（园林植物与观赏园艺专业论文）扇子花品种‘sunfan’和‘blue+ribbon’组织培养研究.pdf

l i i i iii ii i i ii1 1 11 1l y 1812 4 4 4 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 如需保密，解密时间 是否保密是 2 矿肜耸易月勿目 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：蒸托妨时间：砂护7 年 月7 - 日 学位论文使用授权书 本人完全了解“华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定”，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷 版和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发 表、传播学位论文的全部或部分内容。 注：保密学位论文在解密后适用于本授权书。 学雠文储鲐藤粕撕鲐膨辟反 签名日期：弘口7 年万月) - 日签名日期：娜p 年月纱日 1 1 4 其他方面的研究3 1 2 本研究的目的与意义4 2 试验材料和方法5 2 1 供试材料及来源5 2 2 方法5 2 2 1培养条件5 2 2 2 s u n f a n 组织培养研究5 2 2 3 b l u er i b b o n 组织培养研究8 2 2 4 观测指标1 1 2 2 5 数据分析1 1 3 结果与分析1 1 3 1 s u n f a n 组织培养1 1 3 1 1 无菌体系的建立1 1 3 1 2 初代培养1 2 3 1 3 继代增殖培养1 3 3 1 4 生根培养15 3 1 5 不定芽直接再生18 3 1 6 不定芽间接再生2 2 3 1 7 炼苗移栽2 8 3 2b l u er i b b o n 组织培养研究2 8 3 2 1 外植体的表面灭菌2 8 3 2 2 b l u er i b b o n 带芽茎段的初代培养2 9 3 2 3b l u er i b b o n 的增殖培养3 2 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 3 2 4 试管苗的生根培养3 3 3 2 5 b l u er i b b o n 无菌叶片直接再生不定芽3 4 3 2 6 不定芽间接再生3 7 3 2 7 移栽实验4 0 4 讨论4 1 4 1一次性成苗的可能性4 1 4 2玻璃化问题及对策4 1 4 3炼苗移栽一4 2 参考文献4 4 图版5 0 致谢5 3 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 音两芰 s c a e v o l aa e m u l a s u n f a n 和s c a e v o l aa l b i d a b l u er i b b o n 是2 个重要的扇子花栽 培品种。本文系统地研究了这2 个品种的组织培养技术。主要研究结果如下： ( 1 ) 两品种的外植体表面消毒均采用二次消毒法。先用7 5 酒精消毒3 0 s ，然后 根据不同的外植体选择适合的n a c l 0 消毒处理。4 种外植体的最佳n a c l 0 消毒处理 分别为：s u n f a n 叶片o 5 n a c l o 消毒1 5 m i n ；s u n f a n 茎段为i n a c i o 消毒2 0 m i n 。 b l u er i b b o n 叶片为用0 5 州a c l o 消毒2 0 m i n ；b l u er i b b o n 茎段1 n a c l 0 消毒 1 5 m i n 。 ( 2 ) s u n f a n 的初代和增殖培养最佳培养基配方为：m s + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂； 最适壮苗培养基配方为：m s + 3 0 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂；最佳生根培养基配方为： 1 2 m s + 3 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂。 ( 3 ) b l u er i b b o n 的初代培养最佳培养基配方为：m s + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 r d l 琼脂，或 m s + 0 5 m g lb a + 0 1 m g ln a a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂；最适增殖培养基配方为： m s + 0 2 m g lb a + 0 0 5 m g ln a a + 2 0 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂：最佳生根培养基配方为： i 2 m s + 1 0m g li b a + 0 0 5m g ln a a + 3 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂。 ( 4 ) 不定芽直接再生时，s u n f a n 无菌叶片和叶柄的最佳培养基配方为：m s + i 0 m g lb a + o 1 m ln a a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂，芽诱导率分别为9 0 o 和8 6 7 ； s u n f a n 无菌茎段的最佳培养基配方为：m s + 0 5 m g lb a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂，芽 诱导率1 0 0 ；b l u er i b b o n 无菌叶片最佳培养配方为：m s + 2 0 m g lb a + 0 1 m g l n a a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂，芽诱导率为8 3 3 。 ( 5 ) s u n f a n 无菌叶片和叶柄在m s + 0 5 m g lb a + 0 2 m g l2 , 4 一d + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂培养基中先暗培养2 0 d ，再放到光下培养，3 0 d 后出愈率达1 0 0 o ；愈伤组织 分化不定芽的最适培养基配方为：m s + 0 5 m g lb a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂。 ( 6 ) b l u er i b b o n 愈伤组织诱导的最佳组合为：以茎段为外植体，m s + 0 5 m g l b a 和0 2 m g l2 , 4 d ，先暗培养1 0 d ，然后光照培养2 0 d ；愈伤组织增殖的最佳培养 基配方为m s + i 0 m g lb a + o 1 m g ln a a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂；愈伤组织分化的最 佳培养基配方为：m s + 0 5 m g lb a + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂。 ( 7 ) 两个品种的组培苗炼苗移栽可选用河沙为栽培基质，移栽成活率分别可达到 9 3 3 和8 6 7 。 关键词：扇子花；s c a e v o l aa e m u l a s u n f a n ；s c a e v o l aa l b i d a b l u er i b b o n ；组 织培养；再生 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 a b s t r a c t s c a e v o l aa e m u l a s u n f a n a n ds c a e v o l aa l b i d a b l u er i b b o n a r ep e r e n n i a l e v e r g r e e nh e r b sa n dt w oo f t h ei m p o r t a n tc o m m e r c i a lv a r i e t i e so fa u s t r a l i a nf a nf l o w e r ad e e p - g o i n gr e s e a r c ho nt i s s u ec u l t u r et e c h n o l o g yo ft h e s et w ov a r i e t i e sw a sc a r r i e d o u ti nt h i sp a p e r m a j o rr e s u l t sw e r ea sf o l l o w i n g ： ( 1 ) t w o s t e ps u r f a c es t e r i l i z i n gw a sa p p l i e dt ol e a fa n ds t e me x p l a n t so f b o t h v a r i e t i e s ： a l le x p l a n t sw e r ef i r s tt r e a t e dw i t h7 5 a l c o h o lf o r3 0s e c o n d s ；a n dt h e nd i f f e r e n tk i n d so f e x p l a n t sw e r et r e a t e dw i t hs u i t a b l en a c l 0s o l u t i o nf o rs u i t a b l et i m e f o r s u n f a n ，i tw a s s u i t a b l et od i s i n f e c tl e a v e sw i t h0 5 n a c l 0f o r15m i na n dt od i s i n f e c ts t e ms e g m e n t s w i t h1 n a c l 0f o r2 0 r a i n ；f o r b l u er i b b o n i tw a ss u i t a b l et od i s i n f e c tl e a v e sw i t ho 5 n a c l 0f o r2 0m i na n dt od i s i n f e c ts t e ms e g m e n t sw i t h1 n a c l 0f o r15 m i n ( 2 ) f o r s u n f a n ，t h eo p t i m u mi n i t i a t i o na n dm u l t i p l i c a t i o nm e d i u mw a sm s + 2 0 9 l s u c r o s e + 8 9 la g a r ；t h em o s ts u i t a b l es h o o tg r o w t hm e d i u mw a sm s + 3 0 9 ls u c r o s e + 8 la g a r ；t h eb e s tr o o t i n gm e d i u mw a s1 2 m s + 30 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r ( 3 ) f o r b l u er i b b o n ，t h eo p t i m u m i n i t i a t i o nm e d i u mw a sm s + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 l a g a ro rm s + 0 5 m g lb a + o 1 m g ln a a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r ；t h em o s ts u i t a b l e m u l t i p l i c a f i o nm e d i u mi sm s + 0 2 m g lb a + 0 0 5 m g ln a a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r ； t h eb e s tr o o t i n gm e d i u mi s1 2 m s + i 0 m g li b a + 0 0 5 m g ln a a + 3 0 9 ls u c r o s e + 8 9 l a g a r ( 4 ) f o r s u n f a n a s e p t i cl e a v e sa n dp e t i o l e s ，d i r e c ta d v e n t i t i o u s s h o o t si n d u c t i o n p e r c e n t a g eo f9 0 o a n d8 6 7 r e s p e c t i v e l yc o u l db eo b t a i n e d w i t ht h eo p t i m u m m e d i u mm s + i 0 m g lb a + 0 1 m g ln a a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r ；w h i l e1 0 0 o f d i r e c ta d v e n t i t i o u ss h o o t si n d u c t i o nf r o ma s e p t i cs t e ms e g m e n t sc o u l db eo b t a i n e dw i t h t h eb e s tm e d i u mm s + 0 5 m g lb a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r t h eo p t i m u mm e d i u mf o r a s e p t i cl e a v e so f b l u er i b b o n w a sm s + 2 0 m g lb a + 0 1 m g ln a a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r t h ei n d u c t i o np e r c e n t a g er e a c h i n g8 3 3 ( 5 ) a10 0 c a l l u si n d u c t i o np e r c e n t a g ew a so b t a i n e da f t e r3 0 d s c u l t u r ew h e n a s e p t i cl e a v e sa n dp e t i o l e so f s u n f a n w e r ec u l t u r e di nt h em e d i u mo fm s + 0 5 m g l b a + 0 2 m g l2 , 4 - d + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a ri nd a r kf o rt h ef i r s t2 0 da n di nl i g h t a f t e r w a r d s t h eo p t i m u mm e d i u mf o ra d v e n t i t i o u s s h o o t si n d u c t i o nf r o mc a l l u sw a s m s + 0 5 m g lb a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r i i 华中农业人学2 0 0 9 届硕上学位论文 ( 6 ) g o o dc a l l u si n d u c t i o no f b l u er i b b o n c o u l db ea c h i e v e db yc u l t u r i n gs t e m s e g m e n t si nm sm e d i u mw i t h0 5 m g lb aa n d0 2 m g l2 , 4 - di nd a r kf o rt h ef i r s t10 d ， a n di n l i g h ta f t e r w a r d s f o r2 0 d t h eo p t i m u mm e d i u mf o rc a l l u ss u b c u l t u r ew a s m s + i 0 m g lb a + 0 1m g ln a a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r t h eo p t i m u mm e d i u mf o r s h o o t si n d u c t i o nf r o mc a l l u sw a s m s + 0 5 m g lb a + 2 0 9 ls u c r o s e + 8 9 la g a r ( 7 ) w h e nt r a n s p l a n t i n g ，f i v e rs a n d sw e r eu s e da sm e d i u m ，a n dt h es u r v i v a lr a t eo f s u n f a n a n d b l u er i b b o n r e a c h e d9 3 3 a n d8 6 7 i nr e s p e c t i v e k e yw o r d s ：f a nf l o w e r ；s c a e v o l aa e m u l a s u n f a n ；s c a e v o l aa l b i d a b l u er i b b o n ； t i s s u ec u l t u r e ；r e g e n e r a t i o n i i i 2 f # 中农业大学2 0 0 9 届硕 ：学位论文 1 前言 澳大利亚扇子花，属于草海桐科( g o o d e n i a c e a e ) 草海桐属( s c a e v o l a ) ，以它扇子形 状的花瓣而广为知晓，草本、亚灌木或灌木。叶互生而螺旋状排列，罕对生；花常 为5 数，很少多过或少于此数，花的外形一般呈半圆，形同扇子，单生于叶腋内或 排成短的聚伞花序，一般为紫色，有的呈白色，花期较长一般约9 个月，有苞片和 小苞片；萼管与子房贴生，萼裂片极短，有时缺；花冠偏斜，一边分裂至基部，裂 片5 ；花药分离；子房1 2 室，下位或半下位，每室有胚珠1 2 颗；果为一核果；种 子1 颗或和子房室同数。 草海桐属植物，约1 0 0 种，广布于澳大利亚、波利尼西亚和其他海岸，其中7 0 的种是澳大利亚本土植物，6 9 仅存于澳大利亚西部。种子很难萌发( w r i g l e ya n d f a g g ，1 9 8 8 ) ，一般扦插繁殖。我国仅有& s e r i c e av a h l 和sh a i n a n e n s i sh a n c e2 种， 产于台湾、福建、广东、广西。大部分种喜水，喜强光，耐干旱，适应性强。 草海桐属植物是花期很长的多花植物。& a e m u l a 在欧洲和美国市场成功上市 ( s t e f f e n ，1 9 8 9 ) ，作为一种栽植于阳台、盆栽和花床的植物( g u e b e r , 1 9 8 9 ；s t e f f e n ，1 9 8 9 ； v o nh e n t i ga n de h l e r , 19 91 ；v o nh e n t i g ，19 9 3 ) 。欧美市场上比较受欢迎的有a l b i d a m a u v ec l u s t e r s ，ss t r i a t a p i n kp e r f e c t i o n 或m i s t yb l u e 和& p h l e b o p e t a l a 。这些物 种在澳大利亚被用作地被植物和吊篮，在欧洲和美国主要应用于花床。 草海桐属植物用途广泛，在园林应用中，室外可用来做花境、花坛材料，室内主 要应用于吊篮、瓶插和盆栽观赏等；同时还可应用在医学中，据报道可治疗皮肤疾 病，可提取香精用来治疗食管、泌尿和胃等方面的疾病，植物燃烧的烟雾可用来治 疗伤寒。 1 1 国内外对草海桐属植物研究进展 目前国内尚无对澳大利亚扇子花的研究报道，国外有多个方面的研究报道。 1 1 1品种和杂交种的研究 近年来，引进大量的品种和杂交种进行栽培已逐渐成为一种趋势。北半球地区 对sa e m u l a 尤为喜爱，sa e m u l a 及其变种一般栽植于容器和吊篮中观赏。曾尝试各 种育种手段但是没有多大成效。一般用于引种栽培的植株都是对变种进行脱毒后选 育出来的，如通过组织培养和其他方法减少或根除对植物生长发育有害的病毒。 近来大量的sa e m u l a 品种已经上市，如p u r p l ef a n f a r e 、p u r p l ef a n 、b l u e 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 f a n d a n g o 、b l u ew o n d e r 、n e wb l u ew o n d e r 、b r i l l i a n t 、f a nf a l l s 和f a n d a n c e r 等。通常在外部形态上只有很小的差别，花色没有多大的变化。 a l b i d a 是目前发现最有生命力的种，幼苗在温室等栽培地区一般能发芽。一些 幼苗用来选育新品种进行商品化生产。第一个品种的记载是s m a u v ec l u s t e r s ，它 流行于1 9 6 0 s 1 9 8 0 s ，以后的大多数品种与& m a u v ec l u s t e r s 是来自同一个母系。其 他品种包括k u a n gp i n k ( 也称为m i n ip i n kf a n ) 、p e t i r e 、p e t i t ec a s c a d e 和j a c o b s w h i t e 在一定范围内已经成功推广。 杂交品种s u n d a n c e r 和l i g h tf a n t a s t i c 与a l b i d a 有较密切的杂交关系。& s t r i a t a 的变种在栽培上也很受欢迎，它与m i s t yb l u e 、m i s t yp i n k 、p i n kp e r f e c t i o n 等都是其中最广泛栽培的变种。 1 1 2 栽培方面的研究 目前只有少量种类被广泛栽培。作为观赏园艺和专类园的潜力还有待挖掘。& c a l e n d u l a c e a ( 后被称为& s u a r e o l e n s ) 是1 7 9 3 最先进行栽培的种，然后& c r a s s i f o l i a 和& c u n e i f o 册括( 1 8 2 4 ) 也接踵而来，但是直到1 8 4 0 s 早期远亲种( f u r t h e r ) 才开始 出现，& c a l l i p t e r a 、& p l a t y p h y l l a 、& n i 巧d a 也随之逐渐开始栽培。 1 1 3 繁殖方面的研究 1 1 3 1 扦插繁殖 最常用的繁殖方法是扦插繁殖，但是对于某些种组培也逐渐成为一种非常重要 的手段。扦插繁殖对于大多数种是一种理想的方法。扦插繁殖的关键是利用幼嫩的 营养枝进行扦插。适合扦插的种如：& a e m u l a 、& a u r i c u l a t a 、& c r a s s i f o l i a 、& l a n c e o l a t a 、& p h l e o p h y l l a 。对植株进行修剪能刺激腋芽的营养生长，长出的枝条则 适合做扦插材料。适当幼嫩、稍木质化且有腋芽的茎段适合做扦插材料。扦插材料 太嫩则植株容易萎蔫。一般栽培品种扦插不需要生根剂，但是3 0 0 0 p p m 的i b a 常常 有助于形成健壮的根系。 1 1 3 2 有性繁殖 种子繁殖常常不理想，对于传统的催芽方法只有少量的成功报道。有研究表明 烟熏对于提高某些种如& c a l i p t e r a 的发芽是很有用的。种子需经过1 - 6 个月后才能 发芽，所以一般幼苗长到一定程度再将栽培容器去掉。研究表明对于c a l e n d u l a c e a ， 种子在晚秋至初冬播种最适宜；& s p i n e s c e n s 的种子用热水浸泡一个小时左右，发芽 2 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 率会有所提高。 1 1 3 3 组织培养 b h a l l ap l 和s w e e n e yk ( 1 9 9 8 ) 通过组织培养对澳大利亚草海桐属的4 个栽培种和 3 个野生种进行了快繁研究，结果表明，四周后，5 个外植体至少能长出2 5 个苗， 并且通过组织培养获得的植株被移栽到温室具有很高的存活率( 9 5 ) ，表明组培对 草海桐属植物的快繁是可行的。 b h a l l ap l 和s w e e n e yk ( 1 9 9 9 ) 以叶片、茎段、节和根为外植体，对& a e m u l ar b r 的直接离体再生进行了研究，从叶片、节、茎段上能获得从生芽，离体生长的植株 很容易就能适应温室条件，因此可以在短时间内产生大量植株，可用于协助常规育 种和转基因研究。 w a n g y h 和b h a l l ap l ( 2 0 0 4 ) 以& a e m u l ar b r 的叶片为外植体，成功诱导出体细 胞胚，这为研究体细胞胚胎的形成提供了一个研究体系，并且植株通过球状胚胎再 生也为对草海桐属遗传工程的研究具有很大的价值。 w a n g y - h 和b h a l l ap l ( 2 0 0 6 ) 从sa e m u l a 的叶片和根获得的愈伤组织进行细胞悬 浮培养来研究植株的再生，获得芽的再生频率为1 9 2 ，其中1 3 9 是从对叶片和 根获得的愈伤组织进行细胞；悬浮培养产生的微愈伤组织形成的。因此，细胞悬浮培 养为草海桐属的育种工程以及进一步研究方面提供了一种再生体系。 1 1 4 其他方面的研究 自从1 9 8 9 年把这些植物引进园艺市场，主要的研究领域是光强的效应和持续时 间、温度、营养和土壤类型( f i s c h e r , 1 9 9 0 ，1 9 9 1 ；g e r l a c h1 9 9 0 ；s c h u m a n n ，1 9 9 1 ；v o n h e n t i ga n d e h l e r1 9 9 2 ；v o nh e n t i g ，1 9 9 3 ) 。v o nh e n t i ga n de h l e r ( 1 9 9 1 ) 在一些细节上研 究了a e m u l a 的扦插繁殖。他们的研究表明处于营养生长阶段的插条利于扦插繁 殖。通过对不同部位用的生根情况建议对插条进行预处理方法是短同照处理 ( 8 1 0 h ) ，为期3 4 个月。 & a e m u l a 在澳大利亚作为吊篮和花坛植物被广泛栽培( s w o b o d aa n db h a l l a ，1 9 9 7 ； z h a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 。在澳大利亚北部地区，冬季弱光条件下，sa e m u l a 的扦插繁殖 受到抑制( d o n n e l l y , 2 0 0 2 ) ；c 0 2 的富集可导致& a e m u l a 植株气孔导度下降，从而 提高了植株的含水量( b u n c e ，2 0 0 4 ) 。有研究指出，sa e m u l a 在温室中进行生产时可 利用气体交换模型来调控室内环境，使sa e m u l a 更好的生长。 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 1 2 本研究的目的与意义 & a e m u l a s u n f a n 和a l b i d a b l u er i b b o n 属草海桐科( g o o d e n i a c e a e ) ，草海桐 属( s c a e v o l a ) ，原产于澳大利亚，为多年生草本花卉，喜水，喜强光，耐干旱，适应 性强。在园林中，是良好的地被植物材料，室内主要应用于吊篮、翁栽观赏等。花 色蓝紫色，花期长，从三月一直持续开放到十一月，虽然花比较小，但是群体观赏 效果极好，可成片大量种植，营造良好的景观。扇子花的引入丰富了我国的植物种 质资源。 但该科植物种子繁殖困难，种源短缺，无法满足市场需要，组织培养技术则为 大量繁殖提供了一条有效途径，利用组织培养技术进行快速批量繁殖，可向市场提 供优质种苗。 目前国内对于草海桐属的组织培养研究还是一片空白。本次试验中选取的试验 材料，适应性强，花期长，可用来作地被植物或者吊篮。在国内将会有很好的发展 前景。 本研究探索这2 个品种的组织培养技术，建立一套经济高效的快繁体系，使在 短期内获得大量遗传性状一致的苗木成为可能，同时也为进一步遗传育种等研究奠 定基础。 4 培养室条件：温度2 5 2 ，光照时间暗时间= 1 4 h 1 0 h ，光照强度为1 4 0 0 l x 。 2 2 2s u n f a n 组织培养研究 2 2 2 1 材料的清洗、消毒 选用带芽茎段和叶片为外植体，用清水洗去表面的灰尘，用自来水冲洗1 2 h ， 放入超净台中，用7 5 的酒精消毒3 0 s ，然后加入不同浓度的n a c l 0 溶液浸泡，每 隔几分钟摇动一次，最后倒 h 消毒液，用无菌水冲洗3 4 遍，接种在m s 培养基中， 7 d 后统计污染率。消毒实验设计见表2 1 。 表2 - 1 外植体的消毒实验设计 t a b l e2 1e x p e r i m e n t a ld e s i g no fe x p l a n t ss t e r i l i z i n g 5 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 2 2 2 2 初代培养 茎段消毒方法采用表2 1 中5 号处理，消毒后把带芽茎段切成长约l e n a 左右分 别接中到不同b a 浓度( 0 、0 5 、1 0 、2 0 、3 0 m g lb a ) 的培养基中，每瓶接3 个外 植体，每处理1 0 瓶。2 0 d 后统计实验结果。 2 2 2 3 继代增殖培养 ( 1 ) b a 浓度对试管苗增殖的影响 本实验的目的是为了获得大量的无菌材料。增殖培养所用的材料主要为茎段诱 导出的无菌苗，采用单因素设计，比较b a ( 0 、0 2 、o 5 、1 0 、2 0 m g l ) 五种浓度对 茎芽增殖的影响。每瓶接种3 株，每处理1 0 瓶，重复3 次，2 0 d 后统计苗高，观察无菌 苗的长势情况。 ( 2 ) 蔗糖浓度对试管苗壮苗的影响 采用单因素设计，比较蔗糖的三种浓度( 2 0 、3 0 、4 0 9 l ) 对试管苗壮苗的影响。 每瓶接种3 株，每处理1 0 瓶，重复3 次，2 0 d 后统计苗高，观察无菌苗的长势情况。 2 2 2 4 生根培养 ( 1 ) 大量元素对其生根的影响 采用单因素试验设计，比较大量元素( m s 、1 2 m s 、1 4 m s ) 三种浓度对其生根的 影响，每瓶接种3 株，每处理1 0 瓶，重复3 次，2 0 d 后统计其生根情况。 ( 2 ) 蔗糖浓度对其生根的影响 采用单因素试验设计，比较蔗糖( 2 0 、3 0 、4 0 9 l ) 三种浓度对其生根的影响，每 瓶接种3 株，每处理1 0 瓶，重复3 次，2 0 d 后统计其生根情况，基本培养基为1 2 m s 。 ( 3 ) 生长素对其生根的影响 采用单因素试验设计，比较不同的生长素浓度对其生根的影响，每瓶接种3 株， 每处理1 0 瓶，重复3 次，2 0 d 后统计其生根情况。基本培养基为1 2 m s 。实验的因 素水平见表2 2 。 表2 2 s u n f a n ，生根实验的因素和水平表 t a b l e2 - 2f a c t o r sa n dl e v e l so fr o o ti n d u c t i o nf r o m s u n f a n 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕二e 学位论文 2 2 2 5 不定芽直接再生 ( 1 ) 无菌叶片和叶柄直接诱导不定芽 本实验主要研究不同激素浓度对不定芽再生的影响，细胞分裂素选用b a 三种浓 度( 1 0 、1 5 、2 0 m e l ) ，生长素选用n a a z 种浓度( o 、o 0 5 、o 1 m g l ) ，实验采用两 因素三水平完全随机试验设计，共9 个处理。比较b a 、n a a 不同浓度对不定芽再生 的影响。 取无菌苗中上部叶片，切取中上部叶柄，垂直叶脉横切2 刀，叶背面朝下放入培 养基中，每处理3 6 个外植体，重复3 次。培养3 0 d 后统计分化率。 ( 2 ) 茎段直接再生不定芽 选取无菌苗中上部的茎段，分别接种到不同浓度b a ( 0 、0 5 、1 0 、2 0 m g l ) 的 m s 培养基上，每处理3 6 个外植体，重复3 次。培养3 0 d 后统计分化率。 2 2 2 6 不定芽间接再生 ( 1 ) 叶片放置方式对愈伤诱导的影响 把无菌叶片横切两刀分别叶背朝上和叶背朝下接种到m s + 0 5 m g lb a + 0 1 m g l 2 , 4 - d + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 l 琼脂的培养基上，暗培养2 0 d 后置于光下培养，每处理接种 4 8 个外植体，3 0 d 后统计出愈率及愈伤生长状况。 ( 2 ) 暗培养时间对愈伤组织诱导的影响 把无菌叶片横切两刀、叶面朝上接种到m s + 0 5 m g lb a + 0 1 m g l2 , 4 d + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂的培养基上，暗培养不同时问后( 0 d ，5 d ，1 0 d ，1 5 d ，2 0 d ，2 5 d ) 置于 光照条件下继续培养。每处理处理3 9 个外植体，3 0 d 后统计出愈率及愈伤生长状况。 ( 3 ) b a 和2 ，4 一d 不同浓度组合对无菌叶片和叶柄愈伤组织诱导的影响 采用两因素四水平( 见表2 3 ) 完全随机试验设计，比较b a 和2 ，4 d 不同浓度 对无菌叶片和叶柄愈伤组织诱导的影响。 表2 3 s u n f a n 愈伤组织诱导的因素和水平表 t a b l e2 3f a c t o r sa n dl e v e l so fc a l l u si n d u c t i o no f s u n f a n 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 ( 4 ) b a 对愈伤组织分化不定芽的影响 采用单因素四水平来研究b a 不同浓度( o ，0 5 ，1 0 ，2 0 m g l ) 对愈伤分化不定 芽的影响，将s u n f a n 无菌叶片在m s + 0 5 m g lb a + 0 2 m g l2 ，4 - d + 2 0 9 l 蔗糖+ 8 9 l 琼脂的培养基上诱导出的愈伤组织接种到含有不同b a 浓度的分化培养基上。3 0 d 后统计实验结果。 2 2 2 7 炼苗移栽 为保证移栽成活率，先将生根后的试管苗的瓶口松开，在培养室散射光条件下 炼苗，使试管苗逐渐与外界接触，提高适应能力，1 5 d 后轻轻从培养基中取出试管 苗，用自来水清洗掉根部的培养基，在温室( 春季4 月份) 条件下栽入含有不同基 质的营养杯中：河沙林下土：蛭石：珍珠岩= 2 ：1 ：1 ，栽植后1 5 d 内搭塑料拱 棚保温保湿，盖遮阳网，四周留通风口，每2 天浇水1 次，之后揭去薄膜，揭开遮 阳网，每1 2 d 浇水1 次。3 0 d 后统计成活率。 2 2 3b l u er i b b o n 组织培养研究 2 2 3 1 外植体的表面灭菌 五月份采集b l u er i b b o n 的叶片和带腋芽茎段，用清水洗去表面灰尘，分别在流 水下冲洗1 2 h 。然后在超净工作台上采用二次消毒法，先用7 5 的酒精消毒3 0 s ， 而后放入不同浓度的n a c l 0 溶液浸泡，期间每隔几分钟摇动一次，最后倒掉消毒液， 用无菌水冲洗3 4 遍，接种到m s 培养基上。一周后统计污染率和死亡率。消毒实 验设计见表2 4 。 表2 - 4 不同外植体的消毒实验设计 t a b l e2 - 4e x p e r i m e n t a ld e s i g no fe x p l a n t ss t e r i l i z i n g 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 2 2 3 2 初代培养 分别考虑b a 不同浓度( o 、o 5 、1 0 、2 0 、3 0 m g l ) 单因素和b a ( 0 5 、1 0 、2 0 r a g l ) 和n a a ( 0 0 5 、o 1 m g l ) 不同浓度组合对其启动培养的影响。2 0 d 后统计实验结果。 2 2 3 3 增殖培养 采用双因素完全随机实验设计，共8 个处理。将初代培养得到的分化芽接种到 增殖培养基上，比较b a ( 0 2 、0 5 、1 0 、2 0 m g l ) 平f ln a a ( 0 0 5 、o 1 m g l ) 碱度 组合对茎芽增殖的影响。每瓶接种3 株，每处理1 0 瓶，重复3 次，3 0 d 后统计不定 芽数，苗高，观察无菌苗的长势情况。 2 2 3 4 生根培养 采用大量元素( m s 、1 2 m s 、1 4 m s ) 、蔗糖( 2 0 、3 0 、4 0 9 l ) 、i b a ( 0 1 、o 5 、1 0 m g l ) 和n a a ( 0 0 5 、o 1 、0 5 m g l ) p 马因素三水平的正交试验设计l 9 ( 3 4 ) ( 见表2 - 5 ) 配n 培养 基，将增殖得到的芽切成1 o c m 左右的茎段接种到生根培养基上。2 0 d 后统计生根 情况。 表2 5t b l u er i b b o n ，生根培养的正交试验设计表 t a b l e2 - 5o r t h o g o n a ld e s i g no fr o o ti n d u c t i o nf r o m b l u er i b b o n 2 2 3 5 叶片直接再生不定芽 取无菌苗中上部叶片，垂直叶脉横切2 刀，叶背面朝下放入培养基中，采用两 因素完全随机试验设计，共9 个处理，比较b a ( 1 0 、2 0 、3 0 m g l ) $ 1 n a a ( 0 1 、o 2 、 9 扇子花品种s u n f a n 和b l u er i b b o n 组织培养研究 0 5 r a g l ) 不同浓度对不定芽再生的影响。每处理3 6 个外植体，重复3 次，分别统计 培养3 0 d 和4 0 d 后的分化情况。 2 2 3 6 不定芽间接再生 ( 1 ) 愈伤组织诱导 采用外植体( 叶片、叶柄、茎s t ) 、b a ( 0 5 、1 0 、2 0 m g l ) 、2 , 4 d ( 0 2 、0 5 、1 0 r a g l ) 和暗培养时间( 1 0 、2 0 、3 0 d ) l 四因素三水平的正交试验设计l 9 ( 3 4 ) ( 见