（作物遗传育种专业论文）小麦抗旱突变体的离体诱发鉴定及SSR分析.pdf

摘要 小麦是我国主要粮食作物，在小麦生产中，干旱已成为影响小麦产量的主要因子。 因此，选育抗旱性强的小麦品种，是提高干旱和半干旱地区小麦丰产潜力的重要措施。 化学诱变是一种诱发突变频率高、诱变范围广的有效育种手段，应用于小麦育种，可 以创造各种类型的变异，丰富小麦种质资源。鉴于自然突变率低，抗旱筛选受环境影 响较大，抗旱资源难以获得等问题，本试验将诱变技术与离体培养相结合筛选抗旱 变异株，探讨了抗旱筛选时培养基中p e g 的临界浓度，e m s 诱变剂的诱变效应及 其适宜浓度，对筛选的抗旱植株进行了s s r 分子标记分析，从分子水平上证明了变 异的发生，为今后抗旱基因精确定位、基因克隆、抗旱新品种的培育提供可靠的理 论依据。主要结果如下： 1 以抗旱性强的小麦品种河农花8 4 、晋麦3 3 和抗旱性弱的小麦品种温麦6 、周 麦1 7 为材料，花药和幼胚离体培养的生根阶段，在培养基中添加浓度为8 0 9 l 的p e g 。 结果表明，抗旱品种根系发达，不抗旱品种根系生长势很弱，甚至发根停滞。因此， 可通过在培养基中添加浓度为8 0 9 l 的p e g ，观察再生植株根系的有无，判别供试品 种的抗旱性强弱。 2 将小麦品种温麦6 和周麦1 7 的幼胚、花药愈伤组织和幼胚愈伤组织进行e m s 诱变处理。结果表明，e m s 溶液处理幼胚后相对出愈率近5 0 的浓度和时间组合为 0 8 0 + 8 h ；处理花药愈伤组织相对分化率近5 0 的浓度和时问组合为0 2 0 + ( 2 h 4 h ) ；处理幼胚愈伤组织相对分化率近5 0 的浓度和时间组合为( o 2 0 0 4 0 ) _ ( 2 h 4 h ) 。婀l i l l ，种相比，周麦1 7 愈伤组织对e m s 反应更为敏感。 3 将e m s 诱变处理后分化的植株接种到p e g 浓度为8 0 9 l 的生根培养基中，进 行抗旱筛选共得到2 l 株抗旱植株，e m s 处理后植株的平均变异率为2 8 4 。在e m s 浓度0 1 0 o 2 0 及处理时问2 h 6 h 范围内，随着e m s 浓度和处理时间的增加， 花药、幼胚愈伤组织分化率均呈下降趋势，但再生植株中抗旱植株比率有显著提高。 e m s 浓度o 8 及处理时间8 h 时未得到再生植株。因此，花药愈伤和幼胚愈伤e m s 溶液处理的适宜浓度和时间组合为0 2 0 + ( 2 h 4 h ) 。 4 对幼胚分化植株中筛选到的抗旱植株、不抗旱植株以及未经组培诱变处理的植 株进行s s r 标记分析。在4 9 对s s r 引物中，共有1 9 对引物出现多态性。1 3 对s s r 引物在抗旱植株中出现特异性条带，从分子水平上证明了变异的发生。 关键字：小麦；p e g ；e m s 诱变；抗旱突变体；s s r i nv i t r oi n d u c t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n ds s r a n a i ) s i so fd r o u g h t r e s i s t a n t m u t a n t so fw h e a t a u t h o r ：w a n gj i n m a j o r ：w h e a lg e n e t i c sa n db r e e d i n g a d v i s o r ：p r o f e s s o rl i ug u i r u p r o f e s s o ry a n gx u e - j u a b s t r a c t w h e a ti st h em o s ti m p o r t a n tf o o dc e r e a lp l a n t si nc h i n aa n dt h ed r o u g h tb e c o m e st h e m a i ni n f l u e n t i a lf a c t o ri nt h ew h e a tp r o d u c t i o n t h e r e f o r e ，i ti sa l lu r g e n tq u e s t i o nt os e l e c t d r o u g h t - r e s i s t a n tw h e a tv a r i e t yf o re x c a v a t i n gt h ew h e a to u t p u tp o t e n t i a li nt h ed r o u g h t a n dh a l fa r i da r e a c h e m i c a lm u t a t i o nb r e e d i n gi se f f e c t i v eo n i n d u c i n gh i g hf r e q u e n c y a n d w i d es c o p em u t a t i o n s i fu s e di nw h e a tb r e e d i n g ，i tc a l lb r i n ga l lk i n d so fv a r i a t i o n sa n d r i c hw h e a tg e r m p l a s r n s i nv i e wo ft h ef a c tt h a tj tj sh a r dt of i n dm u t a n tw h e a ti nt h ef i e l d a n dt h ee n v i r o n m e n th a sa s t r o n g e f f e c to n s e l e c t i n gd r o u g h t r e s i s t a n t p l a n t s s o m u t a g e n e s i sa n di nv i t r oc u l t u r ew e r ec o m b i n e dt ob r e e dd r o u g h tr e s i s t a n tw h e a ti nt h i s r e s e a r c h t h er e s e a r c hs t u d i e do us u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no fp e ga n de m ss u i t a b l e c o n c e n t r a t i o na n dg o ts o m en m t a t i o n s a n a l y s i so fw h e a td r o u g h t r e s i s t a n tm u t a n tw i t h s s rm a r k e rp r o v i d et h et h e o r e t i c a lf u n d a m e n t a l sf o rc h r o m o s o m el o c a t i o na n dc l o n i n g g c n ea n db r e e d i n gd r o u g h tr e s i s t a n tw h e a tv a r l e t 3 t h er e s u l t sa r ef o l l o w i n g ： 1 d r o u g h tr e s i s t a n c ew h e a t ( h u a 8 4 ，j i n 3 3 ) a n dd r o u g h ts u s c e p t i v ev a r i e t y ( w e n 6 ， z h o u l 7 1w e r ec h o o s e da sm a t e r i a l s a n dt h e i rr o o t sw e r eo b s e r v e di nt h es a n l em e d i u m a d d e dp e g t h e d r o u g h t s e n s i t i v ew h e a tr o o ta p p e a l e df e e b l eg r o w i n gt e n d e n c ye v e n n o r o o tu n d e r8 0 9 lp e g 6 0 0 0w a t e r - s t r e s s i ti sc o n c l u d e dt h a tw h a tt h er e g e n e r a t e dp l a n t l e t s h a dr o o to rn o tc a nb eu s e dt o i d e n t i f yd r o u g h tr e s i s t a n c e u n d e r 8 0 9 l p e g 6 0 0 0 w a r e 卜s t r e s s 2l nt h i sr e s e a r c h ，e m sw a su s e dt om u t a t et h ei m m a t u r ee m b r y o s a n t h e rc a l l u s ， i m m a t u r ee m b r y o sc a l l u so fw e n 6a n dz h o u l 7 a b o u t5 0 r e l a t i v ei n i t i a t i n gr a t ea n d r e l a t i v ed i f f e r e n t i a t i o nr a t ed o s eo ft h em u t a g e n sw e r eu s e da st h es e l e c t i v ei n d e x e so f o p t i m a im u t a g e nc o n c e n t r a t i o n sa n dt r e a t m e n tt i m e t h ec o m b i n a t i o no ft r e a t m e n t sw e r e a sf o l l o w s ：i m m a t u r ee m b r y o st r e a t m e n tw i t he m ss o l u t i o n 0 8 0 + 8 h ； a n t h e r c a l l u st r e a t m e n tw i t he m ss o l u t i o n0 2 0 + ( 2 h 4 h ) ：i m m a t u r ee m b r y o sc a l l u s t r e a t m e n t w i t h e m ss o l u t i o n ( 0 2 0 0 4 0 ) + ( 2 h 4 h ) ，t h e t o l e r a n c eo f z h o u l 7 w a s h i g h e ro ne m s t h a nt h a to fw e n 6 3t h ed i f f e r e n t i a t i o np l a n t sw e r ep l a n t e di nt h er o o t i n gm e d i u ma d d e d8 0 9 lp e g w h i c hw e r ed i f f e r e n t i a t e df r o me m sm u t a t em a t e r i a l s a n d2l d r o u g h tr e s i s t a n c ep l a n t s w e r eg o t e m sm u t a t i o nr a t i ow a s2 8 4 i nt h er a n g eo fe m ss o l u t i o n ( o 10 0 2 0 ) + ( 2 h 6 h ) w i t hm u t a g e nc o n c e n t r a t i o n sg o i n gu pa n dt r e a t m e n tt i m ep r o l o n g i n gt h e c a l l u sd i f f e r e n t i a t i o nr a t i ow a sd e c r e a s e d ，m e a n w h i l et h ed r o u g h tr e s i s t a n t p l a n t sr a t i o i n c r e a s e d w h e nt h ee m ss o l u t i o nw a s0 8 0 + 8 h i th a dn or e g e n e r a t e dp l a n t l e t s s ot h e b e s tc o m b i n a t i o no ft r e a t m e n tw c r ec a l l u st r e a t m e n tw i t he m ss o l u t i o n0 2 0 + ( 2 h 4 h ) 4 l h ei m m a t u r ee m b r y oc a l l u sd i f f e r e n t i a t i o n d r o u g h tr e s i s t a n tp l a n t sa n dd r o u g h t s u s c e p t i v ep l a n t sa n dt h ep l a n t si nt h ef i e l dw e r es t u d i e dw i t ht h em e t h o d so fs s r s s r m a r k e r sw e r eu s e dt od e t e c t g e n e t i c v a r i a t i o n a m o n gt h e m 19p a i r s o fp r i m e r sh a d p o l y m o r p h i cb a n d s 13p a i r so fp r i m e r sh a ds p e c i f i cb a n d s ，t h em u t a t i o n sw e r ep r o v e di n m o l e c u l el e v e l k e y w o r d s ：w h e a t ；p e g ；e m sm u t a t i o n ；d r o u g h tr e s i s t a n c em u t a n t ；s s r 缩略词 2 ，4 d a c r a f l p a p b i s c 1 7 c t a b d n a d n t p e d l l a e m s k t m s n 6 n a a o d 2 6 0 o d 2 8 0 p c r p e g p v p 4 0 r a p d r f l p r n a s e a r e p e ls i l a n c e s s r t a q t b e t e t e m e d 1 y i s 本文所用缩略词及中英文对照 英文全称 2 , 4 - d i c h l o r o p h e n o x v a c e “ca c i d a c r y l a m i d e a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m a m m o n i u mp e r s u l f a t e b i s a c r y l a m i d e c e t y l - t r i m e t h y l a m m o n i u m b r o m i d e d e o x y r i b o s en u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d e t h y l m e t h a n e s u l f a n a t e k i n e t i n m u r a s h i g ea n ds k o o g ( 1 9 6 2 ) m e d i u m q n a p h t h y a c e t i ca c i d a b s o r b a n c ea t2 6 0 n m a b s o r b a n c ea t2 8 0 n m p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h l e n eg l y c o l p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 4 0 r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m r j b o n u c l e a s ea s i m p l es e q u e n c er e p e a t s t h e r m u s a q u a t i c u sd n ap o l y m e r a s e t r i s b o r a t ea c i d e d l l ab u 仃e r t r i sb a s e ，e c ) 1 ab u f f e r n ，n n ，n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s - h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 中文全称 2 , 4 二氯苯氧乙酸 丙烯酰胺 扩增片段k 度多态性 过硫酸铵 甲叉双丙烯酰胺 c 。，培养基 溴代十八烷基= 甲胺 脱氧核糖核酸 脱氧核糖二磷酸 乙二胺四乙酸 甲基磺酸乙酯 激动素 m s 培养基 n 6 培养基 u 萘乙酸 2 6 0 n m 处的吸光值 2 8 0 n m 处的吸光值 聚合酶链式反心 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮 随机扩增多态性d n a 限制片段氏度多态性 r n a 酶a 一：甲基二氯硅烷 简单序列重复 栖热水生菌d n a 聚合酶 t r i s ，硼酸e d t a 缓冲液 t r i s e d t a 缓冲液 四甲基乙二胺 三羟甲基氨基甲烷 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导f 进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致喇的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盛些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的晚明并表示谢意。 学位论文作者签名：王芝缸 签字f l 期：w p 岁年月乃日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑垦垒些盘茔有关保留、使f l f j 学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑i 垦盔些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用奉授权书) 学位论文作者签名： 王蕴 签字曰期：卅of 年月乡同 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师虢麦i 杉够 签字日期： 2 口够年月二日 电话 邮编 小麦抗旱突变体的离体诱发鉴定及s s r 分析 1 引言 干旱对农作物造成的损失在所有的非生物胁迫中占首位，仅次于生物胁迫病虫害 造成的损失。全球干旱半_ t + 旱地区约占土地总面积的3 6 ，占耕地面积的4 3 ，我 国干旱、半二f 旱地区约占国土面积的一半以1 ，年受害面积达2 0 0 2 7 0 万公顷，特 别是负担我国粮食生产任务6 5 以上的华北、东北和西北地区，恰恰是我国最缺水 的地区，而在其他种植区普遍存在降雨期与作物生长期不吻合的现象，即使在水分 供应充分的南方地区，季节性干旱也常常对农业生产产生严重影响i lj 。面对我国人 口不断增长、耕地和水肥资源日益减少、环境状况目益恶化、粮食供需矛盾r i 益尖 锐的严峻现实，如何通过提高作物的抗旱、抗盐、耐养分眨缺的能力和水分、养分 资源利用率来增加粮食生产、节约资源和改善环境，已成为我国农业持续高效发展 的重大要求。 小麦是人类粮食和动物饲料的重要来源，综合世界粮农组织( f a o ) 的统计报 道，小麦是世界上种植面积最大，产量最高的粮食作物，但是世界各地每年因程度 不同的干早所导致的小麦减产占总产量3 0 左右1 2 j 。小麦也是我幽广泛种植的粮食 作物，其产量约占我国粮食总产量的1 5 ，预测2 0 3 0 年我国将会达到1 6 亿人口高 峰，随着人口的增加和耕地面积的减少，到2 0 3 0 年我国的粮食总产量只有达到6 4 7 亿屯，即粮食单产：必须在目前水平上提高5 0 以上，j 能恭本满足我国的粮食需求， 小麦产量的波动将会对我国的粮食安全保障产生明显影响。在我幽的小麦生产二中， 干旱半干旱区小麦产量占全困小麦总量的5 0 以上，占有极其重要的地位。在小麦 生育期间，尤其是小麦生育的中后期，水分供应不足已成为制约我国广人产麦区小 麦发展的主要障碍。据资料统计，我国因干旱所造成的小麦产量损失约为其它自然 灾害造成产量损失的总和1 3 】。中国冬小麦约占小麦总产量的9 0 ，它是构成多种种 植制度、提高复种指数的重要组成部分。由于近年全国主要小麦产区遭逢干旱，重 要的冬小麦生长受到影响，2 0 0 3 年全国小麦产量已连续第四年下降。 在作物生产中，如何有效利用水资源已成为2 1 世纪最重要的问题之一。今天， 4 5 亿人面临严重的水资源短缺。一方面，研究者认为应当把农业用水再增加 1 5 2 0 ，以保证食品安全；另一方面，环境学家认为应当在未来的2 5 年内把用 水减少到1 0 ，以保护自然水资源。所以说，传统的灌溉农业已不能适应水资源短 缺的形势，提高作物自身的抗旱性才有可能取得抗旱上的新突破【4 1 。因此，加强小 麦抗旱性遗传研究，培育抗旱丰产品种具有重要的理论意义和实践意义。 对小麦抗旱性遗传研究，寻求抗旱变异株是其主要工作之一，在实验室通过组 织培养产生的植物群体中，变异是种普遍现象。以往人们只是将愈伤组织和细胞 培养再生植株当成一种营养繁殖方法，变异往往被看作一种有害因素1 5 l ，随着国内 外学者应用组织培养技术筛选突变体取得一些成果，组织培养逐渐成为遗传变异的 一个重要来源1 6 】。研究结果表明，应用组织培养技术可以筛选出在生产及理论研究 河北农业大学硕士学位论文 上有重要意义的抗性突变体。由于突变细胞在愈伤组织中比在有分化结构的组织中 易存活，因而组织培养应用于育种上可获得较高的突变率。已知愈伤组织中不定芽 的形成往往是发自少数几个细胞甚至是单个细胞，配以选择的手段，杀死或淘汰 未突变的敏感细胞，就可较好地克服嵌合体的形成，随着选择手段日益完善，利用 组织培养筛选抗性材料，已成为抗性筛选的一种重要手段。近年来，除了利用组织 培养在继代过程中产生的自发突变以外，还采用r 射线、e m s 、叠氮化钠等物理或 化学因素诱发变异【，一1 。 e m s 化学诱变产生点突变的频率较高，而染色体畸变相对较少，可阻对作物的 某一种特殊性状进行改良。与其它诱变剂相比，e m s 诱变后产生的突变频率高，且 多为显性突变体，易于突变体的筛选，如e m s 处理玉米花粉，突变频率可高达 7 8 i ”i 。此外它可以产生范围较广的突变类型，如转换、颠换等1 1 1 】。1 9 5 3 年，k a l m a r k 首次报告了e m s 对突变诱导的有效性i ”】。此后，e m s 在作物诱变育种中得到广泛 的应用，g t 前已成为应用最广泛，应用效果最好的一种化学诱变剂i 】”i 。因此，用 e m s 诱发小麦花药、幼胚愈伤组织获得抗旱植株，具有极高的可行性。 对抗旱植株的签定，目前所用的方法很多，概括起来有以下几种：即田问直接 鉴定法、干旱棚、抗旱池法、人工气候室法、盆栽法、室内模拟干旱法。这些方法 各有优缺点，适用于不同时期、不同目的的抗旱性鉴定与研究。田间直接鉴定法就 是把种予直接播于大用，利用自然降水不足或控制浇水等办法造成干旱胁迫，这种 方法投资小，简堆易行，无需特殊设备，有产量结果做保证，容易被人们接受。但 避环境闪誊影响严重，年间变化大，所需时吣长( 尤其多点多年份的苇复攀定) 工作量大，速度慢，每年结果可比性差，重复性不好。盆栽鉴定法就是把利，子播种 于盆内，人工控制浇水，可以根据试验目的，在任何生育期内进行不同程度的干旱 胁迫处理，一卜要用于作物苗期抗旱性鉴定与生长后期的抗性有一定差别，1 作量 大，不能大批量进行。人工气候室与干旱棚鉴定法效果好，但投资大，设备复杂， 只能用于对少量材料的深入研究。室内模拟干旱条件法就是在实验室内人工模拟干 旱条件，方法简单，重复性好，适于大批量进行。可以对作物进行萌发期、苗期抗 旱鉴定。 对谷类作物室内抗旱性鉴定多采用高渗溶液模拟水分胁迫的方法i ”。9 1 ，比较常 用的高渗溶液胁迫剂有不同分子量的p e g 及甘露醇，也有把蔗糖用作胁迫剂的报道 1 2 0 - 2 3 1 。目前多数研究者应用p e g 一2 0 0 0 、6 0 0 0 或8 0 0 0 作为胁迫试剂，其中以p e g 6 0 0 0 的研究报道最多【2 引，本研究利用渗透剂p e g 6 0 0 0 ，配制成多种浓度的高渗溶液模 拟水分胁迫，分析适于进行小麦抗旱鉴定的条件，为利用渗透胁迫鉴定小麦抗旱性 提供依据。 作物的抗旱性是多基因控制的数量性状，不仅与作物的种类、品种的基因型、 形态指标及生理指标反应有关，而且不同强度或不同类型的干旱很可能导致不同程 度的适应性反应，引起不同的抗旱机制。目前抗旱性研究的难点主要表现在以下四 个方面：( 1 ) 作物抗旱机制复杂，一种作物常常具有综合的几种机制共同起作用； ( 2 ) 生理生化指标测量时比较繁琐，与增产没有确凿相关的证据；( 3 ) 作物的生 2 小麦抗旱突变体的离体诱发鉴定及s s r 分析 理生态抗旱性研究受环境影响较大，环境条件不易控制：( 4 ) 植物育种家、植物遗 传学家和植物生理学家缺乏有效的合作，生理机制的遗传背景知识了解较少。目前， 随着生物技术的广泛应用，从分子水平上阐明作物抗旱性的物质基础及生理生化功 能，进而通过基冈工程手段进行抗旱基因重组以创造抗旱新类型，是本研究追求的 目标。 近年来，随着分子生物技术及分子信息学的不断完善，各类作物分子连锁图谱 的构建及其它分子遗传学研究为改良作物抗旱性提供了新妁机遇。各类分子标记技 术的发展给育种家带来了新的曙光。t a n k s l e y 等【2 4 1 指出，通过r f l p 或其他分子标 记进行辅助选择为难以测量的复杂性状提供了一条重要的选择途径。通过对抗旱相 关性状基因的分子标记，就可以把复杂的数量性状分解成简单的质量性状来研究。 一旦找到与相关基因紧密连锁的分子标记，就可以在育种工作中进行标记辅助选择。 分子标记辅助选择是通过利用与目标性状紧密连锁的d n a 分子标记对目标性状进 行问接选择的现代育种技术，可以使育种家无需测定表型就能够追踪调查抗旱性状 的遗传位点，可免去多年多点的大量f j 问测试丁作，提高选择效率。同时，高分辨 率的遗传图谱和物理图谱建成之后，就可能通过作图克隆技术分离抗旱相关基因， 研究基因功能。利用抗旱相关性状的主效q t l s 及其在谷类作物中的保守性，有可 能在不同作物之间进行抗旱相关性状基因的转移，改良作物的抗旱性1 2 5 l 。 六倍体小麦是由a a 、b b 和d d 三组染色体组成，染色体的部分同源性及多倍 性给小麦的遗传研究增加了很多困难。另外，与其它主要作物如水稻、玉米相比， 酱通小麦基凼组大，种内酶切位点少与多态性低等限制了小麦遗传图谱的构建。，旦 足在利用分子标；i x , t 抗旱相关基因进行定位、克隆和转基因方面，人们仍做了不少 工作，q u a r r i e 等i 2 6 j 利用同功酶和r f l p 分子标记，在小麦5 a 染色体上定位了3 个 a b a 反应位点。n e l s o n 等【27 j 通过r f l p 作图对小麦的a b a 的作用基因进行分析， 发现了异质的a b a 作用位点p b s l 2 8 。g u i l t i n a n 和g a d l e 2 8 j 利用小麦整倍体和异代 换系，分离得到7 个a b a 调节应答基因。m o r g a n l 2 9 l 利用埃及红和中国春的异代换 系，将小麦渗透调节基因( o s m o r e g u l a t i o n ，o r ) 定位在7 a 染色体上，并在7 a 染 色体上找到了1 个与o r 基因紧密连锁的r f l p 标记x p s r l l 9 。杨凯1 3 0 l 利用中国春h o p e 染色体异代换系，将小麦控制苗期叶片a b a 含量的基因定位在5 a 染色体上，将控 制脯氨酸、游离糖、叶片水势的位点定位在5 a 和5 d 染色体上。景蕊莲等利用 s s r 标记分析我国小麦抗旱种质及其衍生品种的等位变异，发现位于1 b l 的 x p s p 3 1 0 0 、3 b l 的x g w m l 0 8 可能与抗旱相关基因连锁，4 b l 上3 个连锁位点 x g w m 2 5 1 、x g w m 3 7 5 、x g w m 5 3 8 区域可能具有抗旱、耐瘠相关基因。l i l 32 j 利用反 转录p c r 技术在小麦中克隆并鉴定了在盐分和干旱胁迫条件下诱导产生s 一腺苷甲 硫氨酸脱氢酶( s a d e n o s y l m e t h i o n i n ed e c a r b o x y l a s e ) 基因。郭北海【3 3 】等将与抗旱有 关的甜菜碱脱氢酶( b a d h ) 基因转到小麦中。 不同分子标记各有特点，理想的分子标记应具备如下条件 3 4 】：遗传上呈共显性； 具有高度特异性；分析简便；易于实现自动化；便于交换和传播等。s s r 3 5 6 1 标记 是检测遗传差异的有效方法，它是类以少数几个核苷酸( 重复单位少于6 b p ) 串 3 河北农业大学硕士学位论文 联重复的d n a 序列【3 7 】，广泛分布于真核生物基因组中，由于不同等位基因间重复 数的数日和重复序列存在丰富的差异，因而s s r 显出较强的多态性。s s r 主要技术 是p c r ，比之r f l p 分析容易的多，而且易于分析自动化。在植物当中，s s r 已被 证明在很多物利，中是高信息量的，并且是位点特异的分子标记【3 “。s s r 标记的特 殊性及重要性在于：( 1 ) 均匀、随机、广泛地分布于水稻、大麦、小麦、大豆等多 种作物基因组中。( 2 ) s s r 序列的两侧顺序常较保守，在等位基因问多相同。( 3 ) 多数s s r 序列无功能作用，增加或减少几个重复序列的重复数不影响作物的正常发 育，因而在品种间具广泛位点变异，比r f l p 及r a p d 分子标记更具多态性，尤其对 六倍体小麦等用常见分子标记技术检测不出很多d n a 片段多态性的作物品种来说， 具有更大的价值和应用前景。( 4 ) 呈孟德尔式遗传，共显性，因而对个体鉴定具有 特殊意义。( 5 ) 需d n a 量少，对d n a 要求质量也不高。( 6 ) s s r 标记的引物是 根据重复序列两端相对保守的单拷贝序列设计，其扩增产物稳定1 4 4 “”。目前该技术 已被广泛应用于小麦遗传图谱的构建1 4 9 4 “、遗传多样性分析1 5 。5 孙、标记和定位目的 基因【5 4 “”、鉴定和标记外源染色体片段1 6 8 卅】、鉴定和区分品种1 7 2 州】等研究中。 近几年来我国培育了许多抗旱小麦品种，但普遍存在抗旱性不强或是阶段抗旱 性，能在小麦整个生长季保持高度抗旱的品种少之又少，所以选育抗旱性强的品种是 挖掘小麦存干旱和半干旱地区丰产潜力的迫切问题。但迄今为止，在小麦研究上还 没有完整的关于试管内诱变抗旱筛选系统建立的报道，本研究中将组织培养与诱变 相结合，_ h = e m s 对小麦的幼胚、花药愈伤组织及幼胚的愈伤组织进行诱变，通过调 1 ，堵养琏中水分的方法对其分化植株进行抗旱突变体筛选，选育高度抗旱的小爱品 种，从而为探讨作物的抗旱机理，认识作物抗旱的本质，改良作物的抗旱性提供种质 资源。同时，将筛选得到的抗旱品种进行s s r 分子标记分析，从分子水平上证明变 异的发生，为以后对抗早相关基因进行定位、克隆和转基因方面打下基础。 4 小麦抗旱突变体的离体诱发鉴定及s s r 分析 2 1 供试材料 2 材料和方法 2 1 1 确定p e g 抗旱筛选临界浓度的材料 本研究以4 个抗旱性不同的小麦品种为材料，分别为河农花8 4 、晋麦3 3 、温麦 6 和周麦1 7 。经多年抗旱性鉴定，河农花8 4 和晋麦3 3 的抗旱性强，温麦6 和周麦 1 7 的抗旱性弱，其中晋麦3 3 是由山西临汾小麦研究所育成，多年用作抗旱对照品 种。 2 1 2e m s 诱变处理的材料 试验材料选白河北农业大学育种室使用的小麦骨干种质温麦6 号和周麦1 7 ，这 两个品种具有高产、优质等优点，但抗旱性较差。 2 2 试验内容和方法 2 2 1 培养基的配制方法 将基本培养基其配成母液，保存于4 。c 冰箱中备用。 2 2 1 1 基本培养基的配制方法 大量元素母液的配制 称取下列药品，并逐一溶解，c a c l 2 2 h 2 0 单独溶解后再混入母液中，定容至1 l ， 冷藏保存备用，如配制1 l 培养基，只需吸取5 0 m l 该母液。 m si 成分 称量( g )浓度( g l ) k n 0 3 3 8 0 0 1 9 0 n h 4 n 0 33 3 0 01 6 5 m g s 0 4 7 h 2 0 7 4 0 0 3 7 k h 2 p 0 4 3 4 0 0 1 7 c a c l 2 2 h 2 0 8 8 0 0 4 4 5 河北农业大学硕士学位论文 c 1 7i 成分 k n o ， n h 4 n 0 3 m g s 0 4 7 h 2 0 k i - t 2 p 0 4 c a c l 2 2 h 2 0 n i 成分 k n o ， ( n h 4 ) z s 0 4 m g s 0 4 7 h 2 0 k h z p 0 4 c a c l e 2 h 2 0 称量( g ) 2 8 0 0 6 ，o o 3 0 0 8 0 0 3 0 0 称量( g ) 5 6 6 0 9 2 6 3 7 0 8 o o 3 _ 3 2 浓度( g l ) 1 4 0 o 3 0 o 1 5 0 4 0 o 1 5 浓度( 叽) 2 8 3 0 0 4 6 3 ( ) 1 8 5 0 4 0 0 0 1 6 6 微量元素母液的配制 称取下列药品，并逐一溶解，若有沉淀，加少量l m o l lh c i 滴溶，定容至l l 冷藏保存备f 1 j ，如配制l l 培养基，斋吸取1 0 m l 该母液。 m sj i 6 成分 m n s 0 4 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 h 3 8 0 3 k i n a z m n 0 4 2 h z o c u s 0 4 5 h 2 0 c o c l 2 6 h 2 0 c 1 7 i l 成分 m n s 0 4 1 2 0 z n s 0 4 7 h e o h 3 8 0 3 k 称量( m g ) 1 6 9 0 8 6 0 6 2 0 8 3 2 5 2 5 2 5 称量( r a g ) 8 4 9 8 6 0 6 2 0 8 3 浓度( r a g l ) 1 6 9 0 0 8 6 0 0 6 。2 0 0 0 8 3 0 0 2 5 0 0 0 2 5 o 0 2 5 浓度( m g l ) 8 4 9 0 8 6 0 0 6 2 0 0 0 8 3 0 小麦抗旱突变体的离体诱发鉴定及s s r 分析 n a 2 m n 0 4 。2 h 2 0 c u s 0 4 5 h 2 0 c o c l 2 6 h 2 0 n 6 i i 成分 m n s 0 4 h 2 0 z n s 0 4 7 h 2 0 h 3 8 0 3 k i 5 0 2 5 2 5 称量( m g ) 3 3 0 1 5 0 1 6 0 8 0 o 0 5 0 o 0 2 5 0 0 2 5 浓度( r a g l ) 3 3 0 0 1 5 0 0 1 6 ( ) 0 o 8 0 0 b 5 维生索母液的配制： 称取下列药品，并逐一溶解，烟酸先用少量h c i 溶解，然后再与其他药品混合， 定容至1 l ，冷藏保存备用，如配制1 l 培养基，只需吸取1 0 m l 该母液。 m s 成分 v b l v b 6 煳峻 肌醇 称量( g )浓度( r a g l ) 0 4 0 0 5 0 o 5 0 1 0 0 0 4 0 5 0 5 0 1 0 0 o c 1 7 、n 6 成分 v b l v b 6 烟酸 肌醇 称量( g )浓度( r a g l ) 1 0 0 o 5 0 u 5 ( 】 1 0 0 0 1 0 o 5 0 5 o 1 0 0 o 铁枯母液的配制： 称取下列药品，并逐一溶解，混匀后加热，避光放置至室温，定容至o 5 l ，冷 藏保存备用，如配制1 l 培养基，只需吸取5 m l 该母液。 成分 称量( g )浓度( m g l ) f e s 0 4 7 h 2 0 3 7 37 4 6 n a 2 e d t a 2 7 85 6 6 2 2 1 2 激素的配制方法 k t 母液( 1 i n g l ) ：取5 0 m g k t 先用少量l m o l l h c l 滴溶，然后定容至5 0 m l ， 冷藏保存备用。 2 , 4 - d 母液( 1 i n g l ) ：取5 0 r a g2 , 4 一d 先溶于少量l m o l ln a o h 中，然后定容 至5 0 m l ，冷藏保存备用。 2 2 2p e g 抗旱筛选临界浓度的确定 2 2 2 1 诱导培养基的配制 7 河北农业大学硕士学位论文 花药诱导培养基：诱导培养基为c 】7 + 2 ，4 一d2 m g l + k to 5 m g l ，培养基中蔗糖 浓度为9 。在培养基中分别加入2 0 9 l 、4 0 l 、6 0 9 l 、8 0 9 l 、1 0 0 9 l 分子量为 6 0 0 0 的p e g ，以不加p e g 的c 1 7 培养基为对照，共6 个处理，每个处理5 个重复。 幼胚诱导培养基：n 6 培养基，添加2 , 4 - d2 m 【l 、水解酪蛋白0 5 l 、蔗糖8 0 9 l 。 存培养基中分别加入2 0 9 r e 、4 0 9 l 、6 0 9 l 、8 0 9 l 、1 0 0 9 l 的p e g ，以不加p e g 的 n 6 培养基为对照，其6 个处理，每个处理5 个重复。 2 2 2 2 材料处理 花药：选取花粉处于单核中期的小麦穗子，其外部特征为麦穗中部露白，剥去 苞叶后，麦穗弯曲角度为4 5 。将麦穗剥出后，无菌条件下用1 。升汞浸泡8 r a i n ， 进行表面消毒后用无菌水冲洗3 5 次，接种时取麦穗中部的小穗，在小穗中部发 育较好的小花中剥取花药，接种在诱导培养基上。 幼胚：选取授粉后1 3 1 5 天的麦穗，小心去除稃片，将淡绿色的颖果取出后用 纱布包好，无菌条件下在1 。升汞溶液中表面灭菌8 m i n ，后用无菌水冲洗3 5 次， 接种时在超净工作台上，将消毒过的颖果用解剖针划破取出幼胚，接种到诱导培养 基上。 2 ，2 2 3 诱导培养条件 花药：进行暗培养，3 0 。c 培养6 天后，转到2 8 条件下培养。 幼胚：置于2 8 暗培养。 2 2 2 4 愈伤组织的分化 花药愈伤组织的分化：花药出愈后7 1 5 天，将其转移到含有n a a 0 2 m d l 、 k t 0 5 m l 和蔗糖3 的c 1 7 培养基上进行分化，分化培养基中p e g 浓度梯度和诱 导培养基中相同。转移后的愈伤组织置于加有人工照明的培养室中，每天给以1 0 小时光照，培养温度为2 5 。 幼胚愈伤组织的分化：幼胚出愈后3 0 天，将其转移到含有n a ao 2 r n i l 、k t ( ) 5 m g l 和蔗糖3 的n 6 培养基上进行分化，分化培养基中p e g 浓度梯度和培养条 件同花药分化处理。 2 2 t 2 5 分化植株诱导生根 在幼苗长出2 3 片真叶时，可将其转入含有n a a0 5 m g ，l 、k t0 2 m g l 和蔗 糖8 的m s 培养基上诱导生根，生根培养基中p e g 浓度梯度、培养条件同分化处 理。3 0 天后对不同p e g 处理中分化出的植株的根长和根数进行调查统计，确定最 适的p e g 抗