（森林保护学专业论文）松毛虫地理种群遗传多样性及其与生态因子的相关性研究.pdf

摘要 本文采用简单序列重复问区扩增多态性d n a ( i s s 鼬技术检测了赤松毛虫 ( d e n d r o l i m u s p u n c t a t u s s p e c t a b i l i s ) 、油松毛虫( d e n d r o l i m u s p u n c t a t u st a b u l a e f o r m i s ) 和落叶松毛虫( d e n d r o l i m u ss u p e r a n s ) 在河北、山东、辽宁等省不同地区种群之间9 个种群的遗传多样性及遗传分化。根据扩增图谱，运用p o p g e n e 软件对松毛虫9 个种群的遗传多样性和遗传相似性进行分析，并根据遗传相似性系数应用n t s y s p c 一2 2 1 0 软件对供试松毛虫的所有个体进行聚类分析。同时应用s p s s 软件对松毛虫 不同地理种群的遗传多样性、遗传距离与所处地区的一些生态因子的相关性进行了分 析。 建立并优化了适于松毛虫研究的i s s r 反应体系，应用此体系，从5 0 条松毛虫近 缘种的i s s r 引物中挑选出重复性、稳定性和多态性都较好的1 3 条引物对松毛虫9 个群体的1 1 9 个d n a 样品进行p c r 扩增，共获得1 9 5 个清晰稳定的条带，其中多态 性位点1 8 4 个。研究结果表明： 由s h a n n o n 信息指数与n e i 指数估计的松毛虫不同地理种群的遗传多样性的结 果是一致的，即：落叶松毛虫( 围场群体) 的遗传多样性最高，赤松毛虫( 沈阳群体) 最低。 同一群体内个体存在的遗传变异仅仅体现在很少量的基因位点上，说明了同一群 体中遗传的稳定性。同一种群内不同地理群体间出现了一定程度的遗传分化。总体上 看，在同一种群内部遗传距离与地理距离、寄主都有一定的相关性。 遗传相似性和聚类分析表明种间的遗传差异明显大于同种内群体之间的遗传差 异。反应出从d n a 水平上揭示的遗传差异程度与表型水平的差异程度基本一致，赤 松毛虫与油松毛虫的亲缘关系较近，而与落叶松毛虫关系较远，这与性信息素学研究 的结果一致。 用s p s s 软件分析了赤松毛虫不同种群的遗传多样性指数与各种群所处的生态环 境的各因子之间的相关性，结果表明：赤松毛虫各群体的遗传多样性与生境的年均温 度、年均湿度均呈较显著的正相关趋势；与所处地区纬度相关性很小；但与所处地区 的海拔高度却呈显著的负相关趋势，表明海拔在维持赤松毛虫遗传多样性方面起着重 要的作用；赤松毛虫取食的寄主植物种类对遗传多样性的大小无明显的影响。 赤松毛虫不同地理种群两两之间的遗传距离与海拔距离呈一定程度的正相关性， 初步说明地理隔离对基因交流存在一定的阻碍作用。 关键词：松毛虫；地理种群；i s s r ；遗传分化；生态因子 g e n e t i cd i v e r s i t yi nt h ep a r t i a ld e n d r o l i m u s ( l e p i d o p t e r a ) g e o g r a p h i c a lp o p u l a t i o n s a n di t sr e l a t i o n s h i pw i t he c o l o g i c a lf a c t o r s s p e c i a l i t i ：f o r e s t r y p o s t g r a d u a t e ：g a ol i j i e a b s t r a c t d i r e c t i o no f s t u d y ：i n s e c te c o l o g y a d v i s o r ：g a ob a o - j i a t h i ss t u d y , b yu s eo fi s s rt e c h n i q u e , e x a m i n e dt h eg e n e t i cs t r u c t u r ea n dd i v e r g e n c e a m o n g t h e9n a t u r a lp o p u l m i o n so f t h ep i n ec a t e r p i l l a r s ( d e n d r o l i m u s p u n c t a t u s s p e c t a b i l i s ； d e n d r o l i m u s p u n c t a t u st a b u l a e f o r m i s ：d e n d r o l i m u ss u p e r a n s ) c o l l e c t e df r o md i f f e r e n ta r e a $ i nh e b e i 、l i a o n i n ga n ds h a n d o n g b a s eo nt h ea m p l i f i c a t i o nb a n d s ，u s i n gp o p g e n e s o f t - w a r e ，g e n e t i cd i v e r s i t ya n dg e n e t i cs i m i l a r i t i e sw e r ea n a l y z e d b e s i d e s ，c l u s t e ra n a l y s i s w e r ea n a l y z e do na l lt h ei n d i v i d u a l so fp i n ec a t e r p i l l a r sb yn t s y sp c - 2 2 1 0 t h e c o r r e l a t i o na n a l y s i sw a sa n a l y z e db e t w e e nt h eg e n e t i cd i v e r s i t y 、g e n e t i cd i s t a n c ew i t h i n p o p u l a t i o n sa n de n v i r o n m e n t a lf a c t o r s t h i st e s th a sd e v e l o p e das e to fo p t i m i z e dr e s p o n s es y s t e mo fi n t e r - s i m p l es e q u e n c e r e p e a t sp o l y m o p h i s m ( i s s r ) ，w h i c hp r o v i d e sap o w e r f u lt o o lf o ri n v e s t i g a t i o no fg e n e t i c v a r i a t i o no f 9n a t u r a lp o p u l a t i o n s ( d e n d r o l i m u ss p e c t a b i l i s ；d e n d r o l i m u st a b u l a e f o r m i s ： d e n d r o l i m u ss u p e r a n s ) s h a n n o n i n d e xs h o w sh i g h e s tg e n e t i cd i v e r s i t yi nw e i c h a n g p o p u l a t i o n ( d e n d r o l i m u ss u p e r a n s ) a n dl o w e s t g e n e t i cd i v e r s i t y i n s h e n y a n g p o p u l a t i o n ( d e n d r o l i m u ss p e c t a b i l i s ) , w h i e hi si d e n t i c a lw i t hn e i si n d e x d i f f e r e n tg e o g r a p h i c a lg r o u p si nt h es a m ep o p u l m i o u sh a sag e n e t i cd i v e r g e n c ei n s o m ee x t e n t g e n e r a l l y , t h eg e n e t i cd i s t a n c eb e t w e e ng r o u p si nt h es a m ep o p u l a t i o ni s c e r t a i n l yr e l a t e dw i t ht h eg e o g r a p h i c a ld i s t a n c ea n dh o s l g e n e t i cs i m i l a r i t i e sa n dc l u s t e ra n a l y s i ss h o w st h a ti n t e r - s p e c i e sh e r e d i t yd i f f e r e n c ei s o b v i o u s l y b i g g e r t h a nt h e h o m o g e n e o u s b e t w e e n p o p u l a t i o n s i nt h e h e r e d i t y d i f f e r e n c e , w h i c hr e f l e c t st h eh e r e d i t yd i f f e r e n c ed e g r e ei sc o n s i s t e n tf r o mt h ed n al e v e l w i t ht h ep h e n o t y p cl e v e l d e n d r o l i m u ss p e e t a b i l i sh a sn e a r e rg e n e t i cd i s t a n c ew i t h d e n d r o l i m u s t a b u l a e f o r m i st h a nd e n d r o l i m u ss u p e r a n s ，w h i c hi si d e n t i c a lw i t ht h a t r e s e a r c h e di ns e x u a li n f o r m a t i o no f p i n ec a t e r p i l l a r s c o r r e l a t i o na n a l y s i sb ys p s ss o f t w a r ei nf o u rd e n d r o l i m u ss p e e t a b i l i sp o p u l a t i o n so f d i f f e r e n tg e o g r a p h i c a la r e a ss h o w sas i g n i f i c a n tn e g a t i v er e l a t i o nb e t w e e ng e n e t i cd i v e r s i t y a n de l e v a t i o n , a n dt h eg e n e t i cd i v e r s i t yw i t h i np o p u l a t i o n sw a sp o s i t i v e l yr e l a t e dw i t ht h e a n n u a lt e m p e r a t u r ea n dm o i s t u r e i no p p o s i t e ，t h eg e n e t i cd i v e r s i t yw a sw e a k l yr e l a t e d w i t hl a t i t u d e b e s i d e s ，t h e r ew a sap o s i t i v er e l a t i o nb e t w e e nt h eg e n e t i cd i s t a n c ea n da n d t h ed i s t a n c eo fe l e v a t i o n ，w h i c hs h o w st h a tg e o g r a p h i c a li s o l a t i o nh a so b s t r u c te f f e c to n g e n ei n t e r f l o w g e o g r a p h i c a lp o p u l a t i o n s ；i s s r ：g e n e t i cv a r i a t i o n ： 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些盎些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文 中作了明确的说明并表示谢意 学位论文作者签名： 够互 签字日期：硼年 月f r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑些盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅本人授权塑韭盎些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名飞勃镪、 导师签名：匆锡y 、 ， 签字日期：碲石月，f 日 签字日期：细司年月苫日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 松毛虫地理种群遗传分化及其与生态因子的相关性研究 1 引言 生物多样性是一个自然现象，也是一种生态现象，它随地理位置、气候条件、地理历史过程 和人为活动等发生明显的变化，包含遗传多样性、物种多样性和生态系统多样性三个层次。遗传 多样性是生物多样性的重要组成部分，是地球上所有生物携带的遗传信息的总和，一般在谈及生 态系统多样性和物种多样性时已经涉及到了遗传多样性，因为物种是构成生物群落进而组成生态 系统的基本单元，任何物种都具有其独特的基因库和遗传组成，物种多样性已经包含了遗传多样 性，故遗传多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础，换句话说，遗传多样性是生物多样性 的内在形式，其中种群遗传多样性又是遗传多样性的重要表现。 1 1 物种遗传多样性研究进展 1 1 1 遗传多样性的理论与实践意义 遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，m c n e e l y 等( 1 9 9 0 ) 把遗传多样性定义为蕴藏 在地球上植物、动物和微生物个体基因中的遗传信息的总和。施立明( 1 9 9 0 ) 则把遗传多样性 看成是种内或种间表现在分子、细胞、个体三个水平上的遗传变异度。1 9 9 2 年，世界资源研究 所( w r j ) 在全球生物多样性策略这一纲领性文件中的定义更为明确，提出“遗传多样性是 指种内基因的变化，包括同种显著不同的群体间或同一群体内的遗传变异”。即遗传多样性主要 是指种内不同群体之间或同一群体内不同个体的遗传变异的总和【l j 。群体遗传结构是指一个种 内总的遗传变异程度及其在群体间的分布模式，是一个种最基础的遗传信息。其研究内容主要 有：多态座位百分数，平均杂合度，平均序列差异百分数，群体问的遗传距离和基因流，有效 群体大小等，对群体遗传结构的研究有助于估计群体的遗传多态性、群体问基因流的范围和方 式，推测祖先群体的结构，建立种内群体间系统发育的关系等【2 l 。遗传变异为生物进化的基础， 而种群遗传结构是由自然选择通过遗传力的相互作用和环境条件在时空上的变化而形成的。因 此，在自然种群中维持和建立遗传多样性的基本力量是环境异质性( e n v i r o n m e n th e t e r o g e n e i t y ) 。 在连续的不断变化的环境中，分子、染色体和外形特征都以各自不同的速率进化着，且进化速 率与种群大小和突变率无关。种群间的遗传差异主要依赖于基因流( 同化力) 、遗传漂变和自 然选择( 多样性产生机制) 间相互作用的平衡。尽管自然选择直接作用于表型( p h e n o t y p e s ) ， 但它也是在d n a 和蛋白质水平上引起种群间和种群内遗传差异的主要因素删。对于物种遗传 多样性的研究具有重要的理论和实际意义。物种或居群的遗传多样性大小是长期进化的产物， 是其生存( 适应) 和发展( 进化) 的前提，物种或群体的遗传多样性越高或遗传变异愈丰富， 其进化的潜力也就愈大，为进化提供的原料储备越充分，对环境变化的适应潜力愈强，其进化 潜力也就愈大。 1 1 2 遗传多样性在害虫管理中的作用 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 昆虫作为地球上最繁盛的生物群体广泛分布于世界各地，它们栖息多样的生境，在生态 系统中发挥着重要的功能。当昆虫同人类争夺食物资源、生存空问，或它们的活动干扰人类的 利益时，就变成了害虫。历经漫长的进化过程，害虫已产生出一些能力以及反应的遗传策略以 适应不断变化的环境条件，在一些主要的害虫中表现出大范围的遗传变异，在由于人为因素造 成的诸如农药的使用、生境的退化和环境的污染等的具有巨大生存压力的环境条件下，具有更 高遗传变异特性的害虫更加迅速地进化，以生存下去”j 。 地理变异代表了大范围的生态学的利遗传学的变异，几乎在所有昆虫种群中都可发现地 理变异，也就是说每一个物种在时空上都有不同程度的变异。当地遗传机制和环境变化促进了 地理变异，当这些力在种的遗传变异范围内相互作用时，地方种群便进化。遗传力如突变和遗 传漂变与自然选择相互作用有利于对当地环境条件的适应，导致了地方种群的遗传差异。同时 基因流的作用限制了这种变异【6 l 。害虫是一个具有长期进化历史的有机体组成的动态群体。他 们将继续进化以适应不断变化的环境条件当害虫传入一个新的地方时，它们将不断适应以产 生新的对策。s t e n s e t h ( 1 9 8 7 ) 年提出，解决害虫问题的合理答案必须以害虫的遗传学和进化策 略的研究为基础，这些方面的研究与害虫的生物学和生态学的研究一样重要1 7 j 因此，人们开 始关注害虫的遗传和进化研究，尤其是分子生物技术的发展，为害虫的分子生态学研究带来了 便利条件。许多研究者利用分子遗传技术鉴定主要害虫的种群遗传结构、种内遗传变异、害虫 对寄主植物的选择性变化、害虫抗药性水平，以及对害虫生物璎的正确鉴别。 1 2 松毛虫多样性研究进展 1 2 1 松毛虫物种多样性 松毛虫属d e n d r o l i m u s ( 鳞翅目：枯叶蛾科) 昆虫全世界共有3 0 余种，其中在中国有2 7 种分布，是针叶树种的重要害虫，广泛分布于全国2 8 个省、市、自治区。其中严重危害松林的 有马尾松毛虫、油松毛虫、赤松毛虫、云南松毛虫、落叶松毛虫、思茅松毛虫。这六种松毛虫 经常大面积爆发，影响林木生长，严重时树木大片枯死，在大发生时常有松毛虫毒毛致病( 松 毛虫病、关节肿大) 、致残( 致盲) 的报道口 1 ”。 昆虫与其他生物一样，在长期的生长发育和进化过程中保留了一些遗传特征。使物种得以 延续，同时又存在一些变异，以适应新的环境，这些遗传变异的特性不仅表现在昆虫的种间， 而且存在于同种昆虫的不同种群之间以及同一种群的不同个体之间 1 2 1 4 。 造成松毛虫危害较为严重和难以彻底根除的重要原因是松毛虫天然杂交种的存在和不同种 松毛虫的混同发生l l ”。由于松毛虫分布范围广+ 泛，所处环境复杂，不同地理区域的气候因素， 林型、坡向、寄主、天敌等都对松毛虫的外部形态有一定的影响，因此，使得松毛虫( 如油松 毛虫、落叶松毛虫、赤松毛虫) 在形态特征方面虽有一定的差异，但中间类型普遍，界限有时 不清，而且同一种松毛虫在不同的地理分布区形态特征也有一定的差异( 如油松毛虫在不同地 区翅颜色有白、黄、半黄和杂色，翅纹也有变异) f l q 。文定元等曾应埘模糊聚类方法，分析了 湖南宁乡、永州，福建南安，广西钦州和四川永川、西昌等地松毛虫种群的生殖器的个体变异 2 松毛虫地理种群遗传分化及其与生态因子的相关性研究 和种群类型，结果表明，在同一种群个体间存在着差异，有的种群个体差异显著，有的则不甚 显著”。冈此，单从形态特征对松毛虫进行研究已不能完全客观地反映松毛虫属种群间亲缘关 系。 1 2 2 松毛虫遗传多样性 现代遗传学认为，物种的遗传变异是由基冈决定的，外部形态的变异及体内蛋白质分子的 变化的根本原因是由于基因中d n a 分子碱基序列发生了变化 1 8 2 1 ，松毛虫作为重要的昆虫类 群，种群遗传分化尤为突出，冈而，种群遗传学研究是一个较活跃的领域，研究内容主要包括 孟德尔遗传学和分子遗传学2 个方面。 松毛虫的遗传特性受环境的影响较大，在不同地区常形成不同的地理距种，或在同一地区 形成不同的生态型，显示出种和种下的分化田j 。孔祥波等利用气相色谱( g c ) 、气相色谱与质 谱联用( c _ r c m s ) 和触角电位( e a g ) 等技术结合田间试验，鉴定了落叶松毛虫、思茅松毛虫、 赤松毛虫和油松毛虫的性信息素成分，初步认定马尾松毛虫、油松毛虫和赤松毛虫由于含有共 同的性信息素成分因此亲缘关系较近阐明了性信息素主要成分是松毛虫种间隔离的重要冈素 1 2 3 。赵清山等进一步对马尾松毛虫、油松毛虫、赤松毛虫和落叶松毛虫进行杂交试验，表明马 尾松毛虫、油松毛虫、赤松毛虫之间不存在生殖隔离，因此认为油松毛虫和赤松毛虫应分别定 名为马尾松毛虫的地理亚种俐。此外张爱兵等首次用r a p d 分子标记技术对中国松毛虫属的八 个种和亚种间的亲缘关系进行了研究m j ，1 3 个随机引物在8 种松毛虫中共检测到1 6 8 个多态分 子标记，对8 种松毛虫的分类地位和亲缘关系进行了探讨，表明从r a p d 指纹分析和从信息素 成分得出的结论是一致的。2 0 0 5 年张德兴等建立了适合马尾松毛虫以及其它近缘种种群遗传学 研究的l o 对微卫星标记，并且对油松毛虫、赤松毛虫、落叶松毛虫和思茅松毛虫进行了试验， 发现这1 0 对引物对油松毛虫种群的遗传多样性分析基本适用，而对于其它三种松毛虫种群进行 遗传多样性分析效果却不太好1 2 。 1 3i s s r 技术在昆虫生态学的应用 以聚合酶链反应( p c r ) 为基础发展起来的系列分子标记技术，为研究生物基因组的遗传信 息、种的系统演化和亲缘关系，以及同种昆虫不同种群，甚至个体之间的遗传变化提供了非常 便捷的途径，并且已广泛地用于遗传学、分子进化、基因定位、系统演化等各领域 1 8 , 1 9 2 7 2 8 , 2 9 1 ， 它能从生物体内获得小到单个碱基对变化的丰富信息l ls ”】。i s s r 标记就是其中的一种，通常为 显性标记，星孟德尔式遗传，且具有很好的稳定性和多态性 3 0 l ，因而是非常理想的分子标记。 目前，i s s r 在昆虫生态学的上的应用主要有检测遗传多样性、分析地理种群变异、研究种 群问的亲缘关系等。k u m a re ta 1 ( 2 0 0 1 ) 用i s s r 方法评估2 8 个印度水稻害虫( s c i r p o p h a g a i n c e r t u l a s ) 种群的遗传变异。9 条i s s r 引物在所有种群中共产生7 9 条扩增条带，其中有6 7 条 多态性条带，用u p g m a 法构建树状图表明，遗传距离与地理距离无关，说明种群间的基因交 流不受地理距离的限制，这与早期的r a p d 结果一致【3 l j 。r e d d y 等用5 和3 末端锚定的6 个 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 引物对不同种群的家蚕个体进行扩增，产生多态型条带占总数的7 7 | 3 2 1 0a b b o t 研究发现i s s r 引物能够区分2 种蚜虫( a c y r t h o s i p h o n p i s u n t p e m p h i g u s o b e s i n y m p h a e ) 、蚊虫似e d e s a e g y p t i ) 和 p h i l o d i n a 属的轮虫种群间的变异【”】。( c a ) n 是在鳞翅目昆虫基因组中广泛存在的重复序列，c l u q u e c ta 1 ( 2 0 0 2 ) 成功地用i s s r 标记( c a ) ”构建了鳞翅目昆虫夜蛾科6 个种的基冈组指纹图 谱蚓。戴凌燕等( 2 0 0 4 ) 利用i s s r - p c r 方法分析了6 个棉铃虫地理种群间基因流动情况，产生的 多态性条带占9 0 6 i j ”。 1 4 科学问题的提出 由于松毛虫在森林害虫防治中占有重要地位，松毛虫形态学、生物学、及综合防治等相关 研究已较为深入。但是，目前尚未见到利用i s s r 分子标记研究松毛虫地理种群的种间、种内 变异及其与环境因素之间的相关性的报道。 本研究根据国内外研究现状并结合我国实际，采用i s s r 分子标记技术，从分子水平上探 讨沈阳、锦州、山东泰安、青岛、河北承德县、平泉县、围场县、张家口等地的9 个松毛虫地 理居群的种间及种内的遗传变异和遗传分化，并进行以下探讨： 1 ) 了解i s s r 技术的特点，影响因素及数据处理方法；筛选出适合松毛虫的i s s r 引物并 建立松毛虫的i s s r 反应体系。 2 ) 通过对不同区域松毛虫自然种群的遗传多样性、遗传分化以及基冈交流情况的分析，了 解这些松毛虫种群遗传结构的特点及不同种群之间的遗传分化程度。 3 ) 探讨不同区域的地理环境和生态条件与松毛虫种群的遗传多样性的关系，从分子水平上 初步找出一些影响松毛虫种群变动的生态因子。 通过研究进一步揭示松毛虫的遗传背景及各种群的遗传多样性和遗传分化与其环境因素的 关系，为松毛虫部分种群间遗传关系的研究提供了分子水平的实验证据；同时通过了解不同地 理种群间的基因交流程度，也为阐明松毛虫成灾的遗传适应机制奠定基础。 4 松毛虫地理种群遗传分化及其与生态因子的相关性研究 2 i 供试松毛虫种群 2 i i 油松毛虫种群 2 材料和方法 油松毛虫在华北及东北地区为一a 一代，以幼虫于针叶从、树皮裂缝以及土壤及石块下越 冬，寄主植物主要为油松，在分布边缘地区也取食赤松和马尾松，供试油松毛虫种群主要采白 辽宁沈阳的凌源、河北平泉，承德县。 2 i 2 赤松毛虫种群 赤松毛虫在分布区内为一a 一代，寄主植物为赤松、日本黑松和油松嘲，供试赤松毛虫种 群主要采自沈阳凌源、大连葫芦岛、山东泰安、山东青岛等地。 2 1 3 落叶松毛虫种群 落叶松毛虫在华北地区也为一a 一代，寄主植物为华北落叶松、油松【羽，主要采自河北承 德围场、张家口。 2 i 4 研究地区概况 三种松毛虫分布区互有重叠，表现为同一地区不同松毛虫的混同发生i s 。油松毛虫分别 于2 0 0 5 - 2 0 0 6 年8 月采自河北承德市承德县、承德市平泉县。沈阳凌源县：赤松毛虫于2 0 0 6 年 8 月采自山东泰安，山东青岛、辽宁沈阳、辽宁锦州四个地区；落叶松毛虫于2 0 0 6 年8 月采自 承德市围场县和张家口赤城县( 见表1 ) 。赤诚县、围场县、平泉县，承德县、凌源县、绥中 县地理位置相距较近且几乎全是内陆地区，只有绥中为沿海地区；赤松毛虫青岛群体采自青岛 市胶南市琅牙镇，三面环水( 见图i ) 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 衰l 用于i s s r 研究的松毛虫标本 t a b l e1 p i n ec a t e r p f f i n r a u m p l e tf o r t h ei s s ri t u d y 油松毛l 张德县种群 c y dp u n c t a t u st a b u l a e f o r m f s c h e n n n p o p u l a t i o n 油松毛虫乎泉县种群p y np u n c t a t u st a b u l a e f o r m i s p i n g q u a np o p u l a t i o n 油松毛虫沈阳种群 s y d p u n c t a t u st a b u l a e f o r m i s s h e n y a n gp o p u l a t i o n 赤松毛虫青岛种群q c a p u n c t a t u s s p e c t a b i l i s q i n g d a o p o p u l a t i o n 赤松毛虫( 奉安种群) t c d p u n c t a t u s s p e c t a b i l i j t a i a np o p u l a t i o n 赤松毛虫( 沈阳种群) s c d p u n c t a t u s s p e c t a b i l i s s h e n y a n g p o p o l a t i o n 赤松毛虫锦州种群 j c d p u n c t a t u s s p e c t a b i l i s j i n z h o up o p u l a t i o n 落叶松毛虫张家u 种群 z l d p u n c t a m s u p e r a n s z h a n g j i a k o up o p u l a t i o n 落叶松毛虫( 围场种群) w l n s u p e r a n s w e i c h a n gp o p u l a t i o n 河北承德县 c h e n g d e c o n n t y , h e b e i 河北平泉县 p i n g q u a n c o u n t y , h e b e i 辽宁凌源 l i n g y u m l l i a o n i n g 青岛胶南市 j i a o n a n ， q i f l g d a o s h a n d o n g 奉安徂徕山 c u l a i m o u n 红眦 t a i 辽宁凌源 l i n g y u a n , l i a o n i n g 锦州绥中 s u i z h o n g , j i n 吐o n l i a o n i n g 张家口赤城 县 c h i c h e n g , 抽西i a k o n h e b e i 承德崩场县 w e i c h a n g , c h e n g d e h e b e i e l l 8 0 2 l 9 2 0 n 3 5 鬯l e 1 1 8 口2 7 79 3 5 n 4 1 。1 5 e i l 9 。2 3 n 4 l 。“ e “9 。3 7 n 3 5 。3 0 e 1 1 7 。1 6 4 2 06 05 0 n 3 6 c 呻口 e l l 9 0 2 3 9 0 0 n 4 l 。i i e i l 9 0 5 l 3 8 0 9 t l5 5 n 4 0 0 2 7 7 e l l 5 。8 5 7 l o n 4 0 0 8 5 e 1 1 6 0 5 2 1 2 3 0 n 4 2 0 0 5 6 松毛虫地理种群遗传分化及其与生态因子的相关性研究 2 1 5 实验仪器 图l 取样地点在我国部分地区的分布图 f i 9 1 s a m p l i n gs i t e so f d e n d r o l i m u si np a r t i a la r e ao f c h i n a 仪器：水浴锅、离心机、电泳仪、p c r 仪。 t g l l 6 m 型台式高速离心机( 长沙易达科贸) h h - 4 数显恒温水浴锅( 国华电器有限公司) d y y - 8 b 型稳压稳流电泳仪( 北京六一厂) 电子天平( j a l 0 0 3 ，上海天平仪器厂) p c r 扩增仪( b i o m e t r a , w h a t m a n ) 精密p h 计( p h s 一3 c 型，杭州东星设备仪器厂) 7 5 2 紫外光栅分光光度计c l = 海精密科学仪器有限公司) 电泳仪( d y y - 3 型。北京六一仪器厂) d y y m 3 3 a 型琼脂糖水平电泳槽( 北京六一仪器厂) 紫外检测仪( w d 9 4 0 3 c 型，北京六一仪器厂) 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 6 实验试剂 普通化学试剂购自保定博爱欣生物试剂公司、保定海泰克生物试剂公司： i s s r 随机引物由北京赛百盛生物公司合成；d n a m a r k e r d l 3 ，0 0 0 由保定海泰克公司生产； t a qd n a 聚合酶、d n t pm i x t u r e ，l o a d i n gb u f f e r 、p c rb u f f e r 、为大连宝生物工程有限公司生产 其它试剂与药品有： i r i s 碱、浓h c l 、乙酸、c t a b 、b - 巯基乙醇、e d t a 、s d s 、蛋白酶k ， a g a r o s ei 琼脂糖、e b ( 溴化乙锭) 等购自上海生物工程公司：氯仿、异戊醇、t r i s 饱和酚、无 水乙醇、冰醋酸、n a c l 等化学试剂均为国产分析纯。 2 1 7 主要溶液的配置 2 1 7 1 s d s - 蛋白酶k 法的提取液配置 ( i ) s t e 缓冲液( 见表2 ) 袭2s t e 缓冲液的主要成分 t a b l e 2t h e m a i n c o m p o u n d s o f s t e i mt 墨h e l3 m l 0 5 me d r r a2 0 m l 5 m n a a1 0 m l 加三蒸水至此1 0 0 m l a ：i mt r i s - h c l c o h = 8 0 、 在8 0 m l 水中溶解1 2 1 l g t r i s 碱，加入浓h c l 4 2 m l 调p h 值到8 0 。( 应使溶液冷却至室 温后方可最后调定p h 值，加水定容到l m l ，分装后高压灭菌。) b ：0 5 me d t a ( p h = 8 0 1 称取乙二胺四乙酸二钠( e d t a n a 2 2 h 2 0 ) 1 8 6 1 9 ，加水8 0 m l ，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。 用n a o h 调解溶液的p h 值至8 o ( 约需2 9 n a o h 颗粒) 。然后定溶到1 0 0 m l ，分装后高压灭菌备 用。注意：e d t a 需加入n a o h 将溶液的p h 值校正到8 0 时才能完全溶解。 c ：5 m n a c i 在8 0 m l 水中溶解2 9 2 2 9n a c l ，加水定容到l m l ，分装后高压灭菌。 ( 2 ) 1 0 s d s ( 用同正的s d s ) 8 松毛虫地理种群遗传分化及其与生态因子的相关性研究 称取十二烷基硫酸钠( s d s ，电泳级纯) 1 0 9 ，加水9 0 m l ，加热至6 8 助溶，加几滴浓 h c i 调p h 至值7 2 ，加水定容至l i l l l 分装备用，无须高压灭菌。 ( 3 ) 蛋白酶k ( 2 0 i l l g ，m 1 ) 用水配成2 0 n i 咖i 酶液，一2 0 保存。此液用于提取d n a 时消化蛋白质，反应终浓度 多为5 0 - 1 0 0 u 洲。 ( 4 ) t e 保存液 l m 嘶s h c l 2 m l 0 5 me d i t a4 0 0 u l 定容至2 5 0 m l 。 ( 5 ) 5 0 x t a e ( 贮存液) t a e 在5 0 倍时最稳定 t m 2 4 2 9 冰乙酸5 7 1 m l e d t a ( 0 5 m o h ) 1 0 m l 混匀加水定容至1 0 0 m l 。 ( 6 ) m g c l 2 ( 5 0 m m ) m g a 2 6 h 2 01 0 1 6 9 ，加水定容至1 0 0 0 m l ，分装，高压灭菌后备用。 m g c l 2 极易潮解，应购小瓶( 1 0 0 9 ) ，启用后勿长期存放。 ( 7 ) 溴化乙锭( 1 0 0 m g ，m 1 ) 在1 0 0 m l 水中加入1 9 e b ，磁力搅拌数小时，使其完全溶解，用铝箔包裹容器或转移 至棕色瓶中，保存于室温。 待手套谨慎称取e b ( 分子量3 9 4 3 3 ) 约2 0 0 m g ，放入棕色瓶内，加水2 0 m l ，溶解 后储存于4 冰箱备用。使用时1 0 0 m l 琼脂糖凝胶中加5 u l1 0 m 咖l 的e b ，终浓度 为0 5 m 蒯。 ( 8 ) 溴酚蓝载样缓冲液( o 2 溴酚蓝，5 0 蔗糖) 称取溴酚蓝2 0 0 m g ，加水1 0 m l ，室温过夜，待溶解后再称蔗糖( 分析纯) 5 0 9 ，加水定容 至1 0 0 m l 。加l o m o l l n a o hl - 2 滴，调至蓝色，4 储存备用。 2 1 7 2c r a b 法提取液配制 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 裹3c t a b 提取液的主要成分 t a b l e 3t h e m a i nc o m 咖出o f c t a b 2 2 实验方法 2 2 1 松毛虫的采集处理 采集到9 个地区的松毛虫，分属于赤松毛虫( n p u n c t a t u s s p e c t a b i l i s ) 、油松毛虫( d t n t t m t a t u $ t a b u l a e f o r m i j ) 、落叶松毛虫( d s u p e r a n s ) 每个地理种群的松毛虫根据五点取样法采集蛹，于 实验室内按地区分装于大网内，待蛹羽化后备取1 4 头雌虫( 除沈刚凌源油松毛虫因发生量少、 羽化率低仅余7 头外) 按采集地分别放入无水乙醇中于4 度冰箱中保存。 2 2 2 松毛虫d n a 的提取及检测 2 2 2 1 用s d s - 蛋酶k 法啪3 9 】( 改进后) 提取松毛虫基因组d n a 预处理将无水乙醇浸泡的松毛虫先用t e ( p h 8 o ) 浸泡一段时间( 1 - 2 h ) ，以去除其 他化学物质对p c r 的影响；将松毛虫雌成虫个体取中后胸肌肉( 去掉表皮约为0 1 9 ) 置丁二 1 5 m l e p p e n d o f 管中，用眼科剪剪碎肌肉；加入7 0 0 i l l s t e 提取缓冲液 1 m t r i s - h c l ，0 5 m e d t a ， 5 m n a c l 混匀，再加入7 7 u l l 0 s d s 溶液和蛋白酶k ，指弹混匀后放入5 6 1 2 水浴锅中( 4 h ) ， 中途指弹混匀，并根据消化情况添加适量蛋白酶k 充分消化。 酚抽提3 0 0 0 f r a i n 离心，用租枪头( 剪去枪头尖部) 取上清，加入等体积饱和酚手摇混匀 半小时，1 1 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n 。可重复几次直到两相界面无白色蛋白质层为止。 酚氯仿抽提取上清液，假如等体积酚：氯仿( 1 ：1 ) 手摇混匀1 5 m i n ，l1 0 0 0 r m i n 离心 1 0 r a i n 。 氟仿异戊醇抽提取上清液，加入等体积氯仿异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提蛋白，11 0 0 0 r r a i n 离 1 0 松毛虫地理种群遗传分化及其与生态冈子的相关性研究 心1 0 r a i n 。 沉淀d n a 取上清液，2 倍的无水乙醇沉淀，l1 0 0 0 r m i n 离心5 m i n 。 洗涤d n a 弃上清液，7 0 n , 6 冷乙醇洗涤沉淀。 溶解d n a 弃上清液，3 t c 干燥过夜，加入1 0 0 p l t e 于4 c 溶解。 2 2 2 2 用c r a b 法提取松毛虫基因组d n a d n a ( c t a b 方法) 【柏j 。将s t e 、s d s 和蛋白酶k 提取液换成c t a b 提取液 其余均与s d s 蛋白酶k 法提取法相同。 2 2 2 3d n a 的纯化 首先，加入4 0 0 lc t a b 裂解液至总体积为5 0 0 t t l 轻摇混匀。然后加入等体积的氯仿缓慢 混匀，1 0 0 0 0 r m i n 离心1 0 r a i n ：取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇( 2 4 ：1 ) 缓慢混匀，1 0 0 0 0 r l m i n 离心1 0 m i n ；取上清液，2 倍的无水乙醇沉淀，1 1 0 0 0 r l m i n 离心5 m i n ；弃上清液，7 0 0 冷乙醇 洗涤沉淀；弃上清液，3 7 干燥过夜，加入1 0 0 j l t e 于4 溶解。 2 2 2 4d n a 样品纯度和浓度的检测 本实验采用两种方法评价模板d n a 提取质量。 紫外分光比色检测将提纯好的d n a 样品每份吸取5 p 1 稀释至3 m l ，分别标记。用重蒸水 作空白对照校零点，然后用紫外分光光度计测定o d 2 6 0 和0 1 3 2 8 0 值，按照1 个o d 值相当于 5 0n g - t t l 4 和稀释倍数来换算d n a 的浓度，用o d 2 6 0 o d 2 8 0 值表示d n a 样品的纯度。最后将 d n a 样液稀释调整至合适的浓度后用于扩增。紫外分光