（园林植物与观赏园艺专业论文）三角紫叶酢浆草组培及碳源效应的研究.pdf

摘要 本研究以三角紫叶酢浆草( o x a l i st r i a n g u l a r i ss u b e g t r i a n g ) 的叶片、 叶柄为外植体进行组织培养技术体系的建立及以三角紫叶酢浆草叶片为外植体 进行碳源效应研究。通过正交试验设计并结合方差分析和多重比较，探讨了三角 紫叶酢浆草离体培养的最佳培养基配方及培养条件，并在此基础上研究了不同碳 源对叶片外植体植株再生，不同蔗糖浓度对植株开花和有糖无糖培养基交替培养 对组培苗叶色的影响。其试验结果表明： ( 1 ) 以叶片为外植体，m s + 6 一b a 0 5 m v l + n a a o 5 m g l + i b a0 1r a g l + 蔗糖 3 为最佳培养基配方组合，其出芽率为9 0 。 ( 2 ) 以叶柄为外植体，m s + k t l o m g l + n a a o 5 m g l + i b a 0 5 r a g l + 蔗糖3 为 最佳培养基配方组合，其出芽率为9 3 3 3 。 ( 3 ) 继代培养中，m s + 6 一b a l 5 m g l + n a a 0 ，2 r a g l + 蔗糖3 为最佳培养基配 方，月增殖倍数达4 4 4 。 ( 4 ) 生根培养中以1 2 m s + n a a 0 2 + 蔗糖2 为最好，生根率达9 5 。 ( 5 ) 在不同碳源及蔗糖浓度研究中发现，蔗糖是三角紫叶酢浆草组织培养的最 佳碳源，3 是其最适浓度，葡萄糖效果其次，可溶性淀粉效果最差。 ( 6 ) 不同浓度蔗糖实验结果表明：蔗糖浓度为3 时，植株生长最好，当蔗糖 浓度达到5 时试管苗就会开花。 ( 7 ) 有糖( 3 ) _ 一无糖( o 呦交替培养实验结果表明：蔗糖是影响三角紫叶酢浆 草叶色的重要因素，在无蔗糖的培养基中植株叶色由紫交绿，转入3 蔗糖浓度 的培养基后又逐渐恢复紫色。糖对叶绿素和花色素苷的含量的影响程度是不同 的，将含糖量3 培养基中正常显色的植株转入无耱的培养基中培养，叶绿素、 花色素苷含量随时间增加逐渐降低，但花色素苷含量降低的幅度远远大于叶绿素 降低的幅度，而再次转入含糖量3 的培养基中，随时间增加，两种色素都逐渐 升高，但花色素苷增加的幅度远远大于叶绿素增加的幅度。 关键词：三角紫叶酢浆草组织培养碳源叶色试管内开花 s t u d yo nt e c h n i q u es y s t e mo ft i s s u ec u l t u r ea n de f f e c t so f d i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e si no x a l i st r i a n g u l a r i ss u b e g t r i a n g w a n g l i ( c o l l e g eo f f o r e s t r ya n dh o r t i c u l t u r e ，s i c h u a na 班c u l t u r a lu n i v e r s i t y , y a a n6 2 5 0 1 4 ，s i c h u a n ，c h i n a ) a b s t r a c t t h el e a v e sa n dl e a f s t a l k sw e r eu s e da se x p l a n t st oe s t a b l i s ht h et e c h n i q u es y s t e m o ft i s s u ec u l t u r ea n dt o s t u d yt h ee f f e c t so fd i f f e r e n tc a r b o ns o u r c e si no x a l i s t r i a n g u l a r i ss u b e g t r i a n g w i t ho r t h o g o n a ld e s i g n ，a n a l ) , s i so fv a r i a n c ea n d m u l t i p l ec o m p a r i s o n s ，t h eb e s tm e d i u mc o m p o s m o u sa n dt h ec u l t u r ep r o c e s sw e r e a u a l y z e d b e s i d e s ，t h e e f f e c t so fs u c r o s e ，g l u c o s ea n ds o l u b l es t a r c ho i lp l a n t r e g e n e r a t i o n ，c o l o u ra n df l o w e r i n gw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： ( 1 ) m s + 6 - b a 0 5 m g 几十n a a 0 5 m g l + i b a 0 1m e d lg a v er i s e t ot h eg o o d r e s u l t i ni n d u c i n ga d v e n t i t i o u sb u d sf r o ml e a fe x p l a n t s ，i nw h i c ht h ei n d u c e m e n t r a t ec o u l db e9 0 ( 2 ) m s + k t1 0 m g l + n a a 0 5m g l + i b a 0 5m v lw a st h eb e s tm e d i u mi n i n d u c i n ga d v e n t i t i o u sb u d sf r o ml e a f s t a l ke x p l a n t sw h e r et h ei n d u c e m e n tr a t ec o u l d b e9 3 j 3 ( 3 ) m ss u p p l e m e n t e dw i t h6 - b a l 5 m g , ，la n d0 2 m g ，ln a a w a s , f a v o r a b l et o t h ep r o l i f e r a t i o no f b u d s ，i nw h i c ht h em u l t i p l i c a t i o nr a t ec o u l db e4 4 4 ( 4 ) t h eg r o w t h o fr a n t sw a sb e s to n1 2 m sm e d i u ma d d e dn a a 0 2 m g l ，w h e r et h er o o t i n gr a t ec o u l db e9 5 ( 5 ) s u c r o s e w a st h eb e s tc a r b o ns o u r c ei nr e g e n e r a t i n gp l a n t l e t sf r o ml e a f e x p l a n t s3 w a st h eb e s ts u c r o s ec o n c e n t r a t i o ni nw h i c ht h ep l a n tr e g e n e r a t i o nr a t e w a sh i g ha n dt h ep l a n t l e t sg r e ww e l l ( 6 ) 5 s u c r o s ec o n c e a l t a t i o nw a se f f e c t i v ei ni n d u c i n gf l o r a lb u d s ( 7 ) a l t e r n a t ee x p e r i m e n tb e t w e e nt h em e d i u mw i t hs u e r o s e ( 3 ) a n dt h e m e d i u mw i t h o u ts u c r o s es h o w e dt h a ts u c r o s ew a st h ei m p o r t a n tf a c t o rd e t e r m i n i n g t h ec o l o ro fl e a v e so ft h ep l a n t s i nt h em e d i u mw i t h o u ts u c r o s et h el e a fc o l o u r c h a n g e df r o mp u r p l et og r e e n a f f e rt r a n s f e r r e dt ot h em e d i u mw i ms u c r o s e ( 3 ) , t h e l e a fc o l o u rc h a n g e df r o mg r e e nt op u r p l e s u c r o s eh a dm o r ee f f e c to nt h ec o n t e n to f a n t h o c y a nt h a nt h a to fd d o r o p h y l l a f t e rt h en o r m a lp l a n t l e t sw i t hp u r p l el e a v e s o b t a i n e do nt h em e d i u mc o n t a i n i n g3 s u c r o s ew e r et r a n s f e r r e dt ot h em e d i u m w i t h o u ts u c r o s et h ec o n t e n to fa n t h o c y a na n dc h l o r o p h y l ld e c r e a s e dg r a d u a l l ya s t i m ep a s s e d , b u tt h er e d u c t i o nr a n g eo fa n t h o c y a nw a sl a r g e rt h a nt h a to f c h l o r o p h y l l h o w e v e rw h e nt r a n s f e r r e dt ot h em e d i u mw i t hs u c r o s e o ) a g a i nt h e t w o p i g m e n t s r o s eg r a d u e d l 弘b u tt h er i s i n gr a n g e o f a n t h o c y a nw a sl a r g e rt h a nt h a t o f c h l o r o p h y l l k e yw o r d s ：o x a l i st r i a n g u l a r i ss u b e g t r i a n g ；t i s s u ec u l t u r e ；c a r b o ns o u r c e ； c o l o u r ；nv i t r o f l o w e r i n g 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作 所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中 不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业 大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研 究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 豆知7私。i 年6 疑上| b 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 嗣家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名：立赤j 导师签名 亟泳 z o 。r 年6 月、7 日 。至年g 只方b 1 刖吾 近几年来随着我国园林业的发展，彩叶植物越来越受到人们的重视。彩叶植物是 一类在自然界存在的或经人工栽植的、在一定季节或常年表现出与自然绿色有极为显 著差别的，有明显观赏价值的植物总称。在我国彩叶植物的大量应用主要集中在风景 林，而在城市园林中应用较少，常见的种类多为紫叶小檗、金叶女贞、紫叶李等，应 用方式也较为单调，尚未形成一定的规模“3 。草本彩叶植物的应用较少，品种还不够 丰富，缺乏合理的开发应用。1 ，地被植物是指那些经简单管理即可代替草坪覆盖在地 表的低矮植物，包括矮生灌木、竹类、藤本以及多年生或一、二年生的草本。1 。地被 植物是园林绿地重要的基础材料，城市园林植物群落不可缺少的部分，因此，加大彩 叶地被植物的育种繁殖力度，发掘和利用新优彩叶地被植物品种，对美化、保护环境， 形成多层次园林景观，提高园林绿化水平具有重大的意义。 植物组织培养技术是在生产中得到最广泛应用和产生了最大经济效益的一项生 物技术，也是快速繁殖植物新品种的最重要方法。利用植物组织培养技术可以在短 期内迅速建立无性繁殖体系，实现新优品种的快速推广繁殖，同时也是新品种培育的 一种必不可少的手段。三角紫叶酢浆草是一种优良的彩叶地被植物，具有色彩鲜艳、 观赏期长、易于形成大色块景观的特点，是一类值得大力推广、应用前景广阔，具有 市场潜力的新优园林植物。本研究利用组织培养对三角紫叶酢浆草进行快速繁殖，探 讨该种植物组织培养的方法和最佳方案以及碳源对植物生长发育的影响，为三角紫叶 酢浆草走上工厂化生产、彩叶植物生理研究提供技术和理论依据，具有重要的经济和 科学价值。 2 文献综述 2 1 三角紫叶酢浆草的形态特征及组培研究现状 三角紫叶酢浆草( o x a l i s 打j a 倒- a r i s s u b e g t r i a n g ) 又名感应草、浅紫花酢浆 草“1 。为酢浆草科，酢浆草属多年生草本，原产热带美洲，植株丛生，株高3 一l o c m ， 根纤细。根状茎直立，有残留的鳞片状叶柄基。叶丛生，呈倒阔三角形，顶端凹缺， 叶长2 - 3 c m ，宽4 - 5 c m ，叶色为深紫色，叶片中有入字形浅玫瑰红斑纹，到了晚上叶片 合拢，似困倦的少女抱膝而眠，独具特色，趣味无穷。叶柄长3 2 0 c m ，总花梗基生， 单花近叶柄长或更长，花梗长1 0 1 5 c m ，花直径约2 c m ，萼片5 ，花瓣5 ，花浅紫色，卜8 朵组成腋生的花序，花期4 1 1 月。酢浆草属植物全世界有8 0 0 多种，我国常见的有酢 浆草( o x a l i sc o r n i c u l a t al ) 、紫花酢浆草( o x a l i sc o r y m b o s ad c ) 等8 种。三角 紫叶酢浆草是本属植物中最具观赏价值的一种0 3 。 三角紫叶酢浆草喜半阴、凉爽、湿润且通风良好的环境，要求疏松、排水良好的 微酸性土壤，其畏寒冷，温度低于5 。o n 叶、花等会受冻，温度高于3 5 。c 叶片易卷曲， 焦黄，忌强光直射，否则植株生长不良，其繁殖多采用切分块茎的方法，但繁殖速度 慢；也可用种子繁殖，但其结种率低，周期长。 我国对酢浆草属植物的组织培养始于2 0 0 2 年”1 ，目前，有关三角紫叶酢浆草组 织培养研究报道很少，主要集中在两个方面，一是外植体的选取：二是初步研究了影 响三角紫叶酢浆草组织培养的激素种类和浓度。 三角紫叶酢浆草目前采用的外植体有：叶片、叶柄、鳞茎。邓小梅、况小宝等人 用三角紫叶酢浆草的鳞茎作为外植体，诱导出了完整的三角紫叶酢浆草植株。高贵 珍、张兴桃、刘小阳等人嘲采用三角紫叶酢浆草的叶片、叶柄进行组织培养并诱导出 完整的植株，并认为叶片是三角紫叶酢浆草组织培养的最佳外植体。虽然目前的两篇 文献对三角紫叶酢浆草组织培养都做了一定的研究，但在培养基的筛选、试管苗继代 增殖和激素的应用等方面都还不够完善。且未在三角紫叶酢浆草的组织培养中对碳源 影响进行研究。虽然三角紫叶酢浆草的微型繁殖技术已有了初步进展，但要真正应用 组培技术实现工厂化育苗，目前常无三角紫叶酢浆草组织培养整个技术体系及全套工 艺流程研究的报道。 2 2 糖类研究进展 糖类物质是自然界存在的一大类具有广普化学结构和生物学功能的有机化合物， 在生物体内具有重要和复杂的生理作用和生理活性，糖类作为植物组培中的碳源，在 各种最简单至最复杂的培养基中几乎都要加入。在植物的组培中，糖类作为碳源物质 为细胞提供合成新化合物的碳骨架，为细胞的呼吸代谢提供底物与能源，作为渗压剂 用于维持一定的渗透压。 据丁世萍等人统计至今已有单糖、二糖、三糖、多糖以及未经纯化的糖类近5 0 种在植物组织培养中被试验用作碳源或者渗压剂“。 2 2 1 糖的种类和用量对植物组培的效应 5 0 年代初g a u t h e r e t 。”首先对植物组织培养中的糖类进行研究，他以胡萝h 为材 料研究组织生长的最适浓度和不同糖类的效应，结果表明蔗糖是最好的碳源，阻下依 次为葡萄糖、麦芽糖、棉子糖、果糖和半乳糖。甘露糖和乳糖效果则较差，戊糖和多 糖无效。糖在组培中的效应已越来越引起人们的重视，不同的碳源及不同的浓度具有 不同的生理效应，糖的种类和用量不仅影响培养物生长速度和生长量，而且影响其代 谢水平、次生代谢物合成以及细胞的形态和发生，是植物组培成功与否的关键之一“。 吕芝香认为在植物的组织培养中最适的蔗糖浓度为2 o 一4 o “”。糖的种类和浓度 对分化不定芽具有影响，胡开林“”等人的研究表明在培养基中添加不同质量浓度的蔗 糖和甘露酵明显影响青花菜下胚轴不定芽的分化。当蔗糖为3 0 克升时，不定芽分化 率最高，随着蔗糖的增加的基础上添加不同质量浓度的甘露醇，均会明显抑制不定芽 的分化，李艳红等人“”也有类似报道。郭达初等人“。以化学纯蔗糖、葡萄糖、食用蔗 糖为碳源，对香石竹试管苗进行了3 种浓度的试验，结果表明葡萄糖效果最差，嫩梢 细长，叶色发黄，且玻璃化率高。食用蔗糖处理的嫩梢长势与化学纯蔗糖无异。无论 何种糖，嫩梢高度均随着糖浓度的升高下降，高糖浓度对植株生长有抑制作用。不同 碳源对不定芽复壮也有影响，杨华等人“”的实验表明在蔗糖为碳源的培养基上生长的 不定芽粗壮、在食用糖为碳源的培养基上生长的不定芽较为细弱。蔗糖有利于文心兰 原球茎增殖而不利于幼苗的分化，麦芽糖、山梨醇虽不是文心兰原球茎增值培养过程 中的最佳碳源，但可能是进行幼苗分化培养时应优先选用的碳源种类“”。王爱民、刘 文等人“”以蔗糖、红糖、白糖等为碳源培养红边朱蕉，蔗糖和葡萄糖、果糖在支持培 养物的生长、生根、内含物的积累方面的有效性基本等同。红糖和白糖作为碳源，也 能很好地支持培养物的生长，有利于根的诱导和物质积累。 2 2 2 不同碳源对植物次生代谢物生产的影响 不同碳源对植物次生代谢物生产有不同影响。大多数情况下蔗糖更有利于细胞中 次级产物的形成。其原因之一是提高了培养基的渗透压，因而刺激次级产物形成。但 有的试验表明葡萄糖更有利于次级产物的合成。n i g r a “”报道银叶茄( s o l a n u m e l e a g n i f o l i u m ) 悬浮培养生长量以蔗糖为最大，麦芽糖最小，而茄解碱产量各种糖类 均相似。李茂寅、赵德修等啪1 以蔗糖为唯一碳源时，3 0 9 b 的蔗糖浓度既有利于愈伤 组织生长又有利于黄酮类形成，蔗糖和葡萄糖的组合得到更高的黄酮类产量。 f 1 0 w e r 。o 等于1 9 8 2 年报道在白长春花( c a t h a r a n t h u sr o s e u s ) 离体培养中葡萄糖有 较高的生物产量，但生物碱产量与使用蔗糖时相似，并发现培养物从蔗糖或葡萄糖为 碳源的培养基转移到果糖为碳源时生长量急剧下降。在对红花的六种碳源培养中，蔗 糖对细胞生长最合适，而葡萄糖对次级产物a 一生育酚的形成较有利，乳糖和可溶性 淀粉对细胞生长非常缓慢，无次级产物出现。“。钟俊辉。”报道提高蔗糖浓度有利于茶 细胞次生代谢产物的形成，茶愈伤组织培养及其茶氨酸的积累，随着蔗糖浓度的增加， 茶愈伤组织生长逐渐上升，6 时生长最好，而茶氨酸积累量继续上升，当浓度为8 时氨基酸含量为2 时的2 5 倍。 2 2 3 糖对花药培养的影响 植物花粉萌发及花粉管生长过程中糖起了重要作用，其中外源性糖要比花粉内源 性糖作用更为显著，内源性糖是以淀粉为主的多糖在花粉萌发中发生水解性消耗，而 在提供外源性糖的情况下，花粉在萌发过程中可直接吸收葡萄糖、蔗糖以提供生长所 需的碳源和能源。在花药培养中，过去一般均以蔗糖作为碳源，蔗糖浓度历来被看作 是诱导花粉再生植株的一个重要因素，欧阳俊闻和胡含等”4 3 将蔗糖浓度从3 提高到 6 次成功从花药获得了小麦花粉植株。李波等人“”报道3 的蔗糖最适于小麦双核期 花粉的细胞分裂，要比6 蔗糖诱导率高出几倍，而9 时观察不到花粉的细胞分裂。 近年来发现其他糖类特别是麦芽糖代替蔗糖能够促进花药培养效率。”。r a q u i n 首先 报道了以麦芽糖代替蔗糖可促进矮牵牛的花药培养效率。麦芽糖作为碳源可明显的促 进稻小孢子培养中细胞分裂，形成愈伤组织，并再生成植株，而以蔗糖为碳源，小孢 子只有少数能进行分裂，均不能形成愈伤组织。在某些情况下使用渗压剂对作物花药 培养有利：在淀粉为凝固剂的培养基上加入1 2 蜜二糖与只供应8 蔗糖相比大麦花药 培养胚胎发生率高3 5 倍，达3 5 4 0 ，但蜜二糖单独使用未能促进其胚胎发生。 2 2 4 糖的其他调节作用 在高等植物中，糖不仅作为细胞碳素代谢源和细胞组分而且也作为与植物生长和 发育有关过程的重要调节因子，研究表明糖或者他们的代谢物对植物生长和发育有关 的重要过程起着正的或负的调节的作用。糖对涉及与氮索代谢相关的酶亦有调节作 用。例如对拟南芥和烟草的硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶表现出诱导作用，而对拟 南芥和玉米的天冬酰胺合成酶呈现出抑制作用。有研究表明蔗糖可提高烟草叶柄培养 物的内源i 从水平啪1 ，蔗糖有增进i a a 促进大白菜不定根发生的功效。内源糖水平 提高可启动小麦侧根的形成。外源性糖影响蛇麻草体内碳水化合物的状况，w e l c m d e r i l l 报道外值体内碳水化合物和氮素水平受培养基内的蔗糖和氮素水平的影响。糖还 是调控花生长和化色素苷合成的一个重要信号分子。花生长发育中代谢过程的一些重 4 要前体物都需要糖提供，没有糖生长发育和花色素苷的合成过程就不能进行。培养 基中糖的添加对试管苗r u b p 羧化酶的活性也有影响，可能是外源性糖的加入影响了 一系列生化反应，从而导致r u b p 调节或反馈抑制能力的下降”“3 。 2 3 试管内开花研究进展 自从1 9 4 6 年罗士韦在菟丝子茎尖培养时发现了花器官的形成以来，关于植物试 管内开花的报道越来越多，从种子苗、植物组织、甚至原生质体，都能在人工控制的 试管培养中得到花芽分化。“”1 。试管开花研究可以分成两大类。”：一是开花诱导： 二是成花决定的表达。关于离体条件下花芽的分化及试管内开花的研究目前主要集中 在植物的生理状态、外源激素的种类和浓度、营养条件、光照、温度。“1 ”“等方 面。成花决定的表达是从处于生殖生长期的植株上采取花序轴、花柄、苞片等作外植 体研究外部因子对花芽再生的影响。这两方面的研究对外植体内部发生的变化都知之 甚少，基本上处于“黑匣子”试验阶段。 2 ，4 碳源在组培彩叶植物色彩发育中的作用 糖对花色素苛合成的影响很早就开始研究了，许多学者认为糖能促进花色素萤的 生成，对不同植物而言，促进花色素苷生成的糖类也是不同的。蔗糖对紫萍花色素的 合成有明显的促进作用，葡萄糖、果糖和山梨糖等有利于芥菜花色素苷的生成“。一 定浓度的蔗糖能显著促进凤仙花中花色素苷的积累。糖在分子水平上具有促进花色素 苷合成相关酶基因表达的作用“”。在离体培养的大花草原龙胆、洋水仙和玫瑰花中也 发现，提高培养基中的蔗糖浓度，可明显提高花瓣生长速度和花色素苷的合成水平“ 7 】 3 本研究目的和意义 本实验以三角紫叶酢浆草叶片、叶柄为外植体，建立三角紫叶酢浆草离体培养再 生体系，为三角紫叶酢浆草工厂化生产提供理论和技术依据。在三角紫叶酢浆草组织 培养中，发现碳源具有一般植物上少见的明显影响，为此本试验开展了不同碳源对三 角紫叶酢浆草植株再生、叶色、开花的影响，这对于完善三角紫叶酢浆草组织培养技 术，提高三角紫叶酢浆草绿化价值，认识彩时植物的“复绿”现象的枫理都具有一定 意义。 4 材料与方法 4 1 实验材料 供试材料为成都龙泉农业科技园引进的优良品种盆栽三角紫叶酢浆草，以其叶片、 叶柄为外植体。 4 2 技术路线 本研究的技术路线如图l 所示： 外植体( 叶片、叶柄) 一愈伤组织一丛芽一生根培养一完整小植株一炼苗一移栽 碳源及蔗糖浓度对叶片器官发 生影响的试验 蔗糖浓度对组培苗开花试验 无糖培养基交替培养试验 0 测定培养过程中叶绿素、花色素苷含量变化 图1 三角紫叶酢浆草组织培养技术路线 f i g 1 t h et e c h n i q u er o u t eo f t i s s u ec u l t u r ei no x a l i st r i a n g u l a r i ss u b e g t r i a n g 4 3 试验设计 4 3 1 初代培养 4 3 1 1 外植体表面灭菌 以盆栽的三角紫叶酢浆草为试验材料，取其初展叶的叶片、叶柄作为外植体。接 种前将选取的外植体在自来水下冲洗3 0 m i n 后，将叶片和叶柄切成4 c m 小段，用o 1 的升汞溶液浸泡3 分钟，取出用无菌水冲洗5 - 6 次，滤纸吸干表面水分。叶片切成2 c m 小块，叶柄切成2 3 c m 小段。 4 3 1 2 激素配方的筛选 采用正交设计探索培养基，激素6 一b a 、k t 、n a a 、 i b a 对叶片、叶柄的适用 量，采用5 因素4 水平的正交设计l 。( 4 5 ) ，见表l 、表2 。将消毒后的叶片剪成l c m 1 c m 和将叶柄剪成2 c m 左右进行接种，每处理每次接种1 0 管，重复3 次 基本培养基：m s ，附加琼脂5 9 l 、蔗糖3 9 6 ，p h 5 8 ，6 0 观察内容：分化情况 分化率 未污染外植体分化数 1 0 0 未污染外植体总数 表1 初代培养试验因子水平表 t a b l eit h et a b l eo f f a c t o ra n dl e v e li ni n i t i a lc u l t u r e i b a00 0 50 10 5 n怂00 0 5 0 10 5 6 一b a 00 51 0 1 5 k t 00 51 01 5 表2 初代培养正交设计表l ，。( 4 5 ) t a b l e2t h eo r t h o g o n a ld e s i g nf o ri n i t i a lc u l t u r e 处理编号 1234 空列处理编号 123 4 空列 c o d e b l a n kc o d eb l a n k 1111l193 1342 21222 2l o3243 1 3133331 1 3 3 124 41 4 4 441 2342l 3 521234 1 341423 622 1 431 442314 723412 1 543241 8 2 4 32 11 644 132 4 3 2 继代培养 4 3 2 】材料 初代培养得到的芽苗 4 ，3 2 2 激素配方的筛选 在初代培养基的基础上，通过对培养基的调整，迸一步扩大芽苗数量。采用2 因 素3 水平全面组合设计，见表3 。 每处理每次接种9 瓶，每瓶接种l 株芽苗，重复3 次 7 基本培养基：m s ，附加琼脂5 9 l 、蔗糖3 ，p h 5 8 - 6 0 激素：6 - b a 、n a a 观察内容：3 0 天时统计和计算增殖系数，并观察试管苗质量。 3 0 天后统计的芽苗数 增殖系数= 接种时的芽苗数 表3 继代增殖培养6 一b a 、n a a 全面组合设计 t a b l e3c o m p l e t ec o m b i n a t i o nd e s i g no f 6 - b aa n dn a ai ns h o o tm u l t i p l i c a t i o n 4 3 3 生根培养 4 3 3 1 材料 采用生长粗壮的无根试管苗 4 3 3 2 生根培养基配方的筛选 处理激素为i b a 、n a a ，将4 c m 以上的丛生苗转入生根培养基进行生根培养，基本培 养基为1 2 m s ，分别附加i b a ( 0 、0 1 、0 2 、0 5 ) 和n a a ( 0 i 、0 2 、0 5 ) ，附加糖2 0 9 l ， 琼脂5 9 l ，每处理每次接种2 0 瓶，每瓶l 株芽苗，重复3 次，3 0 天观察并测量生根率、 平均根长、平均根数。 4 3 3 3 活性碳对生根的影响 在4 3 2 的基础上选取诱导生根率最好的配方比较活性碳对生根的影响，试验设 计见表5 。 8 表4 生根培养激素设计 t a b l e4 d e s i g no f d i f f e r e n tg r o w t hr e g u l a t o r so f r o o t i n gc u l t u r e 处理编号( c o d e ) n a a ( r a g l ) i b a ( m g l ) 4 3 3 4 观察内容：生根率、平均根长、平均生根数 基本培养基：1 2 m s 生根株数 生根率= 平均根长 1 0 0 接种株数 生根单苗根总长 平均根数= 生根单苗总根数 生根总数 生根株数 一 一一一叭呲兰 一叭吣 一 一 二 拈 4 3 4 炼苗与移栽 本实验在四川农业大学脱毒中心温室进行，由于三角紫叶酢浆草为地被植物， 生命力较强，生根容易，移栽易成活，根据实验过程中初代培养就已出现生根苗， 故移栽实验中选用两弛生根茧进行试验，并选用预备实验中观察表现较好的基质进 行试验。 材料：初代培养已生根的芽苗和生根培养后的试管茁 材料处理：将适宜移栽的试管苗开瓶炼苗3 - 4 天后，小心洗去培养基，在室内放置 一天后移栽。 基质：2 0 e 沙+ 3 0 腐熟锯末+ 5 0 园士 基质处理：用0 5 的多菌灵消毒处理 观察内容：移栽成活率 3 0 天时未死亡植株总数 移栽成活率= l o o 移栽植株总数 4 3 5 碳源试验 4 3 5 1 碳源种类和蔗糖浓度对叶片器官发生的影响 在4 。3 。l 试验结果中最适初代培养基的基础上进行不同碳源试验，观察不同碳 源及蔗糖浓度对三角紫叶酢浆草叶片外植体再生植株的影响，每处理每次接种1 8 个叶片，重复3 次。 材料：继代培养获得的无菌叶片 碳源：选用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉3 种碳源，其中葡萄糖、可溶性淀粉浓度均 为3 0 9 l ，蔗糖浓度设o g l 、l o g l 、3 0 9 l 、5 0 9 l4 个水平 基本培养基：m s ，附加琼脂5 9 l 观察内容：外植体出芽数、平均株高、植株表现、叶片颜色 外植体不定根分化数、平均根长、平均根数 4 3 。5 2 蔗糖浓度对组培苗开花的影响 将生长健壮的组培苗转入蔗糖浓度为o g l 、l o g l 、3 0 9 l 、5 0 9 l 的培养基中 培养，每处理接种1 5 瓶，每瓶接种1 株，重复3 次。 材料：生长健壮的组培苗 l o 其它培养基成分：与初代培养最佳培养基配方相同 观察内容：植株生长和开花情况。 4 3 5 3 有糖一无糖培养基交替培养对组培苗叶色和色素的影响 将生长健壮的组培苗转入无糖的培养基中培养6 0 天后，转入蔗糖浓度为3 的 培养基中6 0 天，之后再转入无糖培养基中培养6 0 天，如此循环3 次。每处理每次 接种6 0 瓶，每瓶接种1 株，重复2 次。 材料：生长健壮未生根组培苗 培养基其它成分：与初代培养的最佳培养基配方相同 观察和测定内容：每2 0 天观察和测定组培苗的生长情况，植株颜色变化及色素的 变化，色素含量每次测量3 株，重复3 次，组培苗颜色由绿到紫分为3 级。 花色素苷测定方法参考文献 4 8 ：将样品洗净、剪碎、混匀，准确称取o 1 5 0 9 试样， 以o 1 盐酸甲醇研磨提取、过滤、定容至2 5 m l 。以o 1 盐酸为对照，于最大吸收 波长5 3 0 n m 处测其吸光度，并用1 _ 一3 0 0 紫外可见光分光光度计进行扫描。 叶绿素测定方法参考文献 4 9 ：取叶片0 5 9 剪碎置研钵中，加少许碳酸钙、石英 砂和8 0 的丙酮充分研磨，过滤。滤液入2 5 m l 容量瓶，用8 0 丙酮反复洗涤残渣 无色滤纸至无绿色，合并滤液，定容，取上述提取液l m l 摇匀，以8 0 9 6 丙酮为参比 液，在分光光度计6 6 3 n m 、6 4 5 n m 下测其光密度，按a r n o n 公式计算材料中叶绿素a 、 b 及叶绿素总含量 v c h l a 含量m g g = ( 1 2 7 0 瞻。一2 6 9 0 d8 4 5 ) x w 1 0 0 0 v c h l b 含量m g g = ( 2 2 9 0 吣；一4 6 8 0 d * a ) w x l 0 0 0 v c h t 含量m g g = ( 2 2 9 0 矾。+ 8 0 2 0 d 。) w x l 0 0 0 v ：叶绿素提取液总体积w ：材料鲜重 4 4 实验数据的统计分析方法 采用e x c e l l 和s p s sf o rw i n d o w s l o 0 统计分析软件对实验观察数据资料进行 数据统计、方差分析和差异显著性测验等。在实验中由于愈伤组织、不定根分化率、 芽分化率属于二项分布，各观察值实验误差不一致，因此进行方差分析时先进行了 反正弦转换。 5 结果与分析 5 1 初代培养 5 1 1 叶片初代培养 叶片外植体接种7 天时边缘开始褪绿膨大，并且有黄色颗粒状愈伤组织出现， 叶脉处出现乳白色愈伤组织，并逐渐长出白色小点( 不定根根原基) ( 见附图1 ) 。 2 0 天后开始从不定根中心形成明显的紫色突起( 芽原基) ，3 0 天后分化出蜷曲的芽 苗( 见附图2 ) 。初代培养实验结果见表6 ，对反正弦处理后的数据进行方差分析， 结果见表7 ，表8 。 表6 叶片初代培养结果 t a b l e6r e s u l t so f i n i t i a lc u l t u r eo f l e a f e x p l a n t s 10 25 3 3 3 39 3 3 3 49 3 3 3 55 6 6 7 64 3 3 3 71 0 0 88 0 0 96 0 0 1 08 0 0 1 16 0 0 1 28 3 3 3 1 34 0 o 1 45 3 3 3 1 55 6 6 7 03 0 0 5 3 3 31 3 3 3 5 6 6 71 3 3 3 5 6 6 72 0 0 5 3 3 31 3 3 3 1 0 0 4 0 0 7 6 6 71 3 3 3 l o ，02 0 0 2 0 01 3 3 3 8 6 6 7 2 0 0 01 3 3 3 2 6 6 74 6 6 7 2 3 3 32 3 3 3 2 3 3 32 0 0 o3 0 0 5 6 6 7 2 6 6 7 4 0 9 3 3 3 4 3 - 3 3 7 6 6 7 3 6 ，6 7 8 0 0 3 0 0 3 3 _ 3 3 9 0 ，0 8 0 0 3 6 6 1 6 0 0 5 6 6 7 1 0 04 6 6 7 6 6 73 0 0 1 0 05 0 0 2 6 6 7 5 6 6 7 3 3 36 6 7 1 6 6 75 0 o o4 0 o 3 6 6 7 8 3 3 3 03 3 3 03 0 0 1 0 07 6 6 7 1 6 ，6 79 0 0 3 3 32 0 o 2 0 o3 3 r 3 3 3 0 04 3 3 3 1 63 3 3 305 0 08 6 6 701 0 07 6 6 7 1 2 o 0 o o o o 0 0 o 0 o 0 0 0 o 5 1 1 1 叶片愈伤组织诱导 1 5 天时叶片愈伤组织诱导率的方差分析结果见表7 ，结果表明1 5 天时各因素 对愈伤组织的诱导率影响不显著。 表71 5 d 时愈伤组织诱导率的方差分析结果 t a b l e7a o vo f p e r c e n t a g eo f c a l l u si n d u c t i o no nd a y1 5 3 0 天时愈伤组织诱导率的方差分析结果见表8 ，结果表明因素6 - b a 对愈伤组 织的诱导率有显著性影响，i b a 、n a a 、k t 各因素对愈伤组织的诱导率无显著性 差异。对6 - b a 各水平平均值进行多重比较，采用新复极差( s s r ) 检验见表9 。 表83 0 d 时愈伤组织诱导率的方差分析结果 t a b l e8a o vo f p e r c e n t a g eo f c a l l u si n d u c t i o n0 1 1d a y3 0 变异来源平方和自由度均方 f s i g v a r i a n c es c es u m o f s q u a r e s d fm e a n s q u a r e i b a 1 2 8 3 2 1 3 34 2 7 7 3 83 7 6 9 n a a6 7 5 2 4 332 2 5 0 8 l1 9 8 3 6 - b a4 4 9 6 0 9 531 4 9 8 6 9 81 3 2 0 6 k t8 2 6 8 9 332 7 5 6 3 12 4 2 9 误差 3 4 0 4 6 93 1 3 3 4 9 0 总变异 7 6 2 1 9 1 21 5 1 5 2 2 9 4 0 3 1 2 4 3 表96 - b a4 水平新复极差检验表 t a b l e9s s ra n a l y s i so f t h ed i f f e r e n tl e v e l so f 6 - b a 注：s s r 检验，大写罕母表而1 差异显著形水平，小写字母表不5 差异显著性水平，字母相同表示差异不显 著，以下相同 表9 结果表明6 - b a 0 5 m e , i 与6 - b a l 咖啦差异不显著，6 - b a 浓度为0 m g l 时效果最差，6 - b a l ，5 m g l 对愈伤组织诱导效果最好。 5 1 1 2 叶片不定根诱导 对1 5 天时叶片的不定根分化率进行方差分析，结果见表l o ，结果说明各因素 1 5 天时对不定根分化率的影响不显著。 表1 01 5 d 时不定根分化率的方差分析结果 t a b l e1 0a o v o f r o o t i n gt a l co nd a y1 5 对3 0 天时叶片的不定根分化率进行方差分析，结果见表1 1 ，结果说明各因素 3 0 天时对不定根分化率的影响也不显著。 1 4 表1 13 0 d 时不定根分化率的方差分析结果 t 出1 e 11 a o v o f r o o t i n gr a t eo nd a y3 0 5 1 1 | 3 叶片不定芽诱导 在1 5 天时观察到所有处理中均无不定芽产生。 在3 0 天时除处理7 、处理9 、处理1 0 外，各处理均有不定芽长出，对3 0 天时 的不定芽诱导结果进行方差分析，结果见表1 2 。 表1 23 0 d 时不定芽诱导率的方差分析结果 t 抽l e1 2a o vo f a d v e n t i t i o u sb u dr a t eo nd a y3 0 i b a n a a 6 - b a k t 误差 总变异 1 0 5 4 0 3 2 1 87 2 0 1 0 0 1 9 7 8 0 8 2 8 1 6 7 6 7 0 ，6 2 9 1 3 0 4 5 9 8 0 4 8 2 6 4 4 4 1 6 6 5 9 7 1 8 从表1 2 可以看出各因素在3 0 天时对不定芽的诱导影响差异不显著。 在6 0 天时对各处理的芽分化率进行方差分析，结果见表1 3 。 5 3 3 3 3 3 抛 跏 似 缁 & 氐 伉 互 王 8 ” ：3 砌 m 如 m 表1 36 0 d 时芽分化率方差分析表 t a b l e1 3a o vo f a d v e n t i t i o u sb u dr a t eo i ld a y6 0 由表1 3 可以看出，因素i b a 、因素6 一b a 、因素k t 差异不显著，因素n a a 差异 显著，表明因素n a p , 各水平变化对不定芽的分化率有显著影响( 见表1 4 ) 。在本实 验的浓度范围内，随着n a a 浓度的升高，三角紫叶酢浆草的不定芽诱导率呈上升趋 势。 表1 4