造血干细胞表型及分离纯化方法.ppt

造血干细胞表型及分离纯化方法,一个多世纪前，由Arturappenheim(18701916)提出。是一类同时具有自我更新和向各系血细胞分化能力的原始细胞群。,HematopoieticStemCell,支持干细胞存在的初始证据,1.从小鼠独特的染色体标记中证实，存在能同时产生淋巴和髓系细胞的多能干细胞(pluripotent)。2.慢性髓性白血病同工酶分析可见，B淋巴细胞和髓样细胞都来自慢性髓性白血病干细胞克隆。,3.用带有新霉素抗性基因标志的逆转录病毒载体转染鼠骨髓细胞，分析病毒特异聚集部位证实，不同淋巴和髓系表型的细胞来自同一干细胞。4.鼠胎肝造血祖细胞体外单细胞培养可生成髓系和粒系细胞。,缺乏辨认、计数干细胞的手段。干细胞的辨认仅靠体外克隆形成分析和估算如：CFU-GM，CFU-Mix。Civin等制备出一株鼠抗人髓系白血病细胞单抗(My-10),当时称KG-la,该抗体可与所有造血前体细胞(progenitors)特异结合。,过去干细胞研究进展缓慢的原因,之后，其他研究小组也相继研制出12.8;BI-3c5;ICH-3等类似抗体。1986年，这些抗体被命名为CD34，为目前公认的干细胞的重要标志。CD34抗原的发现促进了造血干细胞研究的深入和发展，是一重要的里程碑事件。,一.造血细胞的表型CD34；Sca-1；Thy-1；Lin-；c-kit二.造血细胞分离方法FACS；磁柱分离；亲合分离；Panning,本次课的主要内容,一、造血干细胞表型,免疫技术、克隆技术、流式细胞分类术等的发展，促进了干细胞的研究，相继发现许多干细胞特有的表型(phenotype)。如CD34；Sca-1；Thy-1；Lin；c-kit等。,1.CD34的生物学特性,（一）CD34,基因定位Chromosome1,(1q32)(human)也有报道位于1q12qter与CD45及一些其它膜蛋白家族毗邻。,全长(spans)2628kb(human),编码序列含8个exons，第1和8个exon编码翻译区和部分非翻译区；27个exons仅编码翻译区。也有报道人CD34基因全长38kb。,基因长度,在cytoplasmicdomains,人、鼠CD34基因的同源性达90%以上。这种同源性在N末端逐渐减少为45%左右。,人、鼠CD34基因的同源性,分子量为105-120kd。人CD34cDNA转录翻译的多肽链长373个氨基酸残基，是一跨膜蛋白。,CD34分子的大小,N端为20aa的信号肽，含有大量的serine/threonine；胞外区258aa；跨膜区22aa；胞内区73aa。,不同部位AA的长度为：,所谓表位是指同一抗原分子上有不同的抗原识别位点。目前有My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3,TUK,115.2等单抗识别的位点。前四株识别的表位取决于sialicacidresidues,后二者却不一样。,CD34分子的epitopes,（根据对neuraminidase和glycopotease的敏感性不同）,对GPAs敏感，对NAAs敏感性不同(My-10,BI-3c5,12.8,ICH-3)对GPAs，NAAs都敏感(TUK3,115.2,8G12)对NAAs不敏感，对GPAs敏感(QBEND-10),CD34表位分三类：,许多CD分子既是细胞分化的标志也是功能的标志。CD34分子的确切功能目前尚不完全清楚，但已发现具有以下功能：,2.CD34的功能,(1)粘附功能(与stromalcell粘附),电镜发现CD34分子浓集在内皮交叉膜(interdigitatingmembrane)的micro-processes。此部位是白细胞结合并迁移到血管外的重要部位。CD34分子的结构可能影响其与细胞的粘附。,此外，淋巴内皮小静脉粘附实验表明，由重组L-selectin识别的一种内皮糖蛋白的硫化碳水化合物，其氨基酸的序列与CD34一致，因此，CD34分子至少可作为L-selectin的配体，协助干细胞与基质细胞接触和粘附。,干细胞越原始，表面CD34分子密度越大，细胞分化到形态学发生改变时，表面CD34分子表达逐渐减少，直至消失。推测，在造血早期，CD34分子的作用可能与干细胞之间或干细胞与基质细胞之间的接触、通信和相互作用有关。,(2)细胞间接触、通信和相互作用,Civin小组证实，CD34可由激活的PKC迅速磷酸化，激活的PKC能刺激CD34阳性前体细胞CD34上调，这种上调独立于内质网内CD34的转录和转换。可见，CD34磷酸化是细胞表面上调的扳机，PKC活化是生长因子配体-受体结合启动胞浆信号转导级联的一个成分。,(3)在细胞信号传导中的作用,外周血单核细胞约为0.1%破骨细胞(osteoclasts)、骨髓基质前体细胞、外周神经鞘细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞等也发现有CD34抗原表达。骨髓单核细胞约为13%。,3.细胞CD34的表达,一些恶性疾病，如AML、早前，前和急性T淋巴细胞白血病细胞都有CD34抗原的表达。在成人AML中，外周细胞CD34的表达预示患者对系统治疗反应较差，完全缓解率及存活率低，传统的化疗方案治疗效果可能不好。,根据细胞表面抗原表达的情况，可将CD34阳性细胞分为许多亚群，这些细胞多数已定向到特定细胞系。与CD34共表达，可作为干细胞进一步分型依据的抗原有：CD38、CD10、CD19、CD5、CD7、CD71、CD45、CD41、CD13、CD33等。,4.CD34阳性细胞亚群,不同CD34阳性细胞亚群,CD34+CD38-；CD34+CD38+；CD34+CD10+CD19+(前B)；CD34+CD5+CD7+(前T)；CD34+CD71+CD45RO+(红前)；CD34+CD41+(巨前)；CD34+CD13+CD33+CD45RA+(髓前),CD34hiLin-HLA-DRlowThy-1+CD45RO+Rhodull.,较原始干细胞亚群的免疫表型一般为：,(Rhodamine123Dull),CD34+CD38-HLA-DR+和CD34+CD38-HLA-DR-两群细胞，前者克隆率为50%，能向所有造血细胞系分化；后者除前者功能外，还能形成复杂的，能支持造血前体细胞分化的基质结构，这种细胞被命名为Common(hematopoietic/stromal)StemCell(CSC)。,三色分析又发现,Osawa等人首先证明小鼠HSCs可以是CD34阴性的。人的CD34阴性细胞也有低水平的造血能力。移植研究表明胎绵羊CD34阴性细胞有重新繁殖的能力。人和鼠的CD34阳性细胞可能来源于CD34阴性细胞。,CD34是HSCs标志物近年受到的挑战,这些报告提示，HSCs可能是CD34+或CD34-。只选择表达CD34的细胞可能导致将更原始的干细胞排除在外。然而几乎所有的临床和实验流程包括体外培养、基因疗法和HSC抑制，目前都设计成收集富含CD34+的细胞。,(二)干细胞其它免疫表型,从前T细胞杂交瘤中得到的几株单抗，由此单抗识别的抗原被命名为Sca-1。是18kDa磷脂酰肌醇锚定蛋白，属Ly-6抗原家族成员。43Sca-1被广泛认为和Ly-6半抗原一起，是小鼠HSC标志分子，在多能HSCs上表达。,1.Stemcellantigen-1(Sca-1),抗Sca-1抗体经常和一些细胞表面标志分子联用一起用来鉴定和分离小鼠HSCs。Sca-1+HSCs可在成年骨髓、胎儿肝脏、成年动物外周血和脾脏中被找到。Sca-1在几种非造血组织中也被发现。43Sca-1可用来富集HSCs之外的祖细胞。Sca-1可能参与调节B细胞和T细胞活化。,根据Sca-1是否阴性可将Thy-1lowLin-细胞进一步分为：Thy-1lowLin-Sca-1+和Thy-1lowLin-Sca-1-两群，前者含干细胞和CFU-T，后者不含CFU-T，两群细胞都含CFU-s。,mouse和rat骨髓造血干细胞中与淋巴系组细胞定向、分化有关的抗原。,2.Thy-1(CD90),一种原癌基因。最近证明造血干细胞与c-kit基因密切相关。c-kit可编码一种穿膜酪氨酸激酶受体分子。应用单克隆抗体证明此分子可存在于造血干细胞膜上，其后证明它的配体分子是造血干细胞因子（stemcellfactor,SCF），一种信号传导分子，对造血干细胞的分化具有重要作用。,3.c-kit(CD117),c-kit分子可高频率表达于多能干细胞表面,但骨髓中c-kit+细胞可分化为各种血细胞，而胸腺中c-kit细胞可分化为淋巴细胞，不能分化为髓系细胞，所以胸腺内c-kit+细胞，可能是淋巴样干细胞。,Lineagenegative,指T-、B-、M-、G-细胞。,4.Lin-,97kDa的糖蛋白，包括5个跨膜结构域，糖基化后在蛋白胶上显示120kDa的蛋白带。最初是通过AC133单抗鉴定的，它能识别人HSCs的CD34+亚类29,30。一种CD133异构体AC133-2,最近已经被克隆并鉴定为可被AC133抗体识别的原始表面抗原。,5.CD133(AC133),ChromosomalLocation,4p16.2-p12human,TheAC133antigenislikelytocontain5-TMdomainsinadditiontoasignalpeptide.The5-TMstructureincludesanextracellularN-terminus,twoshortintracellularloops,twolargeextracellularloopsandanintracellularC-terminus.,ProteinSequence,hematopoieticstemandprogenitorcells.neuralandembryonicstemcells.someleukemiasandbraintumoursthatmaybederivedfromstemcells.Lowlevelexpressioncouldalsobedetectedinthekidney,pancreas,placenta,andfetalliver.,Expression,MACS-isolatedCD133+cellsbecameadherentandCD133-duringcultivation,butgaverisetonon-adherentCD133+cellsbuddingfromtheadherentcellsurfacebyasymmetriccelldivision.CellswerestainedwithCD133/1(AC133)-PE.,Treeofdifferentiation,6.ABCG2,(ATP-bindingcassette,sub-familyG,member2),Synonyms:,ABC15,ABCP,BCRP,BCRP1,BMDP,Breastcancerresistanceprotein,EST157481,MRX,MXR,MXR1,Placenta-specificATP-bindingcassettetransporter.,二、造血干细胞的分离纯化,1.FluorescenceActivatedCellSorting(FACS),(1)组成,细胞计数,数据收集,结果处理,光源,液流,(2)基本原理,Flowcell,液体+cell,液鞘,单细,胞液柱,激光激发,数据处理,样本+气压,定量分析,(3)非标记分析,根据光散射特性，FACS利用前向光散射(FLS)区别细胞大小，利用垂直光散射(PerpendicularLightScatter)观察细胞的形态和结构。用上述方法分离细胞称非标记分离。,(4)标记分离,利用被分离细胞表面的一些抗原或受体与相应配体结合，用激光激发结合配体上的萤光，分析不同标记物的光谱，对细胞进行分离。,2.avidin-biotin亲合分离,细胞用biotin化的抗CD34抗体标记,avidin化的polycrylamidebead柱,CD34阳性细胞挂在柱上,机械振摇，冲洗柱床,收获细胞,一根商品化的分离柱(CEPRATM)一次可收获50 x109个CD34细胞，分离细胞CD34阳性率为67%,占整个分离细胞阳性率的51%。整个分离过程约需二小时。(94年前的产品),3.MegneticActivatedCellSorting,上述方法花费大。之后发展了一种iron-dextran系统。细胞-dextran-iron，磁场吸附，去掉未吸附细胞，去掉磁场收获感兴趣的细胞。该法特异性较差，分离率不高。,聚苯乙烯包被的微球法：,细胞与抗CD34抗体孵育,与二抗,包被的微球孵育,启动磁场,到掉未结合细胞,去掉磁场,蛋白水解酶消化,收获细胞,Magneticlabeling,Magneticseparation,Elutionofthenon-Labeledcellfraction,ElutionoftheLabeledcellfraction,MiniMACSSeparatorBasicforthelab:MiniMACSSeparatorwithMSColumn.,autoMACSSeparatorAutomatedbench-topmagneticcellsorterforhighcellnumbersormultiplesamples,CliniMACSplusInstrumentCliniMACSallowslargecellnumberstobeseparatedinaclosedandsterilesystem.,方法评价：,属间接法。分离细胞纯度达90%以上，回收率约为67%。由于去掉磁珠时使用了蛋白酶，对细胞其它表面分子有一定破坏作用，该法分离细胞表型完整性尚不十分清楚。,直接法：,抗CD34、CD38等抗体吸附在直径不同的磁珠上，细胞与之孵育，开启磁场，表面抗原阳性的细胞被吸附，去掉未吸附细胞，去掉磁场，收