（蔬菜学专业论文）表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究.pdf

y7 3 2 8 6 8 单位代码： 研究生学号： 2 q 21 业2 表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性 的生理机制研究 论文答辩日期：二零零五年六月f 三日 答辩委员会主席： 答辩委员会成员： 论文评阅人：郑重 教授 吴根良高级农艺师 致谢 本论文是在导师喻景权教授、周艳虹博士的亲切关怀和悉心指导下完成的。从 论文的选题、试验设计、实验操作到论文的撰写、修改和定稿，无不凝聚着导师的 心血和智慧。导师渊博的知识、敏锐的思维、严谨求实的学风、执着的事业心和宽 厚的人格魅力深深地影响着我，这一切学生将铭记在心并终生受益。同时，对导师 三年来在学业和生活上给予无微不至的关怀和照顾，启发和教诲，一并致以我最崇 高的敬意和最衷心的感谢l 在个人求学及研究进行历程中，受到本院朱祝军教授、曹家树教授、周雪平教 授、寿森炎教授、张明方教授、陈利萍副教授、钱琼秋老师等以及生科院陈集双教 授、分析测试中心洪健老师等多方的帮助、指导及关心，使个人的论文得以如期完 成，在此致上最深切的谢意。 感谢胡文海、师恺、孙瑶等中心大楼南楼3 8 3 的师兄弟妹们在生活和试验中给 予的热情帮助；感谢王萍、史庆华和生理生化实验室其他同学在实验操作等诸多环 节给予的支持与帮助；感谢同舍好友张艳、宰文珊、庄晓英在生活中给予的关心和 照顾。正是你们的鼓励和支持促使我最终能信心十足地迎接挑战、直面困难，从中 受益良多，在此深表谢意。 深深感谢家人的养育之恩，是他们教会了我怎样做人，做一个正直、善良和快 乐的人：他们一直以来给予的支持、鼓励和无微不至的关爱陪伴我度过了多年的学 习生涯，激励我努力向上。我衷心的祝愿他们健康、长寿! 最后，向所有给予我关心、支持和帮助的人表示我衷心的感谢。 4 陶嫒 2 0 0 5 年5 月于浙大华家池畔 摘要 表油菜素内酯( e p i b r a s s i n o s t e r o i d ，e b r ) 是目前应用最为广泛的油菜素甾醇类 化合物，在调节植物生长方面已有多年的研究历史。近年来，油菜素甾醇类化合物 在非生物和生物胁迫中的作用受到广泛重视，但是表油菜素内酯增强植物抗病性的 作用机理还存在争议。因此，本研究通过探讨喷施e b r 和诱导接种黄瓜花叶病毒 ( c u c u m b e r m o s a i c v i r u s , c m v ) 对西葫芦苗的影响，阐明表油菜素内酯在抵御、缓 解病害中的调控机制。主要研究结果如下： 1 表油菜内酯处理降低了c m v 对西葫芦植株的侵染水平，病株率和病情指数相 对于只接种c m v 处理均有所下降，相对平均防治效果达到3 8 8 ，同时喷施表油菜 素内酯也明显降低西葫芦叶片中病毒含量，提高了西葫芦对c m v 的抗性。 2 喷施表油菜素内酯在短时间内促使西葫芦叶片大量累积h 2 0 2 ，含量明显高于对 照。丙二醛含量没有因喷旖表油菜索内酯而提高，其含量甚至低于对照水平。e b r 处理在早期主要通过降低h 2 0 z 降解酶a p x 、p o d 、c a t 活性而使过氧化氢保持 个较高水平。接种c m v1 2 小时，表油菜素内酯明显提高了h 2 0 2 含量，甚至高于只 接种c m v 处理( c + ) ，而丙二醛含量只接种c m v 处理却高于喷施e b r 并接种c m v 处理( b c + ) 。病毒侵染提高了a p x 和p o d 活性，而喷施e b r 处理无论接种与否a p x 和p o d 活性均低于c + 处理。e b r 处理后，游离水杨酸( s a ) 含量与对照相比几乎 没有差异，结合态s a 含量甚至低于对照处理。接种c m v l 2 小时测定s a 含量发现， c + 处理无论是游离s a 还是结合s a 含量都最高，而e b r 预处理后无论接种与否其 含量都远远低于c + 处理。 3 接种后1 1 - 2 5 天内，西葫芦感染黄瓜花叶病毒导致h 2 0 2 大量累积，同时产生较 多的膜脂过氧化产物丙二醛，但b c + 处理h 2 0 2 及丙二醛含量均低于c + 处理，而未 接种的b r 处理叶片中h 2 0 2 含量较低，说明活性氧代谢处于平衡状态，细胞受害较 轻。相对于只接种c m v 处理，b c + 处理h 2 0 2 代谢酶活性变化更有利于活性氧的代 谢平衡并使细胞保持一个良好的状态。而p a l 活性各个处理间几乎没有差异。上述 结果表明，表油菜素内酯诱导的抗病性可能与水杨酸的生物合成无关，丰要依赖于 h 2 0 2 所介导的抗病途径。 4 接种c m v l l 天，西葫芦植株已经明显表现出病毒病症状，此时，c + 处理新生 叶片叶绿素含量下降，叶绿体超微结构受到破坏，p si i 电子传递的量子产量降低， 电子传递速率下降，光合速率显著下降，光合作用受到严重破坏。与此同时，在病 毒侵染情况下表油菜素内酯处理提高了新生叶片叶绿素含量并降低了病毒侵染对叶 绿体超微结构的破坏程度，同时光合速率、o p si i 、q p 、f v f m 均达到与对照相 近的水平，提高了整个植株的光合能力以及西葫芦对c m v 的抗性。 5 ，表油菜素内酯对西葫芦植株的生长具有明显的促进作用，e b r 处理使西葫芦植 株的生物量和根冠比即使在感染病毒的情况下依然可以相对增加，并且使檀株在形 态以及生理生化代谢方面都发生了改变，大大提高西葫芦植株自身的抗病能力。同 时，e b r 处理导致西葫芦植株总糖、蔗糖、还原糖含量都有所下降，可能是e b r 处理 后糖份向其他组织的运转速度加快，从而更有利于植株的生长、发育。 表油菜素内酯提高西葫芦抗c m v 的可能的机理是：在西葫芦一c i , f v 相互作用中， e b r 通过调节植物的代谢或生理活动，诱发植物产生对病原物的一系列抗性反应，增 强植株的系统抗病能力，从而减轻c m v 对西葫芦的危害。 关键词：西葫芦( c u c u r b i t a p e p o l ) ，表油菜素内酯( e b r ) ，黄瓜花叶病毒( c u c u m b e r m o s a i cv i r u s ，c m v ) ，过氧化氢( h 2 0 2 ) ，水杨酸( s a l i c y l i ca c i d ，s a ) ，过氧化氢 代谢酶，病毒含量，叶绿体超微结构，光合作用，叶绿素荧光 6 硕士论文表油菜素内醑提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 第一章前言 2 0 世纪7 0 年代初，美国农业科学家m i t c h e l l 研究小组首次报道在油菜花粉中 发现一种生物活性极高的物质，其对菜豆幼苗生长具有极强烈的促进作用。g r o v e 等 在1 9 7 9 年用2 2 7 k g 油菜花粉提取得到1 0 m g 的高活性结晶，它是一种甾醇内酯化台 物，并命名为油菜素内酯( b r a s s i n o l i d e ，b l ) 。后来又从许多植物中分离出多种 油菜素甾醇类化合物( b r a s s i n o s t e r o i d s ，b r s ) ，目前已知的天然油菜素甾醇类化合 物有6 0 余种。随着油菜素内酯生物合成途径的逐渐阐明以及对拟南芥油菜素内酯突 变体研究的深入，在第十六届国际植物生长物质年会上被正式确认为第六类植物激 素。油菜素内酯具有极高的生物活性，激发了人们极大的研究兴趣。 1 油菜素内酯的生理效应及其在农业上的应用 1 1 油菜素内酯的结构及其在植物体内的分布 油菜素内酯是植物中发现的第一种甾类激素，其分子式为c 2 8 1 - 1 4 8 0 6 ，基本结构 是一个甾体核，在核c - 1 7 上有一个侧链。分子量4 7 5 6 5 ，熔点2 7 4 2 7 5 ，可溶于 9 5 乙醇溶液。活性油菜素内酯必须具备如下结构特征( 图1 ) ：a b 环为反式； b 环含有7 位内酯和6 位酮基：a 环上具有2 位和3 位两个羟基；侧链2 2 位2 3 位具有羟基；侧链2 4 位上有1 2 个c 的取代基。根据这些特征，目前人工 图l 油菜素内酯结构图 f i g i s t 兀l c n l r co f b r a s s i n o s t e r o i d 硕士论文表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 合成了许多种类的油菜素内酯，如表油菜素内酯( e p i - b r a s s i n o s t e r o i d ) 、高油菜素内 酯( 2 8 - h o m o b r a s s i n o l i d e ) 以及长效油菜素内酯t s 3 0 3 。 裸子植物和被子植物中存在油菜素甾醇类化合物，藻类也有。此外，在高等植 物的枝、叶、花各器官中均有，以花粉和种子中最多( f u j i o k a ，1 9 9 6 ：s c h n n d t ，1 9 9 7 ) 。 1 2 油菜素内酯的生物合成 利用同位素标记和突变体进行的试验表明，油菜素内酯的生物合成途径是从菜 油甾醇( c a m p e s t e r 0 1 ) - - c a m p e s t a n o l - - - c a t h a s t e r o n e - - ，茶甾醇( t e a s t e r o n e ) _ 油菜素 内酯( b r a s s i n o l i d e ) 。其中催化菜油甾醇- - - - - c a m p e s t a n o l 反应酶的基因d e t 2 和催化 c a t h a s t e r o n e - - - - 茶甾醇反应的酶基因c p d 已经得到克隆，前者是一种甾醇5 a 还原酶， 后者是一种含细胞色素p 4 5 0 的甾醇羟化酶( s t e r o i dh y d r o x y l a s e ) ( 武维华，2 0 0 3 ) 。 对b l 生物合成抑制剂如芸苔素唑、b r z 2 0 0 1 等以及一些生物突变体的研究也证实 了这 1 3 合成途径( 顾庆龙，2 0 0 2 ) 。 油菜素内酯在植物体内的运输 油菜素内酯在植物体内的运输是一个直接与油菜索内酯作用密切相关的问题。 在一些试验中油菜素内酯是通过茎基部的切口进入植物体内的，因此1 9 8 7 年在东京 举行的油菜素内酯研讨会中有人对b r 通过非切口进入整体植物体内提出了质疑。 但是竹松所用的b r 萝h 幼苗生物测定法是利用非切口幼苗，如果b r 不能进入植 物体内又怎会促进生长昵。之后又有许多实验室通过对黄瓜、水稻、小麦等植物材 料的同位素示踪研究证实同位素标记的b r 能够从根进入地上部，但是从叶子中施 入后运转的较少，因此，有必要进一步研究。 1 4 的生 料。 油菜素内酯的生理效应 油菜素内酯是第一个在植物中发现的甾体激素，在极低的浓度下就表现出极强 理效应。对于油菜素内酯生理功能的研究已有很长的历史并且积累了大量的资 1 4 ，1 油菜素内酯对细胞伸长和细胞分裂的作用 8 硕士论文表油菜素内酯提高鼯葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 油菜素内酯类物质能够促进植物细胞分裂和伸长，与生理作用比较清楚的生长 素、赤霉素、细胞分裂素、乙烯和脱落酸不同，属于另一类物质。n m 叫v f 级的b r s 就可以促进双子叶植物下胚轴、上胚轴、花序梗以及单子叶植物胚芽鞘和中胚轴的 伸长( c l o u s e ，1 9 9 6 ；m a n d a v a ，1 9 8 8 ；c u t l e r 等，1 9 9 1 ) ，尤其是植物的幼嫩组织对b r s 更为敏感。通过分析豌豆茎b r 敏感区域的b r 含量( k a r s s e n 等，1 9 9 2 ) ，绿豆上胚 轴生长区域积累的外源”5 i - b r 含量以及黄瓜幼苗生长点的b r s 含量( x u 等，1 9 9 4 ) ， 证实了b r s 就分布于这些组织中。 b r s 所诱导的伸长效应常常伴随有质子外渗、细胞膜超极化的发生。在水稻叶 片不对称生长中也发现了这种现象( c a o 等，1 9 9 5 ) 。在藻类中，b r s 的浓度1 0 - 1 s l o 。8 m 可以明显加速藻类的生长周期。另外，也有研究认为，油菜素内酯促进细胞 壁松散，这个作用与其对木葡聚糖内转葡糖基酶的影响有关。油菜素内酯促进伸长 作用可能还和细胞的微管有关( 赵毓橘等，2 0 0 2 ) 。 油菜素内酯对细胞分裂的作用还没有定论。用显微镜对拟南芥b r 缺失型及非 敏感型突变体进行测验，结果表明矮化型细胞变小，但是数目却没有减少 ( k a u s c h m a n n 等，1 9 9 6 ) 。1 9 9 6 年n a k a j i m a 等人研究了2 4 表油菜素内酯对中国白菜 原生质体的影响，发现被处理组织细胞分裂速度明显提高。油菜素内酯还能促进原 生质体的脱分化和细胞壁再生。 1 4 2 油菜素内酯对维管分化的作用 在木质部分化初期需要生长素和细胞分裂素( f u k u d a ，1 9 9 7 ) 。然而越来越多的 研究表明，在维管分化过程中，b r s 也起到明显作用。c l o u s e 和z u r e k ( 1 9 9 1 ) 等人 发现对h t u b e r o s u s 外源施用n m 级b l 就可以使导管状物质分化速度提高l o 倍。而 正常条件下其分化则需要7 2 小时。在另外一种模式系统中，导管的形成被分为3 个 阶段( f u k u d a ，1 9 9 7 ) ，目前已有研究表明第3 个阶段需要内源b r 的参与。用赤霉 素以及b r 生物合成抑制剂处理植株可以抑制叶肉细胞中管状物质的分化，而这种 抑制作用可以通过b r 处理进行克服( 1 w a s a k i 等，1 9 9 1 ) 。 1 4 3 油菜素内酯对花粉和生殖生长的作用 b r 首先是从花粉中分离出来而花粉又是油菜素内酯含量最丰富的器官。以往 的研究也表明，b r s 可以促进花粉管的伸长( h e w i t t 等，1 9 8 5 ) 。b r 非敏感型拟南芥 突变体的雄性不育证实了这点( c l o u s e 等，1 9 9 6 ；k a u s c h m a n n 等，1 9 9 6 ；l i 等，1 9 9 7 ) 。 9 硕士论文表油菜索内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 但是丝状体能够生长却不能生长到柱头的事实也表明，b r 缺失型d w f 4 突变体的雄 性不育可能还存在其它机理。此外，有研究表明，o 0 1 m g lb r 可以将烟草花粉管 的生长速度提高近4 0 ，b r 还可诱导雌雄同株异花的西葫芦雄花开出两性花或雌 花( 顾庆龙，2 0 0 2 ) 。 1 4 4 油菜素内酯对衰老的影响 细胞分裂素可以延缓植物叶片及子叶的衰老，但2 4 表油菜素内酯却加快其衰 老( d i n g 等，1 9 9 5 ；h e 等，1 9 9 6 ；z h a o 等，1 9 9 0 ) 。研究人员认为b r s 通过调节活性氧状 态如改变p o d 、s o d 、c a t 活性以及增加丙二醛含量而加速植株衰老。然而，也有 研究表明，2 4 表油菜素内酯可以抑制氧化降解并且降低丙二醛的含量，保护细胞膜 不受伤害，从而延缓衰老( e r s h o v a 等，1 9 9 6 ) 。k u l a e v a 等( 1 9 9 1 ) 也认为油菜素内酯 对盐处理引起的叶绿体超微结构的破坏有明显的保护作用。而无活性的油菜甾醇类 化合物则不起保护作用。用b r s 对拟南芥有关衰老的突变体以及其中与衰老相关基 因表达的研究对于弄清b r s 在衰老中的作用提供很大帮助。 1 4 5 油菜素内酯和其它激素的相互作用 较多研究表明，b r s 和其它植物激素之间存在互作( k h r i p a c h1 9 9 9 ；m a n d a v a 1 9 8 8 ) 。b r s 和生长素相互作用产生协同效应，与g a 之间也可以产生积极效应，而 a b a 是b r 的一个拮抗剂，在基因调控方面两者也表现出不同的机制( a b r a h a m ， 2 0 0 3 ；w i l e n ，1 9 9 5 ) 。近来，分子方面的研究也充分证明了b r s 和其它植物激素之 间存在互作。b r s 和其它植物激素如生长素、g a 、a b a 、乙烯和j a 等相互作用可 以引起激素合成基因以及信号途径中某些物质的改变( b o u q u i n ，2 0 0 1 ；f r i d r i c h s e n ， 2 0 0 2 ) 。因此，要确定b r s 介导的逆境反应在基因表达方面的变化时，就应意识到 这种变化可能并不是b r 直接作用的结果，有可能是因为b r 与其它激素相互作用 产生的。有人认为，在b r 介导的逆境反应中也可能涉及到a b a 、j a 、s a 、乙烯等 植物激素的调控作用( l i e c h t i ，2 0 0 2 ) 。 1 5 油菜素内酯在农业上的应用 1 5 1油菜素内酯促进植物的生长 b r 处理可明显促进绿豆、大豆上胚轴及油菜幼苗下胚轴的伸长；提高许多农作 硕士论文表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究 ( 陶嫒，2 0 0 5 ) 物如：水稻、小麦、大豆、棉花等的产量( 侯雷平，2 0 0 1 ) 。在园艺作物中，表油莱 素内酯( e b r ) 可提高黄瓜( 刘永正等，1 9 9 6 ) 、西瓜( 王玉琴等，1 9 9 4 ) 、番茄( 唐嘉义等， 1 9 9 6 ) 的结果率，从而提高产量。另外还可促进芹菜( 王玉琴等，1 9 8 8 ) 、菠菜f 梁广坚 等，1 9 9 8 ) 的生长。总之，b r 促进植物生长的靶区域是细胞的细胞壁，通过各种机 制( x e t 、微管) 促使细胞壁松弛，使细胞体积扩大，摄入水分和养分，同时b r 促进 光合作j 日j ，提高核酸、蛋白质的代谢，为细胞的伸长提供物质基础，进而促进植物 的生长。另外b r 还促进细胞的分裂。现在有关b r 促进生长的研究只是处于生理 代谢水平，在分子生物学方面也只限于与哪些基因有关和促进哪些基因的表达方面。 但b r 的信号如何传导，b r 如何调节这些基因的表达进而作用于细胞壁的机理还有 待于进一步的研究。相信b r 突变体将为这一领域的研究提供一个方便的途径。 1 5 2 油菜素内酯在植物组织培养上的应用 目前，生长素和细胞分裂素广泛用于植物愈伤组织的增殖和继代，而生长素和 油菜素内酯的组合应用也受到越来越多地关注。高表油菜素内酯0 0 0 1 1 0 m g l ， 2 , 4 一dl m g l 或萘乙酸l m g l 的组合适合细胞的增殖。在拟南芥的组培实验中加入 0 5 或o 0 5 m g l 表油菜素内酯，明显促进愈伤组织的增殖、细胞分化( 赵毓橘等， 2 0 0 2 ) 。 i 5 3 油菜素内酯提高植物抗逆性 b r s 通过改变植物的生理生化水平以及保护植物免受逆境胁迫而促进植物的生 长发育。b r s 对许多胁迫如温度、水分、盐分以及瘸害等都具有抗性。尽管如此， 对于其抗逆机理方面的研究还不是很多。通过对b r s 所介导的信号途径以及调控基 因的特性的研究，说明在调控逆境反应中b r s 在分子水平上也发生了变化。 温度逆境在植物生长的环境因素中，温度条件可能是变化最快的一个因子，因此 在许多逆境反应中都对温度变化作了研究。玉米在种子萌发以及生长初期对低温高 度敏感。低温处理中，油菜素内酯促进了植株的生长。在低温照光条件下，b r 处理 促使玉米的白化叶片变绿( h e 等，1 9 9 1 1 。用b r 浸泡玉米种子，可以促进幼苗在低温 下生长。与清水对照相比，其株高、干物重、叶片叶绿素含量以及可溶性糖含量明 显增加，而电导率却有所下降( 周天等，2 0 0 4 ) 。在低温条件下，b r 可以促进水稻生 长，而在正常条件下对植株生长却没有明显效果( k a m u r o 等，1 9 9 1 ) 。陈善娜等( 1 9 9 7 ) 用b r 浸种并喷洒在水稻二叶期叶面上，经低温暗胁迫2 天，生物量、叶片s o d 、 碗士论文表油菜索内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) p o x 活性以及还原性谷胱甘肽( g s h ) 含量均高于清水对照，提高了水稻幼苗的抗 冷性。在黄瓜植株上喷施b r 也表现出同样的特性。低温条件下( 5 c ，3 天) ，经 b r 浸种后的黄瓜幼苗长势好于未经处理的幼苗。在低温过程中，b r 处理的植株叶 绿素含量几乎不变，在低温恢复过程中，叶绿素含量甚至有所提高( k a t s u m i ，1 9 9 1 ) 。 在低温条件下，对番茄植株喷施油菜素内酯，提高了番茄的座果率。 b r 在高温逆境中的作用通过对小麦叶片总蛋白以及叶片细胞超微结构的分析 得到证实。生长于4 3 的小麦植株，用b r 处理后，叶片总蛋白含量与生长于2 3 的小麦植株相近；而= ! = l 三长于高温条件未用b r 处理的小麦植株，相对于生长在2 3 条件下的小麦，叶片总蛋白含量下降2 5 倍张u l a e v a ，1 9 9 1 ) 。在高温逆境条件下， 植物体内些小的热激蛋白聚集在一起形成具有高度序列型的细胞质复合物，也就 是富集热激蛋白颗粒( h s g s ) 。k u l a e v a 等人( 1 9 9 1 ) 研究发现，小麦叶片细胞中h s g s 聚集成小晶体，在b r 处理的叶片中，晶体平均大小以及晶体中h s g s 的数目都高 于未用b r 处理的叶片。朱诚等( 1 9 9 6 ) 也发现e b r ( 表油菜素内酯) 对黄瓜种子浸 种2 4 小时，能提高幼苗对热激的忍耐性，还能有效促进幼苗脯氨酸的累积。 盐份逆境大麦叶片先用b r 或水作预处理之后，培养在o 5 mn a c i 溶液中，n a c i 溶液分为添加b r 和不添加两种。在正常条件下，b r 对叶片细胞超微结构没有影响， 但是b r 明显缓解了盐分胁迫导致的细胞核及叶绿体的伤害程度( k u l a e v a 等，1 9 9 1 ) 。 在1 5 0 r a m n a c l 存在下。b r 处理提高桉树种子的发芽率，然而，当幼苗生长于盐溶 液中并对根部施加b r ，反而对植株造成了更大的伤害( s a s s e ，1 9 9 9 ) 。此外，水稻种 子用水或1 5 0 m m n a c i 浸种并生长于添加或不加b r 的盐溶液中，b r 明显缓解了盐 份胁迫对种子发芽率的抑制作用，并且在胁迫条件下能够提高核酸和可溶性蛋白质 含量，促进幼苗的生长( a n u m d h a 等，2 0 0 1 ) 。 水分逆境生长于干旱胁迫条件下的甜菜，根产量随着胁迫程度的加重而下降。在 不太严重的干旱条件下，用b r 处理完全能够弥补由干旱造成的生物量的损失。在 水分胁迫中，b r 处理可以促进根的生长。而生物量的增加与幼叶中酸性转化酶活性 的提高相关联( s c h i l l i n g 等，1 9 9 1 ) 。在逆境条件下，用b r 对小麦耐旱品种和对干旱敏 感品种进行种子或叶面喷施处理，均对植株生长起到了促进作用，而且耐旱品种对 b r 处理表现出了更强的反应。b r 之所以能诱导抗旱能力是因为提高了植株的吸水 能力，膜的稳定性以及c 0 2 和n o 的同化率( s t i r a m ，1 9 9 4 ) 。周天等人( 2 0 0 3 ) 的研究 也证实了这一点，0 1 m g lb r 喷施玉米幼苗叶片并在干旱条件下与清水对照相比 硕士论文表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫂，2 0 0 5 ) 较，幼苗脯氨酸含量增加，细胞膜系统完整性良好，叶绿素含量增加，相对含水量 提高，提高了幼苗的抗旱性。对于黄瓜，在干旱条件下用b r 处理可以提高其植株 氨基酸和酰氨含量，进而提高黄瓜苗对干旱及高温的抵抗能力( p u s t o v o i t o v a 等， 2 0 0 1 ) 。 水通道蛋臼在控制细胞内水分含量方面起到关键作用。分别从野生型拟南芥、 b r - 缺失型( c p d ) 以及对b r 不敏感型拟南芥突变体中提取原生质体并对其渗透能 力进行测定。结果，b r 处理对c p d 植株原生质体的渗透能力有所提高( m o r i l l o n 等， 2 0 0 1 ) 。由此推断水通道蛋白在b r 介导的增强水分渗透能力方面起定作用而且由 于b r 对原生质体的渗透能力没有“快”、“慢”之分，因此b r 可能并没有直接作用于 原生质膜。虽然这些结果看起来都是间接的，但是b r 对细胞内水分状况的影响以 后一定能够测出。 病原物侵染近年来些研究结果表明，b r s 对真菌限h r i p a c h 等，1 9 9 9 ；k h r i p a c h 等，2 0 0 0 ) 细菌以及病毒瘸害( n a k a s h i t a 等，2 0 0 3 ) 具有广谱抗性。在植物的化学保护 效应方面，b r s 的作用效果甚至优于杀真菌剂。用b r 喷施马铃薯植株，降低了 p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s 的侵染率。b r 处理马铃薯块茎，提高了a b a 、乙烯、酚类以 及萜类物质的含量从而增强其抗病性。b r 所诱导对真菌性病害的抵抗性在黄瓜植株 中也有体现，b r 处理提高了黄瓜苗中过氧化物酶和多酚氧化酶活性，从而提高其抗 病性。另一个试验中，番茄根部接种v e r t i c i l l i u m d a h l i a e 真菌，用1 “m e b r 处理1 4 天并在接种后2 8 天内调查病情。用e b r 处理过的植株或者没有表现出病症或者病 情很轻，而未用e b r 处理的植株大多数表现出较严重的病情。但是，在接种前一天 对幼苗进行短时间的e b r 处理并不能减轻病害程度( p r i t i ，2 0 0 3 ) 。基于以上观察， b r s 具有抗真菌的潜能。然而，这种潜力也是相对而言的。如果将b r s 作为抗真菌 剂使用就必须对其施用浓度、施用时问、施用方式以及施用于植物生长发育的时期 进行严格控制，否则可能反而会刺激真菌的生长加重病情。 有报道称，用b l ( 最具活性的b r s ) 处理烟草植株可以诱导其对烟草花叶病毒 ( t m v ) 、细菌病原物p s e u d i m o n a ss y r i n g a e 以及真菌病原物o i d i u ms p 的抗性。对 于水稻则可以诱导对导致稻瘟病的m a g n a p o r t h eg r i s e a 和细菌性枯萎病的 x a n t h o l n o l q ( i s o r y z a e 的抗性( n a k a s h i t a 等，2 0 0 3 ) 。b l 对烟草和水稻分别采取叶面 喷施和土壤灌溉的方式进行处理，5 天后接种病原物。在烟草试验中b l 处理既未增 加水杨酸含量也未导致p r 基因( p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dg e n e ) 的表达，这表明，b l l3 硕士论文表油菜素内酯提高西葫芦痛毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 诱导的抗性机理有别于水杨酸和伤害信号诱导的抗性机理。用s a r 的激发子以及 b l 同时处理植株，在植株上产生了更强的保护效应。这种增值效应与同时激活不同 的防御反应机制有关。进一步的研究要从分子水平入手，对控制信号传递的关键因 子进行深入研究以揭示其抗性机理。 b r s 在抗病毒方面的作用也是值得广泛注意的。马铃薯块茎培养在含有b r 的 介质中，在其生长发育的各个阶段都表现出更强的抗性( k h r l p a c h 等2 0 0 0 ) 。另外， 在细胞培养中，b r s 及其衍生物对i 型单纯疱疹病毒( h e r p e ss i m p l e x v i r u st y p ei ， h s v - i ) 和沙粒病毒( a r e n av i r u s ) 的复制可以起到很好的抑制作用( w a e h s m a n 等。 2 0 0 0 ) 。一些b r s 的衍生物对麻疹病毒也表现出很好的抗性( w a c h s m a n 等，2 0 0 2 ) 。 其它逆境在虫害防治方面，常常使用杀虫剂和除草剂，但是也会对植物造成不同 程度的伤害。b r 处理能够减轻由杀虫剂和除草剂造成的伤害，对植物体起到保护作 用( c u t k e rg c ，1 9 9 1 ) 。但是，这方面的研究还不是很多，因此，在实际应用上还不够 成熟。 2 植物的诱导抗病性 植物的诱导抗病性，又称获得性抗病性或植物免疫。是植物在一定的生物或非 生物因子的刺激或作用下，对随后的病原物侵染具有较不受处理的情况下更强的抵 抗性的特征。植物初次接受处理的因子，叫做诱导因子或诱导物；经一定时间后进 行挑战接种的病原物称为挑战因子或挑战物。病原物本身或其弱株系以及其它非病 原微生物都可以成为生物性的诱导因子。非生物因子包括有化学药剂、植物组织抽 提液和物理及机械损伤刺激等等。根据植物诱导接种与挑战接种部位之间的距离关 系，诱导抗性又可分为局部性诱导抗性和系统性诱导抗性。前者只发生在植物接受 初次刺激处或其紧邻地区；后者则能在距离诱导处一定距离的地方表现出来。两者 表现形式不同，所涉及的机理也有差别。 2 1 生物学特性和其诱发的防御反应 诱导抗性有3 个时间参数，即诱导期、最大期和持久期，因诱导因予、植物及 病害利，类而不同。诱导抗性的产生需要在诱导处理和挑战接种之间有一个时间间隔， 即为诱导期或迟滞期( k u c 等，1 9 8 3 ) 是植物对诱导刺激发生“免疫应答”到防卫基 1 4 硕士论文表油菜素内酶提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 因表达和产物积累所需的时间。最大期指诱导抗性基因以刺激活化到获得最大表型 效应所经历的时间。持久期即诱导抗性的持续时间，在不同病害体系中有很大差别。 病菌弱毒株对烟草抗赤星病诱导的诱导期为3 d ，最大期为1 2 d ，持久期为2 1 2 8 d ( 董 汉松等，1 9 9 3 ) 。诱导抗性的另一特点是非专化性，即一种病害的抗性可由多种因子 诱导，或一种因子诱导产生的抗性对抵抗多种病原物都有效。 植物与病原或其它诱导因子相互识别，启动或引发系列的防御反应。就目前 的认识来看，主要有以下几个方面： 过敏反应过敏反应是植物受病原菌侵染后，细胞组织快速死亡的现象，是植 物抗病性的重要标志( w e i 等，1 9 9 2 ) 。当用诱导菌预接种或激发子处理植物时，植 物可产生h r ，从而启动一系列防卫反应，抵抗挑战菌的侵染。 植物保卫素的合成和积累植物受到病原菌侵染或激发予刺激后所产生或积累的一 类低分子量抗菌性次生代谢产物，称为植物保卫素( p h y t o a l e x i n ) ( e b e l je la l ，1 9 8 8 ) 。 目前发现的植物保卫素都不是蛋白质，多属于类异黄酮、类萜、呋喃香豆素、聚乙 炔、葡糖苷类化合物。 p r 蛋白形成当植物受到病原菌侵染时，抗性反应的激活总伴有一系列特殊蛋白的 积累，此类蛋白称为病程相关蛋i ! i ( p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n s ，p r ) ( 王勇刚等。 2 0 0 2 ) 。目前认为p r 蛋白，特别是几丁质酶和母一1 ，3 一葡聚糖酶是植物潜在的抗 病物质，且具有广谱抗性。 抑制病原物降解酶的蛋白质抑制物的合成病原物中含有能分解植物细胞壁物质的 酶，如角质酶、果胶酶、半纤维素酶、木质素酶等及分解细胞内物质的蛋白酶、淀 粉酶、脂质酶等。正是依靠这些酶开路，病原物才能穿透植物细胞壁，杀伤寄主原 生质，消解寄主组织从而使植物生病，而经激发子激发后，可诱导植物产生酶抑制 物质，如酚类、丹宁、蛋白质等，来抑制病原菌分泌的一系列水解酶，从而延缓或 阻止病程发展。如葡萄幼果果皮中的一种丹宁含量较高，可抑制灰霉菌的多聚半乳 糖醛酸酶( 病原菌降解寄主细胞壁的。种关键酶) ，使侵染中断。在甘薯组织中发现 一种水溶性蛋白质，也可抑制多聚半乳糖醛酸酶( 王金生，1 9 9 9 ) 。 细胞壁修饰作用病原物侵染或激发子诱发可导致植物细胞壁木质化、木栓化、产 生酚类物质和钙离子沉积等多种防卫反应f 李振歧，1 9 9 5 ) 。如木质化作用是在细胞 壁、胞间层和细胞质等不同部位产生和积累木质素类似物，从而抵抗病菌的侵入或 使侵入的菌丝只局限在少数的表皮细胞内，阻止侵入菌丝的扩展。现已发现真菌细 堡主笙塞墨塑整鲞塑塑堡查堕塑要塑量塑垫丝塑生墨塑! ! ! 堕! 堕塑：! ! ! ! ! 胞壁成份如凡丁质、脱乙酰几丁质等均能诱导木质化作用。 2 2 h ：o ：与植物诱导抗病性 活性氧( a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ，a o s ) 是含氧而且具有高度化学活性的几种分 子总称，包括：超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基、单线态氧和脂质过氧化的中间 产物等( 孙存普等，1 9 9 9 ) 。自从d o k e 首次发现植物与病原物非亲和性互作中产生 0 2 、h 2 0 2 等活性氧以来，人们对活性氧代谢与植物诱导抗病性之间的关系进行了 许多研究。在植物与病原菌互作中，a o s 迸发不但对病原物在寄主体内的活力产生 直接影响，限制病原物侵染及进一步扩展，而且增强了植物细胞壁的结构，使植物 产生一系列抗病反应，从而提高植物的抗病性。 在多种植物病害系统中都有h 2 0 2 的积累，h 2 0 2 在植物抗瘸反应中的作用受到 广泛重视。a p o s t o l 等( 1 9 8 9 ) 用真菌细胞壁制备的寡聚半乳糖醛酸激发子可诱导大 豆悬浮培养细胞产生h 2 0 2 。l e g e n d r e 等( 1 9 9 3 ) 用柑桔果胶制备的寡聚半乳糖醛酸 也能诱导大豆悬浮培养细胞产生h 2 0 2 。来自病原真菌及植物的葡聚糖、半乳糖醛、 寡聚肽等诱发物处理均可诱导植物产生h 2 0 2 ( l e g e d r e 等，1 9 9 3 ；n u m b e r g e r 等， 1 9 9 4 ：s v a l h e i n 等，1 9 9 3 ) 。c h e n 等( 1 9 9 3 ) 用水杨酸处理也可诱导植物产生h 2 0 2 。 许多研究发现h 2 0 2 在激活抗病反应中可能起到一个二级信使的作用，在转录水 平上激活和调控植物体内各种防御相关基因的表达。目前，人们对活性氧与抗病防 卫反应信息传递的关系有两种理解，一种观点认为细胞代谢产生的h 2 0 2 直接作为二 级信使参与植物抗病防卫反应。h 2 0 2 可能作为二级信使在大豆培养细胞植保素大豆 素诱导中起作用( w u 等，1 9 9 7 ) ；激活菜豆悬浮培养细胞中植保素合成所需酶类及 壳聚糖酶等防御相关基因的表达( m e h d y ，1 9 9 4 ) 。水杨酸诱发植物产生系统抗病反 应并激活防御相关基因的表达，可能是通过抑制过氧化氢酶的活性，增加植物体内 h 2 0 2 的浓度来调控的。h 2 0 2 在此可能作为第二信使起作用( c h e n 等，1 9 9 3 ) 。h 2 0 2 作为信使，其作用位点可能处于信号传递途径中的不同层次，它可以氧化质膜受体 上的巯基使受体活化，也可以活化或抑制信号级联反应中的重要酶类。 当然，也有研究结果显示h 2 0 2 作为信号分子还缺乏说服力。其观点认为细胞产 生的活性氧通过引起膜脂过氧化，产生某些不饱和脂肪酸的过氧化物作为信号分子， 如茉莉酸、荣莉酸甲酯等，激活植物的各种防卫反应。 硕士论立表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究 ( 陶嫒2 0 0 5 ) 看来h ：o ：作为植物抗病反应信号分子需要进一步确认，以及是否以第一信使 ( 胞外信使) 和第二信使( 胞内信使) 两种形式同时存在，还有对基因表达的调节，都是 值得深入探讨的问题。在植物与病原菌互作过程中h 2 0 2 积累的机制还不清楚，但 h 2 0 ：在植物抗病反应中的作用得到了愈来愈多研究结果的支持。综合前人所做的工 作，可以发现h 2 0 2 在植物抗病反应中所起的作用是多方面的：( 1 ) 直接抑制和毒害 病原菌：( 2 ) 引发寄主膜脂过氧化，导致h r ；( 3 ) 促进寄主细胞壁的木质化和细胞壁 结构蛋白的交联，使得细胞壁的结构得以增强，是病原菌侵染后植物产生的主要防 御反应之一；( 4 ) 诱导植保素的合成。植保素( p h y t o a l e x i n s ) 是植物受到生物或非生物 因子侵袭酎在体内合成并积累的一类低分子量抗菌性物质。 另外，在植物一病原菌互作研究中h 2 0 2 代谢有关酶类的作用也受到广泛重视。 过氧化氢酶( e a t a l a s e ，c a t ) 是过氧化酶体( p e r o x i s o m e ) 中重要酶类之一。在催 化过程中c a t 催化h 2 0 z 转化为水和氧分子。过氧化氢酶( c a t ) 作用在于分解h z 0 2 ， 在非亲和反应中c a t 活性明显下降；诱导剂处理引起的h ：0 2 含量提高现象，可被 外源c a t 处理抑制( g l a z e n e r 等，1 9 9 6 ) 。s a ，i n a ( 2 ，6 一二氯异烟酸) 等诱抗剂 也是通过直接或间接作用调节c a t 的活性来诱导植物产生抗病性( c o n r a c h 等， 19 9 5 ) 。利用带有c a t 反义基因的转基因烟草植株的试验进一步证明，处理后c a t 的水平降低，而，r 基因被诱导表达，抗t m v 的能力增强( t a k a h a s h i 等，1 9 9 7 ) 。 过氧化物酶( p e r o x i d a s e ，p o d ) 是一类性质较复杂的酶类，抗坏血酸过氧化物酶、 谷胱甘肽过氧化物酶、细胞色素c 过氧化物酶等均属于这一类。它在植物与病原菌 互作系统中的活性变化，及其作用的广泛性和多样性已有大量的报道，被认为是植 物抗病反应中关键性酶。p o d 的作用之一被认为是清除h 2 0 2 ，近来也有研究表明 p o d 参与植物体内h 2 0 2 的产生( g r a n e 等，1 9 9 1 ：w i n s t o n 等，1 9 9 0 ) 。 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d a s ed i s m u t a s e , s o d ) 是目前研究最多的抗氧化酶。s o d 在生物体内是防御0 2 一伤害的主要酶类。植物中超氧化物歧化酶( s o d ) 被认为是产生 h 2 0 ：的重要酶类，但是有关s o d 活性变化与植物抗病性关系的研究所得结论并不 一致( m e h d ym c ，1 9 9 4 ) 。 总之，各种抗氧化酶活性在不同植物不同环境中都会发生变化从而导致h 2 0 z 的最终累积或清除 硕士论文表油菜素内酯提高西葫芦病毒病抗性的生理机制研究( 陶嫒，2 0 0 5 ) 2 3 水杨酸与植物诱导抗病性 水杨酸( s a l i c y l i c a c i d ，s a ) ，即邻羟基苯甲酸，是一种简单的酚类化合物。因 为它既在动物上有作用，又在植物上有作用，尤其是在植物防御病害方面的作用而 引起人们的特别关注。 早在1 9 7 9 年，w h i t e 就报道了烟草叶片注射s a 后，引起p r 蛋白积累，并提高 烟草对t m v 侵染的抵抗力。9 0 年代以后，把s a 作为一种植物对胁迫反应所需的 信号分子来研究，已积累了大量资料。s t i c h e r 等( 1 9 9 7 ) 在其文献综述中归纳了s a 作为诱发s a r 的信号分子主要依据：外源s a 可诱导多种植物p r 蛋白表达，合成 植保素，产生活性氧，并产生对真菌、细菌、病毒等多种病原菌的抗性；在s a r 基 因表达及s a r 产生之前，内源s a 先积累，且s a 积累水平与抗性强弱呈正相关； s a 适合于在植物韧皮部中进行长距离输送；水杨酸羟化酶基因的转基因烟草和拟南 芥试验结果表明，s a 是植物产生s a r 所必需的，许多诱抗因子诱导植物产生s a r 需要通过积累s a 的途径。 但是，对于s a 是否是诱发s a r 的原初信号却有不同的看法。r a s m u s s e n 等 ( 1 9 9 1 ) 发现，在检测到s a 积累之前摘除黄瓜诱导处理叶，植株上部未处理叶仍 能产生s a r ，故认为s a 不是诱发s a r 的原初信号。v e m o o i j 等( 1 9 9 4 ) 以转水杨 酸羟化酶基因烟草和野生型抗病品种烟草分别作为接穗和砧木进行嫁接，用t m v 诱导接种砧木进行试验，结果同样表明s a 并不在诱导部位产生，不是诱发s a r 的 原初信号，但它为诱发s a r 所必需。p i e t e r s e 等( 1 9 9 6 ) 用荧光假单胞杆菌w c s 4 1 7 r 菌株诱导拟南芥对f u s a r i u m o x y s p o r i u mf s p r a p h a n i 或p s e u d o m o n a ss y r i n g a e p v t o m a t o 产生s a r 时，发现s a r 的产生不需要s a 的积累。但是m o l d e r s 等( 1 9 9 6 ) 以“c 标记苯甲酸的方法来标记新合成s a 进行实验，结果s a 产生于诱导接种叶， 未处理叶中s a 的积累先于s a r 的产生，s a 是诱发s a r 的原初信号。 s a 作为信号分子是否具有普遍性，也是“个值得探讨的问题。有研究发现在一 些植物如番茄、豇豆、水稻和马铃暮等本身体内存在较高水平的内源s a ，却未能激 活植株抗病反应和s a r ，提高植株的抗病性( c h e n 等，1 9 9 7 ；y u 等，1 9 9 7 ) 。由此 看来，不同的植物一病原菌互作系统可能产生完全不同的反应，s a 不是诱导所有植 物s a