（病理学与病理生理学专业论文）mmp9基因多态性与结直肠癌相关性研究.pdf

a n 口9 基因多态性与结直肠癌相关性一 摘要：目的：探讨在中国四川省泸州地区人群中，m m p 9 基因p 5 7 4 r 、 r 6 6 8 q 单核甘酸多态性多态位点与结直肠癌易感性；以及p 5 7 4 r 多态性位 点与结直肠癌肿瘤标志物、临床病理相关参数、血脂相关临床生化指标间 的相关性。方法：随机选取2 0 0 9 2 0 1 1 年四川省泸州医学院附属医院2 2 8 例结直肠癌确诊患者和1 0 0 例健康人群，抽取外周静脉血，使用酚一氯仿一 异戊醇法提取基因组d n a ，采用p c r 技术扩增特定基因片段，利用限制性 片段长度多态性，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及银染技术分别确定 m m p 9p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位点基因型。详细收集结直肠癌患者术前初诊临床 检测肿瘤标志物( a f p 、c e a 、c a l 9 9 、c a 7 2 4 ) 、血脂相关生化指标( t c 、 l d l c ) 以及临床病理参数( 部位、大体类型、组织学类型、分化程度、 浸润深度、淋巴结转移情况) 资料。采用卡方检验分析基因多态性位点基 因型频率分布，与结直肠癌的相关性及与肿瘤临床病理学参数的关系；采 用t 检验分析基因型频率与临床肿瘤标志物及临床生化指标相关性。所有 分析均采用s p s s1 3 0 软件进行，以p 0 0 5 具有统计学意义，以相对危险 度比值比( o d d sr a t i o ，o r ) 值和9 5 可信区间( 9 5 c o n f i d e n c ei n t e r v a l ， 9 5 c i ) 表示基因型和等位基因与结直肠癌的相关性。结果：( 1 ) 病例组 与健康组m m p 9p 5 7 4 r 和r 6 6 8 q 位点基因型频率及等位基因频率均符合 h a r d y - w e i n b e r g 平衡定律。p 5 7 4 r 和r 6 6 8 q 两位点基因型频率在病例一对 照组中的分布均无显著性差异，两位点基因型与结直肠癌发病无相关性 ( p = 0 4 81 ，o r = o 6 5 3 ，9 5 c i = o 2 3 4 1 8 2 3 ；p = 0 0 7 3 ，o r = 3 5 7 4 ，9 5 c i = 0 9 8 6 1 2 9 5 8 ) ；病例组与健康组m m p 9p 5 7 4 r 位点p 、r 等位基因频 率，分布无显著性差异i - p = 0 4 9 0 ；o r = 0 6 2 4 ；9 5 c i = 0 2 2 8 1 7 0 5 ；病例 组与健康组m m p 9r 6 6 8 q 位点r 、q 等位基因频率，分布无显著性差异 p = o 0 7 5 ；o r = 3 4 9 5 ；9 5 c i = 0 9 7 5 1 2 5 2 3 。( 2 ) 结直肠癌患者中m m p 9 p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型a f p 值无显著性差异( p = 0 2 0 5 ) ；结直肠 癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型c e a 值无显著性差异( p = o 7 4 5 ) ；结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型c a l 9 9 值无显著性差异( p = 0 5 6 6 ) ；结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + i 汛基因型c a 7 2 4 值无显著性差异( p = 0 4 6 0 ) 。( 3 ) 结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型频率在不同肿瘤部位( 结肠，直肠) 中 无显著性差异( p = 0 7 5 2 ) ；结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型频率在不同肿瘤大体类型( 溃疡型，隆起型) 中无显著性差异( p = 1 0 0 0 ，双侧) ；结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型频 率在不同肿瘤大小( 3c m ， 3c m ， 3c m ) ( p = 0 7 1 3 ，b i l a t e r a l ) ；t h ef r e q u e n c yo ft h e5 7 4 p p , p r + r r g e n o t y p el o c ii nt h ec o l o r e c t a lc a n c e rw a s n o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t i nd i f f e r e n th i s t o l o g i c a lt y p e s ( a d e n o c a r c i n o m a ，m u c i n o u sc a r c i n o m a ) w a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( p = 0 6 38 ，b i l a t e r a l ) ；t h ef r e q u e n c yo ft h e 57 4 p p , p r + r rg e n o t y p el o c i i nt h ec o l o r e c t a lc a n c e rw a sn o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n ti nd i f f e r e n tt u m o rd i f f e r e n t i a t i o n ( w e l l d i f f e r e n t i a t e d + w e l l m i d d l ed i f f e r e n t i a t e d ，m i d d l ed i f f e r e n t i a t e d + p o o r l y d i f f e r e n t i a t e d ) w a sn o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t ( p = 0 7 4 9 ，b i l a t e r a l ) ；t h e f r e q u e n c yo f t h e57 4 p p , p r + r rg e n o t y p el o c ii nt h ec o l o r e c t a lc a n c e r b i l a t e r a l ) ，l d l cv a l u e so fp r o rr r g e n o t y p ei np a t i e n t sw i t hc o l o r e c t a l c a n c e ri sl o w e rt h a np pg e n o t y p e c o n c l u s i o n ：1 m m p 一9p 5 7 4 r ，r 6 6 8 q p o l y m o r p h i s mh a sn o t h i n gt od ow i t hs u s c e p t i b i l i t yt oc o l o r e c t a lc a n c e r ；2 m m p 9p 5 7 4 rp o l y m o r p h i s mh a sn o t h i n gt od ow i t hb i o c h e m i c a l i n d i c a t o r so fc o l o r e c t a lc a n c e r ( a f p , c e a ，c a19 9 ，c a 7 2 - 4 ) 3 m m p - 9 p 5 7 4 r p o l y m o r p h i s ma n dc l i n i c o p a t h o l o g i c a lp a r a m e t e r s ( s i t e ，g r o s st y p e ， h i s t o l o g i c a lt y p e ，d i f f e r e n t i a t i o n ，i n v a s i o nd e p t h ，l y m p hn o d em e t a s t a s i s ) i nc o l o r e c t a lc a n c e ra r ei n d e p e n d e n t 4 m m p - 9 p 5 7 4 rp o l y m o r p h i s mi n p a t i e n t s w i t hc o l o r e c t a lc a n c e rh a s s o m e t h i n g t od ow i t hc l i n i c a l b i o c h e m i c a li n d i c a t o r so fl i p i d a n dm m p 一9p 57 4 rp o l y m o r p h i s mi n p a t i e n t sw i t hc o l o r e c t a lc a n c e rm a yb eat ca n dl d l - cl e v e lo fr i s k f a c t o rl e v e l s k e y w o r d s ：c o l o r e c t a lc a n c e r m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e 一9 s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s u s c e p t i b i l i t y a f p c e a c a 19 - 9 c a 7 2 - 4 t c l d l - - c 7 前言 结直肠癌( c o l o r e c t a lc a n c e r ) ，是威胁人类健康的主要肿瘤之一，全球 发病率和死亡率处于上升趋势。近年来我国结直肠癌的发病率呈上升趋势。 结直肠癌患者就诊时大多处于中晚期，部分患者失去手术机会，部分患者 术后很快发生转移和复发，严重危害人类身体健康i l l 。四川泸州地区结直 肠癌近年来发病呈明显上升趋势，因此，探究结直肠癌发生发展机理，对 防治结直肠癌、保护人民健康具有现实意义。 大肠癌的发生是多因素、多阶段的过程，是环境因素与遗传易感因素 共同作用的结果，而易感基因多态性是遗传易感的重要物质基础之一。环 境中存在着化学、物理、和生物致癌因子，一定条件下它们可以诱发肿瘤。 但暴露在同一环境下的人群，并非人人都发生肿瘤。这表明个体的内在因 素也起着作用，也就是说存在个体的易感性的差异。s n p s ( s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m s ) 个体间基因组d n a 序列同一位置单个核苷酸变异( 替代、 插入或缺失) 所引起的多态性，即在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引 起的d n a 序列多态性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。 基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e ，m m p s ) 是一类与肿瘤转移、 侵袭密切相关的蛋白水解酶，其作用底物是细胞外基质( e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ) 。m m p 9 是m m p s 中重要的成员，可由中性粒细胞、单核细胞、 血管内皮细胞、平滑肌细胞以酶原的形式分泌，经一系列酶解过程被激活 后形成型胶原酶，可降解、破坏靠近肿瘤细胞的e c m ( 细胞外基质，基 底膜) ，肿瘤可沿着缺失的基底膜向周围组织浸润，进而侵入小血管和淋巴 管而发生转移，导致肿瘤的浸润和转移。瞳3 国内外还有学者认为，m m p 9 冀 通过调节细胞的增殖和凋亡，改变细胞的微环境，调节毛细血管、新生血 管生成等参与肿瘤的发生过程。4 3 m m p 9 基因存在启动子区c 1 5 6 2 t 多态性位点、编码区r 2 7 9 q 、p 5 7 4 r 、 r 6 6 8 q 等多态性位点。并且这些多态性位点可能通过调节基因转录或蛋白 表达水平而影响肿瘤的发生、发展6 3 。过去对启动子区研究的比较多，编 码区相对较少。近来，有研究发现m m p 9 基因编码区多态性位点对肿瘤 的发生、发展，同样具有很重要的作用。p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位于血红素结合 区，对酶与底物和抑制物的结合力都有影响。有研究发现凹10 i ，胃肠道肿 瘤患者m m p 9 水平明显升高，其升高对胃肠道肿瘤的发生具有重要作用。 那么m m p 一9 基因p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 两位点多态性是否与结直肠癌易感性有关? m m p 一9 基因p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 两位点的不同基因型是否与我国四川泸州地区结 直肠癌发病有关? 因此，探究m m p 9 基因p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位点多态性在 我国西南泸州地区的易感性，具有重要意义。 临床检测肿瘤标志物是指从临床应用角度，在组织、血浆或其它体液 中能够检测到得与肿瘤有关生化物质，这些物质达到一定水平就能揭示某 种肿瘤的存在。肿瘤标记物在血清中出现的较早，对肿瘤的早期诊断具有 重要意义。目前，应用于结直肠癌的肿瘤标记物有甲种胎儿球蛋白( a f p ) 、 癌胚抗原( c e a ) 、糖链蛋白1 9 9 ( c a l 9 9 ) 、c a 7 2 4 ，它们对结直肠癌的 诊断、病变范围和程度的评估具有一定的临床价值口3 。 血清总胆固醇( t c ) ，低密度脂蛋白( l d l c ) 衡量血脂水平的一个 常用指标。有学者呻1 发现，具有远处转移的结直肠癌患者血清t c 、l d l c 相对高于未发生远处转移的患者。说明t c 、l d l c 与结直肠癌患者的转 移有关。 口 本研究主旨是探讨在中国西南地区人群中，m m p 9 基因p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 多态位点s n p s 与结直肠癌易感性的关系，m m p 9 基因p 5 7 4 r 与临床检测 肿瘤标志物( a f p 、c e a 、c a l 9 9 、c a 7 2 4 ) 的关系；与肿瘤临床病理学 参数( 部位、大体类型、组织学类型、化程度、浸润深度、淋巴结转移有 无) 的关系；与血脂生化指标( t c 、l d l c ) 的关系，为深化了解和认识 结直肠癌发生、发展和转移的相关遗传背景提供实验依据。 材料与方法 1 实验材料 1 1 实验标本 实验对象为2 2 8 位结直肠癌患者和1 0 0 位健康人群外周静脉血。2 2 8 位原发性结直肠癌患者外周静脉血采自泸州医学院2 0 0 9 年至2 0 1 1 年住院 手术前初诊患者，均经手术后病理检查诊断明确；其中男11 3 例，女1 1 5 例；年龄大于等于6 0 岁112 例，小于6 0 岁11 6 例。完整收集了患者术前 检查中的肿瘤标志物、血脂等相关生化指标，术后肿瘤临床病理学参数。 随机选取1 0 0 名与病例组同期的健康体检者作为对照组，其中男5 0 例，女 5 0 例；年龄大于等于6 0 岁4 2 例，小于6 0 岁5 8 例( 见表1 ) 。健康体检对 照组入选者既往无肿瘤病史，否认有肿瘤家族史。以上所有受检对象均为 四川泸州地区无血缘个体，在抽取外周血标本前均知情同意，并自愿参加 本项研究。所有实验个体均采集外周静脉血l m l ，经枸橼酸钠抗凝，一2 0 冰箱保存，并在采血后一周内用酚一氯仿法提取基因组d n a 。 表1结直肠癌患者和健康组年龄性别构成 t a b l e la g e s e xc o m p o s i t i o no ft h ec o l o r e c t a lc a n c e ra n dh e a l t h 1 2 实验仪器 电热恒温水浴锅( 北京市长风仪器仪表公司) 高速离心机( e p p e n d o r f 公司) p c r 扩增仪( a p p l i e db i o s y s t e m s ) 1 1 全自动数码凝胶成像系统( t a n o n 4 2 0 0 ) 垂直电泳槽( 北京市六一仪器厂) d y y - 1 2 型电泳仪( 北京市六一仪器厂) 1 3 实验试剂 蛋白酶k ( m e r c k a m r s e c o ) 三氯甲烷( 成都金山化学试剂有限公司) t r i s 平衡酚( a m r e s c o ) 异戊醇( 成都金山化学试剂有限公司) 乙二胺四乙酸( e d t a ) ( 天津市博迪化工有限公司) 无水乙醇( 四川航嘉生物医药科技有限公司) t a qd n a 聚合酶( t a k a r a 宝生物( 大连) 工程有限公司) 溴化乙啶( s i g m a ) lo x l o a d i n gb u f f e r ( t a k a r a 公司) l o x 丙烯酰胺( a r y l a m i d e ) ( s i g m a 公司) n ，n 二亚甲基双丙稀酰胺( 生工，生物工程( 上海) 有限公司) 四甲基乙二胺( t e m e d ) ( s i g m a 公司) 过硫酸胺( 生工生物工程( 上海) 有限公司) 银染试剂 1 0 乙醇：无水乙醇1 0m 1 ，加入双蒸水至1 0 0m l 。 1 硝酸：取1m l 浓硝酸，加入双蒸水至1 0 0m l 。 o 1 硝酸银：取1g 硝酸银，加入双蒸水至1 0 0 0m l 。 3 碳酸钠：取3g 碳酸钠加入双蒸水至1 0 0m l ，碳酸钠完全溶解加入 0 0 8 5m l 甲醛混匀，常温保存。 2 实验方法 2 1 基因组d n a 提取 ( 1 ) 取4 0 0 p l 抗凝血，加入双蒸水1 0 0 0 9 l ，离心8 0 0 0 8 分钟。 ( 2 ) 弃上清，加入1 0 p l 蛋白酶k 、4 0 0 p l 水，混匀；3 7 。c 过夜( 或5 6 。cl 小时) 。 ( 3 ) 加入等体积的酚一氯仿一异戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，混匀，1 2 0 0 0 x 1 0 分钟。 ( 4 ) 吸取上层水相，加入等体积的氯仿一异戊醇( 2 4 ：1 ) 抽提一次。 ( 5 ) 吸取上层水相，加入过饱和氯化钠3 0 “l 及8 0 0 p l 冰冷无水乙醇， 混匀。 ( 6 ) 一2 0 。c 冷冻6 0 分钟( 或过夜) 后离心1 0 0 0 0 x 1 5 分钟，倒掉上层液 体。 ( 7 ) 吹干或真空抽干，溶解沉淀。 ( 8 ) 测量核酸的浓度和纯度，2 0 。c 冰箱保存。 2 2p c r 2 2 1 引物 ( 1 ) 采用p c r 技术扩增含m m p 9p 5 7 4 r 多态位点的特异性d n a 片 段，引物设计由生工生物工程( 上海) 有限公司设计。 上游引物：5 g c t g g a c t c g g t c t t t g a g g a t c 3 下游引物：5 t t g a g c c t c c t t g a c t g a t g g g 3 扩增片段长度为l1 2 b p 。 ( 2 ) 采用p c r 技术扩增含m m p 9r 6 6 8 q 多态位点的特异性d n a 片 段，引物设计由生工生物工程( 上海) 有限公司设计。 上游引物：5 a c a c g c a c g a c g t c t t c ca g t a t c - 3 下游引物：5 - g g g g c a t t t g tt t c c a t t t c c a 3 扩增片段长度为1 3 8 b p 。 2 2 2 扩增条件 ( 1 ) p 5 7 4 r 位点 p c r 反应体系为2 5 t x l ，其中含d n a 模板约2 1 d ，5l x ll o xp c r 缓冲 液，1 5p lm g c l 2 ，0 2 5 1 at a q d n a p o l y m e r a s e ，0 5 t ld n t p s ，引物各0 5p l ， d d h 2 0 补至2 5 i _ t l 。 9 4 3 m i n 9 4 5 6 7 2 3 5 c y c l e s 7 2 。c5 m i n 2 2 3p c r 产物检测保存 扩增产物经2 琼脂糖电泳及8 聚丙烯酰胺电泳。检测确认后2 0 。c 冰箱保存。 2 3 酶切消化 内切酶由n e we n g l a n db i o l a b s ( n e b ) 在线设计，m m p - 9 p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 内切酶分别为b a m hi 、t a qi 。 ( 1 ) 反应体系：b a m hi 和t a qi 酶切反应体系：p c r 产物约1 0 i t l ，内 切酶缓冲液2 9 l ，内切酶1 p l ，d dh 2 01 0 9 l 。 ( 2 ) 反应条件：b a m hi 酶切反应体系3 7 。c 4 小时；t a qi 酶切反应体 系6 5 。c 4 小时。 2 4 聚丙烯酰胺凝胶电泳与基因型判定 取2 9 l 酶切消化物，经8 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，1 0 乙醇固定1 0 分钟，1 硝酸酸化2 分钟，1 硝酸银染色15 分钟，碳酸钠甲醛显色。 含p 5 7 4 r 多态的p c r 产物酶切后p p 基因型产生9 3 b p 和1 9 b p 两条片 段，p r 基因型产生l1 2 b p 、9 3 b p 、1 9 b p 三条片段，r r 基因型产生l1 2 b p 一条片段。其中1 9 b p 分子量小，可能不易被发现，但不影响基因型的判断 分型。 、0广j c c l e e 幢 啦 僦 妇 0 0 n 含r 6 6 8 q 的p c r 产物酶切产物于8 非变性聚丙烯酰凝胶电泳分离， r r 基因型产生l1 5 b p 和2 3 b p 两个片段；r q 基因型产生1 3 8 b p 、l1 5 b p 和 2 3 b p 三个片段；q q 基因型产生1 3 8 b p 一个片段。其中2 3 b p 分子量小，可 能不易被发现，但不影响基因型的分型判断。 p 5 7 4 r 和r 6 6 8 q 两个位点各随机抽取1 例p c r 产物，基因测序，测 序结果由生工生物工程( 上海) 有限公司提供，基因序列及多态位点准确 无误。 表2m m p 9 基因多态性位点及基因型分析 t a b l e2m m p 一9g e n ep o l y m o r p h i s m ss i t e sa n dg e n o t y p e s 2 5 基因型频率及等位基因频率计算 2 5 1 基因型频率计算公式 各基因型频率= 各基因型个数个体总数 2 5 2 等位基因频率计算公式 ( 1 ) m m p 9p 5 7 4 r p 等位基因频率= ( 2 x p p 基因型个数+ p r 基因型个数) ( 2 x 个体 总数) r 等位基因频率= ( 2 i 浪基因型个数+ p r 基因型个数) ( 2 x 个体 总数) ( 2 ) m m p - 9r 6 6 8 q r 等位基因频率= ( 2 x r r 基因型个数+ r q 基因型个数) ( 2 x 个 】e 体总数) q 等位基因频率= ( 2 q q 基因型个数+ r q 基因型个数) ( 2 x 个 体总数) 2 6 统计学分析 数据统计分析采用s p s s1 3 0 版软件包( s p s sc o m p a n y , c h i c a g o ， i l l i n o i s ，u s a ) 进行，符合所有的统计检验以p 0 0 5 具有统计学意义。采 用卡方检验比较病例组和对照组基因型频率、等位基因频率之间分布差异； 采用卡方检验比较结直肠癌患者各位点基因型肿瘤临床病理参数( 部位、 大体类型、组织学类型、分化程度、润深度、淋巴结转移有无) ；采用t 检 验检测结直肠癌患者各位点基因型与肿瘤标志物( a f p 、c e a 、c a l 9 9 、 c a 7 2 4 ) 、血脂相关临床生化指标( t c 、l d l c ) 之间的关系。 结果 1 p c r r f l p 法检测m m p - 9p 5 7 4 r 和r 6 6 8 q 位点基因多态性 1 1d n a 浓度和纯度测定 外周静脉血标本采用酚一氯仿法提取基因组d n a ，经核酸检测仪测定 d n a 浓度和纯度，浓度均大于10 0 n g i - t l ，o d 2 6 0 2 8 0 值在1 6 0 1 8 0 ，符合 扩增要求。 1 2 特定基因片段扩增产物琼脂糖电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳结果( 图1 ； 图2 ) 2 0 0 b p 图2p c r 产物8 聚丙烯酰胺电泳结果 f i 9 2 p c rp r o d u c to f8 n o n - d e n a t u r i n gp o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i 1 、2 、3 、4 、5 、6 ，m m p 9p 5 7 4 r 位点p c r 产物 7 、8 、9 、1 0 、1 l 、1 2 ，m m p 9r 6 6 8 q 位点p c r 产物 1 3 ，m a r k e r - i l 、2 、3 、4 、5 、6 ，m m p 9p 5 7 4 rp c r p r o d u c t 7 、8 、9 、1 0 、l l 、1 2 ，m m p 9r 6 6 8 qp c rp r o d u c t 1 3 ，m a r k e r - i 1 3 限制性内切酶消化聚丙烯酰胺凝胶电泳及基因型分析结果( 图3 ；图4 ) _ f 猢誊。 2 0 0 b p l o o b p 123456789 图38 非变性聚丙稀酰胺电泳结果 f i 9 38 n o n d e n a t u r i n gp o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i s 1 ：m m p 9p 5 7 4 rp c r 产物2 ：m m p 一9p 5 7 4 rp p 基因型3 ：m m p 9p 5 7 4 rp r 基因型 4 ：m m p 9p 5 7 4 rr r 基因型5 ：m a r k e r - i6 ：m m p 9r 6 6 8 qp c r 产物 7 ：m m p 9r 6 6 8 qr r 基因型8 ：m m p 9r 6 6 8 qr q 基因型9 ：m a r k e r - i l ：m m p 一9p 5 7 4 rp c rp r o d u c t2 ：m m p 一9p 5 7 4 rp pg e n o t y p e3 ：m m p 一9p 5 7 4 rp r g e n o t y p e4 ：m m p 9p 5 7 4 rr rg e n o t y p e5 ：m a r k e r - i6 ：m m p 一9r 6 6 8 qp c rp r o d u c t 7 ：m m p 一9r 6 6 8 qr rg e n o t y p e8 ：m m p - 9r 6 6 8 qr q g e n o t y p e9 ：m a r k e r - i 劈暑曩 壤- 囊_ _ 一 一_ _ 一_ _ - - _ - 椿一 l o o b p - 女。“龋。一。 一 1234567 89 图4m m p 一9 r 6 6 8 q t a ql 内切酶产物 f i 9 4 m m p 一9r 6 6 8 q t a qie n z y m ep r o d u c t l ：m a r k e r - i8 7 1 2 m m p - 9r 6 6 8 qr q 杂合子基因型 露一 = ； _ r 【鼹 余为m m p - 9r 6 6 8 qr r 纯合子基因型 1 ：m a r k e r - i8 ，1 2 m m p - 9r 6 6 8 qr q g e n o t y p e t h er e s tm m p - 9r 6 6 8 qr r g e n o t y p e 1 4 基因测序验证 经基因测序，以上基因序列及多态位点准确无误。 1 5 对照组和病例组m m p 9p 5 7 4 r 和r 6 6 8 q 位点多态性结果 对照组m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 基因型9 5 例，p r + r r 基因型5 例。p 、 r 等位基因所占比例分别为9 7 5 、2 5 。r 6 6 8 q 位点r r 基因型9 4 例， r q + q q 基因型6 例。r 、q 等位基因所占比例分别为9 7 o 、3 o 。 病例组m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 基因型2 1 1 例，p r + r r 基因型1 7 例； p 、r 等位基因所占比例分别为9 6 1 、3 9 。r 6 6 8 q 位点r r 基因型2 2 4 例，r q + q q 基因型4 例；r 、q 等位基因所占比例分别为9 9 1 、o 9 。 见( 表3 ) 。 表32 0 0 9 2 0 1 1 年四川泸州地区病例组和健康组m m p 9p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位点基因多态 性结果 t a b l e 3 ：g e n o t y p eo f t h eg r o u po fc o l o r e c t a lc a n c e ra n dc o n t r o li nl uz h o ua r e a ，i ns i c h u a n p r o v i n c ei n2 0 0 9 - 2 0 11 s n p 位点 基凶分型 基因型及等位基囚 病例组)对照组( ) 2m m p 9p 5 7 4 r 和r 6 6 8 q 基因多态性与结直肠癌易感性 病例组和健康组m m p 9p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位点各基因型均符合 h a r d y w e i n b e r g 平衡定律检测，病例组p 值分别等于o 2 6 和o 8 9 ，健康组 p 值分别等于o 8 0 和o 7 6 。病例组和健康组p 、r 等位基因也均符合 h a r d y w e i n b e r g 平衡定律。病例组和健康组年龄( p = o 2 3 4 ) 和性别( p = o 6 4 8 ) 没有显著性差异。病例组与健康组p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型频率总 体分布无显著性差异( p = o 4 8 1 ) ；p 、r 等位基因频率总体分布无显著性差 异( ( p = o 4 9 0 ) 。病例组与健康组r 6 6 8 q 位点r r 、r q + q q 基因型频率总 体分布无显著性差异( p = o 0 7 3 ) ；r 、q 等位基因频率总体分布无显著性差 异( p = o 0 7 5 ) ( 表4 ；图5 ；图6 ) 。 表4 ：2 0 0 9 2 0 1 1 年四川泸州地区结直肠癌组和健康组基因型 t a b l e 4 ：g e n o t y p eo f t h eg r o u po f c o l o r e c t a lc a n c e ra n dc o n t r o li nl u z h o ua r e a ，i ns i c h u a n p r o v i n c ei n2 0 0 9 2 011 s n p 位点 基囚分型 分型 病例组( )对照组( ) po rc 1 9 5 p s 7 4 r p p 2 1 1 ( 9 2 5 )9 5 ( 9 5 0 ) 0 4 8 1 0 6 5 3 p r + r r 1 7 ( 7 5 )5 ( 5 0 ) p 4 3 8 ( 9 6 1 ) 1 9 5 ( 9 7 5 ) r 1 8 3 9 ) 。 5 ( 2 5 l 。0 4 9 0 0 6 2 4 r 6 6 8 q r r 2 2 4 ( 9 8 2 ) 9 4 ( 9 4 0 ) r q + q q 4 1 8 ) 。6 ( 6 0 ) 0 0 7 3 3 5 7 4 0 2 3 4 - 1 8 2 3 0 2 2 8 - 1 7 0 5 0 9 8 6 - 1 2 9 5 8 r 4 5 2 ( 9 9 1 )1 9 4 ( 9 7 0 ) c t 4 ( 0 9 ) 。6 ( 3 0 ) 。0 0 7 5 3 4 9 50 9 7 5 - 1 2 5 2 3 图52 0 0 9 2 0 1 1 年四川泸州地区病例组和对照m g p 9 p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位点基因型 f i g5g e n o t y p eo f t h eg r o u po fc o l o r e c t a lc a n c e ra n dc o n t r o li nl uz h o ua r e a , i ns ic h u a n p r o v i n c ei n2 0 0 9 - 2 0 1l 图62 0 0 9 - 2 0 1 1 年四川泸州地区病例组和对照组m m p - 9p 5 7 4 r 、r 6 6 8 q 位点等位基 因 f i g6a l l e l ef r e q u e n c yo f t h eg r o u po fc o l o r e c t a lc a n c e ra n dc o n t r o li nl u z h o u a r e a ，i ns i c h u a np r o v i n c ei n2 0 0 9 - 2 01l 3m m p 9p 5 7 4 r 基因多态性与肿瘤标志物的相关性 图72 0 0 9 2 0 11 年四川泸州地区结直肠癌组肿瘤标志物( a f p 、c e a ) 与基因型 f i 9 7c o l e r e c t a lc a l l c e rt u m o rm a r k e r ( a f p , c e a ) a n dg e n o t y p e si nl uz h o ua r e a , i ns i c h u a np r o v i n c ei n2 0 0 9 2 011 图82 0 0 9 2 0 11 年四川泸州地区结直肠癌组肿瘤标志物( c a l 9 9 、c a 7 2 4 ) 与基因型 f i 9 8 c o l e r e c t a lc a n c e rt u m o rm a r k e r ( c a19 - 9 ，c a 7 2 4 ) a n dg e n o t y p e si nl u z h o ua r e a , i n s ic h u a np r o v i n c ei n2 0 0 9 2 011 4m m p 9p 5 7 4 r 基因多态性与肿瘤l 临床病理参数的相关性 结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 基因型频率在不同 肿瘤部位( 结肠、直肠) 没有显著性差异( p = 0 7 5 2 ，双侧) ；结直肠癌患者 中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 各基因型频率在不同肿瘤大体类型( 溃 疡型、隆起型) 中没有显著性差异( p = i 0 0 ，双侧) ；结直肠癌患者中p 5 7 4 r 位点p p 、r + r r 各基因型频率在不同肿瘤大小( 3c m 、 3a n ) 中没有显 著性差异( p = 0 7 1 3 ，双侧) ；结直肠癌患者中p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 各 基因型频率在不同肿瘤组织学类型( 腺癌、粘液腺癌) 没有显著性差异 ( p = 0 6 3 8 ，双侧) ；结直肠癌患者中p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 各基因型频 率在不同肿瘤腺癌分化程度( 高分化+ 高中分化、中分化+ 低分化，) 没有显 著性差异( p = 0 7 4 9 ，双侧) ；结直肠癌患者中p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 各基 因型频率在不同肿瘤浸润深度( 未到全层、全层) 没有显著性差异( p = i 0 0 ， 双侧) ；结直肠癌患者中p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 各基因型频率在肿瘤淋巴 结转移( 无转移、有转移) 没有显著性( p = o 7 6 6 ，双侧) ( 表6 ；图9 ) 。 表62 0 0 9 2 0 1 1 年四川泸州地区结直肠癌组肿瘤临床病理学参数与基因型 t a b l e 6c l i n i c o p a t h o l o g i cp a r a m e t e r so fc o l o r e c t a lc a n c e rt u m o r a n dg e n o t y p ei nl uz h o u a r e a ，i ns ic h u a np r o v i n c ei n2 0 0 9 - 2 0 11 基因型 f i 9 9c l i n i c o p a t h o l o g i cp a r a m e t e r so f c o l o r e c t a lc a n c e rt u m o r ( d e p t ho fi n v a s i o n ，l y m p h n o d em e t a s t a s i s ) a n dg e n o t y p ei nl uz h o ua r e a , i ns ic h u a n p r o v i n c ei n2 0 0 9 - 2 0 11 5m m p 9p 5 7 4 r 基因多态性与血脂相关临床生化指标的相关性 结直肠癌患者中m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + i 汰各基因型t c 值，差异 具有统计学意义( p = 0 0 3 8 ，p t 和r 2 7 9 q 基因型频率与对 照组间的差异无统计学意义。将2 7 9 r 和1 5 6 2 t 作为风险等位基因，含有 7 一至两个或多于两个风险等位基因的基因型并不增加患结直肠癌的风险。 同时，j a c o b se jn 目等人，也没有发现m m p 9 基因多态性与结直肠癌易感 性具有明确的相关性。 造成上述矛盾结果的可能原因有两点，第一，人群不同；第二，样本 数量仍然相对较少。需要更进一步的对结果进行验证。 2m m p 9p 5 7 4 r 基因多态性与临床检测肿瘤标志物的相关性 a f p 、c e a 、c a l 9 9 、c a 7 2 4 是临床比较常用的肿瘤标志物，对肿瘤 的早期诊断，具有重要意义。 本实验结果显示，结直肠癌患者m m p 9p 5 7 4 r 位点p p 、p r + r r 各 基因型a f p 、c e a 、c a l 9 9 、c a 7 2 4 值没有显著性差异。提示四川泸州 地区m m p 9p 5 7 4 r 位点的基因多态性与结直肠癌临床检测肿瘤标记物 ( a f p 、c e a 、c a l 9 9 、c a 7 2 4 ) 没有相关性。 3m m p 9p 5 7 4 r 基因多态性与肿瘤临床病理参数的相关性 本实验在四川泸州地区人群中，未发现m m p 9p 5 7 4 r 位点各基因型 频率与肿瘤组织部位、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、浸润深度、淋 巴结转移情况等临床病理学参数，具有显著性差异。 与本实验结果不一致，胡志斌等n 2 1 发现在中国西南省份，对7 4 4 例肺 癌患者和7 4 7 例健康组做病例对照研究，结果发现，在m m p 9 基因r 2 7 9 q 位点中，r r 基因型，与q q 基因型在淋巴结转移和非转移的肺癌中，差异 具有意义。r r 基因型是风险基因型。p 5 7 4 r 位点中，p p 、p r 基因型，与 r r 基因型相比，在肺癌组和正常组差异有意义。两各位点的联合作用， 使得肺癌风险增加，尤其是对具有淋巴结转移的肺癌。而r 6 6 8 q 基因型位 点多态性与肺癌的易感性和淋巴结转移无相关性，与本实验结果一致。 4m m p 9p 5 7 4 r 基因多态性与血脂相关生化指标的相关性 近年来，国内外许多学者已有研究表明血脂与恶性肿瘤的发生、转移 有密切关系。流行病学n 胡研究，血浆t c 含量高低和癌症的发生呈正相关。 也有研究有学者n 叫发现，具有远处转移的结直肠癌患者血清t c 、l d l c 相对高于未发生远处转移的患者。说明血脂高低可能会影响肿瘤的发生以 及转移。 本次实验结果显示，结直肠癌中m m p 9p 5 7 4 r 位点l d l c 值有显著 性差异，p r 或r r