（外科学专业论文）pten、livin基因表达与食管鳞癌化疗药物敏感性的相关性研究.pdf

渊黜 p t e n 、l i v i n 基因表达与食管鳞癌化疗药物敏感性的 相关性研究 研究生：郑剑 专业：外科学 导师：高松教授 中文摘要 中又于两安 目的 食管鳞癌是消化系统最常见恶性肿瘤之一，其治疗主要以手术切除为主 并辅以术后化疗。但由于不同个体肿瘤细胞对化疗药物的敏感性不同及临床 的经验用药等原因使化疗效果并不尽如人意。本实验着重研究原代培养食管 鳞癌细胞对化疗药物的敏感性，并迸一步探讨其敏感性与食管鳞癌组织中 p t e n ( p h o s p h a t a s ea n dt e n s i nh o m o l o gd e l e t e do nc h r o m o s o m et e n ) 及l i v i n 基 因表达的关系，为食管鳞癌的临床化疗提供个体化用药的实验资料和依据。 方法 取手术切除的新鲜食管鳞癌组织标本，在无菌条件下去除结缔、脂肪及 坏死组织，取大小约1 5 r a m 3 组织块经研磨，过滤制备成活细胞浓度为( 2 3 ) 1 0 5 m t 的单细胞悬液，分别加入1 0 倍血浆峰值药物浓度( p p c ) 的羟基喜 树碱( h c p t ) 、顺铂( d d p ) 、阿霉素( a d m ) 、5 一氟尿嘧啶( 5 一f u ) 、丝 裂霉素( m m c ) 用m t t 法检测经上述药物作用后肿瘤细胞活力及代谢活性 的变化；同时取食管鳞癌组织制成石蜡切片，用免疫组化检测p t e n 、l i v i n 蛋白的表达。 结果 8 4 例食管鳞癌标本经m t t 比色法药敏实验成功者8 1 例。经化疗药物作 用后，体外培养的食管鳞癌原代培养细胞呈现不同程度形态和代谢活动的变 化。m t t 结果显示，不同个体的食管鳞癌细胞对化疗药物的敏感性不同，其 中h c p t 、m m c 及5 f u 之间敏感性差异无统计学意义，p 值均大于0 0 5 ； 但h c p t 、m m c 及5 一f u 与a d m 及c d d p 之间敏感性差异具有统计学意义 ( p 0 0 5 ) ，前者明显高于后者：a d m 敏感性明显低于c d d p ，组间差异具 有统计学意义( p 0 0 1 ) ；在食管鳞癌组织及正常食管鳞癌粘膜中p t e n 蛋白 表达阳性率分别为4 7 5 、1 0 0 ，两者差异具有有统计学意义( p 0 0 1 ) ； p t e n 蛋白阳性表达与食管鳞癌的分化程度及有无淋巴结转移组问差异具有 有统计学意义( p o 0 5 ) ；在8 1 例食管鳞 癌组织中和2 0 例正常食管鳞癌粘膜中l i v i n 的阳性表达率分别为5 6 81 ( 7 0 ) 和0 2 0 ，两者比较差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。l i v i n 的表达与 食管鳞癌的分化程度及有无淋巴结转移组间差异具有有统计学意义 ( p o 0 5 ) ；l i v i n 阳性表达与5 一f u 及 a d m 耐药有关( p 0 0 5 ) ；l i v i n 阳性表达与p t e n 蛋白阳性表达呈负相关关 系( r 。= 一0 6 7 8 ，p 0 0 5 ) 。 结论 1 、m t t 药敏实验能有效的筛选化疗药物并能发现耐药病例，对临床化 疗有较强的预见性和指导性； 2 、p t e n 的下调表达及l i v i n 的上调表达能促进食管鳞癌的淋巴结转移 及降低分化程度； 3 、食管鳞癌组织中p t e n 的表达与l i v i n 的表达呈负相关关系，提示两 者在食管鳞癌的发展中可能具有协同作用，两基因除各自直接作用外还可通 过负性调节对方基因的表达而间接发挥功能。 4 、食管鳞癌组织中l i v i n 阳性表达者与5 一f u 及a d m 耐药有关，提示 l i v i n 可作为食管鳞癌原发性耐药标志之一。 关键词食管鳞癌化疗药物敏感性免疫组织化学m t t 比色法 p t e n l ，i v i n 2 s t u d i e so nt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e np t e n 、 l i v i ne x p r e s s i o na n dc h e m o s e n s i t i v i t yo f e s o p h a g e a lc a r c i n o m a p o s t g r a d u a t e -z h e n gj i a n s p e c i a l t y ：t h o r a c i cs u r g e r y t u t o r ： p r o f g a os o n g a bs t r a c t o b j e c t i v e i nd i g e s t i v es y s t e r m ，e s o p h g e a ls q u a m o u sc e l lc a n c e ri so n eo ft h em o s t c o m m o nm a l i g m a n tt u m o u r ，w h i c hw a st r e a t e dm a i n l yb yo p e r a t i o n ，c o m p a n i e d b yc h e m o t h e r a p y b u tc h e m o t h e r a p yd o e s n o t p r o d u c ed e s i r e d e f f e c t st h a t c o n t r i b u t et ot h ed i f f e r r e n tc h e m o s e n s i t i v i t yo fi n d i v i d u a lp a t i e n t sa n dc l i n i c a l e m p i r i c a la p p l i c a t i o nf o rp a t i e n t s t h e r e f o r e ，w ec o n d u c t e dt h ep r e s e n ts t u d yt o e v a l u a t et h ec h e m o s e n s i t i v i t yo fp r i m a r yc u l t u r i n ge s o p h a g e a lt u m o rc e l l sb y u s i n gm t t a n dt h ep r o t e i ne x p r e s s i o n so fp t e na n dl i v i ni ne s o p h a g e a lc a n c e r t i s s u e s ，a n dt oe x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e np t e no rl i v i ne x p r e s s i o na n d c h e m o s e n s i t i v i t yo fe s o p h a g e a l c a n c e r w ea ls od e t e r m i n e dw h e t h e rt h e s e r e s u l t sc a nb eu s e dt oh e l pt h e r a p yt h ee s o p h a g e a lc a r c i n o m a m e t h o d s i na l l ，81 e s o p h g e a ls q u a m o u sc e l lc a n c e rf r e s hs p e c i m e n sf r o ms u r g i c a l l y r e s e c t e dt s s s u e sw e r eo b t a i n e d a n dt h e nt i s s u e sw e r ee x c i s e df r o ms e r o s as i d e a n dt h er i mo ft u m o rw i t h o u tn e c r o s i sa n dd e g e n e r a t i o n as i n g l e - c e l l s u s p e n s i o no ft u m o rc e l l s ( 2 x10 5t o3x10 5 c e l l sm l 。1 ) w e r es e p a r a t e l ye x p o s e dt o h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ( h c p t ) ，c i s p l a t i n ( c d d p ) ， 5 一f l u o r o u r a c i l ( 5 一f u ) ， a d r i a m y c i n ( a d m ) ，m i t o m y c i n ( m m c ) a tt e nt i m e sp e a kp l a s mc o n c e n t r a n t i o n ( p p c ) i n h i b i t o r yr a t eo fc e l l sw a sd e t e c t e db ym t ta s s a y e x p r e s s i o no fp t e n a n dl i v i ni ne s o p h a g e a lc a n c e rt i s s u e sw e r ed e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( i h c ) r e s u l t s t h ec h e m o s e n s i t i v i t yo f81 8 4c a s e sw e r et e s t e du s i n gm t ta s s a yi n e s o p h g e a ls q u a m o u sc e l lc a n c e r t h em o r p h o l o g i cc h a n g e sa n dd e c r e a s e o f m e t a b o l i ca c t i v i t yo fe s o p h a g e a lc a n c e rc e l l sw e r eo b s e r v e da f t e re x p o s u r et o a n t i t u m o rd r u g s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es e n s i t i v i t yo fm m c ，5 一f ua n d 3 h c p tw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nc d d pa n da d m ( p o 0 5 ) ；i nt h el a t e r ， t h es e n s i t i v i t yo fc d d pw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a na d m ( p 0 01 ) ；t h e p o s i t i v ee x p r e s s i o no fp t e nw a s3 8 8 1 ( 4 7 5 ) i nn o r m a lc a r d i at i s s u e sa n d 2 0 2 0 ( 10 0 ) i ne s o p h a g e a lc a r c i n o m at i s s u e s ( p 0 01 ) e x p r e s s i o no fp t e n p r o t e i nw a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yr e l a t e dt ot h a to fl i v i n ( r s = 一o 6 7 8 ，p 0 01 ) as i g n i f i c a n t l yl o w e rt u m o rp t e np r o t e i ne x p r e s s i o nw a sa s s o c i a t e dw i t ht h e d e g r e e o fd i f f e r e n t i a t i o na n dl y m p hn o d em e t a s t a s i so fe s o p h a g e a lc a n c e r ( p 0 0 5 ) n o n eo ft h e n o r m a lt i s s u e ss t a i n e dp o s i t i v ef o rl i v i n ，w h e r e s5 6o f81 ( 7 0 ) e s o p h a g e a l c a r c i n o m ae x h i b i t p o s i t i v ei m m u n o s t a i n i n gf o rl i v i n ( p 0 0 5 ) c o n c l u s i o n i c h e m o s e n s i t i v e t yt e s t i n go ff r e s hh u m a ne s o p h a g e a lc a n c e ru s i n gm t t a s s a yc o u l dc o n s t i t u t et h ep r e d i c t i o no na p p l y i n gc h e m o d r u g sa n di d e n t i f y d r u g r e s i s t i n gc a s e s 2 o v e re x p r e s s i o n so fp t e np r o t e i na n dl o we x p r e s s i o n so fl i v i np r o t e i n c o u l db eh e l pt ot h ed e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o na n dl y m p hn o d em e t a s t a s i so f e s o p h a g e a lc a n c e r ； 3 e x p r e s s i o no fp t e np r o t e i nw a ss i g n i f i c a n t l yn e g a t i v e l yr e l a t e dt ot h a t o fl i v i n ，t h i sr e s u l ta p p r o v et h a tp t e nm a k et h ef u n c t i o no fr e s t r a i n i n g c a n c e r i z a t i o nb yr e g u l a t i n gn a g e t i v e l yt h ee x p r e s s i o no fl i v i nb e s i d e sb yi t s o w na c t i o n 4 t h el i v i n p o s i t i v ec e l l s s h o w e dr e s i s t a n c et o5 - f ua n da d m o u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t l i v i n p o s i t i v ee x p r e s s i o nm a y c o n t r i b u t et o p r i m a r y d r u g r e s i s t a n c eo ft u m o r k e y w o r d se s o p h a g e a lc a r c i n o m a ；c h e m s e n s i t i v i t y ；i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ； m t tc o l o r i m e t r i ca s s a y ；p t e nl i v i n 4 英文缩写英文全称 p b s d a b h e i h c p c r d e p c e c d m d c 符号说明 p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e d i a m i n o b e n z i d i n h a e m a t o x y l i ne o s i n i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n d i e t h y l p r o c a r b o n a t e e s o p h a g e a lc a r c i n o m a d i m e t h y l d i c h o r s i l a n e e s c c e s o p h a g e a ls q u a m o u sc e l lc a n c e r p t e n m t t m r n a o d p p c h c p t c d d p 5 一f u a d m m m c 中文全称 磷酸盐缓冲液 二氨基联苯胺 苏木素一伊红 免疫组织化学 聚合酶链式反应 二乙基焦碳酸酯 食管癌 二甲二氯硅浣 食管鳞癌 p h o s p h a t a s e a n dt e n s i n h o m o l o g 血管内皮生长因子 d e l e t e do nc h r o m o s o m et e n基因 3 一( 4 ，5 一d i m e t h y l t h i a z o l - 2 一y 1 ) 一2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e m e s s e n g e rr i b o n u c l e i c a c i d o p t i c a ld e n s i t y p e a kp l a s mc o n c e n t r a t i o n h y d r o x y c a m p t o t h e c i n c i s p l a t i n 5 一f l u o r o u r a c i l a d r i a m y c i n m i t o m u c i n ) 四氮唑蓝 信使核糖核酸 吸光度值 血浆峰值浓度 羟基喜树碱 顺铂 5 一氟尿嘧啶 阿霉素 丝裂霉素 。- _ _ 一 刖舌 食管癌( e s o p h a g e a lc a r c i n o m a ，e c ) 是消化系统最常见恶性肿瘤之一。 全世界每年约有3 0 万人死于食管癌。其发病率和死亡率各国差异很大。我国 是世界上食管癌高发地区之一，每年平均病死约16 万人1 ，严重威胁人民 的生命健康。食管癌病理分型9 5 以上为鳞状细胞癌( e s o p h a g e a ls q u a m o u s c e l lc a n c e r ，e s c c ) ，少数为腺癌、肉瘤或未分化癌等。由于大多数食管鳞癌 发病隐匿，多数患者就诊时已属晚期，失去了手术或放疗的最佳时机；因此， 化疗在食管鳞癌的治疗中占有越来越重要的地位。化疗无论作为中晚期食管 鳞癌患者的主要治疗手段还是作为围手术期的辅助治疗，对延长患者生存 期，提高生活质量都发挥着重要作用，特别是术前化疗的提出和应用，使食 管鳞癌的综合治疗水平得到进一步提高。但是近2 0 年来虽然对恶性肿瘤的治 疗效果比以前有较大改善，但是人们逐渐发现多数肿瘤特别是实体肿瘤化疗 效果仍不理想，其主要原因是在许多肿瘤中存在多种耐药基因的扩增及相应 蛋白的高表达，由于多数化疗药物有较大毒性，当临床确定患者对某种化疗 药物不敏感时，药物己产生严重的毒副作用，使化疗不可避免地存在盲目性 及随意性，造成了食管鳞癌化疗效果欠佳，继发性耐药及不必要的毒副作用。 因此，对肿瘤化疗敏感性和耐药性研究己成为人们关注的焦点，以抗癌药物 个体化治疗为目的的药敏实验愈来愈受到重视。通过药敏实验，在化疗实施 前筛选出有效的药物，对于实现肿瘤化疗的合理化、个体化用药有实用价值。 m t t 药敏检测是目前应用最广泛的体外药敏试验方法之一。具有快速简捷、 不使用同位素且与化疗疗效相关性好等优点，对于指导临床化疗用药，预测 可能的药物治疗反应，改善治疗效果具有重要的实用价值。 p t e n 基因作为第一个被发现的具有双重特异性磷酸酶活性的肿瘤抑制 基因，在细胞的生长发育、凋亡、迁移、信号传递等方面起着重要的调控作 用眨1 ，虽然已经证实p t e n 基因的表达水平与多数消化系统肿瘤的发生、发 展及预后存在相关性，但其精确作用点、作用机制、以及它在消化系统肿瘤 发生中的重要性等，均有待于进一步阐明。 l i v i n 是新近发现的凋亡抑制蛋白家族( i n h i b it o r o f a p o p t o s i s p r o t e i n ，i a p ) 成员之一，是从人类基因组e d n a 文库中克隆得到的一种蛋白质，同时也被命 名为m li a p 、k i a p 。研究表明l i v i n 在正常成人组织中不表达或低表达，在多 6 数肿瘤组织中高表达，如黑色素瘤、乳癌、宫颈癌、膀胱癌、白血病以及淋巴 瘤等。新近研究表明l i v i n 可能还与肿瘤的化疗药物的耐药性和预后有关，可 能成为一种新的耐药标志1 1 ，但是有关p t e n 与l i v i n 基因表达相关性的研 究及其与食管鳞癌化疗药物敏感性的相关性研究少见于报道。本研究从临床 实际出发，取手术切除的新鲜食管鳞癌组织标本，进行体外培养；采用m t t 比色法检测食管鳞癌化疗经典方案中常用的5 种药物的敏感性，探讨化疗药 物杀伤食管鳞癌原代细胞的效应；用免疫组化法检测p t e n 与l i v i n 在食管鳞 癌组织中的表达，并进一步分析其与食管鳞癌化疗药物敏感性的相关性，为 食管鳞癌的临床化疗提供个体化用药的实验资料和依据。 材料与方法 1 材料 1 1 临床资料 收集泰山医学院附属医院医院2 0 0 6 年4 月至2 0 0 9 年2 月外科手术切除的 8 1 例食管鳞癌标本。所有病例均经胃镜活检病理证实且术前未行化疗、放疗。 其中男性4 4 例，女性3 7 ，年龄2 9 岁一7 9 岁，中位年龄5 5 岁。 1 2m t t 比色法药敏试验试剂 r p m i 一1 6 4 0 完全培养液 10 胎牛血清 m t t 异丙醇 1 3 化疗药物 g i b c o 公司产品 美国s i g m a 公司产品 美国s i g m a 公司产品 苏州正兴化工研究院 羟基喜树碱( h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ，h c p t ) 四川太极制药有限公司 顺铂( c i s p l a t i n ，c d d p )中国山东齐鲁制药厂 阿霉素( a d r i a m y c i n ，a d m )中国山东新华制药厂 5 一氟尿嘧啶( 5 一f l u o r o u r a c i l ，5 一f u )中国上海华联制药有限公司 丝裂霉素( f i t o m u c i n ，m m c )中国黄石美升药业有限公司 以上药物以生理盐水稀释至血浆峰值药浓度( p e a kp l a s mc o n c e n t r a n t i o n ， p p c ) 分装，2 0 0 保存待用。五种化疗药物的p p c 见表1 。 表1 五种化疗药物的血浆峰值浓度o t g m 1 ) t a b l e lp p co fc h e m o t h e r a p e u t i e rd r u g s ( 1 a g m 1 ) h c p t ：h y d r o x y c a m p t o t h e c i n ；c d d p ：c i s p l a t i n ；5 一f u ：5 一f l u o r o u r a c i l ； a d m ：a d r i a m y c i n ；m m c ：m i t o m y c i n p p c ：p e a kp l a s mc o n c e n t r a n t i o n 1 4 免疫组化检测试剂 鼠抗人l i v i n 单克隆抗体 兔抗人p t e n 多克隆抗体 s p 试剂盒 多聚赖氮酸 d a b 显色液配制 福州迈新公司 福州迈新公司 ，“州中山公司 s i g m a 公司 福州迈新公司 1 5 主要仪器 自动酶标仪 上海博迅实业有限公司 离心机上海博迅实业有限公司 倒置显微镜( o l y m p u si x 7 0 型)日本o l y m p u s 公司 单人单面净化工作台( s w c j 1f d )苏州净化设备有限公司 电热恒温c 0 2 培养箱( h h c p t w 型) 上海博迅实业有限公司 电热恒温干燥箱山东精鹰医疗有限公司 9 6 孔培养板 美国c o r n i n g 2 0 0 目不锈钢筛网北京康寿医疗器械 血细胞计数板北京北德器材公司 派克斯细胞形态学图象分析系统北京派克斯科技有限公司 2 方法 2 1 取材 8 1 例食管鳞癌标本均来自泰山医学院附属医院胸外科手术切除标本。自 浆膜面分离、切开肿瘤，从瘤体生长活跃、无坏死变性的部位取材，去除结 缔、脂肪及坏死组织，再用酸性离子水反复冲洗，外观半透明，呈新鲜鱼肉 状，有质感和弹性。置于预先准备好的装有h a n k s 液的无菌冻存管中。 2 2 肿瘤细胞悬液制备 在超净工作台上，食管鳞癌组织用灭菌p b s 冲洗3 遍，无菌剪刀剪成糊 状，2 0 0 目铜网研磨过滤，过滤后以3 0 0 0 r m i n 离心10 m i n ，去掉上清后用 h a n k s 液漂洗二次后，用台盼蓝染色记数活细胞数大于9 5 ，用10 胎牛血 清r p m i l6 4 0 培养液重悬，用血细胞计数板调整单细胞悬液至活细胞浓度 ( 2 3 ) 1 0 个m l 。 2 3m t t 药物敏感试验 实验分为3 组，( 1 ) 用药组：取分离纯化后的单细胞悬液加入9 6 孔培养 板，每孔18 0 u l ，分别加入药物终浓度为1o 倍血浆峰值浓度( 见表1 ) 的羟基 喜树碱( h c p t ) 、顺铂( d d p ) 、阿霉素( a d m ) 、5 一氟尿嘧啶( 5 一f u ) 、 丝裂霉素( m m c ) ，每组药物设4 b 复孔；( 2 ) 对照组：每孔加入分离纯化后 的单细胞悬液18 0 u l ，不加药物；( 3 ) 空白组：加18 0 u l 培养液，无培养细胞； 9 置于3 7 、5 c 0 2 、饱和湿度的培养箱中培养4 8 小时后，加入5 m g ml 的 m t t l o u l 于各孔，继续培养4 小时。加入o 0 4 n 盐酸异丙醇1 0 0 u l 孑l 充分溶解 所生成的甲瓒，静止1o 分钟，通过酶标仪在5 7 0 n m 波长检测光密度值( o d 值) 的变化。取4 复孔o d 值的平均值作为细胞在此药物组的平均o d 值。肿瘤细胞 抑制率= ( 对照组o d 值一用药组平均o d 值) ( 对照孔平均o d 值一空白组o d 值) 10 0 。判断标准：肿瘤细胞抑制率 5 0 为高度敏感，3 0 - 5 0 为中度 敏感， 2 分为阳性，0 - - , 2 分为“”， 3 4 分为“+ ”，4 5 分为“+ + ”。 在实验过程中，因污染及其它原因导致8 4 例实验标本中3 例失败，8 1 例成功， 成功率为9 6 4 。将81 例成功标本分别按以下方法进行分组： 3 2 实验组 选取81 例食管鳞癌鳞癌标本。所有病例均经胃镜活检病理证实且术前未 行化疗、放疗。其中男性4 5 例，女性3 6 例，年龄2 9 岁一7 8 岁，中位年龄5 6 岁。 3 3 对照组 选取同期正常食管粘膜2 0 例做为正常对照，其中男性l2 例，女性8 例， 年龄2 9 6 5 岁，中位年龄4 9 5 岁。 4 统计学分析 所有实验数据采用s p s s l 2 0 统计包进行分析，用) c 2 检验，秩和检验、连 续性校正f 检验和f i s h e r 精确概率计算法进行计数资料的显著性检验，用 s p e a r m a n 等级相关进行两变量问的相关性分析。p 0 0 5 视为差异具有统计学 意义。 硅里 ：日木 共取食管鳞癌手术标本8 4 例，m t t 法药敏实验成功8 1 例，成功率9 6 4 ( 8 1 1 8 4 ) 。 培养失败原因：2 例因为污染，由于取材时食管内容物溢出污染所致； 另外1 例为培养活细胞太少造成各孔接种不均多表现为加药孔和不加药的对 照孔o d 值均较低( o d 值均 o 1 ) 。 1 m t t 药敏检测结果 1 1 化疗药物作用后原代食管鳞癌细胞的形态学改变 经血药终浓度的五种化疗药物作用4 8 h 后，经倒置显微镜观察，可见肿 瘤细胞数量减少、肿瘤细胞活力下降，严重者失去贴壁生长能力，胞浆内空 泡增加，形态破坏，形成大量细胞碎片( 如图11 ) 。 1 2化疗药物作用后原代食管鳞癌细胞的体外抑制率 m t t 检测结果提示，不同个体食管鳞癌细胞对化疗药物的敏感率各不相 同；五组药物之间敏感性差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，其中h c p t 、m m c 及5 f u 之间敏感性差异均无统计学意义，p 值均大于o 0 5 ；但h c p t 、m m c 及5 f u 与a d m 及c d d p 之间敏感性差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，前者 明显高于后者；a d m 敏感性明显低于c d d p ，组间差异具有统计学意义 ( p 0 0 5 ) ；对临床化疗药物的选择有指导作用( 图1 、表2 ) 。 表2 食管鳞癌组织m t t 药敏检测结果( 例，) t a b l e 2c h e m o t h e r a p e u t i cd r u gs e n s i t i v et e s tb ym t ta s s a y 注：h = i4 9 1 ，p = 0 0 0 5 ，组间差异具有统计学意义。 与c d d p 纰相比， ，与a d m 组相比， 与c d d p 组相比。 与c d d p 组市只比， 与5 - f u 组相比， 撑与a d m 组相比， 撑与c d d p 组相比， 值= 3 值= 4 值= 4 值= 3 值= 5 值= 3 值= 3 1 2 5 1 1 l l 5 5 o o 0 0 o o o o 0 o o o o 0 p p p p p p p 高度敏感率 5 _ f u 药物 ( 图l 食管鳞癌原代细胞对不同化疗药物的高度敏感率，n = 8 1 ) 2 免疫组化结果 2 1 食管鳞癌中p t e n 蛋白的表达及其与临床病理特征的关系 p t e n 定位于细胞浆和或细胞膜内( 如图4 5 ) 。( 1 ) 8 l 例食管鳞癌组织 中p t e n 蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为4 6 9 ( 3 8 81 ) 。( 2 ) 在食管 鳞癌组织( 3 8 8 1 ，4 6 9 ) 及正常食管粘膜组织( 2 0 2 0 ，1 0 0 ) 中p t e n 蛋白表 达阳性率组间差异有统计学意义( p 0 0 1 ) ；( 3 ) 无淋巴结转移组( 2l 3 5 ，6 0 0 ) p t e n 阳性表达率明显高于有淋巴结转移组( 17 4 5 ，3 7 9 ) ，其差异具有统 计学意义( p 0 0 5 ) 。( 4 ) p t e n 蛋白表达与食管鳞癌的分化程度相关，p t e n 表达阳性率高中分化者( 2 8 4 5 ，6 2 1 ) 明显高于低分化者( 10 3 5 ，2 8 5 ) ，其表达差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。结果见表3 、表4 。 表3p t e n 在正常食管粘膜及食管鳞癌中的表达 t a b l e3 e x p r e s s i o no fp t e n c a r c i n o m aa n dn o r m a lg a s t r i cm u c o s a 表4p t e n 表达与食管鳞癌临床病理因素的关系 t a b l e4c o r e l a t i o nb e t w e e nc l i n i c o p a t h o l o g ya n de x p r e s s i o no fp t e n 2 2 食管鳞癌组织中p t e n 蛋白表达与化疗药物体外抑制率的关系 将m t t 检测结果中抑制率兰3 0 者判为敏感，而 3 0 者判为耐药。p t e n 蛋白阳性表达与h c p t 、c d d p 、5 一f u 、a d m 及m m c 的化疗药物耐药性 均无相关性( p = o 6 6 l ，p = o 7 6 9 ，p = o 7 6 8 ，p = o 7 2 9 ，p - - 0 8 6 6 ) ，p 值均 大于0 0 5 ( 表5 ) 。 1 4 表5 食管鳞癌组织中p t e n 表达结果与m t t 药敏的关系 t a b l e5 r e l a t i o n s h i po fp t e ne x p r e s s i o nt or e s u l t so fm t ta s s a y 3 1食管鳞癌l i v i n 表达及其与临床病理因素的关系 本实验免疫组化染色结果表明，l i v i n 主要定位于细胞胞浆及胞膜，呈 棕黄色颗粒，少量定位于胞核( 如图12 15 ) 。( 1 ) 8l 例食管鳞癌组织中l i v i n 的阳性表达率为6 9 1 。( 2 ) 在食管鳞癌组织( 5 6 81 ，6 9 1 ) 及正常胃粘膜 组织( 0 2 0 ) 中l i v i n 蛋白表达阳性率差异有统计学意义( p 0 0 5 ) 前者阳性率 明显高于后者；( 3 )高中分化及无淋巴结转移组l i v i n 阳性率分别为 ( 2 7 4 5 ，6 0 1 ) 、( 12 3 5 ，3 4 3 ) 与低分化、有淋巴结转移者( 2 9 3 6 ，8 2 8 ) 、 ( 4 4 4 6 ，9 6 5 ) 相比p o 0 5 ) 。结果见表6 、表7 。 结果：日木 共取食管鳞癌手术标本8 4 例，m t t 法药敏实验成功8 1 例，成功率9 6 4 ( 81 8 4 ) 。 培养失败原因：2 例因为污染，由于取材时食管内容物溢出污染所致： 另外1 例为培养活细胞太少造成各孔接种不均多表现为加药孔和不加药的对 照孔o d 值均较低( o d 值均 o 1 ) 。 1 m t t 药敏检测结果 1 1 化疗药物作用后原代食管鳞癌细胞的形态学改变 经血药终浓度的五种化疗药物作用4 8 h 后，经倒置显微镜观察，可见肿 瘤细胞数量减少、肿瘤细胞活力下降，严重者失去贴壁生长能力，胞浆内空 泡增加，形态破坏，形成大量细胞碎片( 如图1 1 ) 。 1 2化疗药物作用后原代食管鳞癌细胞的体外抑制率 m t t 检测结果提示，不同个体食管鳞癌细胞对化疗药物的敏感率各不相 同；五组药物之间敏感性差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，其中h c p t 、m m c 及5 f u 之间敏感性差异均无统计学意义，p 值均大于o 0 5 ；但h c p t 、m m c 及5 f u 与a d m 及c d d p 之间敏感性差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) ，前者 明显高于后者；a d m 敏感性明显低于c d d p ，组间差异具有统计学意义 ( p 0 0 5 ) ；对临床化疗药物的选择有指导作用( 图1 、表2 ) 。 表2 食管鳞癌组织m t t 药敏检测结果( 例，) t a b l e 2c h e m o t h e r a p e u t i cd r u gs e n s i t i v et e s tb ym t t a s s a y 注：h = 1 4 9 1 ，p = 0 0 0 5 ，组i 旬差异具有统计学意义。 与c d d p 组相比， 与a d m 组相比， t 与c d d p 组相比， 与c d d p 组相比， 与5 一f u 组相比， 拌与a d m 组相比， # 与c d d p 组相比， 值= 3 值= 4 值= 4 值= 3 值= 5 值= 3 值= 3 1 2 jl 5 5 o o o o o o 0 o o o o o o o ( p p p p p p p 高度敏感率 h c p rc d d p5 一f u 药物 ( 图l 食管鳞癌原代细胞对不同化疗药物的高度敏感率，n = 8 1 ) 2 免疫组化结果 2 1 食管鳞癌中p t e n 蛋白的表达及其与临床病理特征的关系 p t e n 定位于细胞浆和或细胞膜内( 如图4 5 ) 。( 1 ) 8 1 例食管鳞痛组织 中p t e n 蛋白在食管鳞癌组织中的阳性表达率为4 6 9 ( 3 8 8 1 ) 。( 2 ) 在食管 鳞癌组织( 3 8 8 l ，4 6 9 ) 及正常食管粘膜组织( 2 0 2 0 ，1 0 0 ) 中p t e n 蛋白表 达阳性率组间差异有统计学意义( p 0 0 1 ) ；( 3 ) 无淋巴结转移组( 2 1 3 5 ，6 0 0 ) p t e n 阳性表达率明显高于有淋巴结转移组( 17 4 5 ，3 7 9 ) ，其差异具有统 计学意义( p