（病理学与病理生理学专业论文）慢性心力衰竭大鼠心肌组织中tgfβ1和ctgf的动态表达.pdf

，l_-_-_-_，_-j_-_-_，_，j_，_，j111 i i llli illli l li l li iu l 、t18 9 7 5 8 7 慢性心力衰竭大鼠心肌组织中t g f p 1 和c t g f 的动态表达 d y n a m i ce x p r e s s i o no ft g f p 1a n dc t g f i nm y o c a r d i u mo fr a t s j l w l t nc h r o m ch e a r tt a l l u r e 研究生：谢亚芹 学号：2 0 0 8 0 4 1 年级：2 0 0 8 级 导师：李秀华教授 学科专业：病理与病理生理学 所在系部：基础医学部 研究方向：心力衰竭病理生理 研究起止日期：2 0 0 9 年9 月 - - 2 0 1 1 年3 月 论文提交日期：2 0 11 年3 月 目录 中文摘要1 英文摘要3 英文缩写8 研究论文 慢性心力衰竭大鼠心肌组织中t g f p l 和c t g f 的动态表达 1 j _ 日l j 吾9 材料与方法9 结果1 7 附图2 0 附表3 5 讨论3 7 结论4 3 参考文献4 4 综述4 8 致谢5 8 个人简历5 9 1_j_-_1j_-_-_1_1_ii 中文摘要 慢性, b 3 j 衰竭大鼠心肌组织中t g f p ，和c t g f 的动态表达 摘要 慢性心力衰竭( c h r o n i ch e a r tf a i l u r e ，c ) 为各种心脏疾病的终末 期表现，是导致心脏病患者死亡重要原因。近年来，随着我国高血压病和 冠心病发病率的持续上升，c h f 的发病率随之上升，已成为严重威胁人 们健康的重要疾病。心肌纤维化是c h f 的重要病理基础，因此防治心肌 纤维化已成为近年来研究的热点。在心肌纤维化的发生和发展过程中，一 系列促炎因子发挥着重要的作用，其中转化生长因子p 1 ( t r a n s f o r m i n g g r o w t hf a c t o r - 1 3 l ，t g f p 1 ) 和结缔组织生长因子( c o n n e c t i v et i s s u eg r o w t h f a c t o r ，c t g f ) 近年来引起了人们的关注，本研究采用肾上腹主动脉缩窄 术建立c h f 心肌纤维化模型，探讨t g f p l 和c t g f 在心肌纤维化发生、 发展过程中的作用。 目的： 采用肾上腹主动脉缩窄方法建立c h f 心肌纤维化的动物模型。采用 免疫组织化学染色、r t - p c r 方法，从细胞水平和分子水平观察t g f 1 3 1 和c t g f 在压力负荷型心力衰竭大鼠心肌组织中的动态表达，探讨t g f b 1 和c t g f 与心肌纤维化发生、发展的关系。 方法： 1 清洁级雄性w i s t a r 大鼠4 2 只，随机抽取8 只作为假手术组，其余 大鼠全部采用肾上腹主动脉缩窄术制作c h f 模型。以左室舒张末压( 1 e f t v e n t r i c u l a re n dd i a s t o l i cp r e s s u r e ，l v e d p ) 1 5 m m h g 作为成模标准。待 模型建立成功后，将剩余大鼠随机分为3 组，即心衰1 d 、心衰7 d 、心衰 1 4 d 组，每组8 只。假手术组只做分离不做结扎。 2 各组大鼠到达观察终点时，采用多导电生理记录仪检测血流动力学 参数l v e d p 及左室内压上升、下降最大速率( 1 e f tv e n t r i c u l a rp r e s s u r er i s e a n df a l l ，_ _ _ d p d t m a x ) ，取左心室并计算左心室质量指数( t h el e f tv e n t r i c u l a r m a s si n d e x ，i 舢) 。 3 采用苏木素一伊红( 眦) 染色和m a s s o n 染色法观察各组大鼠左心 室心肌组织病理学改变，并检测左心室心肌胶原容积分数( c o l l a g e n 中文摘要 v o l u m ef r a c t i o n ，c v f ) 。 4 采用透射电镜观察各组大鼠左心室心肌组织超微结构。 5 采用s p 免疫组织化学染色法检测各组大鼠左心室心肌组织 t g f b 1 和c t g f 蛋白的表达。 6 采用r t - p c r 法检测各组大鼠左心室心肌组织t g f p l 和c t g f m r n a 的表达。 结果： 1 各组大鼠血流动力学参数：心衰l d 组、心衰7 d 组和心衰1 4 d 组大鼠 l v e d p 分别为( 1 5 5 6 a ：1 6 9 ) m r n h g 、( 1 7 8 7 土2 1 9 ) m n a q g 和( 2 0 0 3 + 1 9 3 ) m m h g ， 明显高于假手术组 o 0 1 ) 。心衰1 d 组、心衰7 d 组和心衰1 4 d 组大鼠 d p d t m a x 分别为( 4 6 7 3 6 2 - 4 ：2 0 6 6 3 ) m m i - i g s ，( 3 3 3 9 7 4 4 - 2 3 8 6 5 ) m m h g s ； ( 4 3 6 0 2 6 a ：2 3 9 6 5 ) m 1 ：1 1 l g s ，( 3 0 9 1 8 5 - & 2 4 5 2 4 ) m m h g s 和( 4 1 2 0 5 9 - 生- 2 1 5 1 3 ) m m h g s ， ( 2 8 6 0 2 0 士1 9 9 7 3 ) m m n g $ ，与假手术组大鼠比较明显降低( p o 0 1 ) ，并且 随着心衰时间的延长，大鼠心功能逐渐恶化。 2 各组大鼠左心室心肌组织病理学改变h e 染色：假手术组大鼠心 肌细胞排列整齐，形态正常，细胞质纹理清晰；心衰1 d 组、心衰7 d 组和 心衰1 4 d 组大鼠随着心衰时间的延长，逐渐出现心肌细胞肥大，心肌纤维 排列紊乱，呈现波浪状，甚至断裂。m a s s o n 染色：假手术组大鼠心肌无 明显胶原沉积，心衰1 d 组、心衰7 d 组和心衰1 4 d 组大鼠随着心衰时间的 延长，心肌胶原沉积逐渐增多。 3 各组大鼠l v m i 和c v f ：心衰1 d 组、心衰7 d 组、心衰1 4 d 组大 鼠l v m i 和c v f 分别为( 2 5 3 4 - 0 1 7 ) ，( 1 5 6 2 1 8 3 ) ；( 2 8 6 i - 0 2 8 ) ， ( 2 2 3 1 2 3 4 ) ；( 3 1 5 + 0 2 6 ) ，( 2 5 1 2 2 9 6 ) 。与假手术组大鼠 比较明显升高( p o 0 1 ) ，且随着心衰时间的延长逐渐升高。 4 各组大鼠左心室心肌细胞超微结构观察假手术组大鼠心肌肌原 纤维排列整齐，z 带清晰可见，线粒体结构清晰完整，无肿胀及空泡样变， 心肌间质极少有胶原纤维沉积。心衰1 d 组、心衰7 d 组和心衰1 4 d 组大鼠 心肌组织逐渐出现肌原纤维排列紊乱，肌节错位，z 带部分消失。线粒体 肿胀、嵴不同程度溶解断裂，心肌间质有较多的胶原纤维沉积。 5 各组大鼠左心室心肌组织t g f 一1 3 l 的表达t g f p l 蛋白免疫阳性产 物呈棕黄色颗粒状，位于心肌细胞的细胞膜和细胞间质，以细胞间质为主。 中文摘要 与假手术组大鼠比较，心衰l d 组、心衰7 d 组和心衰1 4 d 组大鼠心肌组织 t g f 1 3 l 蛋白及m r n a 的表达均明显升高( 氏o 0 1 ) ，且随着心衰时间的 延长，表达逐渐增强，心衰各组间比较有明显差异( 尸 o 0 1 ，p 0 0 5 ) 。 6 各组大鼠左心室心肌组织c t g f 的表达c t g f 蛋白免疫阳性产物 呈棕黄色颗粒状，位于心肌细胞的细胞质和细胞间质，以细胞质为主。与 假手术组大鼠比较，心衰1 d 组、心衰7 d 组和心衰1 4 d 组大鼠心肌组织 c t g f 蛋白及m r n a 的表达均明显升高( 尸 0 0 1 ，p 0 0 5 ) ，且随着心衰 时间的延长，表达逐渐增强，心衰各组间比较有明显差异( 尸 7 15 m m h gw a st a k e na ss t a n d a r d w h e nt h ec h r o n i ch e a r tf a i l u r e 4 英文摘要 m o d e lw a ss u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e d ，r e s i d u e sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t o3 g r o u p s ，h fldg r o u p ，i - i f7 dg r o u p ，h f14 dg r o u p ，a n d8r a t si ne a c hg r o u p t h er a t si ns h a mg r o u pw e r eo p e r a t e di nt h es a m ew a ya so t h e r se x c e p tf o rn o a o r t i cc o n s t r i c t i o n 2h e m o d y n a m i cp a r a m e t e r sl v e d pa n dt h em a x i m u mc h a n g er a t eo f l e f tv e n t r i c u l a r p r e s s u r er i s e a n df a l l ( 4 - d p d t m a x ) w e r ee x a m i n e d b y m u l t i l e a de l e c t r i cp h y s i o l o g i c a li n s m m a e n ta tt h ee n d p o i n t so fe a c hg r o u p ， a n dt a k e nt h el e f tv e n t r i c l et oc a l c u l a t i o nt h el e f tv e n t r i c u l a rm a s si n d e x ( l v m i ) 3h ea n dm a s s o ns t a i n i n gw e r eu s e dt oo b s e r v eh i s t o p a t h o l o g i c a lc h a n g e o fl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m ，a n dt od e t e c tt h ec o l l a g e nv o l u m ef r a c t i o n ( c v f ) i ne a c hg r o u p 4t r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p e w a su s e dt oo b s e r v e t h e u l t r a s t r u c t u r eo fl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m 5s pi m m u n o h i s t o c h e m i c a ls t a i n i n gw a su s e dt oo b s e r v et h ee x p r e s s i o n o ft g f 一1 3 1a n dc t g fp r o t e i ni nl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m 6r t - p c rw a su s e dt od e t e c tt h e e x p r e s s i o no ft g f - 1 3 1a n dc t g f m r n ai nl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m 9 ： r e s u l t s ： 1h e m o d y n a m i cp a r a m e t e r si ne a c hg r o u p ：t h el v e d pi nh fl dg r o u p ， h f7 dg r o u p ，h f1 4 dg r o u pw e r e ( 1 5 5 6 士1 6 9 ) m m h g ，( 1 7 8 7 4 - 2 1 9 ) m m h g a n d ( 2 0 0 3 + 1 9 3 ) m m h g ，w h i c hi n c r e a s e ds i n g n i f i c a n t l yc o m p a r e dw i t hr a t s i ns h a m g r o u p ( 尸 o 01 ) t h e d p d t m a x i nm o d e l g r o u p s w e r e ( 4 6 7 3 6 2 4 2 0 6 6 3 ) m m h g s ，( 3 3 3 9 7 4 4 - 2 3 8 6 5 ) m m h g s ；( 4 3 6 0 2 6 4 2 3 9 6 5 ) m m h g s ， ( 3 0 9 1 8 5 4 - 2 4 5 2 4 ) m m h g s ；( 4 1 2 0 5 9 4 2 1 5 1 3 ) m m h g s ，( 2 8 6 0 2 0 4 1 9 9 7 3 ) m m h 的 c o m p a r e dw i t hs h a mg r o u p ，t h e4 - & m a xi nm o d e lg r o u p sw e r eo b v i o u s d e c r e a s e d 衅0 01 ) a st h et i m eo fh e a r tf a i l u r ee l o n g a t e d ，t h ed e g r e eo fl e f t v e n t r i c u l a rf u n c t i o nw o r s e n i n ga g g r a v a t e d 2h i s t o p a t h o l o g i c a lc h a n g eo fl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u mi ne a c h g r o u p ： h es t a i n i n g ：i ns h a mg r o u p ，t h e a r r a n g e m e n to fm y o c a r d i a lf i b e r sw e r e c o m p a c ta n do r d e r l i n e s s ，t h ea p p e a r a n c eo fm y o c a r d i a lc e l l sw e r en o r m a l ，a n d 5 英文摘要 t h ec y t o p l a s mt e x t u r ew a sc l e a r f o rm o d e lg r o u p s ，w i t ht h et i m eo fh e a r t f a i l u r ee l o n g a t e d ，t h em y o c a r d i u ms h o w ：t h em y o c a r d i a lc e l l sw e r es w e l l i n g a n dd e g e n e r a t i o n ，t h em y o c a r d i a lf i b e r sw e r ew a v e de v e nf r a c t u r e m a s s o n s t a i n i n g ：t h e r ew a sn o to b v i o u s l yc o l l a g e nd e p o s i t i o ni ns h a mg r o u p f o r m o d e lg r o u p s ，t h ec o l l a g e nd e p o s i t i o ni n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h et i m eo f h e a r tf a i l u r ee l o n g a t e d 3l v n i ia n dc v fi ne a c hg r o u p ：t h el v m ia n dc v fi nh fl dg r o u p ， i - i f7 d g r o u p ，h f 1 4 d g r o u pw e r e ( 2 5 3 士0 1 7 ) o ，( 1 5 6 2 1 8 3 ) ； ( 2 8 6 士0 2 8 ) o ，( 2 2 31 2 3 4 ) ；( 3 15 + 0 2 6 ) ，( 2 5 1 2 2 9 6 m t h e i n d e x e si nm o d e lg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a ti ns h a mg r o u p o 01 ) ，a n di t i n c r e a s e dg r a d u a l l y 埘廿lt h et i m eo fh e a r tf a i l u r ee l o n g a t e d 4u l t m s t r u c t u r eo fl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u mo b s e r v e di ne a c hg r o u p ： i nt h es h a mg r o u p ，t h ea r r a n g e m e n to fm y o f i b r i l sw e r eo r d e r l i n e s s ，t h e z o n ezw a sc l e a r t h es t r u c t u r eo fm i t o c h o n d r i aw a si n t e g r a t e d t h e r ew a s o n l yal i t t l ec o l l a g e nd e p o s i t i o ni nt h em y o c a r d i a li n t e r s t i t i a l i nt h em o d e l g r o u p s ，t h em y o f i b r i l s w e r ed i s a r r a n g e d ，t h es t r u c t u r eo fs a r c o m e r ew a s u n c l e a r , t h ez o n ezw a sp a r t l yd i s a p p e a r e d ，t h ec f i s t a eo fm i t o c h o n d r i aw a s s w o l l e na n dp a r t l yd i s s o l v e d t h ec o l l a g e nd e p o s i t i o ni n c r e a s e dg r a d u a l l y w i t ht h et i m eo fh e a r tf a i l u r ee l o n g a t e d 5t g f p le x p r e s s i o ni nl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u mo f r a t s ： t g f 一1 3 , i m m u n o p o s i t i v ep r o d u c t sw e r eb u f f yg r a n u l e sa n dl o c a t e di n c y t o m e m b r a n ea n di n t e r s t i t i a l t i s s u eo fm y o c a r d i u m ，m a i n l ya t i n t e r s t i t i a l t i s s u e c o m p a r e dw i t hs h a mg r o u pr a t s ，t h et g f - p 1p r o t e i na n dm r n a e x p r e s s i o ni nm y o c a r d i u mo fr a t s i nm o d e lg r o u p si n c r e a s e do b v i o u s l y ( 氏o 01 ) ，a n di ti n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h et i m eo f h e a r tf a i l u r ee l o n g a t e d t h e r eh a ds i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e si nm o d e lg r o u p s ( p o 01 ，p o 0 5 ) 6c t g f e x p r e s s i o ni nl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u mo f r a t s ： c t g fi m m u n o p o s i t i v ep r o d u c t sw e r eb u f 矽g r a n u l e sa n dl o c a t e di n c y t o p l a s m a n di n t e r s t i t i a lt i s s u eo fm y o c a r d i u m ，m a i n l ya t c y t o p l a s m c o m p a r e dw i t hs h a mg r o u pr a t s ，t h ec t g fp r o t e i na n dm r n ae x p r e s s i o ni n m y o c a r d i u mo fr a t si nm o d e lg r o u p si n c r e a s e do b v i o u s l y 职0 01 ，p o 0 5 ) ， 6 英文摘要 a n di ti n c r e a s e dg r a d u a l l yw i t ht h et i m eo fh e a r tf a i l u r ee l o n g a t e d t h e r eh a d s i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c e si nm o d e lg r o u p s ( p 0 01 ) c o n c l u s i o n s ： 1n l em o d e lo fm y o c a r d i a lf i b r o s i sw i t hc h r o m ch e a r tf a i l u r ei nr a t sw a s s u c c e s s f u l l ye s t a b l i s h e db ya b d o m i n a la o r t i cc o n s t r i c t i o n ，a n d i ti si n a c c o r d a n c ew i t ht h ep a t h o l o g i c a lp r o c e s so fh u m a nm y o c a r d i a lf i b r o s i s 2t h ee x p r e s s i o no ft g f p 1a n dc t g fi nl e f tv e n t r i c u l a rm y o c a r d i u m w a si n c r e a s e di nm y o c a r d i a lf i b r o s i so fr a t sw i mc h r o m ch e a r tf a i l u r e ，a n di t s l e v e li sr e l a t e dc l o s e l yt ot h es e v e r i t yo fc l l r o m ch e a r tf a i l u r e k e yw o r d s ：h e a r tf a i l u r e ；m y o c a r d i a lf i b r o s i s ；t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o r - p l ；c o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r ；e x t r a c e l l u l a r m a t r i x 笆” 7 英文缩写 c t g f - p l c t g f l v e d p i 舢 c e c m c f s 英文缩写 c l l r o m ch e a r tf a i l u r e慢性心力衰竭 t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 l转化生长因子一p l c o n n e c t i v et i s s u eg r o w t hf a c t o r结缔组织生长因子 l e f tv e n t r i c u l a re n dd i a s t o l i cp r e s s u r e 左室舒张末压 l e f tv e n t r i c u l a rm a s si n d e x左心室质量指数 c o l l a g e nv o l u m e f r a c t i o n e x t r a c e l l u l a rm a t r i x c a r d i a cf i b r o b l a s t d p d t m a x l e f tv e n t r i c u l a rp r e s s u r er i s ea n df a l l d a b p b s 心口s s p 3 , 3 - d i a m i n o b e n z i d i n e p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s s t r e p t a v i d i n p e r o x i d a s e a p n a d i p o n e c t i n 心肌胶原容积分数 细胞外基质 心肌成纤维细胞 左室内压上升、下降 最大速率 二氨基联苯胺 磷酸缓冲盐溶液 基质金属蛋白酶 过氧化物酶标记的链 酶卵白素 脂联素 研究论文 慢性心力衰竭大鼠心肌组织中t g f p 1 和c t g f 的动态表达 上- - 刖舌 慢性心力衰竭( c h r o n i ch e a r tf a i l u r e ，c ) 是由各种疾病引起心肌 收缩能力减弱，从而使心脏的血液输出量减少，不足以满足机体的需要， 并由此产生一系列的症状和体征。c h f 不是一个独立的疾病，是指各种 病因致心脏疾病的严重阶段及最终归宿，也是心脏疾病患者最主要的死亡 原因。近年来，c h f 的发病率在逐渐上升，尤其是在6 5 岁以上的老年人 群中，c h f 是促使老年病人住院的常见病之一。因此c h f 发病机制及防 治已成为研究领域的热点。 心肌纤维化是c h f 的重要病理基础。心肌纤维化是指心肌胶原过量 沉积，胶原浓度和胶原容积分数显著增加，各型胶原比例失调以及排列紊 乱，其形成是一个多因素相互促进和相互制约的复杂过程。近年来研究发 现多种细胞因子的激活均有致纤维化的作用，其中转化生长因子d l ( t r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o r - 1 3 l ，t g f p 1 ) 和结缔组织生长因子( c o n n e c t i v e t i s s u eg r o w t hf a c t o r ，c t g f ) 是两种重要的促成纤维分裂和胶原沉积的细 胞因子，与多种器官的纤维化密切相关。本研究通过观察不同时间点 t g f p 1 和c t g f 在c h f 心肌组织中的表达情况，探讨其与心肌纤维化发 生、发展的关系。 材料与方法 1材料 1 1 实验动物 清洁级雄性w i s t a r 大鼠4 2 只，体重2 2 0 - - - 2 5 0 9 ，由天津市山川红实 验动物科技有限公司提供，许可证编号：s c x k ( 津) 2 0 0 9 0 0 1 。 1 2 仪器设备 b l 4 2 0 e 生物机能实验系统成都泰盟科技有限公司 e mu c 6 超薄切片机德国l e i c a 公司 h - 7 6 5 0 b 透射电子显微镜日本日立公司 研究论文 京立l d 4 2 a 离心机北京京力公司 c s r - 1 3 0 型超纯水机北京爱思泰克公司 s i m f 1 2 4 制冰机日本s a n y o 公司 h x g l 0 0 4 5 0 a 型医用干燥箱江苏省墟沟电器厂 d n p 9 0 5 2 型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司 y x q g 0 2 型手提式电热压力蒸汽消毒锅山东安得医疗科技有限公司 s o r v a l l b i o f u g ef r e s c o 冷冻离心机 德国k e n d r ol a b r o t a r y 公司 m d f u 4 0 8 6 s 低温冰箱日本s a n y o 公司 e s j 2 0 0 4 电子天平沈阳龙腾电子有限公司 y k h - i 型液体快速混合器江西医疗器械厂 d y y - 6 b 型稳压稳流转移电泳仪北京市六一仪器厂 1 - 1 1 9 8 1 2 7 酸度计意大利h a n n a 公司 b h 2 型o l y m p u s 显微镜及摄像装置日本o l y m p u s 公司 m i v n t 图像分析系统中国山东易创 光学显微镜日本o l y m p u s 公司 l e i c a 石蜡切片机德国l e i c a 仪器公司 紫外可见分光光度计( d u 8 0 0 )美国b e c k m a nc o u l t e r 公司 紫外透射反射分析仪( z f 型)上海嘉鹏科技有限公司 1 3 主要试剂 2 5 戊二醛 锇酸 丙酮 环氧树脂e p o n 81 2 酸酐硬化剂d d s a 胺类加速剂d m p 3 0 n m a 枸橼酸 枸橼酸钠 m a s s o n 染色试剂盒 国药集团上海化学试剂有限公司 美国s i g m a 公司 天津市德恩化学试剂有限公司 美国s i g m a 公司 成都科龙化学试剂厂 国药集团上海化学试剂有限公司 美国s p i 公司 北京北化精细化学品有限责任公 司( 批号：2 0 0 6 0 8 2 0 ) 北京北化精细化学品有限责任公 司( 批号：2 0 0 5 0 8 0 5 ) 珠海贝索生物技术公司 研究论文 兔抗t g f p l 多克隆抗体美国s a n t ac r u z 公司 兔抗c t g f 多克隆抗体美国r & d 公司 s p 免疫组织化学染色试剂盒北京四正柏生物技术有限公司 t r i z o l 试剂 美国i n v i t r o g e n 公司 t a k a r a 砌姨p c r 陆( a m v ) v e r 3 0 宝生物工程( 大连) 有限公司 1 2 0 0 b pd n a l a d d e r北京泰格美科技有限公司 琼脂糖美国u n i c h e 公司 t g f p l 、c t g f 、p - a c t i n 引物 上海生工公司 氯仿天津市福晨化学试剂厂 异丙醇天津市福晨化学试剂厂 无水乙醇天津市福晨化学试剂厂 d e p c美国a m r e s c o 公司 过氧化氢( h 2 0 2 )天津市福晨化学试剂厂 一j ； 甲醇天津市大茂化学仪器供应站 氯化钠( n a c l )天津市佳兴化工玻璃仪器有限公司 n a h 2 p 0 4 + 2 1 - 1 2 0天津市化学试剂厂 n a 2 h p 0 4 1 2 i - 1 2 0天津市化学试剂厂 2 方法 1 2 1 实验动物模型的制备及分组 清洁级雄性w i s t a r 大鼠4 2 只，适应性喂养1 周后，随机抽取8 只作 为假手术组，其余大鼠全部采用肾上腹主动脉缩窄术制作c h f 模型【l 】。 模型制作方法：各组大鼠手术前禁食1 2 h 以上，用3 戊巴比妥钠o 1 5m l 1 0 0 9 腹腔注射麻醉，腹部正中剑突下切开皮肤2 - - 一3 c m ，打开腹腔，在左肾动脉 上方分离腹主动脉，穿过一条“0 号丝线，将去尖磨钝的7 号手术针置 于丝线处，结扎丝线，抽取手术针，检查腹主动脉通畅后分层关腹。假手 术组大鼠分离腹主动脉后不做结扎。术后各组大鼠均给予连续3 d 青霉素 2 0 万单位腹腔注射。常规喂养4 周后，从造模大鼠中随机抽取1 0 只检测 血流动力学参数，结果达到c h f 模型成模标准即左室舒张末压( 1 e f t v e n t r i c u l a re n dd i a s t o l i cp r e s s u r e ，l v e d p ) 1 5 m m h g 【2 】。造模成功后， 将剩余大鼠( 2 4 只) 随机分为3 组，即心衰1 d 、心衰7 d 、心衰1 4 d 组， 每组8 只。 研究论文 2 2 血流动力学检测 用3 戊巴比妥钠o 1 5m l 1 0 0 9 腹腔注射麻醉，经右颈总动脉逆行插 管至左心室，另一端接压力换能器输入b l 。4 2 0 e 生物机能实验系统，记 录分析后获得l v e d p 及左室内压上升、下降最大速率( 1 e gv e n t r i c u l a r p r e s s u r er i s ea n df a l l ，4 - d p d t m a x ) 。 2 3 标本采集 各组大鼠到达观察终点时，将大鼠测体重，进行血流动力学检测后， 迅速开胸取出心脏，冰生理盐水洗净，滤纸吸干，沿房室沟剪掉两心房， 剪掉主、肺动脉，紧贴室间隔右侧剪下右心室游离壁，剩余部分即为左心 室。测定左心室质量，计算左心室质量与体重的比即左心室质量指数( 1 e f t v e n t r i c u l a rm a s si n d e x ，i ，) 后，取部分左心室放入4 多聚甲醛固定 2 4 h 以上，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，留待h e 和m a s s o n 染色及免 疫组织化学染色。另取1 n m 3 大小的左心室组织数块放入3 1 戊二醛中 固定，留待电镜观察心肌组织的超微结构改变。剩余左心室全部放入液氮 中保存，留待r t - p c r 检测。 2 4 大鼠左心室心肌组织病理学变化 2 4 1 苏木素伊红( 既) 染色 l e i c a 石蜡切片机连续切片，片厚5 岬。 ( 1 ) 石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗5 m i n x 2 次。 ( 2 ) 苏木素染色5 m i n 。 ( 3 ) 1 盐酸酒精、1 氨水分化。 ( 4 ) 水洗返蓝。 ( 5 ) 伊红染色2 m i n 。 ( 6 ) 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。 2 4 2m a s s o n 染色 l e i c a 石蜡切片机连续切片，片厚5 1 a m 。 ( 1 ) 石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗5 m i n x 2 次。 ( 2 ) 苏木素染色5 m i n 。 ( 3 ) 丽春红品红液染5 m i n 。 ( 4 ) o 5 冰醋酸水溶液快速冲洗。 ( 5 ) 1 磷钼酸水溶液快速处理，其切片由深红色至鲜红色至粉红色， i 研究论文 其颜色的掌握度必须在显微镜下控制染色。 ( 6 ) 直接用苯胺蓝染色。 ( 7 ) o 5 冰醋酸水溶液快速冲洗。 ( 8 ) 常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察。 m a s s o n 染色下心肌细胞呈红色，胶原呈蓝色。采用m i v n t 图像分析 系统在1 0 2 0 倍显微镜下，测定心肌胶原容积分数( c o l l a g e nv o l u m e f r a c t i o n ，a 腰) = 心肌胶原面积所测视野面积，每只大鼠选取6 张切片， 每张切片均随机选取3 个视野测量，取平均值。 2 5 透射电镜观察左心室心肌的超微结构 ( 1 ) 取材：取新鲜心肌组织并细切成l m m 3 的小块。 ( 2 ) 固定：用牙签将切好的组织小块挑入3 1 戊二醛进行固定，于4 c 时固定2 h ，再以1 锇酸进行固定1 h 。 ( 3 ) 漂洗：组织块经前固定以后，使用配制固定液所用同系缓冲液充 分漂洗，以除去残留的固定液，3 h x5 次，于4 。c ，可过夜。 “) 固定：以1 锇酸于4 。c 进行后固定1 5 h 。 ( 5 ) 漂洗：o 1 m o l l 磷酸盐缓冲液洗l h x3 次。 ( 6 ) 脱水：用梯度丙酮进行脱水，于4 。c ，逐级加大脱水剂浓度，步 骤如下：二 5 0 一7 0 一8 0 一9 0 一1 0 0 ( 两次) 每步1 0 - - - ，1 5 m i n ，前四步于 4 ，后两步为室温。 ( 7 ) 浸透 脱水剂：包埋剂时间 1：l1 h 纯包埋剂 3 h ( 8 ) 包埋：用环氧树脂进行包埋，具体做法是：先将包埋液注入胶囊， 再用牙签从浸透液中将组织块移入胶囊，置于其底部并拨正。也可先将组 织块放入胶囊底部，然后注入包埋液。注意在包埋时要将标签放好，以免 心衰组与假手术组相混。包埋剂的配制及比例如下： 环氧树脂e p o n 8 1 2 ( m 1 ) 9 9 8 酸酐硬化剂d d s a ( m 1 ) 2 4 8 胺类加速剂d m p 一3 0 ( “) 0 3 4 研究论文 n m a ( m 1 ) 4 5 4 ( 9 ) 包埋块聚合：4 0 1 2 h 6 0 2 4 h ( 1 0 ) 包埋块修整 将包埋块置于双筒解剖镜下，用去脂锋利刀片修整，使包埋块顶部呈 金字塔形。 ( 1 1 ) 为了选取所需要的研究部位或确定超薄切片的切割方向，先用 超薄切片机做成半薄切片，厚度为0 5 - 一2 1 a m ，将之捞于载玻片上，滴加 5 0 甲苯胺蓝( o 0 1 m o l l 磷酸盐缓冲液配制，p h7 2 7 4 ) ，在加热板上 染色2 - 3m i n ，用蒸馏水冲净多余染液，然后光镜下观察并选区定位。 ( 1 2 ) 切片：用超薄切片机将样品切成5 0 , - 、, 7 0 n m 厚度的超薄切片。 ( 1 3 ) 染色：在室温下，醋酸双氧铀液染色3 0 m i n 。 ( 1 4 ) 复染：在室温下，枸橼酸铅复染1 0 m i n 。 样品切片干燥后即可在透射电镜下观察。 2 6 左心室心肌组织t g f d 1 和c t g f 表达的检测 2 6 1 左心室心肌组织t g f p 1 和c t g f 蛋白表达的检测及定量分析 采用s p 免疫组织化学染色法观察左心室心肌组织t g f p 1 和c t g f 蛋白的表达。 ( 1 ) 石蜡切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗5 m i n x 2 次。 ( 2 ) 3 h 2 0 2 室温孵育1 5 - - - 2 0 m i n 以灭活内源性酶，p b s ( p h = 7 4 ) 洗 涤5m i n 3 次。 ( 3 ) 0 0 1m 枸橼酸盐缓冲液( p h = 6 o ) 微波预沸后放入切片，中档加热 修复1 0 - 1 5 m i n ，室温冷却后p b s 洗涤5 m i n x 3 次。 (