（微生物与生化药学专业论文）大豆肽的制备及其体内外抗氧化活性研究.pdf

摘要 摘要 自由基医学基础研究表明氧自由基引起的疾病已超过百种，有资料显示许多慢性疾 病及衰老现象均和人体内的自由基水平失衡有关，过量的自由基对机体产生氧化性损 伤，当这种损伤不能及时修复并且积累到一定程度时往往导致疾病的出现。外源性抗氧 化剂可以帮助人们维持体内自由基的平衡。通过对具有抗氧化性的天然食物进行研究、 筛选和改性，有可能开发出非常有效的抗氧化药物和保健食品。 大豆肽是大豆蛋白经酶水解获得的短肽混合物，目前已发现大豆肽具有抗氧化、降 血压、降胆固醇、降血糖、抗疲劳等生理活性，其中抗氧化性是大豆肽其它生理功能的 基础。通过筛选、分离抗氧化大豆肽有可能从中发现治疗自由基引发疾病的药物或保健 食品。 本论文首先通过单因素实验结合响应面分析对大豆抗氧化活性肽的酶解工艺进行 优化研究，确定了酶解的最佳工艺条件为：底物浓度8 5 0 、加酶量87 5 0u g 底物、 p h l1 、温度5 5 、时间3 0h ，该条件下得到羟自由基清除率为6 5 3 7 的大豆肽。 采用凝胶过滤层析对豆粕粉酶解物进行分离得到了多肽的3 个组分，其中fi i 组分 具有最强的抗氧化活性，对fi i 进行制备，进一步进行体外、体内抗氧化实验。体外实 验结果表明，大豆肽能够清除f e n t o n 反应产生的羟自由基，能清除邻苯三酚系统产生的 超氧阴离子自由基，并能显著地抑制h 2 0 2 诱导的红细胞溶血。大豆肽对于脂质过氧化 反应的终产物m d a 的实验表明，大豆肽粗品和f i i 体外可显著降低肝匀浆的自氧化与 诱导氧化所产生的m d a 。用烘箱加速氧化法，通过测定油脂的p o v 值探讨了在保温条 件下大豆肽对大豆油、菜籽油氧化的抑制效果，结果显示大豆肽对两种油脂的脂质过氧 化均有一定的抑制作用。 用d 半乳糖建立小鼠衰老模型，给予不同浓度的大豆肽，考察了实验小鼠脑指数、 心指数、肝指数、脾指数、肾指数变化，测定小鼠血清中m d a 的含量，s o d 的活力； 测定小鼠脑、肝组织中m d a 的含量，s o d 、g s h p x 、c a t 的活力。实验结果表明大 豆肽：( 1 ) 对小鼠脾指数有显著影响；( 2 ) 可提高衰老小鼠血清中s o d 活力降低m d a 含 量；( 3 ) 降低衰老小鼠肝、脑组织m d a 含量；( 4 ) 提高肝、脑组织s o d 活力、g s h p x 、 c a t 活力。 关键词：大豆肽；酶水解；抗氧化；自由基；脂质过氧化； a b s t r a c t a b s t r a c t f u n d a m e n t a ls t u d yi nf r e er a d i c a ls h o w e dt h a to x y g e nr a d i c a l sr e l a t et oh u n d r e d so f d i s e a s e s p r e v i o u sd a t as h o w e dt h a tm a n yc h r o n i cd i s e a s e sa n ds e n i l ep h e n o m e n o no fh u m a n b e i n gw e r ea l lr e l e v a n tt or a d i c a ll e v e lu n b a l a n c ei nt h eb o d y e x c e s s i v er a d i c a l sc a u s e o x i d a t i o nd a m a g ei nt h eb o d y i ft h ed a m a g ec o u l dn o tb er e p a i r e dt i m e l ya n db ec o l l e c t e dt o s o m ed e g r e e ，i tw o u l dr e s u l ti ns o m ed i s e a s e s b i o a n t i o x i d a n tc a nh e l pp e o p l eh o l dr a d i c a l b a l a n c ei nt h eb o d y i ti sp o s s i b l et od e v e l o pp o t e n ta n t i o x i d a n td r u g sa n df u n c t i o n a lf o o d s t h r o u g hs t u d y i n ga n dm o d i f y i n gs o m en a t u r a lf o o d sh a v i n ga n t i o x i d a t i v ea c t i v i t y s o yp e p t i d e s w e r es h o r tp e p t i d em i x t u r eo b t a i n e d b ys o y b e a np r o t e i ne n z y m a t i c h y d r o l y s i s b yf a r ，s o yp e p t i d e sw e r ef o u n dt oh a v eb i o a c t i v i t ys u c ha sa n t i o x i d a n ta b i l i t y ， b l o o dp r e s s u r er e d u c i n ga c t i v i t y ，c h o l e s t e r o la n db l o o ds u g a rr e d u c i n ga c t i v i t y ，a n t i f a t i g u e a c t i v i t ya n do t h e r s a n t i o x i d a n ta b i l i t yo fs o y b e a np e p t i d ei st h eb a s i so fo t h e rp h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s i ti sp o s s i b l et od e v e l o pn e wd r u go rf o o dp r o d u c t st oc u t et h ed i s e a s et r i g g e r e db y f r e er a d i c a l sb ys c r e e na n ds e p a r a t ea n t i o x i d a n ts o y b e a np e p t i d e b a s e do nt h er e s u l t so fo n e - f a c t o r - a t - a t i m e - t e c h n i q u e ，at h r e e - l e v e lb o x b e h n k e n f a c t o r i a ld e s i g nc o m b i n i n gw i t hr e s p o n s es u r f a c ea n a l y s i s ( r s a ) w a se m p l o y e dt oo p t i m i z e t h ee n z y m a t i ch y d r o l y z ec o n d i t i o no fa n t i o x i d a n ts o yp e p t i d e s i ts h o w st h a tt h eo p t i m u m c o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gh i g ha n t i o x i d a n ts o yp e p t i d e sb ya l k a l i n ep r o t e a s ew e r e ：s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n8 5 0 ，p r o t e a s e sc o n c e n t r a t i o n87 5 0u p e rg r a ms u b s t r a t e ，p h l1 ，t e m p e r a t u r e 5 5 ，a n dt i m e3 0h t h es o yp e p t i d e sp r o d u c e di nt h i sc o n d i t i o nh a ds t r o n gs c a v e n g i n g a c t i v i t i e so f h y d r o x y lr a d i c a l s ；s c a v e n g i n gr a t eo nt h e mw a s6 5 3 7 t h ed e f a t t e ds o ym e a lh y d r o l y s a t ew a ss e p a r a t e di n t ot h r e ep a r t su s i n gs e p h a d e xg - 2 5 g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ；t h es e c o n dp a r tf i ih a ss t r o n ga n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e s s ow e p r e p a r ef i ia n dt e s ti t sa n t i o x i d a n tb i o a c t i v i t y nv i t r oa n di nv i v o t h ee x p e r i m e n ti nv i t r o s h o w st h a t s o yp e p t i d e s h a v e s i g n i f i c a n te f f e c to ns c a v e n g i n gh y d r o x y lr a d i c a l s a n d s u p e r o x i d ea n i o nf r e er a d i c a l s i tc o u l di n h i b i tt h eg e n e r a t i o no fm d a i nl i v e rh o m o g e n a t e ， h e m o l y s i so fr e db l o o dc e l li n d u c e db yh y d r o g e np e r o x i d e a l lt h er e s u l t sa b o v es h o w 廿1 a ts o y p e p t i d e sh a v ea n t i o x i d a t i o ne f f e c ti nv i t r o p o vw e r em e a s u r e db yo v e ns t o r a g em e t h o dt or e s e a r c ho nt h ea c t i v i t i e so fo x i d a t i o n r e s i s t a n c eo ft h es o yp e p t i d e sb ys o y b e a no i la n dc o l z ao i la ss u b s t r a t e s t h er e s u l ts h o w st 1 1 a t t h es o yp e p t i d e sh a v ea n t i o x i d a t i v ea c t i v i t i e st or e s i s tl i p i n o x i d a t i o n t h es e n i o rm o d l ew a sb u i l tu pw i t hk u n m i n g m i c eb yt r e a t i n gd - g a l a c t o s e d i f f e r e n t d o s e so fs o yp e p t i d e sw e r ea d m i n i s t e r e dt ot h ee x p e r i m e n t a lm i c e b r a i ni n d e x ，h e a r ti n d e x ， l i v e ri n d e x ，s p l e e ni n d e x ，k i d n e yi n d e xw e r em e a s u r e d m d ac o n t e n ta n ds o da c t i v i t yo f m i c ei ns e r u mw e r em e a s u r e d t h ec o n t e n to fm d a ，a c t i v i t yo fs o d ，g s h p xa n dc a ro f m i c ei nb r a i na n dl i v e rw e r em e a s u r e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a ts o yp e p t i d e sc o u l d ( 1 ) e f f e c t o ns p l e e ni n d e xo fm i c e ；( 2 ) i n c r e a s et h ea c t i v i t i e so fs o d r e d u c et h el e v e lo fm d ai n s e r u m ；( 3 ) r e d u c et h el e v e l o fm d ai nl i v e ra n db r a i n ；( 4 ) i n c r e a s et h ea c t i v i t i e so fs o d ， g s h p xa n dc a ti nl i v e ra n db r a i n k e yw o r d s ：s o yp e p t i d e s ；e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ；f r e er a d i c a l ；l i p i d i i a b s t r a c t p e r o x i d a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 粒 迦8 ：! 仝 日 期：，棚3 。) 第一章绪论 第一章绪论 大豆肽是大豆蛋白质的水解产物，它是由不同氨基酸排列的多肽分子混合物组成。 目前一般以大豆、豆粕或大豆分离蛋白为底物，用酶解的方法来制备。 大豆肽的分子质量大小、肽链长短以及各种理化性质由所选用的酶的种类、水解条 件和分离方法而定【l l 。大豆肽的蛋白质含量为8 5 左右，其氨基酸组成几乎完全与大豆 蛋白质相同，必需氨基酸平衡良好且含量丰富。与大豆蛋白相比，大豆肽具有更好的理 化性质如易消化吸收、低抗原性、加热不凝固、易溶于水、流动性好等，且含有某些生 理活性物质在机体内有多种生理功能。 1 1 大豆肽的理化性质【2 3 l 1 1 1 良好的溶解性及在高浓度状态下的低粘度 大豆蛋白的粘度随着浓度的增高而急剧升高，在浓度1 3 以上时经高温处理易于产 生疏水键结合和二硫键结合形成网状聚合物，使得溶液粘度高达90 0 0 厘泊，失去流动 性，这限制了大豆蛋白在流体食品中的添加使用，大豆蛋白经过水解后，网状结构被破 坏，因而膨胀性减少、粘度下降，大豆肽在溶液中浓度达3 0 时的粘度仅相当于1 0 大 豆蛋白溶液的粘度，即使浓度达到6 5 ，粘度只有22 0 0 厘泊，且溶解度高达9 9 以上， 流动性良好。大豆肽在高浓度时具有低粘度的特性，特别适合应用在需要高蛋白含量而 又无法大量添加的高蛋白流体食品中。 1 1 2 良好的耐酸及耐热的稳定性 大豆蛋白在酸性或加热条件下会产生沉淀，而很多酸性饮料的p h 正好处于p h 4 5 左右蛋白质的等电点附近，因此就无法添加大豆蛋白来强化营养。精制的大豆肽能够在 大豆蛋白的等电点p h 4 5 附近保持良好的溶解状态，溶液澄清透明，不受p h 变化及加 热的影响另外，大豆肽的n s i 值高达9 0 以上，速溶性好，很适合于速溶饮品的生产， 这为开发酸性大豆饮料和富含蛋白质的酸性食品提供了有利条件。 1 1 3 良好的吸湿性和保湿性 大豆肽的吸湿性非常强。这一特殊性质已被应用于日化工业，作为毛发和皮肽的保 湿剂使用。大豆肽的吸湿性和保湿性比胶原蛋白多肽和丝蛋白肽更强，符合人们追求纯 天然植物性化妆品的心理，并能降低产品成本。 1 1 4 改善蛋白质的起泡性 酶解可以增加大豆蛋白的起泡性，研究表明大豆蛋白的水解度不同，其起泡性也不 同，在水解度达到4 时起泡能力可以达到大豆蛋白的1 0 倍。 1 1 5 使凝胶软化功能 大豆肽具有明显的抑制蛋白质形成凝胶的性质，这是由于大豆肽具有较强的吸湿和 江雨大学硕= f ：学位论文 保湿作用，使水分保存在制品中。利用这种性质可以用于火腿、香肠、鱼糕等高蛋白食 品中，起到软化食品、调整硬度、改善口感的功能作用。 1 1 6 促进发酵作用 大豆肽具有促进微生物生长发育和活跃代谢的作用，可以促进乳酸菌、双歧杆菌、 酵母、霉菌和其它菌类的增殖以及有益代谢物的分泌【4 j 。实验证明，在发酵液中添加o 2 的大豆肽，就能显著促进发酵速度。因此，可以将其用于乳酸饮料、干酪、醋、酱油和 发酵火腿等发酵食品的生产，明显提高生产效率，稳定产品品质，改善风味，也可以用 于生产酶制剂。 1 2 大豆肽的营养价值及生理功能 近年来，蛋白质所具有的特殊生理活性越来越引起人们的关注，这就是所谓的蛋白 质第三功能。现已发现源于食物蛋白的一些特殊序列具有抗氧化、降血压、调节血清中 血脂水平、抗癌、提高免疫等功能【5 7 】，对于大豆功能性多肽的研究成为当今研究的热 点。 1 2 1 易消化和吸收性 人们一直认为蛋白质在体内必须通过消化道中的多种蛋白酶水解后，最终以氨基酸 的形态被吸收。现代生物代谢研究表明，人类摄食的蛋白质经消化酶消化后，主要是在 胃及小肠中被水解生成肽，并以肽的形式由肠道直接吸收。而且据资料报道，小分子大 豆肽的吸收速度和吸收率比蛋白质和氨基酸更高，能更快更容易地被机体吸收利用。所 以可以将大豆肽作为肠道营养剂和流态食品，用于那些由通常饮食不能充分满足蛋白质 营养需求的特殊条件的人员，如康复期病人、消化功能衰退的老年人以及消化功能不健 全的婴幼儿等。 1 2 2 增强运动员体能的效果 大豆肽对运动员有增强肌肉功能的效果，要使运动员肌肉有所增加，必须要有适当 的运动刺激和充分的蛋白质补充。通常，刺激蛋白质合成的成长激素的分泌在运动后 1 5 3 0m i n 之间以及睡眠后6 0m i n 时达到顶峰，若能在这段时间内适时提供消化吸收性 良好的多肽作肌肉蛋白质的原料将是非常有效的。日本学者曾对大学柔道运动员进行大 豆肽饮服实验，结果发现服用大豆肽者体能明显增强，当肌红细胞破坏时血液中的肌红 蛋白就会增加，肌肉恢复疲劳时则肌红蛋白减少【s j 。试验表明，摄入大豆肽后运动员肌 红蛋白值减少速度较快，所以大豆多肽有加速肌肉恢复疲劳的效果。再加上大豆肽比大 豆蛋白更易吸收，大豆肽比大豆蛋白和氨基酸更适合于作为运动食品的原料，可以用来 生产蛋白质强化食品和能量补给饮品等，用于运动员补充营养和增强体质。如日本不二 制油公司已将大豆肽制成强化运动饮料，该饮料清爽可口，连续饮用可明显增强运动员 的体力和耐力能迅速消除肌肉疲劳，并恢复体力，显著提高了运动成绩。 2 第一苹绪论 1 2 3 促进脂肪代谢效果 对大豆肽的营养效果所进行的一系列研究中，发现大豆肽具有很强的促进脂肪代谢 的效果，可以使人体的能量消耗更高。若以肥胖的动物，比如小鼠做试验发现大豆肽既 能有效减少脂肪，又能保持骨骼肌重量不变【9 ，1 0 】。目前认为原因是小鼠通过摄取大豆肽， 促使交感神经活跃，引起褐色脂肪组织功能激化，促进了能量的代谢。年幼肥胖症患者 食用添加大豆肽的食品时，皮下脂肪减少的速度加快，利用这一特性，可将大豆肽用作 运动员增强体质、减轻体重的食品以及肥胖病人减肥的良好食品。 1 2 4 大豆肽的降血压作用 血管中的紧张素转换酶( a n g i o t e n s i nc o n v e r t i n ge n z y m e ) 能使血管紧张素x 转变为 y ，而血管紧张素y 能使末梢血管收缩压升高，引起高血压【1 1 1 。大豆肽能抑制血管紧张 素转换酶的活性，起到降低血压的效果，并且它降压平稳，不会出现药物降压过程中容 易产生的大的血压波动，对原发性高血压患者具有显著疗效，而且大豆肽对血压正常的 人没有降压作用，可以放心食用【l 2 。 1 2 5 抑制胆固醇的作用 大豆肽还能刺激甲状腺激素分泌增加，促进胆固醇的胆汁酸化，而胆汁酸又为食物 中的纤维素所吸附而排出体外，阻止了人体对胆固醇的吸收，从而使体内胆固醇呈下降 趋势。给老鼠服用大豆蛋白和大豆多肽的试验结果表明【1 3 ，1 4 】。大鼠血清胆固醇的浓度分 别是大豆蛋白组3 4 0 - - 3 6 0m g l ，大豆多肽组为9 2 8 - 1 0 6m l ；肝脏胆固醇浓度分别 是大豆蛋白组6 9 5m e v g ，大豆多肽组为7 7 0m e c g 。日本学者菅野等通过试验已发现大 豆蛋白的胰蛋白酶分解物，分子量在50 0 0 以上的部分有降低胆固醇的效果，用微生物 蛋白酶水解的产物也有同样的效果【l 纠。 1 2 6 大豆肽的抗氧化性 大豆蛋白酶水解物中存在具有抗氧化性的活性肽，这类活性肽能抑制机体内自由基 的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效【1 6 1 。从而能在一定程度上消除机体内 多种生理功能的障碍，延缓机体的衰老，减少各种老年性疾病的发生。 1 2 7 低抗原性 由于大豆蛋白的7 s 和1 1 s 蛋白有很大的抗原性，以及一些蛋白质酶抑制因子的存 在，使大豆蛋白的消化率和生物效价大大降低。目前，脱除过敏原大体有三种方法：物理 化学法脱除；酶分解过敏原；育种法降低大豆中的过敏原。由于过敏原为蛋白质，用蛋 白酶分解处理，可降低过敏性。大豆多肽为大豆蛋白的酶解产物，用酶免疫测定法( e l i s a ) 测得大豆多肽的抗原性是大豆蛋白质的o 1 1 ，因此进食后不易引起过敏反应，这 一点在临床上具有实用价值，可以给易引起食物过敏的人们提供一种比较安全的营养食 品，如用于非致敏性的婴幼儿食品、甜点心等保健食品生产【l 。7 1 。 江南大学硕士学位论文 1 2 8 降低血糖 n i i h o y 用大豆多肽( 10 0 0m g k g ) 喂养高血糖的小鼠，发现在3 0 - 1 2 0m i n 后，大豆 多肽能明显降低小鼠的餐后血糖水平i l 引。 1 2 9 增加骨密度，预防骨质疏松 o m i m 等人用大豆蛋白，大豆多肽喂养骨成型的小鼠，测定骨盐密度( b m d ) 和机械 骨强度。结果显示，大豆多肽组和大豆蛋白组与对照组相比，明显地增加b m d 和机械 骨强度，大豆多肽组比大豆蛋白组能更明显地促进肠内c a 的吸收和积累，更能增加b m d 和机械骨强度【1 9 】。 1 2 1 0 其它功能特性 近年来的研究表明大豆蛋白的水解物中还含有具有抗癌功能、免疫功能的大豆肽。 k i ms o n ge 等采用凝胶层析分离和c 1 8 反相液相色谱对大豆肽进行了分离，研究不同 大豆肽的抗癌效果，确定了一个具有很强抗癌效果的多肽，其氨基酸序列是：x m e t l e u p r o - s e r - p r o t y r 。j i n g w uz h a n g 从大豆蛋白水解物中分离到能够提高人免疫功能的大豆 肽，其氨基酸序列是l e u p r o p r o 。s e r - a r g 。 1 3 抗氧化肽活性的研究方法 不同抗氧化剂的抗氧化能力依赖于自由基的种类、产生过程、产生部位及它所作用 的靶【2 0 1 。因此，在进行肽的抗氧化活性实验时，只有考虑采取多种不同自由基，作用于 不同的体系来进行才有希望得出客观的结论。研究抗氧化肽活性的实验体系从原理上可 分为四类：第一类是通过氧化还原法研究抗氧化肽还原氧化物能力的体系；第二类是研 究抗氧化肽对各类自由基的抑制和清除作用的体系；第三类是研究抗氧化肽对脂质过氧 化抑制的体系；第四类是研究抗氧化肽在动物体内的抗氧化活性。 1 3 1 氧化物的还原体系 实验室通常以h 2 0 2 为氧化剂，采用氧化还原的原理，研究抗氧化肽对h 2 0 2 的还原 能力，如果还原能力越大，其抗氧化能力越强；相反，则不具有抗氧化能力【2 1 1 。其原理 在于一定量的抗氧化肽将h 2 0 2 还原，余下的h 2 0 2 将体系中氧化成1 2 ，1 2 采用n a s 2 0 3 以淀粉作指示剂定量滴定，被h 2 0 2 氧化的1 2 越多，则表示抗氧化肽的还原能力越低。 此反应体系可用作抗氧化肽的抗氧化活性的初步判定。 1 3 2 自由基体系 自由基种类很多，实验室常采用超氧阴离子、羟自由基、过氧自由基、二苯代苦味 酰基自由基等进行抗氧化肽活性实验【l 引。 1 3 2 1 清除超氧阴离子( 0 2 - ) 青g # s 的检测 超氧阴离子自由基也是生命活动代谢过程中产生的一种重要的自由基，具有很强的 氧化能力，因此在检测抗氧化物质的活性时经常把清除超氧阴离子自由基作为其中个 4 第一章绪论 重要的指标。产生0 2 的体系有黄嘌呤黄嘌呤氧化酶、碱性二甲基亚矾( d m s o ) 、甲硫 酸非那宗n a d p h 、碱性邻苯三酚自氧化等。判断被测物质是否具有清除超氧阴离子自 由基能力的方法有： ( 1 ) 比色法：次黄嘌呤黄嘌呤氧化酶反应体系中生成的0 2 可与羟胺反应形成亚 硝酸盐，该物质与对氨基苯磺酸和n 1 萘乙二胺发生颜色反应，在5 5 0n l l l 处可检测出 亚硝酸盐的生成量，继而再转换成0 2 - 的生成量【2 2 1 。 ( 2 ) 化学发光法：0 2 可使鲁米诺( ( 1 u m i n 0 1 ) 受到激发，在回到基态时发生光子若被 测物质能清除0 2 ，则可使发光强度减弱，因此可根据发光抑制程度来反映该物质清 除0 2 活力的高低【2 3 1 。 ( 3 ) 邻苯三酚自氧化法：邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，在邻苯三酚的自 氧化过程中有超氧阴离子自由基产生，它既是邻苯三酚氧化的中间产物，又能加速邻苯 三酚的自氧化进程。如果及时清除超氧阴离子自由基，就会抑制其自氧化反应速率，因 此可以通过测定样品对邻苯三酚自氧化的抑制率来作为它对超氧阴离子自由基的清除 ，能力的表征。 ( 4 ) 电子自旋共振( e s p ) 法：当0 2 。和甲酸离子存在时，辐射水很容易产生超氧阴 离子自由基，与清除羟基自由基一样，可用脉冲辐射来检测被测物质与超氧阴离子自由 基形成产物的波谱。将含饱和空气的d m s o 溶液与被测物质混合，反应一定时间后用 电子自旋共振仪测定体系超氧阴离子自由基的信号强度，即可反映待测物清除超氧阴离 子自由基的能力 2 4 2 5 。 1 3 2 2 清除羟自由基( o h 。) 能力的检测 生命活动的代谢过程所产生的自由基中，o h 。是体内最活泼的活性氧，氧化能力极 强。主要有产生羟自由基( o h 。) 的体系有f e 3 + - e d t a 抗坏血酸一h 2 0 2 体系、f e 2 + e d t a h 2 0 2 体系、f e 2 + h 2 0 2 邻二氮菲体系、黄嘌呤黄嘌呤氧化酶h 2 0 2 体系及紫外光 照h 2 0 2 光解产生o h 等。判断被测多肽是否具有清除羟自由基能力的方法有： ( 1 ) 比色法：f e 2 垤2 0 2 体系可以通过f e n t o n 反应产生羟自由基【2 6 1 ，邻二氮菲f e 2 十 水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲f e 3 + ，其在5 3 6n l t l 的最大吸收峰消失，根据以上原 理，我们可以用邻二氮菲法测定样品对羟自由基的清除作用。f e m o n 反应是经典的产生 羟自由基的体系，被认为能模拟人体内产生羟自由基的过程。反应式如下1 27 j ： f e 2 + + h 2 0 2 ，f e 3 + + o h + o h 。 f e ( c 1 2 h s n 2 ) 3 2 + ( 橙红色) + o h - - * f e ( c 1 2 h s n 2 ) 3 ( 淡蓝色) ( 2 ) 二甲基亚砜法：用上述体系产生o h ，使二甲基亚砜( d m s o ) 氧化生成甲醛， 于4 1 2 n m 处测定吸光度，可了解被测样品清除o h 。的情况【2 引。 ( 3 ) 电子自旋共振( e s p ) 法：d m p o ( 5 , 5 一d i m e t h y l - l - p y r r o l i n e ) 可与f e n t o n 反应产生 的o h 生成加合物( d m p o o h 。) ，该加合物可通过自旋捕获得到的e s r 谱线测得。抗氧 化物质能与d m p o 竞争o h 。，减弱d m p o o h 信号强度，从而反映出抗氧化物质清 除o h 。的能力2 9 ，3 0 1 。 ( 4 ) 化学发光法：在v c c u 2 + _ 酵母鲁米诺h 2 0 2 体系中，o h 可使鲁米诺受到激 江南大学硕：七学位论文 发，在回到基态时发出光子，当加入抗氧化物质时，由于对o h 。的清除作用，发光强度 减弱，因此可以根据发光抑制程度来反映样品对o h 的清除能力【3 。 1 3 2 3 清除过氧自由基( r 0 2 ) 能力的检测 将产生过氧自由基( r 0 2 ) 的体系于3 7 c 与顺式十八碳四烯酸反应，r 0 2 造成顺式十 八碳四烯酸脂质过氧化，测定荧光强度( 于3 2 4n n l 激发，4 1 2h i l l 处释放) 了解其脂质过 氧化的情况，推测受试物清除r 0 2 的情况。 。 1 3 2 4 清除二苯代苦味酰基自d 了( d p p h ) 基能力的检测 3 2 , 3 3 1 d p p h ( 1 ，1 - d i p i c r y l h y d r a z y l 或1 ，1 一二苯一苦肼基是一种很稳定的以氮为中心自由基。若 受试物能清除它，则提示受试物具有降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基等自由基的 有效浓度，打断脂质过氧化链反应的作用。d p p h 有个单电子，在5 1 7n l t l 有强吸收，其 乙醇水溶液呈深紫色，在可见光区最大吸收峰为5 1 7m n 。当d p p h 溶液中加入自由基清 除剂时，溶液颜色变浅，5 1 7n n l 处的吸光度变小，而吸光度变小的程度与自由基被清除 的程度呈线性关系。因此，可用自由基的清除情况，来评价某物质的抗氧化能力。其抗 氧化能力用抑制率来表示，抑制率越大，抗氧化能力越强。 1 3 3 脂质过氧化体系 在自由基的作用下，生物膜上的多不饱和脂肪酸( p u f a ) 发生脂质过氧化，其检测方 法主要有：电子自旋共振法，二烯共扼法，硫代巴比妥酸法。以上检测脂质过氧化的方 法均可用于检测受试物是否可抑制脂质过氧化反应，从而了解其抗氧化性。在实验中， 可使用红细胞、脂蛋白、组织匀浆、肝微粒体、肝线粒体、肝细胞等生物脂质体系，各 体系具不同特点，实验中可有选择地使用。 在进行抗氧化肽体外抗氧化实验的时候，通常要求采用的方法快速、灵敏。具体实 际应用中可根据实验具体需要，筛选一定的实验方法进行。 1 3 4 体内抗氧化实验 ， 生物体内影响自由基代谢的酶类包括超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) ，谷 胱甘肽过氧化物酶( g s h p x ) 等t 3 4 】。体内抗氧化实验通常将被测物质喂养或注射动物一段 时间后，处死实验动物，测定血液或组织中的s o d ，c a t ，g s h p x 的活力，若活力升 高则说明受试物具有抗氧化能力。也可以测定m d a 的含量，若含量降低，则同样可以 说明其具有抗氧化能力【3 5 , 3 6 。 1 4 立题背景和研究意义 中国自古就有药补不如食补之说，食物和药物虽然都具有抗氧化效果，但通常药物 往往具有一定副作用，增加肝脏的解毒负担，而食物却相对更安全，可以长期食用，对 于预防和治疗像心血管病、糖尿病、癌症和衰老等慢性病，应该着眼于补充抗氧化食物， 尤其是那些天然食物及其提取物的补充。通过对这些具有天然抗氧化特性的食物进行研 究，从中提取和分离出抗氧化成分，有可能发现对治疗由自由基过量引发的疾病非常有 效的新型药物和保健食品。 6 兰二里竺丝 大豆肽是大豆蛋白经酶水解获得的短肽混合物，氨基酸组成与大豆蛋白质基本相 同，其必须氨基酸平衡良好，含量丰富，具有许多优良的理化特性，且易为人体消化， 安全无毒，是一种优良的肠道营养物质。目前已发现大豆肽具有抗氧化、降血压、降胆 固醇、降血糖、免疫、抗疲劳等生理活性。其中抗氧化性是大豆肽其它生理功能的基础。 通过筛选、分离抗氧化大豆肽有可能从中发现治疗自由基引发疾病的药物或保健食品。 美国在2 0 世纪7 0 年代研制出大豆多肽产品，后来又建成了年产五千吨食用大豆多 肽的工厂，日本几家乳业公司于8 0 年代也成功地将大豆多肽应用于食品工业，与之相 比，我国在大豆肽的研究开发上起步较晚。当前大豆活肽性研究的主要方向是肽的定向 酶解技术、生物活性肽的分离及功能检测技术等。在生物活性研究方面，大豆肽抗氧化 研究方面比较欠缺，表现在( 1 ) 所用蛋白酶具有随意性，未能针对大豆肽的抗氧化性进行 系统的选择；( 2 ) 抗氧化活性的检测方法比较单一，未能较全面反映大豆肽的抗氧化活性； ( 3 ) 体外抗氧化活性研究较多，体内实验研究较少。 豆粕是豆油加工的副产品，成本低廉，来源广泛。目前豆粕主要用作饲料，在食品 方面应用极少，而且只限于酿造食品。豆粕中约含4 5 - - 5 0 的大豆蛋白质，有很高的 开发和利用价值。本研究以豆粕粉作为研究对象，以抗氧化活性作为检测指标，研究酶 水解过程对大豆肽抗氧化活性的影响，找出影响大豆肽抗氧化活性的主要原因，从而确 定生产抗氧化大豆肽的最适用酶和合适的酶解条件，为大豆抗氧化肽的工业化生产提供 理论依据和工艺参数。在此基础上，进一步研究大豆肽在不同体系中的体外抗氧化效果 及在小鼠体内的抗氧化效果。 1 5 本研究的主要内容 ( 1 ) 以抗氧化活性为指标，确定酶法水解豆粕粉的最适蛋白酶种类以及获得具有较高 抗氧化活性大豆肽的最适酶解条件； ( 2 ) 对酶解得到的大豆肽粗品用g 2 5 凝胶进行分子量分级，确定抗氧化活性较高的 组分，并对其进行分子量分布范围分析。对大豆肽粗品和分离组分进行体外清除自由基 及其对抑n d , 鼠红细胞溶血度、肝匀浆氧化的活性进行研究； ( 3 ) 对大豆肽g 2 5 分离组分进行体外抗脂质过氧化研究； ( 4 ) 对大豆肽g 2 5 分离组分进行体内抗氧化效果的研究。 7 江南大学硕士学位论文 第二章酶解豆粕粉制备抗氧化肽的研究 2 1 引言 蛋白酶是催化肽键水解的一类酶。广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物 中。用于水解蛋白质的酶按来源分主要有三种类型：( 1 ) 动物来源的蛋白酶，如胃蛋白酶， 胰蛋白酶等；( 2 ) 植物性蛋白酶，如木瓜蛋白酶，菠萝蛋白酶等；( 3 ) 微生物蛋白酶，如 来源于枯草杆菌，枯草芽胞杆菌，地衣芽胞杆菌产生的酶；来源于黑曲霉、毛霉、青霉 等微生物产生的酶。通常，动物蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶对大豆分离蛋白的水解效 果较好，但由于原料来源困难，价格太高，不适合用于大规模工业化生产；植物蛋白酶 如木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等尽管酶解效率相对较低、容易失活，但由于原料丰富，生 产简单，价格比动物蛋白酶低很多，并且生产的大豆肽产品风味较好，有可能用于大豆 肽的生产；微生物蛋白酶是通过发酵法生产的，随着大量基因工程菌的应用，发酵法产 酶的效率逐年提高，微生物蛋白酶的价格也随之下降，为大规模应用创造了条件，非常 适合于大豆肽的生产。目前广为应用的微生物蛋白酶有丹麦n o v on o r d i s k 公司生产的 碱性蛋白酶a l c a l a s e 、中性蛋白酶p r o t a m e x 、中性蛋白酶n e u t r a s e 以及国产的碱性蛋白 酶地衣型芽孢杆菌2 7 0 91 3 7 , 3 8 j 。 蛋白酶根据酶的作用方式可以分为内切酶和外切酶。内切酶水解的是蛋白质分子内 部的肽链，能生成相对分子质量较小的多肽，外切酶作用于蛋白质或肽分子末端的肽链， 水解生成氨基酸和少一个氨基酸残基的多肽，外切酶还可以再分成为羧肽酶和氨肽酶， 前者的作用是以肽链羧基末端开始，而后者是以氨基末端开始。内切酶在水解过程中， 主要包括以下三个步骤： ( 1 ) 打开肽链 一c h r 一c o n h c h r ，+ h 2 0 一c h r 一c o o h + n h 2 一c h r ”- ( 2 ) 质子交换 - - c h r - - c o o h + n h 2 一c h r ，专一c h r - - c o o 。+ n h 3 + 一c h r ( 3 ) 氨基的滴定 n h 3 + 一c h r ，+ o h + _ n h 2 一c h r ，+ h 2 0 根据上述反应，采用在水解液中加入碱来保持水解液的p h 不变，通过记录消耗的 碱量，可以知道蛋白质的肽键断裂的情况，从而可以计算出蛋白质的水解度，此即水解 度的p h s t a t 测定方法。采用p h s t a t 测定方法的优点是可以连续测定大豆分离蛋白的水 解度，精细反映大豆分离蛋白的水解过程，也能够定向获得特定水解度的具有生物活性 的大豆肽。 豆粕是豆油加工的副产品，成本低廉，来源广泛。目前豆粕主要用作饲料，在食品 方面应用极少，而且只限于酿造食品。豆粕中约含4 5 - - 一5 0 的大豆蛋白质，有很高的 开发和利用价值，是一种潜在的植物蛋白资源，可以做为蛋白酶水解的底物，进行有控 制的酶解，来获得具有生物活性的大豆肽。本部分实验选用豆粕粉为原料，选择2 7 0 9 8 蔓三皇堕堡里塑塑型鱼垫篁些鉴箜婴塑 碱性蛋白酶、中性蛋白酶、高效水解蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶为研究用酶，以 水解度和羟自由基清除率作为测定指标，筛选出制备抗氧化大豆肽的最佳用酶，然后通 过单因素和响应面实验优化酶解条件，获取抗氧化活性最高的酶解产物，为进一步体外 和动物实验的开展提供依据。 2 2 材料与仪器 2 2 1 实验材料 脱脂豆粕( 粉碎，过8 0 目筛) ，购自无锡三里桥农贸市场；2 7 0 9 碱性蛋白酶，中性蛋白 酶，高效水解蛋白酶，风味蛋白酶，木瓜蛋白酶，购于无锡雪梅制剂有限公司；其它试 剂均为国产分析纯。 2 2 2 主要仪器 数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；p h s 2 5 精密p h 计，上海雷磁仪器厂；7 2 2 型分光光度计，上海第三分析仪器厂；t g l 2 0 m 台式型离心机，湖南湘仪离心机仪器 有限公司；微量凯氏定氮仪，广州尚准仪器有限公司。 2 3 实验方法 2 3 1 酶法制备大豆肽 根据预备实验，确定了5 种蛋白酶水解脱脂豆粕的最适p h 及反应温度( 表2 1 ) ，然 后在相同的底物质量分数、加酶量( 40 0 0u g 底物) 的条件下比较5 种蛋白酶的水解效果 和羟自由基的清除率。 表2 - 1 蛋白酶水解的最适p h 和温度 t a b2 - 1t h eo p t i m u mp ha n dt e m p e r a t u r ef o rp r o t e a s e sh y d r o l y s i s 2 3 2 脱脂豆粕的酶解工艺 按一定的底物浓度准确称取脱脂豆粕粉于水解反应器中，加入适量蒸馏水，轻微搅 拌至底物均匀分散于水中。然后在9 0 下加热1 0m i n ，冷却到酶解反应温度后，用 1 0m o l l 的n a o h 调节酸碱度至所需的p h ，依据所用酶的活力单位，准确称取蛋白酶 后加入水解反应器，并慢慢搅拌。反应过程中及时滴加1m o l l 的n a o h 使系统稳定 在最适p h 。反应到预定时间，即停止加热搅拌，用lm o l l 的h c l 调节p h 至4 5 ，迅 速升温到8 0 ，加热1 0m i n 钝化蛋白酶。记录水解过程消耗的碱液量，并以此计算水 解度d h 。 2 3 3 水解度( d h ) 测定：ph s t a t 法【3 9 ，4 0