（海洋生物学专业论文）浙江索氏桃花水母的生物学及遗传分析.pdf

致谢 三年的研究生生活即将结束，在各位老师和同学的指导与帮助下，我走过 了这段不同寻常的历程，我要特别感谢三年里所有指导、关心和帮助过我的老师、 同学和朋友们。 首先，我要向尊敬的导师姜乃澄副教授致以深深的谢意。感谢他在学业上 给予我的谆谆教诲，从论文选题、实验设计、电镜照片的拍摄和分析到论文的构 思与撰写，得到了姜老师的悉心指导、鼓励与帮助；感谢他在生活上给予我的关 山与照顾。姜老师不仅在研究上给予我悉心的指导与帮助，而且教给了我很多为 入处世的道理，姜老师对工作和事业的无比热情、对科学的严谨态度与孜孜追求 将会影响我整个科研生涯。 我还要特别感谢尊敬的刘季科教授和卢建平副教授。刘老师对我的实验与 论文撰写提出了许多宝贵的意见与建议；卢老师对我的研究及电镜照片分析给予 了很多意见与帮助。他们热情的指导和帮助，让我感激不尽、受益匪浅。同时还 要感谢浙江大学分析测试中心华家池分中心电镜室的黎军英老师，在电镜样品的 制备、观察和拍照过程中给予了详尽的指导和帮助；感谢大分子实验室的高其康 老师提供实验条件并给予热情指导。 此外，在研究生学习期间，师兄王弱、张晓辉，师姐于晓云、张立飞，师 妹郑聪霞，同学李红亮、项盈、贾兵兵等给予了我很大的帮助与鼓励，在此我表 示衷心的感谢。另外还要感谢我的家人给予我的无私支持、我的其他同学朋友给 予我的无私帮助，在此我也向他们表示衷心的感谢。 胡义波 2 0 0 5 年6 月 浙扣：大学硕十学位论文 中文摘要 桃花水母( c r a s p e d a c u s t as p ) 是一种原始的低等多细胞动物，具有重要的 学术和观赏价值。目前列桃花水母的分类主要依据外部的形态特征，但桃花水母 的形态常因生长发育的不同阶段，以及各地生存环境的差异而有所变化，因此国 内外学者对桃花水母的分类争议很大。本文从形态学和分子生物学两方面研究探 讨了采自浙江杭州余湖与绍兴羊山的桃花水母( 定种为索氏桃花水母 c r a s p e d a c u s t as o w e r b y il a n k e s t e r 1 8 8 0 ) 的分类地位与形态特征，为桃花水母的 分类提供分子水平的依据；并以杭州产索氏桃花水母为材料，系统地研究了桃花 水母的生殖腺发育及上皮组织与刺细胞的超微结构，旨在为桃花水母的生物学研 究积累基础资料。 主要研究结果如下： 1 杭州与绍兴产桃花水母的形态学鉴别特征为：触手分为3 级，主辐触手 明显较其它触手长；刺丝囊疣乳突状，围绕触手呈螺旋形排列：平衡囊管状；生 殖腺为长囊状。其形态鉴别特征与已知索氏桃花水母的基本一致，故将杭州与绍 兴产桃花水母定为索氏桃花水母。 2 对杭州产索氏桃花水母的形态特征，系统她进行数量统计与分析，发现 水母伞径与缘膜宽度的回归方程为y = o 0 7 0 3 x + 0 5 5 5 ( r 2 = o 3 7 3 7 ，p = 0 0 0 0 0 0 0 1 ) 、伞径与平衡囊数的回归方程为y = 5 9 4 7 9 x + 5 3 6 4 1 ( r 2 = o 2 4 6 1 ，p = 0 0 1 4 0 0 5 ) 、伞径与触手数的回归方程为y = 1 1 7 4 3 x + 1 8 1 9 3 ( r 2 = 0 2 7 7 6 ，p = o 0 0 8 0 0 1 ) ，均为显著或极显著的线性正相关关系；而平衡囊数与触手数之 刚的相关性不显著。性别对桃花水母伞径大小与缘膜宽度无显著性影响。 3 经序列比对分析，杭州与绍兴产桃花水母的核糖体小亚基r r n a 基因序 列与已知索氏桃花水母的核糖体小亚基r r n a 基因序列极为相似，序列相似度分 别为9 9 6 1 和9 9 4 5 ；与索氏桃花水母的遗传距离均为o 0 0 1 ；分子系统树分 析，杭州与绍兴产桃花水母与索氏桃花水母的分支置信度高达1 0 0 。综上分析， 杭州与绍兴产桃花水母均为索氏桃花水母。该结论与其形态学分类相一致。 4 索氏桃花水母的雄性生殖腺发育包括初级精母细胞、次级精母细胞、精 细胞及精子4 个发育阶段。其精子为典型的鞭毛型，可分为头、颈、尾3 部分。 浙江人乎硕士彳： 女论文 头部具一狭长三角形的高电子致密度的核，核两侧具许多纵行排列的颗粒，无项 体结构；预部山4 5 个大型线粒体和被其包围的中心体组成，出远端中心粒三 联体微管间的致密基质中伸出9 条随体样结构，且在其末端又有3 条随体链伸出： 尾部即鞭毛，其轴丝结构为9 2 + 2 型，鞭毛具侧鳍结构。 5 索氏桃花水母初级卵母细胞内具大量电子致密度不等的卵黄颗粒。在卵 黄形成过程中，线粒体、粗面内质网、核糖体始终参与卵黄颗粒的形成：而高尔 基体在较后阶段刁出现，并参与卵黄的形成。滤泡细胞通过指状突起与初级卵母 细胞相连，并将其卵黄颗粒转移至卵母细胞；滤泡细胞也可将卵黄颗粒物质胞吐 入滤泡腔，这些颗粒后经卵母细胞内吞入胞中。 6 ，索氏桃花水母的触手及环管处体壁结构均符合刺胞动物的两胚层特征， 即由内外皮肌细胞层及中胶层构成。外皮肌细胞层电子致密度较高：内皮肌细胞 层电子密度相对较低，细胞呈典型的倒t 形。皮肌细胞间主要的细胞连接方式 为隔壁连接和桥粒。环管处体壁的内皮肌细胞游离面微绒毛数量多，远比触手内 皮肌细胞的微绒毛发达。内、外皮肌细胞基部均具发达的肌原纤维，相互垂直分 布。中胶层由许多纤维细丝和由内、外皮肌细胞分泌的微小颗粒组成。 7 索氏桃花水母具两种刺细胞，即粘性刺丝囊刺细胞与穿刺刺丝囊刺细胞。 刺丝囊发育初期，囊中内含物电子致密度较低，以后电子致密度逐渐增高，并产 生小团分离，逐步形成盘曲的刺丝。在穿刺剌丝囊中，具中心粒结构；首次发现 刺丝囊后方具较大的线粒体，且嵴发达，可为刺丝的排放提供能量。 关键词：桃花水母；生物学；形态；分类；r r n a ：生殖腺；触手：体壁；刺细 胞：超微结构 浙江大学硕j 学位论文 a b s t r a c t c r a s p e d a c u s t aa r eak i n do f p r i m i t i v ea n dl o w e ri n v e r t e b r a t et h a ta r es i g n i f i c a n t i ns c i e n c ea n de n j o y m e n t t h ei d e n t i f i c a t i o na n dc l a s s i f i c a t i o no fs p e c i e so f c r a s p e d a e u s t aw e r em o s t l yb a s e do nt h eo b s e r v a t i o no fm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ， w h i c hv a r i e dw i t hd i f f e r e n tp h a s e so fg r o w t ha n dd e v e l o p m e n ta n dd i f f e r e n c eo f l i v i n ge n v i r o n m e n t s t h e r eh a v e h a dm u c ha r g u m e n ta b o u tt h ec l a s s i f i c a t i o no f s p e c i e so fc r a s p e d a c u s t a t h i sp a p e rd i s c u s s e dt h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n d c l a s s i f i c a t i o ns t a t u so fc r a s p e d a c u s t as p o fy u h u ，h a n g z h o ua n dy a n g s h a n ， s h a o x i n g ( w e r ei d e n t i f i e d a scs o w e r b y ob a s e do n m o r p h o l o g y a n dm o l e c u l a r b i o l o g y ，w h i c hp r o v i d e dm o l e c u l a r l e v e le v i d e n c ef o rt h ec l a s s i f i c a t i o no fcs p a n d i ts y s t e m a t i c a l l yi n v e s t i g a t e dt h eg o n a dd e v e l o p m e n ta n du l t r a s t r u c t u r e so fe p i t h e l i a l t i s s u e sa n dc n i d o b l a s to f cs o w e r b y io f h a n g z h o u t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h em o r p h o l o g i c a l l yi d e n t i f i c a t i o nc h a r a c t e r so fc r a s p e d a c u s t as p o f h a n g z h o ua n ds h a o x i n gi n c l u d et h a t ，t h et e n t a c l e sa r ed i v i d e di n t ot h r e e o r d e r sa n dp e r r a d i a lt e n t a c l e sa l el o n g e rt h a no t h e r s ，n e m a t o c y s tw a r l sa r e p a p i l l a s h a p e da n dh a v eas p i r a la r r a n g e m e n to nt h et e n t a c l e ，s t a t o c y s t sa r e t u b u l a ra n dg o n a d sa r el o n gp o c k e t l i k e t h e s ec h a r a c t e r sa r eb a s i c a l l y c o n s i s t e n tw i t ht h o s eo fcs o w e r b y i s ocs po fh a n g z h o ua n ds h a o x i n g a t ei d e n t i f i e da sc s o w g r b y il a n k e s l e r ，1g g o ， 2t h eq u a n t i t a t i v e l ym o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so fcs o w e r b y io fh a n g z h o u w e r er e c o r d e da n da n a l y z e d a c c o r d i n gt ot h es t a t i s t i cr e s u l t s ，t h er e g r e s s i o n e q u a t i o nb e t w e e nt h e d i a m e t e ro fu m b r e l l aa n dt h ew i d t ho fv e l u mi s y = 0 0 7 0 3 x + 0 5 5 5 ( r 2 = 0 3 7 3 7 ，p = 0 0 0 0 0 0 0 1 ) ，t h e r e g r e s s i o ne q u a t i o n b e t w e e nt h ed i a m e t e ro fu m b r e l l aa n dt h en u m b e ro fs t a t o c y s ti s y = 5 ，9 4 7 9 x + 5 3 6 4 1 ( r 2 = o 2 4 6 1 。p = 0 0 1 4 0 ，0 5 ) ，a n dt h er e g r e s s i o ne q u a t i o n b e t w e e nt h ed i a m e t e ro fu m b r e l l aa n dt h en u m b e ro ft e n t a c l e i s y = 1 1 7 4 3 x + 1 8 1 9 3 ( r z = 0 2 7 7 6 ，p = 0 0 0 8 罂o j 是警。基u gh蚤叶j廷咎宅委q 孽鼋鼙j 纽罄q苗j o 甘* u 对* 酋* u 甘祷 时* o 封* 封* 甘* ：；7：嚣丢蜡 群嚣医蜒 撑嚣- 圭蝌 撑蕃蜡鞭 撑嚣目i 器 挂嚣“f 臣 挂嚣h 1 * 撑嚣井岳 萎#q菩o，矗缸昌 甘篙 是邕茸o 矗_冀高二u 撑嚣寐$ 甘*撑幕世慊 蚶磐 娶譬u崔h晕ukooi。ads矗鲁。它写joqz嚣蠢二旨量鲁皂譬迄讨鲁譬u a8至dd篁岂g专co薯啊首曼意侵oiolidjog苫co禹qgou 葛一暑ij 捌丑窨斟彝最洲扑怕龄蛊嚣霉林噬站长撑嚣岬窜*榉嚣蜷皿 目懈 浙江大学硕士学位论文 2 2 2 形态学鉴别特征比较 将杭州产桃花水母与桃花水母属其它物种的形态学鉴别特征进行比较( 表 4 ) ，发现以杭州产为代表的桃花水母( 包括绍兴产种类) 形态特征与已知索氏桃 花水母的形态特征基本相同，并进一步结合杭州与绍兴产桃花水母核糖体小亚基 r r n a 基因序列的分析结果( 见论文第1 i 部分) ，将杭州与绍兴产的桃花水母订 为索氏桃花水母( c r a s p e d a c u s t a s o w e r b y i l a n k e s e r , 1 8 8 0 ) 。 2 3 杭州产索氏桃花水母形态特征的数量分析 2 3 1 形态特征间的相关关系与分析 2 3 1 1 伞径与缘膜宽度 利用体视显微镜，对8 7 只麻醉常态下的桃花水母( 随机采样) 的伞径和缘 膜宽度进行观测。统计分析发现，缘膜宽度约为伞径的1 1 0 ，分析结果见表5 。 表5 杭州产索氏桃花水母伞径和缘膜宽度的统计 t a b l e5s t a t i s t i c so fu m b e l l ad i a m e t e ra n dv e l u mw i d t ho f c $ o w e r b y if r o mh a n g z h o u 对伞径与缘膜宽度的线性相关性进行分析，结果发现：伞径与缘膜宽度的 相关系数r = 0 6 1 1 ，p = 0 0 0 0 00 1 ，存在极显著正相关。说明缘膜宽度随着水母 伞径的增大相应地增大。 用m i c r o s o f t e x c e l 和s p s s l 0 0 统计软件分析，桃花水母伞径与缘膜宽度的线 性回归分析如图7 所示，回归方程为y = 0 0 7 0 3 x + 0 5 5 5 ( r 2 = o 3 7 3 7 ，p = 00 0 0 0 0 0 1 ) 。 2 3 1 2 伞径与平衡囊数目 对麻醉后再固定的2 4 只桃花水母标本的伞径与平衡囊数进行观测，计数统 计分析结果见表6 。依据水母大小的不同，其平衡囊数平均为1 3 7 个，其中最多 浙江大学硕士学位论文 的为1 9 6 个，最少的为9 0 个。 童2 蓑z 毯 蝾0 1 5 伞径( m m ) 图7 杭州产索氏桃花水母的伞径与缘膜宽度的线性回归关系 f i g 7 l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sb e t w e e nu m b r e l l ad i a m e t e ra n dv e l u mw i d t h o fc s o w e r b y if r o mh a n g z h o u 表6 杭州产索氏桃花水母伞径和平衡囊数目的统计 t a b l e6s t a t i s t i c so f u m b r e l l ad i a m e t e ra n ds t a t o c y s tn u m b e ro f c s o w e r b y if r o mh a n g z h o u 样本数m s e 最小值最大值 s a m p l en u m b e r m i n i m u mm a x i m u m 伞径( ) 2 41 4 0 7 - t - 0 4 49 0 018 0 0 u m b r e l l ad i a n a e t e r 对伞径与平衡囊数目的相关性进行分析，结果发现：伞径与平衡囊数目的 相关系数r = 0 4 9 6 ，p = 0 0 1 4 0 0 5 ，呈显著正相关。说明随着水母伞径的增大， 位于伞缘上的平衡囊数目也相应地增多。 采用m i c r o s o f te x c e l 和s p s s l 0 0 统计软件分析，桃花水母伞径与平衡囊数的 线性回归分析如图8 所示，回归方程为y = 5 9 4 7 9 x + 5 3 6 4 1 ( r 2 = 0 2 4 6 1 ，p = 00 1 4 00 5 ) 。 浙江大学硕士学 _ 7 ：论文 一 皿 强 酬 据 牛 引 ：5引0 81 01 2 1 41 61 8 伞径( m ) 图8 杭卅l 产索氏桃花水母的伞径与平衡囊数的线性回归关系 f i g 8 l i n e a rr e g r e s s i o na n a l y s i sb e t w e e nu m b r e l l a d i a m e t e ra n ds t a t o c y s tn u m b e r o fcs o w e r b y if r o mh a n g z b o u 2 3 1 3 伞径与触手数目 对麻醉后再固定的2 4 只桃花水母标本的伞径与触手数目进行观测，计数统 计分析( 表7 ) 发现：触手数目平均为3 4 7 条，其中最多的为4 “条，最少的为 2 8 0 条。 表7 杭州产索氏桃花水母伞径和触手数目的统计 t a b l e7s t a t i s t i c so f u m b r e l l ad i a m e t e ra n dt e n t a c l en u m b e ro f e 8 0 w e r b y if r o mh a n g z h o u 样本数 m 士s e 最小值最大值 i-samplen u m b e r m i n i m u m m a x i m u m 伞径( “m ) 2 41 4 0 7 ：l - o 4 491 8 u m b r e l l a d i a m e t e r 。7 触手数( 个) 2 4 3 4 7 102 8 04 4 4 t e n l a c l en u m b e r 对伞径与触手数目的相关性进行分析，发现伞径与触手数目的相关系数r = o 5 2 7 ，p = 0 0 0 8 o ，0 5 。说明桃花水母雌雄个体的伞径大小无显著 性差异，即性别对桃花水母伞径大小不存在显著性影响。 2 3 2 2 | 生别对缘膜宽度的影响 对8 7 只随机采集的麻醉常态下的桃花水母的缘膜宽度进行测量，其中雄体 5 0 只，雌体3 7 只。计数统计分析见表1 0 。 表1 0 杭州产雌雄索氏桃花水母的缘膜宽度统计 t a b l e1 0s t a t i s t i c so f v e l t i mw i d t ho f m a l ea n df e m a l e c s o w e r b y if r o mh a n g z h o u 利用独立样本t 检验，分析杭州产索氏桃花水母的缘膜宽度的性别差异。结 果为： _ 1 1 9 0 ，d f = 8 5 p = 0 2 3 7 o 0 5 ，说明雌雄桃花水母的缘膜宽度无显著 性差异，即性别对桃花水母缘膜宽度无显著性影响。 3 讨论 3 1 桃花水母属分类的形态学特征分析 桃花水母具有多种可观察的形态特征，其中，既有可量化的，又有不可量 化的、可明确描述的特征。可量化的形态特征为水母伞径、缘膜宽度、触手数目 及其分级数、平衡囊数目等。不可量化而可明确描述的形态特征包括刺丝囊疣的 形状和排列、生殖腺的形状和颜色、平衡囊形状、主辐触手与其它触手的长度比 浙江人学硕士学位论文 较等。 对表3 所列的桃花水母的可量化形态特征进行分析，发现在已报道的桃花 水母物种中，其可量化的形态特征大多数不统一，也无一致性的规律。其原因有： 一是桃花水母标本以采集时间不同而形态特征有所变化。桃花水母产生过程中， 每一代水母体的出现都有较强的周期性。根据对杭州余湖产的索氏桃花水母的两 年多的观察，水母体在一段时间，以较小的个体为主，随着时间的推移慢慢长大， 此阶段又以较大的个体为主。此后随着大型个体消失( 有性繁殖后死亡) ，新一 代水母体又不断产生，水体中又会出现以小型个体为主的情况，一代一代交替变 换的周期约为1 0 一1 4 天左右。而这一现象，只有通过连续观察才能发现。因此， 在不同时间段随机采集的标本，其形态特征会有较大差异。作者认为，桃花水母 出现时，只采集少量标本，或仅采集一次，往往不能反映水母种群的整体特征； 二是已报道的某些物种的标本甚少，其观测的形态特征不能反映该物种的全部特 征，如分布于日本的伊势桃花水母，自1 9 2 1 年以来，仅采得一次标本且只有5 只个体；三是对某些可量化的形态特征的观测，有一定的误差。如触手数目和平 衡囊数目很多，无论是直接观测还是显微镜下观测，都会有一定的计数误差，在 所难免；四是对某些可量化的形态特征的量化标准不规范。如桃花水母触手长度 的分级，有的将其分为3 、4 、5 级，有的甚至多达6 或7 级，然而分级的标准又 无具体详尽的说明，这种人为的分类标准，反而增加了桃花水母分类的困难。 根据对杭州余湖产的索氏桃花水母的连续观察，认为桃花水母形态分类应 特别重视以下问题。 3 1 1 触手的分级 根据触手的着生位置，将触手分为3 级比较合理。其分级原则是，着生在4 条辐管外侧的主辐触手，为级触手。与主辐触手着生在同一水平面上的其它相 对较短的触手，为二级触手；二级触手在生存时长度会有变化，通常在主辐触手 间正中位置的长一些，各触手的长短并非固定不变，因此无继续分级的必要。位 于一级和二级触手腹侧、着生在同一水平面上，数量最多、长度相对最短的触手， 为三级触手；这些触手在生存时长度虽也有变化，但变化无规律，因此也无需对 三级触手再进一步分级( 图5 ) 。人为地过多分级，反而在具体分类鉴别时，制 造不必要的困惑。在3 级触手中，最常见的长度变化规律为：一级触手即4 条主 浙江大学硕j 吩位论文 辐触手最长，三级触手晟短，二级触手的长度介于二者之间。在己报道的物种中， 一级触手与二级触手的关系可分为以下两类：一类是一级触手明显长于二级触 手；另一类是一级触手与二级触手几乎等长。杭州与绍兴产的桃花水母生存时， 一级触手与二级触手的关系属于前一种类型。因此主辐触手与其它触手的长度变 化可作为桃花水母分类鉴别的重要特征。但在观测比较主辐触手与其它触手的长 度日寸，应以活体标本为对象，结果较准确。固定标本的触手会发生收缩，从而影 响观测的准确性。 3 1 。2 刺丝囊疣的形状与排列方式 位于桃花水母触手上的刺丝囊疣的形状和排列方式一般均作为桃花水母重 要的形态分类特征。j a r t k o w s k i ( 2 0 0 1 ) 也强调刺丝囊疣的形状和排列在桃花水 母分类中的重要性。由表4 可知，已报道的桃花水母刺丝囊疣形状有乳突状、球 形、低圆锥状、细长柱状或棒状，以及刺丝囊不聚集成疣等。虽然，刺丝囊疣在 显微镜下观察形状确切，可作为桃花水母属物种分类鉴别的特征，但问题是，对 刺丝囊疣形状的描述缺乏准确而统一的描述标准，即使是同一形态特征，研究者 的描述也会不一致，尤其是在未见到实体标本的情况下，对描述的理解各研究者 也会有很大的不同。因此，对刺丝囊疣形状的描述需进步规范化，减少主观性。 作者发现，触手上的刺丝囊疣的排列方式，随着触手的伸长或收缩会发生相应的 变化以致于造成观察差错，所以要做到对刺丝囊疣排列规律的准确描述有一定 的困难。本研究观察的桃花水母的刺丝囊疣排列呈螺旋形( 图版i ：5 ) ，形状明 显。但触手前部的刺丝囊疣排列紧密，似呈环形，在触手中部则可见刺丝囊疣明 显呈螺旋形排列。由此可见，以往文献中所述的刺丝囊排列方式如环形、马蹄 形、螺旋形，以及不规则排列等诸多类型，值得进一步研究和探词。 3 1 3 平衡囊的形状 平衡囊是位于水母伞缘处的感觉器官，内有一个平衡石。平衡囊形状是桃 花水母一个重要的形态学鉴别特征，己报道的平衡囊形状只有管形与球形两种。 总的来说，研究者关于平衡囊形状的描述较统一，分歧较小，有助于桃花水母属 物种的分类鉴别。 3 1 4 生殖腺的颜色与形状 由表3 可知，已报道的生殖腺颜色有褐黄色、微绿色、淡黄绿色、粉红色、 浙江大学硕1 嘈j 位论文 绿色及白色等，颜色种类虽较多，但有的区分度并不大。本研究中的桃花水母生 活标本生殖腺颜色为白色，但经固定后则变为浅褐黄色。因此，桃花水母生殖腺 颜色可能受外界生存环境的影响、或所食食物不同，或生长发育阶段不同而有所 变化。所以，作者认为，生殖腺的颜色不能作为桃花水母属物种分类的形态学鉴 别特征。 已报道的生殖腺形状有囊状、小囊状、扁囊状、小扁囊状、袋形、带形囊 状及长囊状等，形状较多。但对生殖腺形状特征的描述也不非常确切，如何理解 囊状与小囊状，扁囊状与小扁囊状，袋形与囊状之间的区分是最大的难点。作者 观察发现，在不同发育时期，生殖腺的大小、外形会发生一定的变化。上述对生 殖腺形状的描述并无实质上的差异。因此，对生殖腺形状的描述需有统一的标准， 其能否作为桃花水母属物种分类的形态学鉴别特征有待商榷。 总括上述，对桃花水母的分类需有严谨的科学态度与方法，仅凭少量标本 或一次采集，不足以确定其分类地位。必须采集大量的标本，尤其是不同发育阶 段的个体，对其进行形态特征的观测与描述，并对有关可量化的指标进行统计分 析，以增加这些形态特征观测的全面性和准确性。本研究观测了大量杭州余湖产 的桃花水母标本的形态特征，并对其进行了统计分析，发现水母的伞径与缘膜宽 度、平衡囊数目及触手数存在显著或极显著的线性正相关关系。由于绝大多数的 己报道桃花水母属物种的可量化的形态特征数据均为独立的离散数据，缺乏大量 数据的统计分析，因此，不能与己报道的桃花水母属各物种进行统计学的分析比 较。所以本研究所得的可量化形态特征的统计分析，可为今后桃花水母的形态分 类提供科学依据。 3 ，2 杭州与绍兴产索氏桃花水母的鉴别 将杭州和绍兴产桃花水母与桃花水母属其它物种的形态学鉴别特征进行比 较，结果发现，上述两地产的桃花水母的形态特征与已知索氏桃花水母的几乎一 致，主辐触手都较其它触手长，刺丝囊疣均呈乳突状，平衡囊都呈管形。索氏桃 花水母的刺丝囊疣呈环形排列，而杭州和绍兴产的桃花水母的刺丝囊疣呈螺旋形 排列，但作者认为二者的排列方式可能相同，因为，在显微镜下观察刺丝囊疣排 列时，触手前部的刺丝囊疣排列紧密，似呈环状排列，但在触手中部则明显可见 浙江大学硕j ：学位论文 刺丝囊疣呈螺旋形排列，故作者推测，索氏桃花水母的刺丝囊疣可能呈螺旋状排 列。索氏桃花水母的生殖腺呈囊状，杭州和绍兴产的桃花水母的生殖腺为长囊状， 其形状一致，只是作者更具体地描述了生殖腺的特征，因此作者认为，二者的生 殖腺形状相同。结合杭州与绍兴产桃花水母核糖体小基r r n a 基因序列分析结 果( 见论文第1 i 部分) ，本文研究的杭州和绍兴产的桃花水母可定种为索氏桃花 水母。 和振武( 1 9 8 0 b ) 将1 9 5 9 年在杭州西湖西泠印社附近一水池中所采集的桃 花水母最初作为索氏桃花水母的一个亚种，但后来又将其上升为独立的种杭 州桃花水母( ch a n g z h o u e n s 捃) ( h e z w ，2 0 0 3 ) 。将杭州与绍兴产的索氏桃花水 母与杭州桃花水母的形态学鉴别特征作一比较发现，二者平衡囊形状一致，均呈 管形；主辐触手都较其它触手长；杭州桃花水母的刺丝囊疣形状为圆锥状，杭州 与绍兴产的桃花水母的为乳突状，并无实质性的差异；杭州桃花水母的生殖腺呈 带形囊状，本研究中的桃花水母的为长囊状，也无本质的区别。杭州桃花水母的 刺丝囊疣排列不规则，而本研究中的桃花水母的刺丝囊疣排列呈螺旋形。二者刺 丝囊疣的排列虽有差异，但仅凭这一特征，将杭州桃花水母订为独立的种的依据 尚不充分。因此，作者认为，杭州桃花水母应恢复最初所定的名称，即杭州桃花 水母( cs o w e r b y ih a n g z h o u e n s 括) 。 3 3 数量分析在桃花水母分类上的应用 3 3 ，1 形态学的数量特征 本研究首次对索氏桃花水母的形态学特征进行数量统计和分析，分析了伞 径、缘膜宽度、平衡囊数、触手数及其之问的相关关系。结果发现，伞径与缘膜 宽度、平衡囊数及触手数存在显著或极显著的线性正相关关系。说明随着桃花水 母的伞径的增大，相应地缘膜宽度也逐渐加宽，平衡囊数和触手数也相应地增多。 据此，通过测得桃花水母的伞径，可预测其缘膜宽度，以及平衡囊和触手的数目。 本研究发现，平衡囊数与触手数的相关关系不显著。这与有关文献中的平 衡囊数与触手数呈一定的比例关系不同。本研究是基于大量标本的计数数据的统 计分析，而二者呈一定的比例关系可能是基于几个样本的计数比较得出的结果， 而无统计学的结论。因此，桃花水母形态特征间内在的变化规律需进行大量的计 4 l 浙江大学硕十学位论文 数统计分析，方可阐明。 3 3 2 性别对形态特征的影响 本文首次分析了桃花水母的性别对其伞径大小和缘膜宽度的影响。结果发 现，雌雄桃花水母的伞径和缘膜宽度不存在显著性差异。说明性别对桃花水母的 伞径和缘膜宽度未产生显著性作用。因此，在同一水体中，随机采集的桃花水母 个体的伞径和缘膜宽度的差异，与其性别无关，而与各个体所处的生长发育时期 不同有关。 浙江大学硕士学位论文 第1 i 部分 浙江两种桃花水母核糖体小亚基r r n a 基因序列分析 2 0 世纪9 0 年代以来，由于现代分子生物学技术的迅猛发展，尤其是聚合酶 链式反应技术( p c r ) 和d n a 测序技术的发明，使通过对生物某一信息大分子 的序列分析与比较，来鉴定分类物种、建立生物的系统发育树成为可能，而且该 项技术的应用领域在不断扩展。众所周知。d n a 分子作为生物遗传信息的载体， 不受外界因素、生物体不同发育阶段及器官组织差异的影响，每一个体的任一体 细胞均含有相同的遗传信息。因此，用d n a 分子遗传标记进行物种鉴别更为准 确可靠。针对国内在桃花水母形态分类中出现的一些混乱现象，有必要引入分子 生物学方法去阐明其分类难题。 目前，用于动物类d n a 测序的基因主要为线粒体d n a ( m t d n a ) 的细胞 色素b ( c y t - b ) 基因和1 6 sr r n a 基因以及d l o o p 序列。m t d n a 具有快速进化、 缺乏重组，以及严格的母系遗传等特点，是鉴定物种有效的遗传标记( 曹晖等， 2 0 0 1 ) 。但是m t d n a 属单拷贝基因，序列重排事件频繁，增加了分析难度。而 r r n a 基因是编码核糖体r r n a 的基因，以连续排列方式存在于所有的生物细胞 中，含量高达8 0 。它作为高度重复串联序列，包含进化速率不等的编码区、非 编码转录区和转录区，并由1 8 s 、5 8 s 和2 6 sr r n a 组成一个转录单位。其中， 位于核糖体小亚基的1 8 sr r n a 基因序列长度较保守，约1 8 k b ，由于协同进化 关系使得该序列片断在核基因组不同拷贝间趋于相近。因此，核糖体小亚基r r n a 基因的测序与分析在物种鉴定与系统发育演化方面的应用越来越广泛( f i e l d 等， 1 9 8 8 ：陈月琴等，1 9 9 9 ；郝家胜等，2 0 0 2 ；丁小霄等，2 0 0 4 ) 。 如论文第1 部分所述，杭州与绍兴两地的桃花水母的形态结构非常相似， 仅后者的生殖腺和二级触手较前者长，其它外形特征十分接近。按目前桃花水母 分类学标准，不可能是不同的种类。本研究通过p c r 和d n a 测序技术对采集自 杭州萧山和绍兴齐贤两地的桃花水母( 后文简称为杭州产和绍兴产桃花水母) 的 核糖体小亚基r r n a 基因进行测序与分析，试图对上述两种桃花水母进行比较， 浙江大学硕士学位论文 并确定与索氏桃花水母的关系，为桃花水母的分类提供d n a 分子水平的证据。 l 材料与方法 1 1 材料 实验用桃花水母于2 0 0 3 年6 月、2 0 0 4 年7 月分别采集自浙江绍兴齐贤镇羊 山与杭州萧山浦阳镇余湖，采集后取部分标本固定在7 0 乙醇中保存待用。 1 2 试剂与仪器 1 2 1 试剂 t e 缓冲液：3 0 0 n n n o l lt r i s h c i ，2 0 0 m m o l le d t a ，5 0 m m o l l n a c l ，p n 8 0 ， 高压蒸气灭菌1 5 m i n ，40 c 储存； d n a 提取缓冲液a ：5 0 m m o l l t r i s h c i ( p h 8 0 1 ，2 5 m m o l le d t a ， 2 5 m m o l l n a c l ，1 s d s ： d n a 提取液b ：3 m o l lk a c ( p h 7 2 ) ： 饱和酚：氯仿：异戊醇：按体积比2 5 ：2 4 ：1 混合； 6 电泳样品溶解液：溴酚蓝0 1 2 5 9 ，蔗糖2 0 9 ，t r i s h c l 缓冲液5 0 m l ； 5 x t b e 电泳缓冲液：5 4 9y r i s ，2 7 5 9 硼酸，0 5 m o l le d t a2 0 m l ( p h 8 0 1 ， 加水定容至1 0 0 0 m l ； d n a 长度标记物：m b if e r m e n t a s 公司的g e n er u l e r t ”1 k bd n al a d d e r 。 1 2 2 仪器 低温离心机：c e n t r i f u g e5 8 0 4 r 型( t i p p e n d o r f 公司) ； p c r 扩增仪：p t c 2 2 5 型( m jr e s e a r c h 公司) ； 电泳仪：d y y _ i i i 6 b 型稳压稳流电泳仪； 紫外透射反射仪：w f h 2 0 1 型： 凝胶成像系统：b i o s e n ss c 3 0 0 型； 电热恒温水槽：d k 8 d 型。 1 3 引物设计 桃花水母核糖体小亚基r r n a 基因p c r 扩增的引物根据m e d l i n 等( 1 9 8 8 ) 设计的引物序列合成。 引物a ：5 - a a cc t g g t tg a tc c t g c ca g t - 3 引物b ：5r - t g a t c c t t c t g c a g c r t t c a c c t a c 一3 浙 _ | = 大学硕士学位论文 由j 核糖体小亚基r r n a 基因长度为i 8k b 左右，利用 对引物进行d n a 测序反应无法得到此基因的全部序列，因此，根据刺胞动物门已测18 sr r n a 基 因的保守序列，结合利用前一对引物测序得到的序列，又新设计2 对测序引物 z j a 和z j b 、l d a 和l d b 进行测序。 引物z j a ：5 - g g gc c t t t a t a g g t c t c g c 一3 引物z j b ：5 - a a g a a c g g c c a t g c a c c a c 3 引物l d a ：5 - c c cc g t a t to t t a t tt c tt o - 3 引物l d b ：5 - g t g c a t g g c c o t t c t t a g t t o 一3 7 引物由上海博亚生物技术有限公司合成。 1 4 基因组d n a 的制备 将桃花水母样品从7 0 乙醇固定液中取出，经5 0 乙醇一3 0 乙醇一1 5 乙醇过渡，再用灭菌d d h 2 0 漂洗数遍，然后用灭菌滤纸吸干水分。 把样品置于1 5 m le p p e n d o r f 管里，先加入1 0 0 1 t ld n a 提取液a 仔细研磨， 然后边研磨边再加入适量提取液a ，直至研磨碎；把e p p e n d o r f 管置于电热恒温 水槽里6 5 c 水浴4 5 m i n ，中间取出混匀2 次。再加入等体积的d n a 提取液b ( 可 见沉淀) ，冰上放置1 h 以上；然后1 2 0 0 0 r p m ，4 低温离心1 0 m i n ，转移上清液 至新管中。加入等体积的饱和酚：氯仿：异戊酵( 2 5 ：2 4 ：i ) ，轻轻溻匀，1 2 0 0 0 r p m 低温离心1 0 m i n ，轻移上清液至新管；加入2 倍体积的预冷无水乙醇，混匀放置 一2 0 冰箱里，i h 以上：之后1 2 0 0 0 r p m 低温离心1 5 m i n ，小心倾尽上清，牧集 沉淀，用7 0 乙醇漂洗，再重复洗1 次；然后1 2 0 0 0 r p m 低温离心5 r a i n ，小心倾 尽上清，收集沉淀晾干或3 7 c 恒温箱里干燥1 5 r a i n 。最后每管加入2 0 p l 无菌 d d h 2 0 ，充分溶解后，一2 0 下保存备用。 1 5p c r 扩增及电泳检测 p c r 扩增体系：在o 5 m le p p e n d o r f 管中依次加入各试剂( 共5 0 1 ) ： 3 8 5 p ld d h 2 0 5 0 b t l 1 0 p c r 反应缓冲液 3 5 p l 2 5 m m o l lm g c l 2 o 5 u l4 种d n t p ( 1 0 m m ) o 5 p 1上游引物( 引物a ) 1 0 p m 浙江大学硕士学位论文 0 5 9 l下游引物( 引物b ) 1 0 l l m 1 0 p 1模板d n a ( 5 6 6 4 n g f 1 ) 0 5 9 lt a q d n a 聚合酶( 约2 5 单位) 混匀后稍离心，使管壁上的液滴沉至管底；利用p c r 扩增仪扩增，先9 4 变性2 r a i n ，然后p c r3 0 个循环( 9 4 。c1 0 s ，4 4 c 4 8 。c 5 2 。c6 0 s ，7 2 c1 5 0 s ) ，最 后一轮循环结束后，于7 2 。c 下保温1 0 m i n ，使反应产物扩增充分( c o l l i n s ，2 0 0 2 ) 。 取p c r 产物5 p 1 与6 x 电泳样品溶解液充分混合，进行d n a 琼脂糖凝胶电 泳( 凝胶浓度为o 8 ) 。电泳完毕后于0 5 _ t g m le b 溶液中染色半小时，最后置 于紫外透射反射仪下进行观察，并在凝胶成像系统下拍照。 1 6p c r 产物纯化 将剩余p c r 产物