（临床检验诊断学专业论文）伤寒沙门菌phop对鞭毛抗原基因fljb：z66的表达调节.pdf

江苏大学硕士学位论文 摘要 目的：探讨调节因子p h o p 对伤寒沙门菌h ：z 6 6 鞭毛抗原编码基因 伽：z 6 6 在各种环境应激下的表达调节作用。 方法： 1 采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌p 办d 尸缺陷变 异株。根据伤寒沙门菌础d 户基因序列，设计p c r 特异性引物， 并在引物末端加上需要的酶切位点。扩增砌d 尸基因上、下游片 段，用剐i i 消化后，定向连接成p 办o p 基因的缺损性同源性核 苷酸片段。将此片段胶回收后用后导入自杀质粒p g 1 5 1 的 b 口m 日i 酶切位点，将阳性质粒用电击法导入伤寒沙门菌野生株 ( g i f u1o 0 0 7 ) ，进行同源重组。用p c r 观察重组现象，将完全重 组的菌株作为砌o p 基因的缺陷变异株，并通过相应的核苷酸序列 分析加以确定。 2 将肠c z 基因作为鞭毛抗原基因舢的报告基因，采用自杀质粒介 导的同源重组方法制备舻：肠c z 变异株，使菌株的p 一半乳糖苷 酶活性代表伊基因的蛋白表达水平。通过电击法将含伊：肠c z 的重组质粒转入野生型及砌卯一伤寒沙门菌，通过在含x g a l 的 蔗糖平板上的显色筛选和p c r 筛选获得同源重组的椰：肠c z 和 p 办卯力b ：肠纪变异株，并通过相应的核苷酸序列分析加以确定。 3 对伤寒沙门菌的脚：肠c z 和肋o p 舻：肠c z 变异株同时进行高渗 应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激，通过比较两者p 一半乳糖苷 酶活性的变化，研究在不同应激环境下调节因子p h o p 是否对鞭 毛抗原编码基因肿：z 6 6 存在表达调节作用。 江苏大学硕士学位论文 结果： 1 经p c r 及序列分析证实变异株中砌d 尸基因缺失了2 9 7 个碱基， 表明成功构建伤寒沙门菌p 办d 尸基因缺陷变异株。 2 经p c r 、x g a l 底物显色及序列分析证实，变异株中伽基因中 的7 6 3 b p 被3 5 5 0 b p 的肠c z 片段替代，表明伤寒沙门菌舻：z 口c z 和p 办d 尸乃日：肠c z 变异株构建成功，可通过测定其p 一半乳糖苷酶 活性反映历b 翻译表达水平。 3 对比伤寒沙门菌的舻：肠c z 和肋d 尸舻：肠c z 变异株在高渗应 激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激下p 一半乳糖苷酶活性变化的差 异，结果显示，在低渗环境下，伤寒沙门菌的伊：肠c z 变异株 的p 一半乳糖苷酶活性明显高于肋。尸舻：肠c z 变异株；在高渗应 激后，伊：肠c z 株中p 一半乳糖苷酶活性呈从高到低的抑制性变 化，而p 乃d 尸- 乃b ：肠c z 株中的酶活性却无明显的动态变化。在氧 应激、胆汁应激和弱酸应激时两者p 一半乳糖苷酶活性变化无明显 兰巳 芝芒升。 结论：在低渗环境下，伤寒沙门菌调节因子p h o p 促进了鞭毛抗原编 码基因邶：z 6 6 的表达；在高渗应激下，p h o p 可能参与了鞭毛 抗原编码基因伊：z 6 6 的表达下调作用。 关键词：伤寒沙门菌，p 历d p 基因，z 6 6 鞭毛抗原，基因表达调节 o b j e c t ： 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t t os t u d yt h ee f f e c to ft h er e g u l a t o rp h o po nt h ee x p r e s s i o no f f l a g e l l i ng e n e 厂矿b ：z 6 6i n 勋办咒d ”e 朋ag 胛胞r f c 口s e r o v a rt y p h i m e t h o d s ： 1 ) c o n s t r a c t i o no ft h ep 办d 尸d e l e t e dm u t a n to f 已玎纪，i c 口s e r o v a r t y p h ib yh o m 0 1 0 9 i o u sr e c o m b i n a t i o nm e d i a t e db ys u i c i d ep l a s m i d a st h eg e n o m i ci n f o r m a t i o n ，t w op a i r f sp r i m e r sw e r ed e s i g n e da t u p p e r - a n dd o 、v n s t r e a m so ft h ep 厶d 尸g e n eo f - 娶g 玎把r f c 口s e r o v a r t y p h it oa m p l i 矽t w oh o m 0 1 0 9 0 u sd n a 仔a g m e n t s a 上弛i is i t e w a sa d d e di n5 一t e m i n io ft h er e v e r s ep r i m e ro ft h eu p p e rs t r e a m 仔a g m e n ta n dt h ef o r w a r dp r i m e ro ft h ed o w ns t r e a mf r a g m e n t a r e ra m p l i f i c a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ，t w o 仔a g m e n t sw e r ed i g e s t e d b y 置妒i a n d 1 i g a t e d a st h e h o m o l o g o u sr e c o m b i n a n td n a f r a g m e n t ，w h i c hc o n t a i n s t h ed e f e c t i v et a r g e tp 办d 尸g e n e t h e h o m 0 1 0 9 0 u sr e c o m b i n a md n af r a g m e n tw a si n s e r t e d i n t om e b 口聊日is i t eo ft h es u i c i d ep l a s m i dp g m b151 t h ep o s i t i v ev e c t o r w a st h e nt r a n s f e r r e di n t ot h et a r g e tc e l lo fsg 刀把r z c 口s e r o v a r t y p h iw i l ds t r a i nb yu s i n go fe l e c t r o p o r a t i o n t h er e c o m b i n a t i o n w a sv i s u a l i z e db yp c r ，a n dt h ec o m p l e t er e c o m b i n a n ts t r a i nw a s s e l e c t e da st h ep 厶d 尸d e l e t e dm u t a n ts t r a i na n dc o n f i m e db yt h e c o r r e s p o n d i n gs e q u e n c i n ga n a l y s i s 2 ) t h e z 徊：勉c zi n s e r t e d m u t a n tw a sp r e p a r e db yh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nm e d i a t e db ys u i c i d ep l a s m i d t h ep o s i t i v ev e c t o r w i t ht h er e c o m b i n a n t 仔a g m e n t 舢：肠c zw a st r a n s f o n n e di n t om e i i i 江苏大学硕士学位论文 w i l da n dp 厶d 尸m u t a n ts t r a i n so fsp 心纪，z c 口s e r o v a rt y p h ib y e l e c 仃o p o r a t i o n i n s e n e dm u t a n t sw e r es e l e c t e do nt h el bs u c r o s e p l a t ec o n t a i n i n g x g a la n dv e r i f i e d b y r e l a t i v ep c ra n d s e q u e n c i n ga n a l y s i s 3 ) s t r a i n so f 力b ：肠c za n dp 办d 尸z 穆：肠c zm u t a n tw e r ei n c u b a t e d l bb r o t ht ol o g p h a s ea n ds u b m i t t e dt oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s ， i n c l u d i n gh y p e r o s m o t i cs t r e s s ，w e a ka c i d i cs t r e s s ，b i l es t r e s sa n d o x i d a t i v es t r e s s w h e t h e rt h er e g u l a t o r yp r o t e i np h o pr e g u l a t e st h e e x p r e s s i o no ff l a g e u aa n t i g e ng e n e 。7 i 驴b ：z 6 6c o u l db ei n v e s t i g a t e d b yc o m p a r i n gt h e a c t i v i t i e so fp g a l a c t o s i d a eo fs t r a i n su n d e r e n v i r o n t t l e n t a ls t r e s s e s r e s u l t s ： 1 ) ad e l e t i o no f2 9 7 b p 行o mt h ep 办d 尸g e n ew a sc o n f i m e db yp c r a n ds e q u e n c i n ga n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h ep 办。尸d e l e t e dm u t a n t w a sc o n s t n j c t e ds u c c e s s f u l l y 2 ) a7 6 3b po f i 乃bg e n ew a ss u b s t i t u t e db y3 5 5 0 b po f 肠e zg e n ei ns p 刀把r z c 臼s e r o v a rt y p h iw i l ds t r a i na n dp 办d 尸m u t a n ts t r a i ni n s e q u e n c i n ga n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h e 力b ：肠c zm u t a n ta n dp 办d 尸。 移8 ：肠c zm u t a n to f g 船纪r z c 口s e r o v a rt y p h iw e r eg e n e r a t e d s u c c e s s 向l l y 3 ) t h e r ew a so b v i o u sd i f f e r e n c eo f z 徊：z 6 6e x p r e s s i o nb e t w e e nt h e 力b ：励c zs t r a i na n dt h ep 办d 尸力曰：肠c zm u t a n ts t r a i n i nt h e o s m o t i cs t r e s s c o n d i t i o n ， w h i l en oo b v i o u s e x p r e s s i o n a l d i f f e r e n c ei no t h e rs t r e s sc o n d i t i o n si n c l u d i n go fo x i d a t i v e ，b i l e a n da c i d i cs t r e s s c o n c l u s i o n s ： 1 ) t h ep 办d 尸g e n ed e l e t e dm u t a mo f e 咒纪r f c 日s e r o v a rt y p h iw a s c o n s t r u c t e ds u c c e s s 凡1 1 y i v 江苏大学硕士学位论文 2 ) t h e 肠c zg e n ew a ss u c c e s s 如1 1 yi n s e r t e di nm e 妒i nw i l da n d p 乃d 尸。m u t a n ts t r a i no f 2 胛纪厂f c 口s e r o v a rt y p h i 3 )r e g u l a t o rp h o pc o u l ds e ea sap o s s i b l ef a c t o rt o 纱b ：z 6 6g e n e e x p r e s s i o n i nt h eo s m o t i cs t r e s sc o n d i t i o n p h o pd i dn o t o b v i o u s l yr e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o fz 6 6f l a g e l l aa n t i g e ni n c o n d i t i o n so fo x i d a t i v e ，b i l ea n dw e a ka c i d i cs t r e s s e s k e yw o r d s ： sp 胛纪，z c 以s e r o v a rt y p h i ，z 膨，p 办d 尸， g e n ee x p r e s s i o n v 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指 导下独立完成的，除文中注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体的研究成果。对本论文做出重要贡献的 个人和集体，均在文中作了声明并表示谢意。 作者签名：茅设孙 日期： 占暖 学位论文版权授予书 本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或 机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权 江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 学位论文作者签名：茅砖；羽 签字日期：z f ，差茎菩耋i 考，誓。争签字日期： f 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 伤寒沙门菌的z 6 6 鞭毛抗原 伤寒沙门菌( 砌d 刀p 肋p 胛胞，f 加s e r o v a rt y p h i ) 是一种具有鞭毛、革兰阴性人 类致病菌，常通过污染的食物经消化道进入体内，在空肠远端侵入肠上皮m 细 胞，并能进一步在局部肠系膜淋巴组织中存活和增殖，再经淋巴液和血液进入肝 脾等全身组织，造成严重全身性感染一“肠热症”( t y p h o i df e v e r ) n 训。在整个感 染过程中，伤寒沙门菌需经一系列自身调节，以克服多种剧烈的环境影响，如剧 烈胃酸，肠道高渗和巨噬细胞高氧环境等。鞭毛编码基因与位于伤寒致病性基因 一岛( i 铴砌伽p 砌p a t h o g e n i ci s l a n d1 ，s p i 1 ) 侵袭因子的表达在侵袭过程中具有极 其重要的作用b “。 鞭毛( n a g e l l a ) 是沙门菌的运动基础，结构复杂，可分为基体、弯钩和细丝 ( b a s i cb o d y ，h o o k ，f i l 锄e m ) 三部分，见图1 1 。基体部被包埋在细菌内外膜中， 结构最为复杂，有中央小管。细丝部在菌体外侧通过弯钩部和基体部相连，主要 由一种称之为鞭毛素( n a g e l l i n ) 的蛋白质构成。大量的单体鞭毛素蛋白在细菌胞内 合成后，经由基体部和弯钩部的中央小管分泌到细胞外侧，以每圈1 1 个单体的 螺旋形式由近及远，逐步聚集成细丝四1 。沙门菌的鞭毛素基因表达受鞭毛调节 因子f 1 1 1 d c 和f l i a 促进，并受环境影响，由r c s b 、p h o p 、o m p r 等多种中央调 节因子( c e n t r a lr e g u l a t o r ) 参与调节四。引。沙门菌的鞭毛素蛋白单体多为5 0 6 0 k d a ， 从空间结构可分为d o 、d 1 、d 2 和d 3 四个区域，d 3 区域主要位于细丝的外表， 相应的氨基酸序列位于多肽中央，具有高度可变性，为鞭毛的抗原性决定区n 4 。们。 。i 。 ! 。鬟i 。i # 罗 赫 一 一 af 【 。氽 fh b e l l i 口 fl i c 一 刚 ， c 耻 m 姚 f f f - 日s) 一 鼢p 一 ： d 叭 p 阳 m 阻 尊 嘣 蛐 $ “ i m 0 哪 j 出 j 小甜胁 妇 江苏大学硕士学位论文 目前，对沙门菌的鞭毛抗原表达相变换调控认为，在二相鞭毛素编码基因 z 笳的下游紧邻的倒是一相鞭毛素编码基因刀f c 的抑制基因，f 1 j a 可在转录后 水平上抑制7 f c 的表达，2 卯。在舯的上游，存在一特殊的巨型发夹样结构( 办抚) 将舢的部分启动区域包括其中，发夹样区域中还有一编码重组酶的乃砌基因。 h i n 可帮助调节该发夹环部结构的方向，从而影响启动区域，如开关控制肿的 表达，间接调控c 的表达，因而在任何时候只有一种鞭毛素蛋白得以表达四，2 们。 长期以来人们都一直认为伤寒沙门菌是单相菌株，即只有一相鞭毛素编码基 因f c ，其相应的抗原为d 抗原或j 抗原( d 抗原的缺损型) m ，捌。1 9 8 1 年g u i n e e 首次在从印度尼西亚分离获得的伤寒沙门菌中发现一种新的鞭毛抗原，命名为 z 6 6 抗原眩引。随后的调查表明，z 6 6 抗原阳性伤寒沙门菌主要分布于印度尼西亚 及周围的东南亚一带旺9 。在体外鞭毛抗体诱导下，z 6 6 抗原阳性伤寒沙门菌也 能改变鞭毛抗原的表达，但这种变化与相变换不同，为单向不可逆变化，即只能 从z 6 6 抗原转变为d 或j 抗原的表达口们。有研究者怀疑z 6 6 抗原的编码基因为 二相鞭毛基因，并多次试用据鼠伤寒沙门菌及其他二相沙门菌的z 砸启动区和下 游序列设计的引物进行扩增，但均未成功，3 2 ，3 引，因此，z 6 6 抗原编码基因的 遗传学特性一直末被认识。 2 0 0 4 年，伤寒沙门菌z 6 6 抗原的编码基因舢被首次成功克隆，并对其遗 传学特性进行了初步的研究略钔，发现伤寒沙门茵z 6 6 抗原基因为一1 4 6 7b p 的 鞭毛素基因，在已完成序列分析的3 3 2 5b p 的染色体区域，其上、下游各有一个 同转录方向的o i 强。下游5 2 5b po r f 与鼠伤寒沙门菌的彬有较高的相似性( 氨 基酸序列相似性达7 0 3 ，称之为倒样基因) 。在z 6 6 抗原基因与倒样基因 之间，有一r h o 因子非依赖性的终止子( r h oi n d e p e n d e n tt e m l i n a t o r ) ，与两相沙门 菌的二相鞭毛基因簇结构类似，但上游的2 6 1 - b p0 r f 与鼠伤寒沙门菌的j i z 加基 因完全不同，且z 6 6 抗原基因的启动( p r o m o t e r ) 区域与鼠伤寒沙门菌舢的有 明显不同，尤其是在3 5 区，这正是以往克隆z 6 6 抗原基因失败的关键所在。另 外，所有z 6 6 抗原阳性菌株中都有一相鞭毛素编码基因f c ：嘶) ，存在与z 6 6 鞭毛抗原基因不同的染色体屁d 砒片段。用z 6 6 抗体诱导后，伤寒沙门菌可改变 鞭毛抗原表达，从z 6 6 抗原转为i 抗原( 以下简称抗体诱变) 。通过对此伤寒沙门 菌诱变株的鞭毛基因调查发现，z 6 6 抗原基因与其下游的倒样基因一起在染色 3 江苏大学硕士学位论文 体上消失了。用励口i 和核酸脉冲电泳对伤寒沙门菌染色体d n a 进行初步分析， 结果显示抗体诱变后伤寒沙门菌确实发生了部分染色体d n a 缺失眵卯。 最近研究表明，z 6 6 抗原的编码基因属于伤寒沙门菌的二相鞭毛素伽基因， 且位于一罕见的线性质粒上【3 6 】，在相应的鞭毛基因的调查中发现，z 6 6 抗原阳性 菌株中都有一相鞭毛素编码基因f c ：彤i ) 。这些特征均提示z 6 6 抗原编码基因是 属于二相鞭毛素编码基因。根据上述有关z 6 6 抗原基因的分子生物学特性的初步 分析，及以往对z 6 6 阳性伤寒沙门菌的研究认识，我们认为z 6 6 阳性伤寒沙门菌 很可能是一特殊的两相沙门菌，其表达调节机制与一般的两相沙门菌不同，抗体 诱变抗原表达转变可能为缺损变异，这将改变以往对所有伤寒沙门菌都是单相沙 门菌的传统认识。但伤寒沙门菌z 6 6 抗原基因的表达变化规律和调节机制仍未被 揭示，中央调节因子和鞭毛调节因子对z 6 6 抗原基因表达是否具有调节作用仍需 要进一步的研究。 1 2p h o p p h o q 双组分调节系统 p h o p p h o q 双组分调节系统是沙门菌的非常重要和多效的调节系统口。刀，是 一经典的二元调控系统，它由位于细胞外膜的感应蛋白p h o q 即一组氨酸激酶和 位于胞质的反应调控蛋白p h o p 构成。当位于细菌外膜上的p h o q 蛋白感应外界 刺激信号，其组氨酸( h i s ) 残基能够自身磷酸化，并将磷酸基团传递至反应调 控蛋白p h o p 的特定天冬氨酸( a s p ) 残基( 位于p h o p 蛋白的调节结构域) ，磷 酸化的p h o p 蛋白将作为被激活的调控蛋白，调控相应靶基因的表达。激活的 p h o p 蛋白作为调控子能够直接或与p m r a p m r b 双组分调节系统间接控制一系列 靶基因转录，如运载m 孑+ ，调控脂质a 的结构修饰，调控对抗菌肽的抵抗力， 调控细菌的毒力等等( 见图1 2 ) 。p h o p p h o q 双组分调节系统通过调节沙门菌 约1 基因的表达，而使细菌适应低m 9 2 + 、酸性p h 、胆汁等其他应激环境，是 沙门菌一个主要的双组分调节系统旧1 刀。 4 江苏大学硕士学位论文 瀚疃 ， ， ， _ 峨蜘蠢h 雕划m 辫翩 i 铲h 删 鞫p 的刚 h h 嘲翻憎蝉矧r v 纠 诤警t 嘲酬嘲瞅 伯喃瞒镰蟹涵瞄蕾州弹叫瞄 钢嘲嘲锄黼伸制蝴 】嘲i 图1 2p h o p p h o q 双组分调节系统调控基因示意图( 引自文献啜刀) f i g 1 2m o d e ld e s c r i b i n gt h es i g n a l sc o n t r o u i n ge x p r e s s i o no f p h o p p h o q r e g u i a c e dg e n e s 1 2 1m 9 2 + 浓度对p h o p p h o q 系统的调节 p h o p p h o q 双组分调节系统作为中央调节因子，可以调节众多基因的表达， 其中p h o p 蛋白激活的基因称为p a g ( p h o pa c t i v eg e n e ) ，而p h o p 蛋白抑制的基因 称为p r g ( p h o pr e p r e s sg e n e ) 。3 川。 研究发现，作为一种细胞生长和维持细胞活性必需的二价阳离子，m 9 2 + 可以 调节p h o p p h o q 双组分系统。细菌在低m 9 2 + 浓度如微摩尔m 9 2 + 浓度下生长，p h o p p h o q 双组分系统被磷酸化激活，促进p a g 基因的转录，而抑制p r g 基因的转录。在 高m 9 2 + 浓度如毫摩尔m 9 2 + 浓度下，p h o p p h o q 双组分系统被抑制，促进p r g 基因 的转录而抑制p a g 基因的转录。 在沙门菌p h o p p h o q 双组分调节系统感受外界m 9 2 + 浓度的刺激信号时， p h o p p h o q 系统通过对下游基因的调控使其更好的适应外界环境。例如，细菌在 低m 9 2 + 浓度下生长时，p h o p p h 0 q 系统活化后促进m 9 2 + 运输蛋白基因聊g 叫和 啷c 引拘转录，m g 认蛋白和m 百c b 蛋白能够顺电化学梯度运输m 9 2 + ，以维持细 胞内外m 矿+ 浓度的稳态口引。p h o p p h o q 系统感受低m 孑+ 活化信号后，还调节很 多下游基因以实现相应功能，如对脂质a 的修饰渤3 、对抗抗菌肽等。 江苏大学硕士学位论文 1 2 2p h o p p h o q 系统在酸性应激时的作用 沙门菌对酸性p h 的适应是其保证毒力的必要条件，酸性p h 能够激活p h o p p h o q 双组分调节系统并调节下游基因，使沙门菌进一步适应酸性p h 环境。 p h o p p h o q 双组分调节系统在活化状态时，p h o q 蛋白的周质区域在内膜膜磷脂与 二价阳离子连接，保持p h o q 蛋白的抑制状态。当p h o q 蛋白的传感器区域接触酸 性p h 后，p h o q 蛋白的构象发生改变而得以活化，这种构象的变化与沙门菌接触二 价阳离子和抗菌肽时的构象改变有所区别h ，活化的p h o o 蛋白进一步活化p h o p 蛋白，上调p a g 基因和下调p r g 基因。 酸性p h 活化p h o p p h o q 双组分调节系统后，能够直接或间接的下调鞭毛基因 _ 7 7 f c 的转录，使在酸性p h 环境下生长的沙门菌l 相和2 相鞭毛蛋白均被下调，这种 鞭毛蛋白表达和细胞活力的下降依赖于p h o p p h o q 系统的活化。在酸性p h 下， p h o p p h o q 系统对鞭毛的抑制可能保存了细菌存活所需要的a t p ，并且限制了质 子进入胞质溶胶的流量，有利于细菌在酸性p h 环境的存活h 。 1 2 3p h o p p h o q 系统在胆汁应激时的作用 作为一种胃肠道感染的病原菌，沙门菌在胆汁应激条件下的适应十分重要。 研究表明p h o p p h o q 系统活化的菌株增强了沙门菌对胆汁的抵抗力，而缺失 p h o p p h o q 系统的菌株对胆汁的敏感性比野生株明显增强，表明p h o p 。p h o q 系统 在沙门菌受到胆汁应激时起着非常重要的作用h 扣。 对受到胆汁应激的沙门菌进行d n a 芯片分析后，发现有关三型分泌系统介 导的侵袭相关基因全部被抑制转录，并且与鞭毛生物合成相关的基因也被抑制转 录。对受到胆汁应激的沙门菌进行双相凝胶电泳和质谱分析后，发现两种胆汁调 节的蛋白，y c i f 和p a g c 。其中y c i f 在胆汁应激时被上调，而受p h o p p h o q 系统调 控的p a g c 被下调h 引。进一步的研究表明，p 昭c 基因受到p h o p - p h o q 系统和s l y a 的共同调节，p h o p - p h o q 系统对p 昭c 基因的调控需要s 1 y a 的共同参与，但 p h o p p h o q 系统并不能通过改变s l y a 的浓度而活化p 昭c 基因1 。p h o p p h o q 系 统在胆汁应激时的作用机制仍需详细研究。 1 2 4p h o p p h o q 系统调控对脂质a 的结构修饰 脂多糖( l p s ) 是革兰阴性菌外膜的一个组分，由脂质a 、核心多糖和特异性 6 江苏大学硕士学位论文 多糖等3 个部分组成。p h o p p h o q 系统能够调控脂质a 的结构修饰，使沙门菌更好 的适应环境。在鼠伤寒沙门菌中，p h o p p h o q 系统活化后能够调控一些基因对脂 质a 进行结构修饰( 见图1 3 ) ，这些对脂质a 的结构修饰方式主要有五类：p h o p 调控的p 秽位点的转录产物是生物合成酰基化脂质a 所必需的，p a g p 能使脂质a 修饰上棕榈酸盐。受p m r a 调控的p m 旭( 也命名为倒) 并吵m r 尺也命名为p 6 9 阳) 操纵子也间接地受p h o p 的调控，在受p h o p 调控的p m 转录产物的参与下激活这2 个位点，转录产物能使脂质a 修饰上4 氨基阿拉伯糖【4 5 1 。在受p h o p 调控的p 聊硝 转录产物激活p 加r c ，p m ，c 能使脂质a 修饰上磷酸乙醇胺。细f p 基因部分受p h o p 调控，概0 位点的转录产物是形成脂质a 的2 羟基十四酸脂部分所需要的【4 6 】。 受p h o p 调控的幽幽位点的转录产物能够对脂质a 进行3 一脱酰基作用，当脂质a 被 修饰上4 氨基阿拉伯糖时，该作用被抑制【47 1 ，而在脂质a 缺乏氨基阿拉伯糖修饰 时，p a g l 能发挥代偿作用【4 8 】。细菌表面带有正电荷的脂质a 增加，减少了与阳离 子抗菌肽结合，细菌增强了抵抗阳离子抗菌肽的能力，也改变了宿主对细菌的免 疫识别【3 。 一蚴 图1 3 鼠伤寒沙门菌脂质a 的结构修饰示意图( 引自文献【4 8 ) f i g 1 3m o d i f i e dl i p i dao f se ，z 胞，耙口s e r o v a rt y p h i m u r i u m 7 江苏大学硕士学位论文 1 2 5p h o p p h o q 系统调控对抗菌肽( a m p s ) 的抵抗力 p h o p p h o q 系统与抗菌肽( a m p s ) 的相互作用模式详见图1 4 。当沙门菌在毫 摩尔浓度的m 9 2 + 环境中生长时，p h o p p h o q 系统处于抑制状态，m 9 2 + 在内膜上与 p h o q 蛋白的周质区域一酸性袋蛋白结合( a ) 。当沙门菌的生长过程中加入a m p s 时，a m p s 能将与p h o q 蛋白结合的m g ”置换出来( b ) ，使细菌内膜和p h o q 结合 的m 矿+ 丢失，p h o q 蛋白形成二聚体和自磷酸化，活化的p h o q 蛋白将偶联的反 应调控蛋白p h o p 磷酸化，活化的p h o p 蛋白进一步调控下游基因，发挥对a m p s 的 抵抗作用( 图1 4 ) 【4 9 j 。 图1 4p h o p p h o q 系统与m 孑+ 、抗菌肽( a m p s ) 的相互作用示意图( 引自文献4 9 ) f i g 1 4t h ei n t e r a c t i o no fm a g n e s i u ma n da mp sw i t ht h e 勋f 聊。聆p ，肠8 门胞，f c 口p h o p p h o q t w o c o m p o n e n tr e g u l a t o r y s y s t e m p h o p p h o q 系统调控对抗菌肽的抵抗力主要作用于两个方面：p h o p p h o q 系统调控脂质a 的结构修饰，改变了l p s 的结构，这样细菌表面带有正电荷的脂 质a 增加，减少了阳离子抗菌肽结合，细菌增强了抵抗阳离子抗菌肽的能力，有 利于沙门菌对抗宿主的天然免疫。p h o p p h o q 系统调控一些编码外膜蛋白酶的 江苏大学硕士学位论文 基因，这些蛋白酶能分解抗菌肽，增强沙门菌对抗菌肽的抵抗力【37 1 。例如，外 膜蛋白酶p g t e 在转录后水平受p h o p p h o q 系统的调控，p h o p p h o q 系统激活p g 征 基因，艇魑的表达能够分解a - 螺旋肽c 18 g ，增强细菌对q 一螺旋阳离子抗菌肽 ( o 【c a m p s ) 的抵抗力5 0 1 。 1 3 调节因子p h o p 与z 6 6 鞭毛抗原表达可能的作用关系 伤寒沙门菌在进入胃肠道的感染过程中，需经一系列自身调节，以克服多种 剧烈的环境影响，如胃酸、胆汁、肠道高渗和巨噬细胞高氧环境等。在不同的应 激环境下，鞭毛编码基因的表达受到相应的调节，以使伤寒沙门菌能够适应环境 的改变得以存活和繁殖，这种鞭毛抗原的表达调节在侵袭过程中具有极其重要的 作用。有研究表明，在高渗应激、氧应激、胆汁应激和弱酸应激下，伤寒沙门菌 的鞭毛抗原基因历b ：z 6 6 在转录水平上均有着相应的变化【5 l 】。 调节因子p h 0 p 是伤寒沙门菌一个非常重要的调节系统和毒力因子，p h o p 在 沙门菌遭遇各种环境影响时，如低m 9 2 + 、酸性p h 、胆汁、抗菌肽等等，都发挥 着很大的作用。沙门菌的中央调节因子p h o p 能够调节约1 的基因，而使细菌 能够适应体内的各种应激情况，p h o p 调节的下游基因中包含了一些编码鞭毛抗 原的基因如历c 基因，能够对鞭毛抗原进行相应的表达调节。那么，在各种环境 应激时，调节因子p h o p 是否参与了鞭毛抗原基因所b ：z 6 6 的表达调节值得进一 步的研究。为了进一步探寻鞭毛抗原基因所b ：z 6 6 的表达是否受到p h o p 的调节， 我们将构建z 6 6 鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的砌d 尸基因缺陷变异株，并进一步构 建舳：肠c z 和p 血d p 舻：肠c z 变异株，对两变异株同时进行高渗应激、氧应激、 胆汁应激和弱酸应激，通过比较两者b 半乳糖苷酶活性变化的不同，观察野生株 和p 乃d 尸缺陷株的鞭毛抗原基因肿：z 6 6 的表达在各种应激条件下是否有所区 别，研究在各种应激过程中调节因子p h o p 是否参与对鞭毛抗原基因舢：z 6 6 的 调控。 9 江苏大学硕士学位论文 第二章本论文研究的目的、方法、实验方案的设计 2 1 研究目的 探讨伤寒沙门茵调节因子p h o p 在各种环境应激下对伽：z 6 6 基因的表达调 节作用。 2 2 研究方法及技术 2 2 1 采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌肋d 尸缺陷株。 2 2 2 采用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌伽：肠c z 和 p 办d 尸舯：肠c z 变异株。 2 2 3 通过比较两种变异株在不同应激条件下p 半乳糖苷酶活性变化的不同，探 讨在不同应激条件下调节因子p h o p 是否参与对鞭毛抗原基因伊：z 6 6 的表达调 节。 2 3 实验方案的设计 本论文实验技术路线方案设计如下： 1 0 江苏大学硕士学位论文 1 r l 获得p j ；2 。尸瑚：三口c z 变异株 、r 获得力b ：三口c z 变异株 1rr1 r、r 破茵并测定细胞b 半乳糖苷酶活性 探讨调节因子p h o p 是否参与对鞭 毛抗原基因弘：z 6 6 的表达调节 江苏大学硕士学位论文 第三章伤寒沙门菌p 厅d p 缺陷株的构建及鉴定 伤寒沙门菌( 勋砌d p z 舷p ，z 胞，f c 口s e r o v a rt y p h i ) 是引起人类伤寒病的革兰阴性 肠杆菌。p h o p 蛋白是沙门菌的一种重要的调节因子，和位于膜上的p h o q 蛋白构 成双组分调节系统，与细菌毒性有关【5 2 1 ，p h o p p h o q 调节系统参与环境m 孑+ 、 p h 、胆汁等变化引起的胞内基因表达调节，与f e 3 + 响应的双组分调节系统 p n l r b p m r a 也有关联，p h o p 可促进p r n r d 的表达而激活p m r b p 删a 系统【3 7 5 3 ，5 4 1 ， 已被认为是一种中心调节因子( c e n t r a lr e g u l a t o r ) ，其许多调节功能目前可能尚未 被发现。为此，我们将构建z 6 6 鞭毛抗原阳性伤寒沙门菌的矽庇d 尸基因缺陷变异株， 以便进一步观察调节因子p h o p 对鞭毛抗原基因所b ：z 6 6 和其他基因的调节作用。 3 1 材料与方法 3 1 1 材料 3 1 1 1 菌株和质粒 z 6 6 阳性野生型伤寒沙门菌g i f u1 0 0 0 7 、s p y 3 7 2 矽f r 和自杀质粒p g m b l 5 1 由 日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠；大肠杆菌d h 5 a 本室保存。 3 1 1 2 主要试剂 胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒、t 4d n a 连接酶( p r o m e g a 公司) ；e xt a q 、 列i i 和b 口聊h i ( t a k a r a ) ；s o c 培养基。 3 1 1 3 主要仪器 核酸紫外检测仪( e p p e n d o r f b i o p h o t o m e t e r ) ；p c r ( m a s t e r c y c l e rp e r s o n a l ) ；凝 胶成像系统( g e n eg e n i u sb i oi m a g i n gs y s t e m ) ；电转化仪( b i o r a dg e n e p u l s e ri i ) ；高速冷冻离心机m e g 疵g e ( h e r a e u s ) ；空气浴摇床t h 1 5 ( j o h a n a n o t t o ) ；核酸检测仪b i o p h o t o m e t e r ( e p p e n d o r f ) 。 3 1 2 方法 3 1 2 1 技术线路 1 2 江苏大学硕士学位论文 p c r 酶切 附 尹砌户必 p 1bp 2 b b t hj f 1 _ 翌烫商掣口占圈圜豳圈 阼f 1if 2 f 克隆 b 矾hf f 2 2 f 1 一f 2 f 1 - f 2 3 1 2 2p c r 引物设计 根据伤寒沙门菌肋卯基因上、下游核苷酸序列，设计两对特异的p c r 引物 p 1 刖1 b 和p 2 2 b ( 见图3 1 ) ，并在p 1 b 和p 2 a 的5 一端加上磁，i i 酶切位点 以便于扩增片段的定向连接，在引物p 1 a 和p 2 b 的5 端加上b 口聊1 酶切位点 以便于连接片段的克隆，在所有引物5 端加上两个保护性碱基，引物由上海生 工生物技术公司合成，详细序列见表3 1 。 4 p i l d pp 1 a + p 2 a 4 8 818 43 8 26 7 51 2 1 8 卜一 p 1 bp 2 b 中心区( 1 6 7 5 ) 为肋卯基因的编码区6 7 5b p ，p 1 a 1 b 、p 2 a 2 b 为该基因上、下游 特异性( 5 端加酶切位点) 引物，扩增获得0 8 5 k b 和o 6 0k b 的上、下游片段后定向连接制 备成1 4 5k b 的该基因同源性缺损片段，缺损区域为该基因的8 4 3 8 2b p 区域，共2 9 7b p 图3 1 却d 尸基因缺失用p c r 引物设计 f i g 3 1d e s i g no f p r i m e r st oa m p l i f yf i a g m e m sf o rd e l e t i o no f t h e 肋。尸g e n e 1 3 江苏大学硕士学位论文 表3 1p c r 引物及序列 t a b 3 1p c rp r i m e r sa n dt h es e q u e n c e s 3 1 2 3 目的基因片段p c r 扩增 从g i f u1 0 0 0 7 菌的l b 平板上挑取一单菌落，接种于3 m l l b ( 1 蛋白胨，o 5 酵母醇，1 n a c l ) 培养液中，3 7 振荡培养过夜。将菌液4 ，6 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ， 弃上清液，沉淀加入1 m l 去离子水，煮沸1 0 m i n ，离心，以上清液作为模板，p c r 扩增上、下游同源性片段f 1 、f 2 ，向o 2 m l p c r 管中加入p c r 反应体系如下： 组份用量 1 0 e xt a ab u f f e r 2 5 m m o l ld n t p 模板d n a 5 o l l m o l lp 1a 5 o l l m o l lp 2 b e xt a q d d h ，o 1 0l l l 5u 1 1 0u 1 5l l l 5l l l o 5u l 加至1 0 0 肛l 9 4 预变性5 m i n ，然后9 4 变性3 0 s ，5 5 退火3 0 s ，7 2 延伸l m i n ，共进 行3 0 个循环，再7 2 延伸1 0 m i n 。p c r 扩增产物进行琼脂糖( 1 0 9 l ) 电泳， e b 染色，g e n i u s 凝胶电泳图像分析系统分析鉴定。扩增后f 1 和f 2 片段分别进 行纯化，步骤如下： p c r 产物中加等体积的酚氯仿混合液充分混合，在4 1 2 ，0 0 0 印m 离心 1 0 m i n ，收集上清液，加入2 5 倍体积的9 9 的冷乙醇和1 1 0 体积的3 m