（分析化学专业论文）光谱法研究生物大分子与小分子相互作用.pdf

。，b“；e野，p 摘要 蛋白质是人体中广泛存在的的物质，其中血清白蛋白的含量最为丰富。研究血清蛋 白与小分子相互作用在生命科学、药代动力学、药物在体内的作用机理等方面具有重要 的理论意义。 本文基于荧光法并结合紫外光谱法、重叠积分法和反应热力学原理等对一些化合物 与血清蛋白的相互作用进行了讨论，为研究生物大分子与药物小分子相互作用的原理、 药代动力学和反应热力学等方面提供了信息。其主要内容如下： 第一章，综述了光谱法在研究生物大分子与小分子相互作用中的应用。 第二章，在模拟人体生理条件下运用荧光光谱等方法研究了苯溴马隆与牛血清白蛋 白的相互作用，l i n e w e a v e b u r e 和s t e m - v o l m e t 方程得出苯溴马隆与b s a 作用的猝灭机 理及其结合位点数。由热力学参数推测出二者间的作用力类型。 第三章，研究了盐酸丁咯地尔与人血清白蛋白的相互作用，结果说明其猝灭机理可 能为静态猝灭，两者主要以静电作用相互结合。研究了z i l 2 + ，c u 2 + ，c a 2 + 等金属离子对盐 酸丁咯地尔与人血清白蛋白相互作用的影响。 第四章，分别讨论了4 硝基苯( 双一4 一羟基一6 一甲基一2 一氧代- 2 h - p 比喃- 3 ) 甲烷和4 氟苯基( 双一4 一羟基一6 一甲基一2 一氧代一2 h 一吡喃一3 ) 甲烷和人血清白蛋白的相互作用。其 猝灭机理可能为静态猝灭。二者分别以范德华力和静电作用与白蛋白结合。研究了金属 离子存在条件下对体系相互作用的影响。 第五章，研究了具有生物活性的吡喃类衍生物新药3 5 - 双氧乙酰基5 ( 2 。氨基 一7 ，7 二甲基5 一氧代5 ，6 ，7 ，8 一四氢4 h 吡哺3 氰基) 2 脱氧尿苷( d a a d ) 和5 ( 乙基 2 氨基4 甲基5 氧代一7 苯基5 ，6 ，7 ，8 四氢4 h 吡喃3 羧酸) - 2 脱氧尿苷( e a m d ) 与牛 血清白蛋白的相互作用，其发生猝灭的机理可能是动态猝灭。e a m d 和d a a d 对b s a 的 作用主要是疏水作用力。 关键词：血清蛋白，相互作用，荧光光谱法 l k a b s t r a c t p r o t e i ni st h es u b s t a n c e s ，w h i c hw i d e l ye x i s t si nt h eb o d y t h em o s ta b u n d a n tp r o t e i ni ss e r u m a l b u m i ni nt h eb l o o dp l a s m a t h es t u d i n go nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e ns e r u mp r o t e i n sa n ds m a l lm o l e c u l e s h a v es i g n i f i c a n tm e a n i n gf o rt h el i f es c i e n c e s ，p h a r m a c o k i n e t i c sa n dt h em e c h a n i s mo fd r u ga c t i o n t h et h e s i si n v e s t i g a t e dt h ei n t e r a c t i o n so fs o m ec o m p o u n d sw i t hs e r x l mp r o t e i n sb yu s i n gf l u o r e s c e n c e a n du l t r a v i o l e ts p e c t r o s c o p y , o v e r l a pi n t e g r a lm e t h o da n dt h er e a c t i o nt h e r m o d y n a m i c s t h er e s u l t sc a n g i v et h ei n f o r m a t i o na b o u tt h em e c h a n i s mo ft h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e sa n dd r u g ， p h a n n a c o k i n e t i c sa n dr e a c t i o nt h e r m o d y n a m i c s t h em a i nc o n t e n t sa r ea sf o l l o w s ： ，n l ef i r s t c h a p t e rr e v i e w s t h ea p p l i c a t i o n so fs p e c t r o c o p yo nt h e i n t e r a c t i o no fb i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e sw i t hs m a l lm o l e c u l e s c h a p t e ri i ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb e r m b r o m a r o n ea n db o v i n es e r u ma l b u m i nw a ss t u d i e db y s p e c t r o s c o p i cm e t h o d s u n d e rs i m u l a t i v ep h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n s n eq u e n c h i n gm e c h a n i s ma n dt h e i r b i n d i n gs i t e sw e r ed e d u c e da c c o r d i n gt ol i n e w e a v e b u r ea n dt h es t e m v o l m e re q u a t i o n t h et y p eo f a c t i n gf o r c ew a so b t a i n e d ，b a s e do nt h et h e r m o d y n a m i cp a r a m e t e r s c h a p t e ri i is t u d yb u f l o m e d i lh y d r o c h l o r i d ew i t hh u m a ns e r u ma l b u m i ni n t e r a c t i o n ，t h er e s u l t ss h o w t h a tt h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mm a yb eas t a t i cq u e n c h i n gm o d e t h ee l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nw a st h e m a i n l yb i n d i n gf o r c e t h ee f f e c t so fs o m em e t a li o n so nt h eb i n d i n gw e r es t u d i e d t h ef o u r t hc h a p t e rd i s c u s s e st h ei n t e r a c t i o no ft h ep y r a nd e r i v a t i v e s 4 - n i t r o p h e n y l ( d i - 4 h y d r o x y - 6 - m e t h y l - 2 - - o x o 2 h - p y r a n 一3 - y 1 ) m e t h a n e ( n p p m ) a n d4 - f l u o r o p h e n y l - ( d i - 4 - h y d r o x y - 6 - m e t h y l - 2 - o x o 2 h p y r a n 3 - y 1 ) m e t h a n e ( f p p m ) w i t hh u m a ns a u ma l b u m i n ( h s a ) t h em e c h a n i s mm i g h tb eas t a t i c q u e n c h i n g v a nd e rw a a l sf o r c ea n d e l e c t r o s t a t i cb i n d i n gm i g h tp l a ym a i nr o l e sf 打n p p m h s aa n df p p m m s a r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so fs o m em e t a li o n so nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h es m a l lm o l e c u l ea n d h s aw e r ed i s c u s s e d c h a p t e rv ，s t u d i n gt h ei n t e r a c t i o no f n u c l e o s i d ec o m p o u n d s ，5 - ( e t h y | 2 - a m i n o - 4 - m e t h y l 5 o x o 一7 p h e n y l - 5 ，6 ，7 ，8 一t e t r a h y d r o - 4 h - c h r o m e n e - 3 - c a r b e x y l a t e ) 一2 - d e o x y a r i d i n e e a m d ) a n d3 5 - d i - 0 一a c e t y l 5 一 ( 2 - a m i n o 一7 ，7 - d i m e t h y l 一5 - o x o - 5 ，6 ，7 ，8 - t e t r a h y d r o - 4 h c h r o m e n e 一3 - e a r b o n i t r i l e ) - 2 - d e o x y u r i d i n e ( d a a d ) w h i c hp o s s e s sb i o l o g i c a la c t i v i t i e sw i t hp r o t e i n i t sq u e n c h i n gm e c h a n i s mm a yb ead y n a m i cq u e n c h i n g t h ea c t i n gf o r c ei sm a i n l yh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nf o r c e k e yw o r d s ：s e r u ma l b u m i n ，i n t e r a c t i o n ，f l u o r e s c e n c e i i i 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 目 录i i i 第一章荧光光谱法在研究生物大分子与小分子相互作用和药物分析中的应用1 1 1 光谱学概述及荧光法研究药物与血清白蛋白的应用1 1 1 1 哒嗪酮及核苷l 1 1 2 抗癌类药物2 1 1 3 黄酮2 1 1 4 类黄酮3 1 1 5 喹诺酮以及氧喹诺酮类3 1 i 6 吲哚酸类4 1 1 7 头孢类4 1 1 8 葸环类4 1 1 9 大环内酯类4 1 1 10 四环素族类5 1 1 1 1 聚合物和蛋白质的相互作用5 1 1 1 2 药用染色剂和蛋白质的相互作用5 1 1 1 3 农药与蛋白质的相互作用5 1 2 荧光前景展望6 第二章苯溴马隆与牛血清白蛋白相互作用的研究。7 2 1 实验部分7 2 1 1 仪器与设备7 2 1 2 实验方法。8 2 2 结果与讨论8 2 2 1 紫外吸收光谱8 2 2 2 苯溴马隆对b s a 的荧光猝灭作用8 2 2 3 猝灭机理9 i v 2 2 4 热力学参数和作用力类型。i1 2 2 5 苯溴马隆和b s a 结合常数k a 及位点n 的求算11 2 2 6 苯溴马隆和b s a 作用距离的计算11 2 2 7 苯溴马隆对蛋白质构象的影响1 2 2 2 8 共存金属离子的影响一1 4 第三章光谱法研究盐酸丁略地尔与人血清白蛋白的相互作用1 5 3 1 实验部分1 5 3 1 1 仪器与设备1 5 3 1 2 实验方法1 6 3 2 结果与讨论1 6 3 2 1u v - v i s 吸收光谱1 6 3 2 2 盐酸丁咯地尔对h s a 的荧光猝灭作用1 7 3 2 3 猝灭机理17 3 2 4 热力学参数及其相关作用力类型1 9 3 2 5 结合常数k a 及位点n 的求算2 0 3 2 6 盐酸丁咯地尔和h s a 作用距离的计算2 0 3 2 7h s a 构象变化2 2 3 2 8 共存金属离子的影响2 3 第四章( 双4 羟基6 甲基2 氧代一2 h 吡喃3 ) 甲烷类化合物与人血清白蛋白相互作用的 光谱研究。2 5 4 1 实验部分2 6 4 1 1 仪器与设备2 6 4 2 实验结果与讨论2 6 4 2 1u v - v i s 光谱研究2 6 4 2 2p p m 对h s a 的荧光猝灭作用2 7 4 2 3 猝灭机理2 7 4 2 4 热力学参数及其相关作用力类型2 9 4 2 5p p m 和h s a 作用距离的计算3 0 4 2 6h s a 构象变化3 l v 4 2 7 共存会属离子的影响3 3 第五章光谱法研究吡喃类嘧啶核苷与牛血清白蛋白的相互作用3 5 5 1 实验部分3 5 5 1 1 仪器与设备3 5 5 2 实验结果与讨论一3 6 5 2 1u v v i s 光谱研究3 6 5 2 2 药物对b s a 的荧光猝灭作用3 6 5 2 3 猝灭机理3 7 5 2 4 药物和b s a 作用距离的计算4 0 5 2 5b s a 构象讨论4 2 5 2 6 共存金属离子的影响4 3 结论4 5 参考文献4 7 致谢错误! 未定义书签。 攻读硕士期间的学术论文目录。5 3 独创性声明5 7 关于论文使用授权的说明5 7 v i 第一章荧光光谱法住研究生物人分子与小分f 卡 | 且作川和约物分析中的戍川 第一章荧光光谱法在研究生物大分子与小分子相互作用和药物 分析中的应用 1 1 光谱学概述及荧光法研究药物与血清白蛋白的应用 紫外可见光谱统称为电子光谱，是由于分子的价电子或外层电子发生跃迁产生的1 1 1 。 当紫外线照射到某些物质，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当照射 停止，所发射的光线随之很快消失。这种光线被称为荧光1 2 j 。 荧光分析法由于其灵敏度高、线性范围广、可供选择的参数多、具有有力的时间标 度等优点在近年来被广泛的运用于生命科学，药物分析，材料科学等诸多领域。药物分 析是分析化学原理、方法和技术在药学研究及生命科学研究领域中的具体应用( 包括体 液中的药物及药物残留量的分析) 。发展的主要趋势是如何能够简便、快速地从复杂组 成的样品( 含体液) 中灵敏、可靠地检测一些痕量成分，了解进入体内的药物在体内的 吸收、分布、排泄、代谢及转化信息，以及药物分子与受体分子之间的关系，减少药物 的毒副作用，改造药物的分子结构，为研制疗效更好、毒性更低的药物提供可靠信息【，l 研究药物在模拟人体生理条件下和蛋白质的相互作用有重要的生理学和临床意义。 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，其结构中包含有一些内源性脂肪酸化合物i a l 。 由于其能与各种药物分子结合并改变其药代动力学而在医药行业中受到广泛关注【5 】。 血清白蛋白的三维晶体结构有3 个结构域：s i t ei 、s i t e i i 和s i t d i i 。每个结构域又 含有a 与b 2 个亚结构域，以槽口相对的方式形成圆筒状结构。大多数药物在血清白蛋 白上的结合部位为s i t ei 及s i t e i l l 7 4 1 ，血清白蛋白还有个强金属结合作用位点在n 末端 1 6 l 。 1 1 1 哒嗪酮及核苷 哒嗪酮及其相关衍生物具有极其重要的药理学活性，大多涉及心血管系统。哒嗪酮 环被发现对心力衰竭具有有利的药理学作用。例如左西孟旦1 9 l m c i 一1 5 4 t l o i 。t e n g w a n g 等人 运用荧光同步荧光圆二色性光谱法和分子建模等方法研究了在模拟人体生理条件下哒 光谱法研究! l 物人分。- f 与小分f 相t a ：f l - j t j 嗪酮衍生物( 5 一氯一2 一硝基一n 一( 4 一( 6 一氧代一l ，4 ，5 ，6 一四氢哒嗪一3 ) 苯基) 苯f 酰胺( c n p b ) 和人血清白蛋白( h s a ) 相互作用。研究表明体系的相互作用主要是疏水作用，但氢键 和静电相互作用不能排除。他们的相互作用主要是位于h s a 的s it ei 位的疏水作用力【l i l 。 核苷和它的衍生物具有极强的生物学活性，医学上常被用于抗癌和抗菌等方面。崔 风灵等人运用荧光紫外分子建模等手段研究了5 碘尿苷与人血清白蛋白的相互作用。证 明机理为静念猝灭，主要结合作用力为疏水作用力【1 2 】。 1 1 2 抗癌类药物 奥沙利铂是第三代铂化合物，作为化疗药物被用来治疗结肠癌【1 3 1 。陈兴国等人用荧 光、吸收、红外光谱和圆二色( c d ) 等方法研究了在生理条件下奥沙利铂与人血清白 蛋白( h s a ) 的相互作用。结果表明其为静态猝灭，奥沙利铂与人血清白蛋白的相互作 用引起了h s a 构象的变化【1 4 】。 没食子酸是一种存在于天然植物中的苯酚类化合物，具有抗氧化性、抗癌性、抗真 菌等作用【1 3 - 1 6 1 。y a h e n gz h a n g 等人运用荧光猝灭傅里叶红外光谱等方法研究了在生理环 境下，没食子酸与h s a 的相互作用，结果发现其相互作用主要是疏水作用力和静电作用 力，作用位置在h s a 的s i t ei 位【m 。 喜树碱是在喜树中天然存在的化合物，该化合物具有很强的抗癌活性【1 8 】。李桂芝等 用荧光光谱法、分光光度法研究了盐酸拓扑替康、盐酸依利替康与牛血清白蛋白的相互 结合反应。实验表明喜树碱类药物与牛血清白蛋白的相互结合作用为单一的静态猝灭过 程，二者之间的主要作用力为疏水作用和偶极偶极相互作用【1 9 i 。 二 1 1 3 黄酮 黄酮类化合物广泛存在于天然中草药中，具有多种生物学活性。 廖卫平等研究了用荧光光谱法、分光光度法研究了水溶液中槲皮素与牛血清白蛋 白，实验表明槲皮素与牛血清白蛋白的作用为静态猝灭，是以疏水作用力为主的自发过 程【2 0 】。张保林等人研究了大黄素、黄酮、栎精等黄酮类和葸醌类药物与人血清白蛋白的 相互作用。发现这些化合物与h s a 的结合能力随其含有极性集团的增多而减弱【2 l 】。李连 山等用荧光猝灭法研究了5 ，7 二羟基磷酰化黄酮对牛血清白蛋白的相互作用，实验表明 5 ，7 二羟基磷酰化黄酮与牛血清白蛋白的作用为静态猝灭【2 2 1 。 2 第一章荧光光潜法住研究生物人分f 与小分i f 相儿作j h 和约物分析中的戍川 1 1 4 类黄酮 类黄酮是一系列多酚类天然化合物，广泛地存在于高等植物中。这类化合物具有广 泛的生物活性和临床运用 2 3 - 2 4 i 。 j i a n n i a o t i a n 等人研究了汉黄芩素与牛血清白蛋白的相互作用，由热力学参数的计 算和荧光猝灭随温度的变化可知两者主要以疏水作用力相结合，猝灭类型为静念猝灭 【2 5 】。葛根素是一种存在于天然植物葛根中的类黄酮。临床试验表明可用于治疗高血压， 防止动脉硬化，扩大冠状动脉 2 6 j 。j i n h u al i 等人研究了葛根素与人血清白蛋白之问的相 互作用，结果表明其为静态猝灭，结合作用力主要是疏水作用力和氢键作用力，并运用 分子建模做了验证姗。y a n q i n g w a n g 等人研究了橘皮苷和牛血清白蛋白的荧光猝灭。证 明其猝灭机理为静态猝灭，疏水作用力和静电引力是主要的作用类型【2 8 1 。j i a n g h o n gt a n g 等研究了5 ，7 ，47 一羟基6 ，37 ，5 三甲氧基类黄酮与h s a 的相互作用【2 9 1 。 1 1 5 喹诺酮以及氧喹诺酮类 氟罗沙星( f l e r o x a e i n ) 是第3 代氟喹诺酮类抗菌素。聂丽华等人研究了氟罗沙星对牛 血清白蛋白的荧光猝灭现象，证明猝灭机理为静态猝灭。两者间的作用力为静电引力1 3 0 】。 姚武等研究了依诺沙星与牛血清白蛋白相互作用，证明体系有较强的结合作用，且结合 作用力主要是氢键和范德华作用力【3 l 】。环丙沙星是第三代喹诺酮类抗菌素，张晓威等人 对环丙沙星与牛血清白蛋白相互作用进行了研究，证实了二者间相互作用为单一的动态 猝灭过程，求出了猝灭常数，并依据能量转移理论确定了药物与蛋白的最近距离【3 2 i 。姚 武等研究洛美沙星与牛血清白蛋白的相互作用，求出洛美沙星与牛血清白蛋白的结合常 数和结合位点数，能量给体受体间的作用距离和能量转移效率【3 3 1 。刘翠格等人研究了氧 氟沙星的荧光光谱与质子化作用研究p 4 1 。张海容等研究了司帕沙星与白蛋白的相互作 用，体系的作用机理为单一的静态猝灭过程，作用机制为能量转移机制【3 5 1 。陈昌云等研 究了普利沙星与牛血清白蛋白相互作用。结果证明其作用机理为静态猝灭，两者间以较 强的静电作用力相结合【3 6 1 。赵利霞等研究了诺氟沙星与牛血清白蛋白结合作用，诺氟沙 星与b s a 产生荧光猝灭是由于形成化合物而引起的静态猝灭。实验结果还证明，诺氟沙 星和牛血清白蛋白之间有较强的结合力【3 刀。颜承农等进行了芦氟沙星与牛血清白蛋白结 合反应的热力学研究，证明体系的作用机理为静态猝灭，结合作用力主要是氢键或范德 华力【3 8 1 。郭明等利用毛细管电泳方法研究了加替沙星与牛血清白蛋白的结合反应，得到 3 光谱法研究生物人分一，- c j d , 分f 相互作川 了实用的非线性模拟计算公式并计算了蛋白质一药物相互作用的结合参数【3 0 】。贸丽华等 研究了甲醇与水的体积比为l ：9 溶液中恩诺沙星与牛血清白蛋白( b s a ) 的相互结合作用， 其作用机理为静态猝灭。郭明等应用荧光光谱法研究了喹诺酮抗菌素甲磺酸培氟沙星 与牛血清白蛋白分子问的结合反应，测定了结合常数k 和结合位点数n 1 4 。 1 1 6 吲哚酸类 消炎疼一种甲基化吲哚衍生物是f 体抗炎药物，其中的双氯芬酸常用于减轻发烧疼 痛肌肉僵硬和肿痛，这种药物与蛋白的相互作用往往利用光谱学信息进行分析，因为其 比传统的方法更具优势 4 2 删。m b o g d a n 等人研究了该药物与h s a 的相互作用。计算了 结合位点数和结合常数。 1 1 7 头孢类 丁焕平等研究了第一代头孢菌素头孢拉定和头孢羟氨苄与牛血清白蛋白的相互作 用，证明体系为静态猝灭。并求出得出了头孢拉定头孢羟氨苄与t r p 2 2 1 4 的距离，证实 药物的稳定性及半衰期与结合常数有关【4 5 1 。邵爽等研究了头孢地嗪钠与牛血清白蛋白相 互作用，可知两者的作用形式是静态猝灭，结合力是氢键或者范德华力。刘洛生等以 光谱技术研究了人血清白蛋i 刍( h s a ) 与头孢克罗分子间结合作用机制，确定该反应的解 离常数。二者相互作用主要是疏水作用力并得出了药效与能量转移效率和解离常数有关 的结论1 4 7 1 。刘洛生等人研究了头孢哌酮与人血清白蛋白相互作用机制，推断其作用力主 要是静电作用，头孢哌酮对1 32 内酰胺酶的稳定性与药物结构有关，抗菌活性和抗生素 效力与能量转移效率和解离常数有判4 8 】。 1 1 8 蒽环类 阿霉素( a d r i a m y c i n ) 是临床广泛使用的葸环类抗癌抗生素，对白血病、乳腺癌及多 种癌症都有显著疗效【4 9 】，黄波等运用荧光光谱和吸收光谱研究了阿霉素与牛血清白蛋白 间的结合作用，确定其猝灭机理为静态猝灭，并计算了能量转移距离和结合常数【5 0 l 。 1 1 9 大环内酯类 红霉素是大环内酯类抗生素，在临床上治疗革兰阳性菌感染的主要药物【5 1 1 。刘保生 等人利用荧光及紫外光谱法研究了红霉素与牛血清白蛋白的相互作用机制，得到其猝灭 4 第一章荧光光潜法在研究生物人分子与小分子相! i ：作川和约物分析中的j 专川 类型主要为静态猝灭，体系的结合作用主要为范德华力1 5 i 。 1 1 1o 四环素族类 四环素是有链霉菌产生的一种广谱抗生素，在结构上都属于多环并四苯羧基酰胺母 核，对革兰氏阳性和阴性菌，支原体等病菌有极好的抑制作用f 5 3 】。陈震华等人用荧光光 谱法研究了四坏素族药物( 四环素，土霉素，金霉素) 对白蛋白荧光的猝灭，由静态猝灭 法和s c a t c h a r d 法获得了药物与白蛋白作用的解离常数，且与其它方法获得的结果相符， 说明它们的作用过程主要是静态猝灭，推测其进入人血清白蛋白中的疏水性腔，且通过 疏水作用力被结合在这种腔结构上【5 4 i 。 1 1 1 1 聚合物和蛋白质的相互作用 多种聚合物常作为蛋白质稳定剂被用作基础研究，并在药理学上有所运用。其生物 相容性和生物来源性很利于被运用在持续给药系统的设计中防5 6 1 。生物降解的聚合物已 经被广泛运用在给药系统中，如p l a ，p l g a ，己被运用在生物多肽的控制释放中【5 7 】。 a s a d o l l a h a s a d i 等人研究了牛血清白蛋白与一些新型的p e g 双嵌段共聚物的相互作用。 实验表明这些共聚物大部分不干扰蛋白质的结构，只是造成螺旋结构的轻微下降【5 8 1 。 1 1 1 2 药用染色剂和蛋白质的相互作用 c i d i r e c ty e l l o w9 是一种在染色、生物标记和诊断辅助中有重要运用的染料，被非 常成功的运用于临床【5 9 1 。陈兴国等人研究了该染料与h s a 的相互作用，结果证明体系中 起作用的是稳定的疏水作用力和氢键唧i 。吖啶橙在生物上由于其平面结构常被用于小分 子与r n a 反应的探针【6 l l ，j u nw a n g 等人运用荧光法研究了牛血清白蛋白和吖啶橙的相互 关系及其在动力超声波下的损害f 6 2 】。 1 1 1 3 农药与蛋白质的相互作用 百草枯是一种农业上常用的无选择性除草剂，由于其抵抗光降解以及微生物降解的 特性f 6 3 i ，残留于农作物中，因其氧化破坏和弄断闯入的d n a 被视为人类和动物的基因毒 性剂汹5 1 。o e n c h e n g z h a n g 等人研究t h s a 与百草枯之间的相互作用，证明体系的作用 机理为静态猝灭，作用力主要是疏水作用力和静电引力f 6 6 1 。甲胺磷是一种有机磷杀虫剂， 为典型的酶毒剂。唐红枫等研究了甲胺磷对小白菜中可溶性蛋白质及s o d 、m g + a t 5 光谱法研究生物人分：f 与小分子相互作川 p a s e 、c a 2 + a t p a s e 和c a t 的影响，实验结果说明农药喷洒后使植物体内产生大量氧自由 基，进而诱导细胞内防御活性氧自由基毒害的物质产生【6 7 1 。叶发兵，董元彦等研究了磺 酰脲除草剂与过氧化氢酶的相互作用，静念猝灭是体系猝灭的主因，3 种除草剂与过氧 化氢酶的结合作用：甲磺隆 氯磺隆 苄嘧磺隆1 6 s 】。 1 2 荧光前景展望 近年来生物学和化学的交叉应用依然在不断地发展。生命物质的多样性要求研究手 段和方法不断地更新。荧光分析已经由简单的荧光光谱发展到荧光光谱和同步荧光光 谱，三维荧光光谱，并有和其他的各种技术如高效液相色谱，质谱，核磁共振，傅里叶 变换红外光谱毛细管电泳等连用，用于弥补各自检测手段的限制，达到更好的分析和研 究物质的作用。 在药物的荧光分析方面，根据潘祖亭等人的总结归纳1 6 9 1 ，胶束增容增敏荧光法，化 学引导荧光分析法，荧光探针分析法等新兴方法得到了研究和应用，对多配体的研究也 得到了发展i t o j 。 6 第_ 二章苯澳马隆与牛血清向赁l q n _ q l 作川的研究 第二章苯溴马隆与牛血清白蛋白相互作用的研究 在模拟人体生理条件下研究药物一蛋白质体系，尤其是血清白蛋白与药物的相互作 用，在生理学和临床意义中有重要的现实意义。血清白蛋白是血清中的主要蛋白质，占 血浆中蛋白质含量的一半。能维持血液的渗透压和酸碱度、担负运输某些代谢产物、可 以与许多内源或外源化合物结合。研究这种体系的相互作用，有助于了解药物在体内的 作用机制、了解药代动力学原理以及蛋白质的结构与功能的关裂l 。 苯溴马隆属于苯骈呋喃衍生物，其功能为促进尿酸排泄。该药物的作用机制主要是 通过抑制肾小管对尿酸的重吸收，从而降低血中尿酸浓度。适用于原发性高尿酸血症、 痛风性关节炎间歇期及痛风结节肿【7 。运用荧光光谱和紫外可见吸收光谱技术对苯溴马 隆与牛血清白蛋白的相互作用和能量转移进行了研究，得出了结合常数、结合位点数、 结合反应的热力学函数等参数；为研究b s a 在苯溴马隆作用下构象的变化、阐明苯溴马 隆在体内的作用机制、储存和运输过程提供了依据。 2 1 实验部分 2 1 1 仪器与设备 图1 - 1 苯溴马隆结构图 f i g 1 - 1t h e s t r u c t u r eo f b e n z b r o m a r o n e f p 6 5 0 0 荧光分光光度计( 日本j a s c o 公司) ；i 6 双光束紫外可见分光光度计( 北 京普析通用仪器有限公司) 。 苯溴马隆( b m ) 储备液：苯溴马隆片剂( h e u m a n np c sg m b h 公司德国) 配制成浓 度为2 o x1 0 4 m o l l 的溶液；用t r i s h c l 缓冲溶液稀释成浓度为1 0 x1 0 5 m o l l 的工作液。 n a c l 溶液：o 5m o l l ( 用p h = 7 4 的t r i s h c l 缓冲溶液配制) 。t r i s - h c hp h = 7 4 ；牛血清白 7 光谱法研究生物人分子与小分子相且作川 蛋白( 美l 蛩s i g m a 公司分装) 储备液：1 o x1 0 4 m o l l ，使用t r i s h c l 缓冲溶液稀释为浓 度为1 0 1 0 m o l l 的工作液。试剂均为分析纯。 2 1 2 实验方法 在1 0m l 容量瓶中加入0 5m o l l 的n a c l 溶液2 0m l 、1 0 x1 0 5m o l l 的b s a 溶液1 0 m l ，以及一定量的苯溴马隆工作液，用t r i s h c i 缓冲溶液定容。分别扫描b s a 以及b s a 在苯溴马隆作用下的u v v i s 吸收光谱、荧光光谱、同步荧光光谱和三维荧光光谱。 2 2 结果与讨论 2 2 1 紫外吸收光谱 在模拟生理条件下，苯溴马隆吸收峰在3 6 2n i n 处，b s a 吸收峰分别位于2 7 8n m 和2 1 2 n n l 处( 图1 2 ) 。当加入苯溴马隆后，蛋白质在2 1 2n m 处的吸收峰红移，2 7 8n l n 处的吸 收峰紫移。吸收光谱的变化说明苯溴马隆和基态的b s a 发生了相互作用，初步推断为静 态猝灭。 x m 图1 - 2 体系的吸收光谱图 f i g 1 2a b s o r p t i o ns p e c t r ao f t h es y s t e m l ：c b s a = 1 0 x1 0 石t o o l l ；2 ：c 陷a = c b m = 1 0 1 0 。6 m o l l ；3 ：c b h i = 1 o 1 0 6 m o l l 2 2 2 苯溴马隆对b s a 的荧光猝灭作用 蛋白质分子中因含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸残基而产生较强的荧光。按实验方法 得到了苯溴马隆存在时，b s a 的荧光光谱。如图1 3 可见，在溶液中，一定量的苯溴马隆 不同程度地降低了b s a 的荧光强度，说明，苯溴马隆和b s a 发生了相互作用。 第一：章苯澳马隆与牛血清向货f 1 相互作川的研究 图1 3 苯溴马隆对b s a 的荧光猝灭光谱 f i g 1 - 3t h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n gs p e c t r ao fb s aw i t hb e n z r o m a r o n e c b s a = 1 0 x 1 0 击m o l l ；c b m = o ，2 x 1 0 j ，4 x 1 0 ，8 x 1 0 ，1 o x i o 。6 ，1 2 x 1 0 - 6 ，1 4 x 1 0 一，1 6 x 1 0 ，1 8 x 1 0 ， 2 0 xl0 - 6 m o l l 2 2 3 猝灭机理 荧光猝灭作用分为动态猝灭和静态猝灭两类。动态猝灭常数磁。反映了动态猝灭中 荧光体和猝灭剂之间的相互作用程度和猝灭作用的性质；静态猝灭结合常数k l b 描述了 静态猝灭中荧光体和猝灭剂之间的相互作用【7 2 l 。 苯溴马隆对b s a 荧光猝灭过程如果是动态猝灭，其作用应该遵循s t e r n v o l m e r 方程 式： 等= l + k g f 。c o = 1 + k ( 2 - 1 ) 式2 l 中，f 0 为b s a 溶液的荧光强度，f 为加入猝灭剂苯溴马隆之后的荧光强度，c q 为加入的苯溴马隆浓度，k 为猝灭常数，k 是由扩散过程控制的双分子动态猝灭速率常 数，to 为生物大分子内源荧光的平均寿命( to = 1 0 s ) 7 3 1 。 将不同温度下的荧光猝灭数据分别按( 2 1 ) 式作s t e r n - v o l m e r 曲线见图1 - 4 ，结果发 现，其猝灭呈现良好的线性关系。2 5 c 和3 7 时，l ( s v 分别是1 2 2 6 10 5l t o o l d ( r = o 9 9 3 4 ) 和1 1 0 4 x1 0 5 l t o o l 。( 1 p 0 9 9 6 3 ) 。由to = 1 0 8 s 可知，速率常数远大于扩 散控制的k q ( 2x1 0 1 0 l m o l q s j ) u 4 i ，可以初步判定苯溴马隆对b s a 的荧光猝灭为静态猝 灭，说明苯溴马隆与b s a 可能生成了复合物。 苯溴马隆对b s a 荧光猝灭过程如果是静态猝灭，其作用应该遵循l i n e w e a v e b u r e 方 程： ( f o - f ) 2 瓦i + 瓦丽1 ( 2 - 2 ) 9 1 0 2 o 1 6 【l 1 2 ，：二，5 ，。7 ：t 7 1 c ：，一 0 8 ： 一 。 一- o 0 0 0 0 0 20 0 0 0 0 0 40 0 0 0 0 0 60 0 0 0 0 0 8 q ( m o l l ) 图卜4 苯溴马隆一b s a 的s t e r n - v o i m e r l 曲线 f i g 1 - 4t h es t e r n v o l m e rc u r v e so ff l u o r e s c e n c eq u e n c h m go fb s a b yb e n z r o m a r o n e 0 0 6 圣0 0 4 【工一 0 0 2 o 0 0 12 0 0 0 0 2 4 0 0 0 03 6 0 0 0 0 4 8 0 0 0 0 1 c q ( l t 0 0 1 ) 图卜5 苯溴马隆一b s a 的l i n e w e a v e - b u r e l 曲线 f i g 1 - 5t h el i n e w e a v e - b u r eg u r v e so f b e n z r o m a r o n e - s s a 表1 1 为不同温度下的s t e m - v o l m e r 和l i n e w e a v e b u r e 方程的线性关系和相关系数。 表1 _ 1 线性方程和相关系数 s t e r n v o l m e r 曲线( 2 5 c ) s t e m v o l m e r l 拄l 线( 3 7 c 1 舌= o s 5 + ! 2 2 6 x1 0s 捌o 朔4 百f = 0 8 7 2 9 + i 1 0 4 岫q 】 。9 9 6 3 l i n e 、懈v 争b u 他曲线( 2 5 ) ( f o - f ) = 0 0 0 2 9 7 + 7 6 7 7 x 1 0 4 q o 9 9 9 1 l i n e 、憎懵b u r e 曲线( 3