基端和羧基端对于其结构和活性都起到关键作用，j u 等【6 悃定点突变的方法研 究了氨基酸序列对2 活性的影响，如图1 1 所示，图中氨基酸序列上箭头所示为突变 成相应氨基酸后突变体所保留的几一2 的活性，没有注明百分数的，说明该位置的突变对 活性没有影响。 1 1 2i l - 2 的生物学作用及临床应用 i l 2 的生物学作用以刺激t 细胞增生为主，是t 细胞在体外长期生长所必需的因子， 也是t 细胞成熟因子。它可促进已活化的t 细胞增殖，并分化成熟为t d 细胞和t c 细 胞，诱导t 细胞表面i l 2 r 的表达增加，并可诱导t 细胞分泌i f n y ，t n - f $ c s f 等细胞 因子 7 ，8 1 。除了t 细胞，i l 2 也对b 细胞、n k 细胞、巨噬细胞和少突神经胶质细胞的功 能具有上调作用唧。 也2 是机体免疫调节网络中的核心物质，与其他细胞因子有协同和拮抗作用，共同 完成机体免疫技能的平衡调节作用。所以在抗病毒、抗感染性疾病、抗肿瘤【1 4 ，l5 等疾病 治疗中得到广泛应用。如采用i l 2 治疗慢性活动型乙肝病人 1o 】；实验室内白介素2 对 小鼠和豚鼠的h s v 病毒感染有明显的抑制作用u u ；r i l 2 对结核杆菌( t b ) 的抑制作用 高达9 9 1 2 】；对a i d s 病患者使用低剂量r i l 2 ( 1 x 1 0 5i u d ) 治疗1 个月也获得了一定的 效果【1 3 】。 一 江南大学硕士学位论文 6 5 z l l e s o - l o o z1 2 1 9 譬 s x v a l 4 1 2 x 卜丐石= 7 ；昏i _ 叫0 01 5 0 z t h rg l u g 1 nl e u6 i np h eg 1 q 电t t t 2 0 tt3 0ttt 至墼鹜乌l e u8 1 扣m e ti l el e ua s hg l yl l ea s ha s ht fl 羚a s hp r ol y sl e u 3 0 4 0 譬 5 0 z 5 z g l ul r l ev a lt w - g l ut y l - r r gl e u t t4 0t tt+tt t h ra r g tt e u t h rp h el y sp h et ”t p h e 6 6 1 0 0 x 5 p h i sl i e ug 1 n 1 x s e r l y s 3 0 一6 0 1 s l ug i t r pg 1 u tt5 0t p r ol y sl y sa 1 at h r 6 1 u l e ul y s 6 0 ，7 0 l e ug 1 ug 1 qg 1 ut e ul y sp r ol e ug 1 ug 1 uv a lt e ua s hl e u 8 0 9 0 a 1 a 笪bs e tl y s a s hp h e h i sl e ua r gp r oa r ga s pl e ul l es e ta s h1 1 ea s h l o o v a li l ev a ll e ug l ul e ul y sg 1 ys e tg 1 ut h rt h rp h em e t 1 l o a s pg 1 ut h r a i at h r1 1 ev a lg 1 up h el e ua s n 3 8 x s e r g 1 ut y ra 1 a 1 暑 i l _ e u o 0 8 2 5 誓 1 x s e ts e rg 1 u 1 2 0 ft a r gt r fpl l et h r ，苎曼囟垒1 2 p h e 5 l o 量 2 0 - 3 0 墨 图1 - 1 2 中氨基酸对其活性的影响 f i g u r e 1 - 1e f f e c to fd i f f e r e n c ea m i l oa c i do nb i o a c t i v i r yi ni l 一2 1 1 3 长效n 一2 的研究进展 自1 9 7 9 年首次发现i l - 2 后，1 9 8 3 年t a n i g u c h i 首次成功克隆了人的白介素2 的 e d n a 使得i l 一2 的大量生产和研究成为可能 1 6 1 。9 0 年代初i l 2 在美国问世 1 7 j 。1 9 9 1 年， 中国科学院上海生化研究所和军医医学科学院承接了“八五 重点攻关课题基因重 组白细胞介素2 。中国科学院上海生化研究所构建了表达正2 的p l y - 4 质粒 1 8 】，表达水 平可达5 0 。此课题于1 9 9 4 年获一类新药证书，卫生部批准按照g m p 标准试生产，并 在指定医院进行临床试验，随后基因重组白细胞介素2 通过卫生部组织的第三期临床审 定，首批获得正式生产文号。这是我国继干扰素后第二个正式进入市场的基因工程高科 技药品。 2 申 第一章绪论 近年来，虽然基因工程i l 2 应用于肝炎及某些癌症的治疗效果引人瞩目，但由于i l 2 分子量小、半衰期短，大剂量长时间用药对病人造成了一系列的副作用，如发热、寒战、 呕吐、头晕和毛细管综合征等【1 9 1 。因此有必要定向改造i l 2 的结构使其成为具有高活 性、低毒性的超级i l 2 。有研究者通过蛋白质工程技术将1 2 5 位c y s 突变为a l a 、1 8 位 l e u 突变为m e t 、1 9 位l e u 突变为s e t 来提高蛋白的稳定性和活性。郑长青等人【2 1 】 将i l 2 的第8 8 位的氨基酸由天冬氨酸( a s h ) 变为精氨酸( a r g ) 并在大肠杆菌中得到高 效表达。 另外采用亲水惰性的高分子和蛋白质的非必需基团共价相结合，可以使抗原决定簇 屏蔽，这样异源性物质在体内不被免疫系统识别，也就不会不产生相应抗体，从而解除 异体蛋白免疫原性。免疫原性被解除后，就不会因为在体内产生抗体而被清除；同时由 于大分子修饰物在蛋白质表面的遮蔽作用，使得蛋白质不易被蛋白酶降解；另外蛋白质 被修饰以后，其分子量大大提高，就不会轻易被肾小球过滤，也就是降低了滤过率。由 于上述几个因素共同作用的结果，使得修饰后蛋白质在体内半衰期得以延长。刘新垣等 2 2 1 就是采用了以i l 2 为模型，合成了两种p e g 的活化试剂，并且最终将也2 的半衰期 提高了7 倍。 令人瞩目的研究方向还有2 的融合蛋白。通过构建融合蛋白技术增加多肽蛋白 类药物分子量延长药物半衰期。国内外都有相关报道。如1 9 9 2 年g i l l i e s 等成功地表达 了重组抗神经节苷脂抗体( g d 2 ) 和i l 2 的融合蛋白 2 3 1 。1 9 9 5 年，e r i c 等对融合蛋白 i g g 3 i l 2 的药理学进行了研究，认为该融合蛋白可以促进l a k 活性【2 4 j 。2 0 0 3 年，k l i m k a 等构建了i l 2 和其保护性单链抗体的融合蛋白，结果证明可以有效抑制相应蛋白酶对 几2 的降解【2 5 】。2 0 0 5 年，魏雪涛等构建了马立克氏病病毒妒与i l 2 融合基因载体并 表达成功 2 6 。2 0 0 7 年，倪剑锋等构建了抗g d 2 单链抗体与2 融合蛋白的基因并大肠 杆菌中表达【2 7 】。 1 2 人血清白蛋白( i i s a ) 概况 1 2 1 人血清白蛋白简介 人血清白蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 是由5 8 5 个氨基酸组成的单链无糖基 化的蛋白质，分子质量为6 6 5k d a ，等电点在4 7 - - 4 9 之间。它是人血浆中最丰富的蛋 白质，占血浆总蛋白的6 0 左右。每升人血含h s a 约4 0g ，一个正常成年男性( 体重 以7 0 蚝计) 约有3 5 4l 血液，即血浆中约有1 6 0gh s a 。h s a 除存在于血浆中外， 还存在于组织、身体的分泌液、皮肤和淋巴腔中，构成血管外池，血液里和血管外池总 的h s a 达3 5 0g 【2 引。 在体液中，人血清白蛋白可以运输脂肪酸、胆色素、氨基酸、类固醇激素、金属离 子和许多治疗分子；同时，它可以维持血液正常的渗透压。在临床上人血清白蛋白可以 用于治疗休克与烧伤，用于补充因手术、事故或大出血所致的血液流失 2 9 】。 重组人血清白蛋白( r e c o m b i n a n th u m a ns e r u ma l b u m i n ，r h s a ) 还广泛用于血浆容 量扩充剂。因其具有无酶活性且无免疫原性等特点，还可作为赋形剂和稳定剂，用于各 江南大学硕士学位论文 种药物制剂及无血清细胞培养基的组分等。另外，由于具有抗氧化性，r h s a 也被用作 药物载体，从而赋予药物更好的理化特性【3 0 j 。 1 2 2 人血清白蛋白的表达系统研究进展 d u g a i c z y k # j l 3 l 】在1 9 8 1 年首次报道了r h s a 的c d n a 序列并且首次采用色氨酸( t r p ) 启动子，色氨酸引导肽及来自质粒p b r 3 2 2 的t c r 和a m p 。基因构建了第一个表达重组人 血清白蛋白的表达载体p h s a i 并在大肠杆菌中得到了成功表达。但应用大肠杆菌表达 系统，表达产物存在于细胞质形成包涵体形式，其基因工程产品需要破菌、分离包涵体、 纯化和复性，而h s a 分子内部二硫键多、三维结构复杂、多肽链骨架内部原子空间排 布所占体积大，所以用大肠杆菌表达容易形成折叠错误以及构象有别天然分子的重组 h s a 分子，并且表达量也较低，一般在每升几十毫克水平，因而难于产业化。 据报道，r h s a 已尝试在多种酵母中表达【3 2 ，3 3 1 ，尤其在毕赤酵母中的表达最为成功， 摇瓶表达近2 0 0m 叽，发酵罐中约为4g l 。国内以毕赤酵母为宿主在摇瓶中的最高表 达量为3 5g l t 3 4 1 。 另外r h s a 在动物、植物表达系统中都获得了成功表达 3 5 1 。 1 2 3 白蛋白融合技术( a l b u m i nf u s i o nt e c h n o l o g y ) 由于h s a 无酶活性和免疫原性，人体相容性好，分子量大( 约为6 6k m a ) ，半衰期 长约1 9d ，微生物发酵表达量高 3 6 等优点，它是目前最常用的融合蛋白载体，通过构建 融合蛋白技术增加多肘蛋白类药物分子量可延长药物半衰期，因此以h s a 为载体的融 合蛋白技术一白蛋白融合技术( a l b u m i n f u s i o n t e c h n o l o g y ) 倍受关注。 美国马里兰州人类基因组科学( h g s ) 公司已经进行一系列与h s a 融合延长蛋白质 药物半衰期的研究【3 7 4 ，其蛋白质药物h s a i f n c c 融合蛋白( a l b u f e r o n c c ) 已完成i i 期临 床试验，在研发的处于临床早期阶段的蛋白药物有h s a i f n p 融合蛋白( a l b u f e m n - 1 3 ) 、 h s a r i l 2 融合蛋白( a l b u l e u k i n ) 、h s a r g 。c s f 融合蛋( a l b u g r a n i n ) 、h s a r h o h 融合 蛋( a l b u t r o p i n ) 。 国内也有类似的报道，如2 0 0 5 年，张伍魁等将h s a 与干扰素q 一2 b 在毕赤酵母中 融合表达，表达产物具有1 1x1 0 7u m g 的生物学活- 洼 4 2 1 。2 0 0 6 年，唱韶红等在毕赤酵 母中表达h s a i f n c t 2 b 融合蛋白，经纯化后以猕猴为动物模型，静脉注射的血浆半衰期 为1 0 1h ，皮下注射的半衰期为6 8 2h 【4 3 j 。 1 3 毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 表达系统 1 3 1 几种毕赤酵母宿主的特性 p i c h i ap a s t o r i s 表达宿主菌于8 0 年代初开发获得，大多应用的宿主菌是通过对野生 型石油酵母y 11 4 3 0 进行突变改造而来。常用的酵母表达菌株可分成两类删，醇氧化酶 ( a l c o h o lo x i d a s e ，a o x ) 型和蛋白酶缺陷型。g s l l 5 、i q m 7 1 、m c l 0 0 3 属于第一类。 在户p a s t o r i s 中已经鉴定了两个a o x 基因( a o xi 和a o x l i ) ，a o x i i 编码的蛋白质 与a o xi 编码的蛋白有9 7 的同源性和几乎相同的催化活性，a o xi 基因的启动子 4 第一章绪论 ( p a o xi ) 受甲醇强烈诱导，而p a o x i i 则很弱。g s l l 5 同时含有a o xi 和a o x i i 基 因，在含甲醇的培养基上快速生长。k m 7 1 的a o xi 基因已被酿酒酵母的a r g 4 基因 所代替，因此，此类茵只有依赖较弱的a o x i i 基因，在以甲醇为单一碳源的培养基中 低速生长。m c l 0 0 3 的两个a o x 基因都被敲除，不能在以甲醇为单一碳源的培养基上 生长。s m d l l 6 8 、s m d l l 6 5 和s m d l l 6 3 菌株为蛋白酶缺陷型菌株。这类菌株基因组中 缺失编码蛋白酶a ( p e p 4 ) 和( 或) 编码蛋白酶b ( p r b l ) 的基因。s m d l l 6 8 编码p e p 4 的基因缺失，这大大降低或消除蛋白酶a 和羧肽酶y 的活性，并部分降低了蛋白酶b 活性；s m d l l 6 5 编码p r b l 的基因缺失使该菌株蛋白酶b 活性的丧失；而s m d l l 6 3 菌 株编码p e p 4 和p 而l 的基因均缺失，其结果是大大降低或清除了这三种酶活性。蛋白酶 缺陷型菌株减弱了蛋白酶对外源蛋白的降解作用，特别适用于分泌型表达。大多数常用 的pp a s t o r i s 宿主菌均为组氨酸脱氢酶基因缺陷型菌株( 1 a i n ) ，只能在含有组氨酸的培 养基中才能生长，这一特性有助于在无组氨酸的葡萄糖基础培养基( m i n i m a ld e x t r o s e m e d i u m ，如) 上筛选阳性转化子。 1 3 2 毕赤酵母表达载体 毕赤酵母表达载体包括自我复制型的游离载体和整合型载体，但以整合型载体为 主。常见的整合载体又分为胞内表达和分泌表达两类。胞内表达的载体有p p i c 3 、p p i c k 、 p p i c 3 5 k 、p p h i l d 2 、p p i c z a 、p p i c z a b 、p p i c z a c 等；分泌表达的载体有p p i c 9 、 p p i c 9 k 、p a c 0 8 1 5 、p p i c z a a 、p p i c z a b 、p p i c z a c 等【4 5 】。常用的整合载体多含有强 启动子如a o xi ，有一个外源基因表达框、多克隆位点( m c s ) 和一个从a o xi 基因 上拷贝下来的终止序列( t t ) ，作为筛选标记的b j s 4 基因和在细菌中进行复制起始点和 选择标记( 如c o l e l 复制起始点和抗氨苄青霉素基因) 以及a o xi 的3 非编码区序列， 使外源基因能以同源重组的方式整合到酵母染色体上。 1 3 3 影响外源基因在毕赤酵母中高效表达的因素 从外源基因的结构考虑，影响外源基因高效表达的主要因素有如下四点： ( g r e t a 的非翻译区序列。主要表现在m r n a 的翻译水平上，优化m r n a5 端非 翻译区( 5 u t r ) 的核苷酸序列和长度，一般地，目的基因编码序列的第一个a t g 应尽可 能接近，最好处于a o x l 基因a t g 的位置。s r e e k r i s l m a 等通过调整人血清白蛋白m r n a 与a o xim r n a 的5 u t r 相同后表达水平提高5 0 倍以上 4 6 1 。 起始密码子旁侧序列。如果起始密码子周围容易形成r n a 二级结构序列，将会 阻止翻译的进行，通过r n a 折叠分析可找到可能阻碍翻译正常起始的二级结构，然后 利用替代密码子重新设计并调整翻译起始区及其旁侧序列，对基因进行改造可明显提高 表达水平 4 7 1 。 外源基因的a + t 含量。许多高a + t 含量的基因由于成熟前终止而不能有效转录。 特定的a + t 富含区可作为多腺苷酸或转录终止信号，导致仅产生低水平或截短的 m r n a 4 6 。 5 江南大学硕士学位论文 酵母密码子偏好性。在不改变氨基酸组成的前提下，将编码外源蛋白的密码子优 化为酵母的偏爱密码子，可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。在酵 母中表达量较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子j 。 从酵母转化子的筛选考虑，影响外源基因高效表达的主要因素有如下两点： 外源基因在酵母内的拷贝数。蛋白表达的优化往往涉及多拷贝表达株的筛选。含 多拷贝整合表达盒的菌株常比单拷贝者表达量高，但情况并非总是如此。pp a s t o r i s 表 达载体在染色体上大多为单拷贝整合，但基于整合的稳定和a o xi 启动子的强启动性， 般单拷贝也可能获得较高的表达水平。如含单拷贝乙肝表面抗原( h b s a g ) 基因的表达 株可获得0 4g l 的产量 4 9 j 。多拷贝整合则有利于充分发挥户p a s t o r i s 的表达潜力。最近 的研究显示，在l 8 整合拷贝数范围内，h b s a g 表达量随基因剂量的增加而成比例升高 5 0 】。理论上表达量会随基因拷贝数的增加而上升，但也有少数例外，即拷贝数增加对表 达产生负效应 5 1 j 。 甲醇利用表型。在尸p a s t o r i s 中一般使用整合型表达质粒，通过同源重组稳定整 合于染色体的a o xi 区或h i s 4 区。a o xi 区的整合包括同源双交换引起的基因置换和 位点特异性单交换引起的基因插入。前者使染色体a o xi 基因被外源基因表达盒替换， m u t + 表型菌株会转变为m u t 5 或m u t - ，而m u t s 和m u t 。菌株表型不变；后者不改变宿主原 有的a o xi 基因，故各种菌株的m u t 表型不变。不同的甲醇利用型对外源基因的表达 水平有很大的影响垆2 l 。 发酵条件也显著影响外源基因的表达水平。pp a s t o r i s 具有强烈的好氧生长偏爱性， 可在极高的培养密度下维持高水平表达，因而利于大规模工业化生产。表达菌株很易从 摇瓶培养过渡到大批量高密度发酵。通常先以摇瓶小规模表达，筛选高表达菌株并初步 确定培养条件。在发酵罐中，可有效监控p h 、通气量和碳源浓度并及时排出代谢产物、 控制维持产物稳定性的因素，所以可达到最优化发酵条件，从而充分发挥大规模高密度 发酵的优势，往往使菌体干重达1 0 0g l 级水平，蛋白产量在每升克级以上水平。 1 4 研究背景与内容 本研究室利用基因工程技术成功构建了含有人白介素2 与人血清白蛋白融合蛋白 ( f u s i o np r o t e i no fi l 2a n dh u m a ns e r u l l 2a l b u m i n ，i l 2 h s a ) 编码基因的重组质粒p p i h 并在户p a s t o r i sk m 7 1 中得以表达，经检测融合蛋白分子量约为9 0k d a ，具有h s a 的抗 原性，用c t l l 2 细胞增殖法测定摇瓶发酵液上清中融合蛋白的人2 活性约为1 0 0 u m l 。 本文在此基础上，进一步开展i l 2 。h s a 的研究工作，主要内容包括： ( 1 ) 以重组菌只p a s t o r i sk m 7 1 p p i h 为研究对象，在5l 发酵罐上对诱导条件( 溶 氧、甲醇浓度等) 进行探索，发掘该菌株的生产潜力。 ( 2 ) 考察常用的三种酵母宿主( 户p a s t o r i sk m 7 1 、pp a s t o r i sg s l l 5 、pp a s t o r i s s m i ) 1 1 6 8 ) 对m 2 h s a 融合蛋白表达量的影响，以期选择合适的宿主。 第一章绪论 ( 3 ) 通过分子生物学手段改造i l 一2 编码基因，包括替换酵母偏好密码子和增加i l 一2 c 1 2 5 a 突变位点，并对h s a 与i l 2 的融合方式进行改造即将2 连接到h s a 的c 末端，以期获得蛋白表达量高、表达蛋白的i l 2 生物学活性好的重组菌株。 7 江南大学硕士学位论文 第二章5 l 发酵罐上溶氧和甲醇浓度对i l 2 h s a 表达量的影响 2 1 引言 溶氧量是影响表达水平的极为重要的因素。有报道认为，如果用发酵罐进行培养， 外源蛋白的表达水平要比普通摇瓶发酵高出1 0 1 0 0 倍，其主要原因为普通摇瓶发酵的 通气不理想，溶氧水平低，影响了菌体的高密度生长及表达 5 引。同时，甲醇诱导的方式、 用量、诱导时间都会对外源蛋白的表达水平产生很大的影响。用两步法( 先用甘油培养 使细胞达到一定的浓度，再加入甲醇诱导) 和联合生长培养的方法( g r o w t h - a s s o c i a t e d ， 在早期加入甲醇诱导) 来诱导外源蛋白的表达都有研究报道，现在常用两步法来诱导外 源蛋白的表达。以甲醇作为诱导剂不但可以诱导a o x 启动子驱动外源蛋白的表达，也 可以诱导蛋白酶的表达，因此甲醇的浓度和流加方式对外源蛋白的表达可以产生影响。 本文在一定的诱导条件下( p h ，诱导温度，诱导时间) ，通过对诱导过程中溶氧水平、 甲醇浓度和流加方式的控制来考察其对融合蛋白表达量的影响。 由于外源蛋白的分泌量与菌体浓度基本成正比关系，人们一般采用高密度培养来实 现外源蛋白的高效表达。毕赤酵母这一应用广泛的外源蛋白重组菌具有好氧、存在 c r a b t r e e 效应、代谢副产物对菌体生长及外源蛋白表达具有抑制作用等特征，所有要求 到微生物的高密度培养必须严格控制营养物质的流加速率。江南大学生物过程与控制实 验室研制了基于p h 和d o 的人工神经网络识别控制方式( a r t i f i c i a ln e u r a ln e t w o r k p a t t e r nr e c o g n i t i o nb a s e dc o n t r o l ，a n ! n p r c t r l ) 基于p h 和d o 的人工神经网络识别控 制方式) ，并将其用于毕赤酵母培养过程中营养物质的流加，不仅大大缩短了菌体培养 时间，而且取得了较高的培养密度 5 4 1 。本文采用上述方法对毕赤酵母生长阶段的营养物 质流加进行控制。 2 2 材料与方法 2 2 1 供试菌种 携带有i l 2 h s a 融合蛋白编码基因的毕赤酵母重组子p p a s t o t i sk m 7 1 ( p p ) 由本课 题组构建并保存【5 引。 2 2 2 主要仪器 b i o t e c h - 2 0 0 2 型5 l 发酵罐 u v 一2 1 0 0 型分光光度仪 1 1 2 a 型气相色谱 f c 2 0 0 2 型甲醇电极流加控制器 p c l 81 2 p g 型d a 、a d 多功能数据采集卡 b t l 0 0 1 0 0 m 型蠕动泵 3 k 15 型超速冷冻离心机 上海保兴生物设备工程有限公司 尤尼柯上海仪器有限公司 上海精密科学仪器有限公司 华东理工大学 台湾研华公司 保定兰格恒流泵有限公司 s i g m a 公司 第二章5 l 发酵罐上溶氧和甲醇浓度对i l 2 h s a 表达量的影响 m i n ip r o t e a n 3c e l l 型蛋白电泳仪b i o r a d 公司产品 d y y - i 4 型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂 隔水式电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂 2 2 3 培养基 y p d 培养基( g l ) ：蛋白胨2 0 ，酵母粉1 0 ，葡萄糖2 0 ，琼脂粉1 8 ； b m g y 培养基( g l ) ：蛋白胨2 0 ，酵母提取物1 0 ，1 0 0m m o l l 磷酸钾p h 6 0y n b 1 3 4 ，生物素4 1 0 巧，甘油2 ； 摇瓶培养培养基( g l ) ：甘油2 0 ，蛋白胨3 0 ，酵母粉1 5 ，k ! - t 2 p 0 4 4 5 ，m g s 0 4o 4 5 ， f e s 0 40 7 5 ，m n s 0 40 7 5 ； 摇瓶诱导培养基( g l ) ：甲醇l o ，蛋白胨3 0 ，酵母粉1 5 ，k h 2 p 0 44 5 ，m g s 0 4o 4 5 ， f e s 0 40 7 5 ，m n s 0 40 7 5 ； 上罐发酵初始培养基( g l ) ：甘油2 0 ，蛋白胨3 0 ，酵母粉1 5 ，k h 2 p 0 44 5 ，m g s 0 4 0 4 5 ，f e s 0 40 7 5 ，m n s 0 40 7 5 ； 上罐流加培养基( g l ) ：甘油2 0 0 ，蛋白胨1 0 0 ，酵母粉2 0 ，m g s 0 45 ； 上罐混合流加培养基：在流加培养基中添加少量甲醇，使发酵罐中甲醇终浓在 0 5 9 z l ； 上罐诱导流加培养基：甲醇( 9 9 5 ) 与去离子水( v v = l ：1 ) 混合。 2 2 4 培养方法 2 2 4 1 种子培养方法 取一环保存于4 。c 冰箱毕赤酵母平板菌种，在y p d 平板上划线，3 0 培养4 8 h 。挑 取单菌落接种于装有5m ly p d 液体培养基的5 0m l 摇瓶中，3 0 c ，1 8 0r m i n ，培养2 0 h 。以1 0 接种量接种于装有1 0 0m ly p d 的5 0 0 m l 摇瓶，3 0 ，2 0 0r m i n ，培养2 4h 左右，作为种子。 2 2 4 25l 罐发酵方法 使用5l 发酵罐，装液量为1 5l ，以1 0 接种量接种。发酵过程分三个阶段：生 长阶段、过渡阶段和诱导阶段。生长阶段：发酵开始时，在转速4 0 0r r a i n 、0 0 5m _ p a 、 通气量4l m i n 的条件下，标定溶氧为1 0 0 。靠流加2 0 氨水以维持罐中p h 在5 5 左 右。培养约1 4h 后，甘油耗尽( d o 迅速上升) 使用a n n p r c t r l ( 口= o 0 5 ) 1 5 4 j 控制流加 培养基，约1 2h 后，细胞浓度达到一个较高的水平。过渡阶段：用a n n p r c t r l 方法流 加混合流加培养基，使得细胞逐步适应甲醇。约4h 后，停止流加。诱导阶段：待发酵 罐内的甘油耗尽后，调p h 6 0 并开始流加诱导培养基，根据实验需要控制溶氧及诱导培 养基的流加。总发酵时间控制在1 0 0h 左右。 2 2 4 3 发酵罐溶氧的控制方法 通过控制发酵过程中搅拌转速和辅助通入纯氧等方法来控制发酵液中的溶解氧浓 度。当发酵液中溶氧值低于目标值时，首先通过调节转速来改善发酵液中的溶氧情况；当 9 江南大学硕士学位论文 转速不能达到预期的溶氧水平，则通过辅助通入纯氧来控制发酵液中的溶氧浓度。发酵 过程中，罐压设定在o 0 51 v _ p a ，通气量为4l r a i n 。 2 2 4 4 甲醇控制方法 通过甲醇的在线检测及流加控制系统包括甲醇采样、在线检测器和离线气相色谱测 定，对诱导过程中甲醇流加进行控制。 2 2 5 分析方法 2 2 5 1 细胞干重测定 菌体浓度采用浊度法测定，分光光度仪波长设为6 0 0 衄，以去离子水作为空白对照。 取1 0m l 不同o d 6 0 0 值的菌体，4 。c ，8 0 0 0r r a i n ，5m a n ，弃上清，用去离子水冲洗沉淀 3 次，置于8 0 烘箱中至恒重，得出o d 6 0 0 值与细胞干重的关系为：细胞干重( d c w ) = o 2 5 0 4 x ( o d 6 0 0 ) 。 2 2 5 2 甲醇浓度测定 用气相色谱仪测定。采用p e g 毛细管柱，内径为3 0m 0 3 2r e _ i n ，初始温度为5 0 ， 保留2r a i n ，升温速率为1 0 m i n ，终止温度为1 4 0 ，保留8m i n 。汽化室2 2 0 ，检测 器温度2 2 0 。载气：高纯氮气；载气流速：1m l m i n ；检测器f i d ；h 2 流速3 0m l m i m 进样方式：手动进样；分流比为5 0 ：1 。采用正丁醇为内标。数据采用n 2 0 0 0 型色谱工作 站分析。 2 2 5 3 总蛋白浓度测定 使用b r a d f o r d 试剂法测定归6 1 。 2 2 5 4 发酵上清中融合蛋白浓度测定 按照h s a 检测试剂盒的说明，根据以下公式计算：融合蛋白含量= h s a 含量融 合蛋白分子量h s a 分子量= 白蛋白含量1 2 4 2 3 结果与讨论 2 3 15 l 罐中茵体生长阶段发酵过程分析 选取菌体生长较为典型的一次实验，其过程如图2 1 所示，发酵开始时搅拌转速调 至4 0 0r r a i n ，菌体在o 5h 内处于延迟期，溶氧下降的速度和菌浓增加的速度都比较 缓慢。5h 之后，菌体生长速度加快。1 2h 左右溶氧