（中西医结合临床专业论文）四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响.pdf

蛰。二 弗 目录 中文摘要1 英文摘要4 研究论文四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响 前言6日吾”6 材料与方法6 结果1 0 附图、附表1 3 讨论1 8 参考文献2 2 综述内皮细胞与v e g f 关系的研究2 5 致谢3 5 个人简历3 6 中文摘要 四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响 摘要 目的：研究四妙勇安汤醇沉药液对体外培养的人脐静脉内皮细胞 ( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ，h u v e c ) 缺氧损伤模型的影响，探 讨四妙勇安汤醇沉药液对缺氧造成的人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用 机制。 方法：用0 1 胶原酶及0 2 5 胰蛋白酶( 1 ：1 ) 混合酶灌注消化法对健 康人脐静脉内皮进行消化，对所消化下来的细胞进行体外原代培养，用光 学显微镜从形态学观察，并采用免疫荧光抗体方法对相关抗原进行检 测，用这两种方法对所培养的细胞进行鉴定并对其进行传代培养。将实验 用细胞分为三组，分别为( 1 ) 正常细胞组：正常的人脐静脉内皮细胞加入正 常培养液，放入3 7 5 c 0 2 培养箱培养2 4 h ；( 2 ) 模型组：对人脐静脉内 皮细胞进行缺氧处理后，加入正常培养液，然后放入3 7 5 c 0 2 培养 箱进行培养2 4 h ；( 3 ) 四妙勇安汤组：对人脐静脉内皮细胞进行缺氧处理后， 加入含1 0 四妙勇安汤醇沉药液的细胞培养液后，放入3 7 5 c 0 2 培养 箱继续培养2 4 h 。用四甲基偶氮唑蓝( m e t h y t h i a z o l e t r a z o l i u m ，m t t ) 实验观 察四妙勇安汤对实验各组内皮细胞细胞活性的影响，实验用t e c a n s u n r j s e 酶标仪测定实验各组细胞吸光度值；用东芝日产1 2 0 全自动生 化仪测定四妙勇安汤对缺氧内皮细胞各组细胞培养液中乳酸脱氢酶 ( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，l d h ) 漏出量的影响；并用免疫荧光化学方法检测 各组细胞中血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ，v e g f ) 生成量的表达，用日产o l y m p u s 荧光显微镜观察各实验组细胞中黄绿色 荧光颗粒数目。 结果：( 1 ) 对所培养的细胞进行鉴定：倒置相差显微镜下的形态学 观察：可见所培养的细胞刚刚接种时细胞多数聚集成团，周边有细胞向外 游离，只有少量细胞单个生长；细胞接种2 4 h 后即可见大量细胞贴壁，细 胞单层扁平，形态多样，呈现圆形，多角形，部分分化，初长出的细胞为 短梭形，3 4 d 细胞生长最迅速，很快融合成片，7 d 左右细胞即可长成致 密单层，呈典型的铺路石状排列，边界清楚，胞浆丰富，胞核圆形居中， 中文摘要 结构清晰，胞质均匀。传代细胞生长更加旺盛，有时可见多核细胞；细胞 的形态也更趋多形，可见圆形细胞。随着细胞传代次数增加，细胞增值缓 慢，细胞呈现长梭形改变，并迅速碎裂，凋亡。免疫荧光抗体方法进行 因子相关抗原检测：荧光显微镜下观察可见所培养的原代及传代细胞胞 浆中均有大量较强黄绿色荧光颗粒，胞核周围尤为明显，而用p b s 替代 兔抗人因子多克隆抗体的对照组细胞，则无此反应。经此两种方法初步 鉴定所培养的细胞为内皮细胞。( 2 ) 四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的 影响：三组细胞m t t 实验中各孔吸光度值、培养液中l d h 漏出量以及 免疫荧光化学检测的v e g f 生成量的表达量结果经方差分析均为p o 0 1 ， 均数做两两比较，结果差异均有显著性。正常组内皮细胞m t t 实验中 各孔吸光度值为( o 2 8 0 4 4 - 0 0 1 0 3 ) ，免疫荧光化学检测的v e g f 生成量的 表达量为( 4 0 6 4 - 8 3 2 9 3 ) ，在三组实验细胞中均为最高，培养液中l d h 漏 出量为( 3 3 5 4 8 8 8 8 ) ，在三组细胞中最低；模型组细胞m t t 实验中各 孔吸光度值为( o 1 5 4 9 4 - 0 0 2 4 7 ) ，免疫荧光化学检测的v e g f 生成量的表 达量为( 2 1 2 4 - 6 6 4 6 6 ) ，在三组实验细胞中均最低，细胞培养液中l d h 漏 出量为( 1 9 6 8 3 3 3 4 - 1 9 3 0 2 ) ，在三组实验细胞中为最高；四妙勇安汤醇 沉药液组m t t 实验中各孔吸光度值为( o 2 1 5 8 4 - 0 0 3 0 1 ) ，免疫荧光化学检 测的v e g f 的生成量的表达量为( 2 8 34 - 3 7 2 2 7 ) ，均介于正常组和模型组 之间，低于正常组，高于模型组；培养液中l d h 漏出量为( 1 2 9 5 4 - 2 5 3 9 0 9 ) 同样是介于正常组和模型组之间，高于正常组，而低于模型组。三组细胞 三种检测指标均数做两两比较，均为p o 0 1 ，差异均有显著性。 结论：( 1 ) 经过0 1 胶原酶及o 2 5 胰蛋白酶( 1 ：1 ) 混合酶灌注消化人 脐静脉内皮所获得的细胞，经原代及传代培养鉴定为人脐静脉内皮细胞； ( 2 ) 四妙勇安汤对缺氧所致的人脐静脉内皮细胞的损伤具有一定的保护 作用，其作用机制可能与四妙勇安汤可能增加缺氧细胞的细胞活性； 四妙勇安汤可能减轻缺氧对内皮细胞的损伤，促进细胞有氧代谢，抑制无 氧酵解及乳酸堆积来维持细胞膜的功能，有一定的膜保护作用，从而达到 对内皮细胞的保护作用；四妙勇安汤增加细胞中v e g f 生成量的表达， 影响细胞的内分泌功能，从而减轻缺氧所致的内皮细胞凋亡、坏死，从而 最终达到促进血管新生的作用有关。有无其他具体的保护作用机制，还有 待于进一步的实验研究。 中文摘要 关键词：四妙勇安汤；缺氧；内皮细胞；血管内皮细胞生长因子；四 噻唑蓝实验；乳酸脱氢酶 e f f e c to fs im i a o y o n ga n t a n go nh u m a nu m b i l i c a lv e i n e n d o t h e l i a lc e l l si n j u r e db y h y p o x i a a b s t r a c t o b j e e t i v e ：t h eo b j e c t i v eo ft h ep a p e ri st os t u d yt h ep r o t e c t i v ee f f e c to f s im i a oy o n ga n t a n go nh u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ( h u v e c s ) i n j u r yi n d u c e db yh y p o x i a m e t h o d s ：t h eh u v e c sw a sc u l t u r e di nv i t r op r i m a r ya n dw a st o p a s s a g e d t h ee x p e r i m e n tc e l l sw e r ed i v i d e di n t ot h r e eg r o u p s t h en o r m a l h u v e c sw a st a k e na st h en o r m a l g r o u pa n dc u l t u r e di nt h en o r m a l m e d i u m t h eh y p o x i am o d e lw a se s t a b l i s h e da tt h et r e a t e dt w o g r o u p sw h i c h w e r ec u l t u r e di nt h eb u f f e rw i t hl o wc o n c e n t r a t i i o no f g l u c o s ea n dc o v e r e db y s c e n l e o i l t h e yw e r ed i v i d e di n t om o d e lg r o u pa n ds im i a oy o n ga n g r o u p t h em o d e lg r o u pw a sc u l t u r e di nt h en o r m a lm e d i u ma n dt h es im i a o y o n ga ng r o u pw a sc u l t u r e di nt h em e d im c o n t a i n i n glo s im i a oy o n ga n t a n g t h ep r o l i f e r a t i o no fh u v e c sw a sm e a s u r e db ym t t a s s a y t h el e v e lo f l d hi nt h em e d i u mw a sm e a s u r e d b yb i o c h e m i s t r ya n dt h ep o s i t i v e e x p r e s s i o no fv e g fw a s d e t e c t e db yi m m u n o f l u o r e s c e n c e c h e m i s t r y r e s u l t s ：t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em t i ，l d h l e a k a g e sa n de x p r e s s i o n o fv e g fo ft h et h r e e g r o u p ss h o w e das i g n i f i c a n td i f f e r e n c e6 0 d 0 1 ) c o m p a r e dw i t ht h em o d e lg r o u p ，t h el e v e lo fl d h ( 12 9 5 2 5 3 9 0 9 ) w a s s i g n i f i c a n t l yl o w e ri nt h es im i a oy o n ga nt a n gg r o u pa n dw h i l et h ec e l l a c t i v i t yi n d i c a t e db ym t t ( 0 2 15 8 o 0 3 01 ) w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e ri nt h es i m i a oy o n ga n t a n gg r o u p ，t h en u m b e ro ft h ec e l l ss t a i n e db yv e g f ( 2 8 3 3 7 2 2 7 ) a l s oi n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y 仞 d 0 1 ) i nt h et r e a t m e n tg r o u po fs i m i a o y o n g a nt a n g c o n s c l u t i o n ：s im i a o y o n ga nt a n gh a ss o m e w h a tp r o t e c t i v ee f f e c to n h u v e c si n j u r e db yh y p o x i a ，w h i c hm a yb er e l a t e dt oi t se f f e c to f i n c r e a s i n g t h ec e l l s l i v a b i l i t y , d e d u c i n gt h ei n j u r yi n d u c e db yh y p o x i a ，p r o t e c t i n gt h e m e m b r a n e ，u p 。r e g u l a t i n ge x p r e s s i o n so fv e g fa n dp r o m o t i n ga n g i o g e n e s i s 4 墓盎塑墨 k e y w o r d s ：s im i a o y o n ga nt a n gh y p o x i a ；h u m a nu m b i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a lc e l l s ；v e g f ；m t t ；l d h 一 5 研究论文 四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响 屿! - 莉茜 内皮细胞是覆衬于全身血管和淋巴管内面的单层扁平细胞，具有多种 生理功能，它作为组织与血液间的第一道屏障，是最先感受缺氧的细胞之 一【1 之】。在缺血性心脏病的发生发展过程中，内皮细胞受损、功能障碍是 其中的关键因素【3 】。缺氧损伤可引起活性氧的大量产生。自由基、活性氧： 脂质过氧化物均可引起内皮细胞损伤。而缺氧是最常见的致血管内皮受损 的因素之一，可导致血管内皮细胞的坏死和凋亡，后者在多种心血管疾病 的发生和发展中起着重要作用【4 】。对缺氧内皮细胞的保护将阻止内皮细胞 的进一步恶化，从而达到改善症状、治疗疾病的目的【5 】。因此对缺氧内皮 细胞的研究成为了研究缺血缺氧性疾病的重要手段。而人脐静脉为体外获 得内皮细胞的重要来源，故而选用人脐静脉内皮细胞作为实验对象。四妙 勇安汤是一首治疗脱疽的古方，具有清热解毒，活血止痛的功效。现代药 理研究证实，该方能够扩张血管、改善供血，疏通及促进血液循环使未闭 塞的动脉及侧枝循环变粗、增多，已经广泛应用于治疗血栓闭塞性脉管炎。 近年来大量研究表明此方对心血管疾患疗效确切【6 】。本研究在建立体外内 皮细胞缺氧模型的基础上，用m t t 方法检测各组细胞活性、用生物化学 方法检测各组细胞培养液中l d h 漏出量、用免疫荧光化学方法检测各组 细胞v e g f 生成量的表达，从三个不同方面观察了四妙勇安汤对缺氧所 致的人脐静脉内皮细胞损伤的影响，从而探讨了四妙勇安汤抗心肌缺血的 作用机制。 材料与方法 l材料 1 1 试剂1 6 4 0 培养基干粉( g i b c o 公司) ，i 型胶原酶( g i b c o 公司) ，胰 蛋白酶( a m e r s c o 公司) ，胎牛血清( 杭州四季青) ，明胶( s i g m a 公司) ， v e g f b ( g i b c o 公司) ，o 9 生理盐水( 石家庄四药) ，1 0 0 u m l 青霉素、 8 0 1 a g m l 链霉素( 华北制药) ，四乙酸乙二胺二钠( d i s o d i u me d e t a t e ，e d t a ) ， 研究论文 含钙低糖缓冲液( 河北医科大学) ，兔抗人因子相关抗原多克隆抗体 ( b s 0 3 3 2 r 北京博奥森生物公司) ，v e g f ( 北京博奥森生物公司) ，异硫氢酸 荧光素( f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，f i t c ) 标记山羊抗兔多克隆i g g ( z f 。0 31 l 北京中杉金桥生物公司) ，m t t ( a m e r s c o 公司) ，二甲亚砜( d i m e t h y l s u l f o x i d e ，d m s o ，g i b c o 公司) ，缓冲甘油，l o 福尔马林液，马血清， 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t - b u f f e rs a l i n e ，p b s ) ，l d h 试剂盒( 上海丰汇科技公 司) ，人脐静脉内皮细胞株( h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ，h u v e c s ， 南京凯基生物公司提供) 。 1 2主要仪器设备 3 7 5 c 0 2 培养箱( t h e r m o ) ，离心机( x i a n g y i l 5 5 0 ) ，倒置相差显微镜( o l y m p u s ) ，荧光显微镜( o l y m p u s ) ，一次性2 5 c m 2 塑料培养瓶( c o s t a r ) ，一次性6 孔细胞培养板( c o s t a r ) ，5 m l 塑料离心管， 5 0 m l 塑料离心管，0 2 0 i _ t m 针头滤器，t e c a ns u n r i s e 酶标仪，东芝日 产1 2 0 全自动生化仪，微量振荡器。 1 3 消化液质量分数为0 1 i 型胶原酶，质量分数为0 2 5 胰蛋白酶 混合消化酶( 1 ：1 ) 。 1 4 完全培养液体积分数为8 0 的16 4 0 培养基，体积分数为2 0 的优 级胎牛血清，8 0 u m l 青霉素，0 0 8 m g m l 链霉素，使用前用5 6 n a h c 0 3 调整完全培养液的p h 值为7 0 7 4 。 2 方法 2 1 人脐静脉内皮细胞原代培养 正常妊娠足月分娩的健康新生儿脐带( 长度应不少于2 0 c m ，石家庄市 第一医院产科协助取得) 娩出后立即放入预先装有冷磷酸盐缓冲液( p b s ， 称取氯化钠8 0 0 9 、氯化钾o 2 9 、磷酸氢二钠3 4 9 9 、磷酸二氢钾o 2 9 ，溶 于1 0 0 0 m l 去离子水中，高压灭菌，4 c 保存) 的磨砂广口瓶中，冰壶中拿 回实验室进行实验。取出脐带，无菌条件下剪去夹痕、血肿、水肿部分( 若 所剩脐带长度短于1 0 c m ，应弃之不用) 温0 9 生理盐水冲洗脐带表面血 迹至无血色，找出脐静脉( 2 根管腔较细的为脐动脉，另l 根管腔较粗的为 脐静脉) 【7 】，两端分别插入三通管并结扎。从一端三通管注入温o 9 生理 盐水冲洗脐静脉至流出液体无血色。封闭一端三通管。从另一端未封闭的 三通管注入消化液使脐静脉充盈，封闭此端三通管。将脐带放入3 7 5 c 0 2 培养箱中消化1 2 m i n ，期间可轻轻揉搓脐带，以使酶与脐静脉内皮充 研究论文 分接触，达到最大消化面积，增强消化效果。取出脐带，打开一端三通管， 将消化液放入预先装有5 m l 温培养液的5 0 m l 离心管中，用温0 9 生理 盐水反复冲洗脐静脉，将消化液和冲洗液充分混匀，1 0 0 0 r p m 离心5 m i n ， 弃上清。轻轻加入生理盐水吹打离心管底，制成单细胞悬液，计数，调整 细胞密度为2 1 0 5 m l ，充分混匀后接种于预先用2 明胶( 称取明胶2 0 9 ， 再加入1 0 0 0 m l 的去离子水，高压灭菌，4 。c 保存) 包被( 实验前用吸管将2 明胶均匀铺在培养瓶底，室温静置3 0 m i n 1 h 即可) 过的2 5 c m 2 培养瓶中， 置于3 7 5 c 0 2 培养箱中2 4 h ，期间绝对禁止反复将培养瓶取出观察细 胞状态。2 4 h 后细胞进行第一次换液，以除去红细胞及未贴壁的杂细胞( 成 纤维细胞和平滑肌细胞) 【8 】。以后根据细胞状态及培养液情况，每2 3 d 换 液1 次，以使细胞处于最佳营养状态。其中3 4 d 细胞生长最迅速，约5 7 d 细胞可长成致密单层，此时细胞需要进行传代，以免形成接触抑制。 2 2 人脐静脉内皮细胞的传代培养 细胞贴壁生长5 7 d 左右长成致密单层，此时细胞需要进行传代，以 免形成接触抑制。吸弃原细胞培养液，加入0 2 5 胰蛋白酶 0 5 3 e d t a ( 1 ：1 ) 混合消化液2 3 m l ，边消化边置倒置相差显微镜下观察， 约l m i n 左右细胞可皱缩变圆，此时立即加入含血清的细胞培养液终止消 化，用吸管轻轻吹打，制成单细胞悬液，按l ：2 1 ：3 比例进行传代。 2 3 人脐静脉内皮细胞的鉴定 2 3 1 形态学观察 原代和传代培养的人脐静脉内皮细胞接种2 4 h 后，将细胞培养瓶直接 置于倒置相差显微镜下观察细胞的结构状态，并对其进行显微摄影。 2 3 2 免疫荧光法检测因子相关抗原【8 】 人脐静脉内皮细胞传代置6 孔细胞培养板内，孔底铺有预先用2 明 胶包被过的盖玻片，待细胞长成致密单层后，弃去原培养液，取出盖玻片， 用p b s 轻轻冲洗3 次，每次持续约l m i n 。用1 0 福尔马林液固定1 0 m i n ， 用p b s 冲洗3 次，每次持续约l m i n 。加入1 0 马血清7 0 1 a l 室温封闭非特 异性抗体2 0 m i n 。加入兔抗人因子相关抗原多克隆抗体7 0 9 l ( 1 ：2 0 0 ) ，3 7 孵育6 0 m i n 。同时设对照组用p b s 代替一抗。用p b s 冲洗3 次，每次 持续约l m i n 。加入f i t c 标记的羊抗兔多克隆i g g 抗体7 0 i _ t l ( 1 ：5 0 ) ，3 7 。c 孵育3 0 m i n 。最后用缓冲甘油封片。立即置于荧光显微镜下观察，并于l 研究论文 x 4 0 0 目镜下观察摄片。 2 4 人脐静脉内皮细胞株的培养 人脐静脉内皮细胞株( 细胞密度为2 3 1 0 6 m l 左右) 复苏后立即置于 3 7 5 c 0 2 培养箱中2 4 h ，待细胞重新贴壁后根据细胞生长状况对细胞 株进行l ：2 或l ：3 的传代培养。传代培养方法同原代细胞的传代培养方法。 2 5四妙勇安汤醇沉药液的制备 按原方准确称取每味中药( 金银花9 0 9 、玄参9 0 9 、当归3 0 9 、甘草15 9 ) ， 加入1 5 倍的去离子水( 即l g 生药加1 5m 1 去离子水) 急火煎煮1 5 h ，1 6 层 纱布过滤，滤出药渣，隔水加热浓缩成生药浓度为3 9 m l 的药液，此时( 6 0 ) 药液相对密度为1 1 8g m l 。冷却后用6 0 乙醇5 。c 6 。c 沉淀2 4 h ，倾去 上清，水浴浓缩成稠膏( 石家庄市中医院制剂室帮助制备) 。4 。c 保存备用。 ( 使用时用细胞培养液稀释成生药浓度为6 4 p g m l 的使用液) 。 2 6内皮细胞缺血缺氧模型的建立【9 】 将人脐静脉内皮细胞株进行传代培养，实验用3 4 代人脐静脉内皮细 胞。将人脐静脉内皮细胞接种于6 孔细胞培养板中，孔底预先铺有2 明 胶包被过的盖玻片，约2 4 h 后，待人脐静脉内皮细胞融合成完整细胞单层 后弃去原培养液，用无菌p b s 缓冲液轻轻冲洗2 次，加入含钙低糖缓冲 液( e a r l e 液，1 17 m m o l l 氯化钠、5 3m m o l l 氯化钾、1 8 m m o l l 氯化钙、 o 8m m o l l 硫酸镁、2 6m m o l l 碳酸氢钠、1 1m m o l l 葡萄糖、lm m o l l 磷酸二氢钠、0 1m m o l l 酚红) 3 m l ，再轻轻的将无菌石蜡油6 0 0 9 l 滴入e a r l e 液，使其完整覆盖于e a r l e 液表面，将6 孔细胞培养板置于3 7 5 c 0 2 培养箱中培养2 4 h 。同时设未加石蜡油的标本为正常对照组。 2 7实验分组 四妙勇安汤组：缺氧内皮细胞中加入含1 0 四妙勇安汤醇沉药液的 1 6 4 0 细胞培养液，放入3 7 5 c 0 2 培养箱中培养2 4 h 。模型组：缺氧内 皮细胞中加入正常1 6 4 0 培养液，放入3 7 5 c 0 2 培养箱中培养2 4 h 。正 常组：正常细胞加入正常1 6 4 0 培养液，放入3 7 5 c 0 2 培养箱中培养 2 4 h 。每组均设置6 个复孔。 2 8m t t 实验【1 叫 细胞接种于9 6 孔细胞培养板中，参照上述缺氧模型及实验分组分别 建立9 6 孔细胞培养板中缺氧模型并进行实验分组。每组均设8 个复孔。 研究论文 将m t t 配成终浓度为o 5 m g m l 的使用液。弃去9 6 孔板中原细胞培养液， 各孔加入m t t 使用液1 0 0j t l ，3 7 5 c 0 2 培养箱中孵育1 h 。取出细胞培 养板倒置，弃去原m t t ，加入d m s o l o o p , 1 ，微量振荡器振荡1 5 m i n 。 用酶标仪在测定波长4 9 2 n m ，参考波长6 2 0 n m 处测定各孔吸光度值。 2 9l d h 漏出量的检测 按试剂盒说明，收集各组细胞各孔细胞培养液2 m l ，1 0 0 0 r p m ，离心 3 m i n ，提取上清液5 0 1 a l ，加入试剂盒自带试齐u ( 2 0 m m o l l 乳酸锂，1 6 5 m m o l l 氧化型辅酶，在培养液中乳酸脱氢酶的作用下产生n a d h ，用东 芝日产全自动生化仪测定培养液中乳酸脱氢酶的含量) 3 0 0 0 d ，混匀后置 3 7 ，分别于3 0 s ，6 0 s 时读取吸光度值。使用前用蒸馏水在3 4 0 n m 处调 零( 石家庄市中医院检验科协助检测) 。 2 1 0免疫荧光法测定v e g f 生成量的表达 取出各组6 孑l 细胞培养板各孔中盖玻片，p b s 轻轻冲洗3 次，每次持 续约l m i n ，1 0 福尔马林固定液室温固定1 0 m i n ，p b s 轻轻冲沈3 次，每 次持续约1 m i n ，1 0 马血清7 0 i - t l 室温封闭非特异性抗体2 0 m i n ，加入一 抗v e g f ( 兔抗人多克隆抗体，1 ：1 0 0 稀释) 7 0 1 a l ，3 7 孵育1 h ，同时用 p b s 代替一抗作为对照组。p b s 轻轻冲洗3 次，每次持续约l m i n ，加入 f i t c 标记的二抗( 羊抗兔多克隆i g g 抗体，l ：2 5 稀释) 7 0 i - t l ，3 7 孵育 3 0 m i n 。立即置于荧光显微镜下观察，黄绿色荧光颗粒为阳性表达。并于 1 4 0 0 目镜下计数，摄片( 附图1 ) 。 3 统计学处理 数据均用统计学软件s a s6 12 版进行统计学分析。实验数据用均数 标准差( x s ) 表示，多组间比较采用单因素方差分析，p o 0 1 为差异 具有显著性。 结果 1 人脐静脉内皮细胞的鉴定 1 1倒置相差显微镜观察 刚刚接种的细胞多数聚集成团，周边有细胞向外游离，只有少量细胞 单个生长；细胞接种2 4 h 后即可见大量细胞贴壁，细胞单层扁平，形态多 研究论文 样，呈现圆形，多角形，部分分化，初长出的细胞为短梭形( 附图2 ) ，3 4 d 细胞生长最迅速，融合成片( 附图3 ) ，7 d 左右细胞即可长成致密单层，呈 典型铺路石状排列，边界清楚，胞浆丰富，胞核圆形居中，结构清晰，胞 质均匀( 附图4 ) 。传代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞；形态更趋多形， 可见圆形细胞。随着传代次数增加，细胞增值缓慢，细胞呈现长梭形改变， 并迅速碎裂，凋亡。 1 2 荧光显微镜下观察 经因子相关抗原免疫荧光检测鉴定，荧光显微镜下可见培养的细胞 胞浆中有大量较强黄绿色荧光颗粒，胞核周围尤为明显( 附图5 ) 。用p b s 代替兔抗人因子多克隆抗体的对照组细胞，则无此反应，为阴性反应。 2 四妙勇安汤醇沉药液对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响 2 1m t t 法检测四妙勇安汤醇沉药液对缺氧人脐静脉内皮细胞活性的 影响 模型组与正常细胞组相比，各孔吸光度值明显降低，活细胞数量明显 减少。四妙勇安汤组与模型组相比，能显著提高各孑l 吸光度值，升高各孔 活细胞数量，提高细胞存活率，减轻缺氧对细胞造成的细胞毒性，但与正 常细胞组相比无法恢复至正常水平。结果经方差分析，模型组与正常细胞 组相比差异有非常显著性意义( p d 0 1 ) ，四妙勇安汤组与模型组差异有非 常显著性意义( 尸 d 0 1 ) ，四妙勇安汤组与正常细胞组差异也有非常显著性 差异妒 d d 似附表1 ) 。 2 2l d h 漏出量测定四妙勇安汤醇沉药液对缺氧人脐静脉内皮细胞的细 胞毒性 模型组与正常细胞组相比，l d h 漏出量明显升高。四妙勇安汤组与 模型组相比，能显著降低l d h 漏出量，减轻缺氧对细胞造成的细胞毒性， 但与正常细胞组相比无法恢复至正常水平。结果经方差分析，模型组与正 常细胞组相比差异有非常显著性意义俨 p 0 1 ) ，四妙勇安汤组与模型组差 异有非常显著性意义俨 d 0 1 ) ，四妙勇安汤组与正常细胞组差异也有非常 显著性差异俨 d d 顸附表2 ) 。 2 3免疫荧光法检测四妙勇安汤醇沉药液对缺氧人脐静脉内皮细胞中 v e g f 生成量的影响 模型组与正常细胞组相比，v e g f 阳性细胞表达数量明显减少。四妙 研究论文 勇安汤组与模型组相比，能显著提高v e g f 阳性细胞表达个数，增加 v e g f 的生成量，但与正常细胞组相比无法恢复至正常水平。结果经方差 分析，模型组与正常细胞组相比差异有非常显著性意义( p d 0 1 ) ，四妙勇 安汤组与模型组差异有非常显著性意义p d 0 1 ) ，四妙勇安汤组与正常细 胞组差异也有非常显著性差异( 尸 d d 似附表3 ) 。 研究论文 附图 f i g 1v e g fi m m u n o f l u o r e s c e n c e b a r ：2 0 0 p m f i g 2h u v e c sw e r ep r i m a r yc u l t u r e d a f t e r 2 4 h ( 1 0 0 ) 1 3 一 塑窒垒查 一 - - _ _ _ - _ _ _ _ _ 一 f i g 3h u v e c s w e l ep r i m a r yc u l t u r e d a f t e r3 d ( x 4 0 0 ) f i g 4h u v e c sw e r ep r i m a r yc u l t u r e d a f t e r7 d ( x2 0 0 ) 一_ 一 1 4 研究论文 f i g 5f a c t o r r e l a t e da n t i g e ns h o w e d p o s i t i v eb yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y b a r ：2 0 0 p m 1 5 研究论文 附表 t a b l e1e f f e c t so fs im i a oy o n ga nt a n go na c t i v i t yo ft h eh u v e c si n j u r i e d b yh y p o x i a r一 一一 一_ 。_ _ 。_ 。_ 。- - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 一 组别例数 m t t 正常组 模型组 四妙勇安汤组 8 8 8 0 2 8 0 4 0 0 1 0 3 0 1 5 4 9 0 0 2 4 7 * o 2 1 5 8 0 0 3 0 la 水 n o t e s ：* i n d i c a t e sp o 0 1 ，c o m p a r e dw i t ht h em o d e lg r o u p ；ai n d i c a t e s p o 0 1 ，c o m p a r e d w i t ht h en o r m a lg r o u p t a b l e2e f f e c t so fs im i a oy o n ga nt a n go nl d hl e a k a g e so ft h eh u v e c s i n j u r i e db yh y p o x i a 。 n o t e s ：* i n d i c a t e sp o 0 1 ，c o m p a r e dw i t ht h em o d e lg r o u p ；ai n d i c a t e s p o 0 1 ，c o m p a r e d w i t ht h en o r m a lg r o u p t a b l e3e f f e c t so fs im i a oy o n ga nt a n go nt h ee x p r e s s i o no ft h eh u v e c s i n j u r i e db yh y p o x i a n o t e s ：* i n d i c a t e sp o 0 1 ，c o m p a r e dw i t ht h em o d e lg r o u p ；ai n d i c a t e s p o 0 1 ，c o m p a r e dw i t ht h en o r m a lg r o u p 1 6 研究论文 讨论 1人脐静脉内皮细胞的原代培养及鉴定、传代培养 获得内皮细胞的血管来源有大血管人脐静脉，家兔、猪、小牛、大鼠 主动脉等；小血管：各种动物的心脏、脑、肺、肾上腺等毛细血管，如大 鼠心脏、脑毛细血管，小牛肾上腺毛细血管等。以人脐静脉在某些方面具 有与动脉生物学特征相似的优点，相对于动物血管，人脐静脉更加接近人 体状况，避免种属之间的差异性，且来源丰富，长度较长，管腔较粗，可 以一次性获得较多的内皮细胞；另外，它对包括炎症因子在内的多种体内 因子均有很好的反应性，而且与动物血管内皮细胞相比，可使实验条件和 所获结果更符合人体情况，因此现代成为血管内皮细胞培养的主要来源。 内皮细胞的分离方法是影响细胞活性的关键因素，传统方法有三种： 即酶消化法、机械刮脱法、贴块法。机械刮脱法对内皮细胞细胞损伤较大， 可刮脱大量成纤维细胞或平滑肌细胞，影响内皮细胞纯度；且操作困难。 贴块法操作方法同机械刮脱法，虽然获得的细胞较纯，但不易掌握贴块时 间，操作上较为困难。酶消化法操作简单，且获得的细胞纯度较高，因此， 目前被广为采用。但消化用酶选择和消化时间长短是关键【1 1 】。蒋红军等【l 2 】 认为，胰酶加胶原酶混合消化液的消化结果较好，最佳消化时间为 1 0 m i n 1 5 m i n ，获取细胞量和贴壁细胞均较多。我们采用o 1 i 型胶原酶， 0 2 5 胰蛋白酶( 1 ：1 ) 混合消化酶在3 7 作用1 2 m i n ，获得大量活性好的人 脐静脉内皮细胞。 内皮细胞培养条件要求严格，脐带离体时间最好控制在4 h 内；内皮 细胞耐酸不耐碱，细胞培养液的p h 值不应大于7 4 ；营养要求比较高， 细胞培养液血清的选择也是决定血管内皮细胞能否存活的决定因素，高质 量的各种血清均能保证内皮细胞的正常生长，有实验结果显示【l3 】高质量的 胎牛血清对人脐静脉内皮细胞的生长有良好的促进作用，是体外培养人脐 静脉内皮细胞的关键。为保证细胞充足的营养，最好用含2 0 优级胎牛血 清的原代细胞培养液；内皮细胞较为娇气，分离下来后，离心速度不应太 高，最好用8 0 0 r p m 1 0 0 0 r p m ，离心时间不宜太长，持续3 - 5 m i n 即可；由 于培养条件严格，细胞不易贴壁，一般需在培养瓶底进行包被，包被物质 较常用的有明胶、纤维连接蛋白、多聚赖氨酸等，由于纤维连接蛋白价格 研究论文 昂贵，大多采用明胶包被；另外，加入肝素等物质可以提高细胞纯度，因 此，也为现在内皮细胞培养实验所常用，但这些又可能成为干扰实验结果 的混杂因素，因此，应根据自己的实验目的，有选择的应用。 内皮细胞由于培养条件严格，而且是一种低更新的细胞，很难体外传 达培养，因此内皮细胞在体外培养过程中一般需要在培养液中加入一些生 长刺激因子，内皮细胞生长因子( e c g f ) 、碱性成纤维细胞生长因子 ( b f g f ) 、血管内皮生长因子( v e g f ) 、肝细胞生长因子、胰岛素及激素等 均较常用，但加入细胞生长因子的种类及用量应根据自己实验室的培养条 件及生长因子的质量从实验中进行摸索，绝对不能只看文献，照抄照搬。 我们在传代培养液中加入1 0 n g m lv e g f b ，细胞传至第4 代生长状态依 然良好。第5 代改为无v e g f b 的原代培养液，细胞很快碎裂、凋亡。 内皮细胞的鉴定方法经典的有形态学观察及免疫组织化学方法两种： 形态学观察又有光学显微镜观察及透射电镜观察两种：光学显微镜观察为 鉴定内皮细胞最简单的方法【8 】，倒置相差显微镜下看到内皮细胞形态单 一，呈梭形或多角形，融合成片后可呈鹅卵样石样排列，细胞边界清楚， 胞质丰富，胞核呈椭圆形，靠近中央，核仁明显，传代后的细胞中还会出 现圆形，椭圆形的细胞。透射电镜观察：w e i b e r - p a l a d e 小体为内皮细胞 特有的结构【1 4 1 ，透射电镜观察到w - p 小体及大量微丝是鉴定内皮细胞的 重要依据之一。本实验采用倒置相差显微镜观察到细胞分离下来时呈圆 形、多角形，初贴壁细胞即呈短梭形，融合成片后呈典型铺路石状排列， 基本认为是内皮细胞。免疫组织化学方法是最为可靠的方法，根据抗原抗 体反应，鉴定的标志物基本有：v m 因子、c d 3 4 、c d l 0 5 ，c d 31 ，d i l l d l ， v w f ( 血管性血友病因子) 等【1 5 1 6 1 。c d 3 4 是一种细胞分化抗原和选择素的 配体，自从f i n a 等【1 7 】发现血管内皮细胞有c d 3 4 的基因表达后，现常用 来标记血管内皮细胞，t h o m a s 1 8 】发现c d 3 4 的阳性表达强于因子，认 为c d 3 4 是目前血管内皮细胞最可靠的标记【1 9 】。但r o s e n b e r g 等【2 0 】认为第 因子是血管内皮细胞的特征性标志之一，因子只存在于内皮细胞、巨 噬细胞和血小板中，因此，因子相关抗原是鉴定体外培养内皮细胞最可 靠的标志。但应注意培养的猪主动脉内皮细胞无因子【8 】。究c d 3 4 及 因子相关抗原哪一个是鉴定体外培养内皮细胞的最可靠标志，仍未有确切 定论。另外，c d l 0 5 ，c d 3 1 ，d i l l d l ，v v i f 等都可作为鉴定内皮细胞的 研究论文 较为可靠的标志，但它们大多都需要和因子或c d 3 4 联合检测。尤其 d i l l d l 更可作为鉴定细胞活力的一项可靠指标【l6 】，而v w f 是血管内皮 细胞受损的高特异性分子标志物【2 1 1 。我们的实验采用较传统的因子多克 隆抗体和f i t c 标记的二抗，在荧光显微镜下观察，发现细胞胞浆中有大 量黄绿色荧光颗粒，结合形态学观察确定所培养的细胞为内皮细胞。 本实验采用o 1 i 型胶原酶，0 2 5 胰蛋白酶( 1 ：1 ) 混合酶灌注消化法 收集细胞，使用1 6 4 0 培养基和2 0 胎牛血清完全培养液对所消化收集的 细胞进行培养，并在培养液中加入1 0 n g m l 生长因子v e g f b ，成功培养 出h u v e c s 并传代至4 代，为内皮细胞的进一步体外实验研究奠定了一 定的基础。 2四妙勇安汤对缺氧人脐静脉内皮细胞的影响 缺氧可明显损害内皮细胞功能，缺氧细胞模型的建立有利于排除在体 实验中众多的干扰因素，可以更加准确的了解缺氧后内皮细胞的功能变化 及调控机制，较以往在体实验更加真实准确。采用人脐静脉内皮细胞，较 动物内皮细胞更符合人体生理特点，有利于进行人体缺氧后内皮细胞内生 物活性物质变化与相应组织器官缺氧后病理改变关系和其作用机制的研 究【9 1 。 四妙勇安汤首见于清鲍相敖验方新编，为治疗脱疽的古方。现 代临床常用于治疗热毒型血栓闭塞性脉管炎，或其它原因引起的血管栓塞 病变。所有这些病变的基本病理基础为血栓闭塞引起局部组织血液供应发 生障碍，产生急性或慢性的严重而持续的缺血缺氧甚至纤维化、坏死。四 妙勇安汤具有清热解毒，活血止痛的功效，多年来，我们根据“异病同治 的治疗原则，将四妙勇安汤用于治疗缺血性心脏血管病变，取得较为满意 的临床疗效。本实验从m t t 、l d h 漏出量、免疫荧光化学检测v e g f 表 达等三方面