（基础兽医学专业论文）fsh通过skp2、p27kip1调节仔猪睾丸支持细胞的增殖.pdf

m a s t e rd i s s e r t a t i o no fs o u t h w e s tu n i v e r s i t y t h ee f f e c to ff s ho nt h ee x p r e s s i o no fs k p 2 、p 2 7 k i p l i n c u l t u r e di m m a t u r eb o a rs e r t o l ic e l l s d i s c i p l i n e ：b a s i cv e t e r i n a r y d i r e c t i o n ：p h y s i o l o g y s u p e r v i s o r ： a d v i s e rp r o f w a n gx i a n z h o n g c a n d i d a t e ： g a nr u i c h o n g q i n g ，c h i n a m a y , 2 0 1 1 本研究为 国家自然科学基金项目( 3 1 0 7 2 1 8 3 ) 、中 央高校基本科研业务费专项项目 ( x d j k 2 0 0 9 8 0 3 5 ) 资助的部份内容 西南大学硕士学位论文目录 目录 中文摘要i a b s t r a c t 。i i i 第一章文献综述l 1 1 睾丸支持细胞1 1 1 1 睾丸支持细胞的结构特点1 1 1 2 睾丸支持细胞的主要功能l 1 2 睾丸支持细胞的增殖3 1 2 1 研究s c 增殖的意义3 1 2 2s c 增殖的分子机制4 1 3 促卵泡素与睾丸支持细胞的增殖6 1 3 1f s h 与f s h r 6 1 3 2c a m p - p l 诅途径7 1 3 3 钙离子通道。7 1 3 4e r k l 2 途径。7 1 3 5p 1 3 k p k b 途径8 1 3 6p l a 2 途径8 1 4 研究睾丸支持细胞增殖的应用前景8 1 4 1s c 在促细胞生长中的作用探索8 1 4 2s c 免疫豁免作用的应用探索9 1 4 3s c 在细胞冷冻复苏中的作用探索9 1 4 4 减少公畜的饲养量，提高经济效益。9 第二章引言1l 第三章实验材料与方法1 2 3 1 实验材料1 2 3 1 1 实验材料1 2 3 1 2 主要试剂和耗材1 2 3 1 3 试剂配制1 2 3 1 4 主要仪器1 4 3 2 方法1 5 3 2 1s c 的分离培养1 5 3 2 2s c 纯度鉴定1 5 3 2 3 细胞增殖1 6 西南大学硕士学位论文目录 3 2 4 免疫印迹1 6 3 2 5 荧光定量p c r 1 8 3 2 6f s h 作用不同时间对s c 增殖的影响。1 9 3 2 7c a m p 对s k p 2 、p 2 7 k i p l 表达的调节作用1 9 3 2 8p k a 对s k p 2 、p 2 7 k i p l 表达的调节19 3 2 8c a ，在s k p 2 、r , 2 7 k i p l 表达中的作用。1 9 3 2 9e r k 对s k p 2 、p 2 7 k i p l 表达的调节作用1 9 3 3 统计分析2 0 第四章实验结果2 l 4 1 支持细胞的分离、体外培养及纯度鉴定2 l 4 2r n a 的完整性检测2l 4 3p c r 扩增2 2 4 4 定量p c r 溶解曲线和标准曲线的制作2 2 4 5f s h 作用不同时间对s k p 2 表达的影响2 3 4 6c a m p - p k a 对f s h 诱导s k p 2 、p 2 7 i d p l 表达的影响2 4 4 7c a 2 + 在f s h 调节s k p 2 、p 2 7 蛳表达中的作用2 5 4 8e r k i 2 在f s h 在调节s k p 2 、p 2 7 娜1 表达中的作用2 6 第五章讨论2 8 第六章结论2 9 参考文献。3 0 致谢3 7 在校期间参与的课题和发表的文章3 8 西南大学硕士学位论文 中文摘要 暑曼曼量皇曼鼍曼舅 i ! l _ i i ii i 曼曼量皇璺皇皇詈皇曼鼍量暮鼍曼鼍鼍曼曼舅曼曼曼皇冒舅量量曼量曼量曼量量量 f s h 通过s k p 2 、p 2 7 硒p 1 调节仔猪睾丸支持 细胞的增殖 基础兽医硕士研究生甘瑞 指导教师王鲜忠副教授 中文摘要 睾丸支持细胞( s e r t o l ic e l l ，s c ) 是影响精子生成的最重要的因素，s c 与生精细胞数量 比例保持恒定是生精细胞分化的一个重要条件，s c 的数量决定了成年动物睾丸产生精子的数 量。s c 的增殖受多种因素的调节，在所有影响的激素和因子中，f s h 是调节s c 增殖过程最 重要的激素之一，而s k p 2 是调节细胞增殖的关键性因子，能与发生泛素化的p 2 7 坤1 结合，促 使p 2 7 却1 在2 6 s 的蛋白酶体上发生降解，促进细胞进程。 本研究拟以2 - 3 周龄的仔猪为研究对象，以f s h 调节s k p 2 的表达为核心，以培养的仔 猪睾丸支持细胞为实验材料，通过添加各种信号通路的抑制剂，运用w e s t e r nb l o t 检测s k p 2 、 p 2 7 b v l 蛋白的表达，运用实时荧光定量p c r 检测s k p 2m r n a 的表达，为进一步认识促卵泡素 调节睾丸支持细胞增殖的分子机制奠定基础。 实验结果如下： ( 1 ) f s h 促进了s k p 2 蛋白的表达，3 0 r a i n 时，蛋白的量最大，此后s k p 2 的表达有所下 降，到9 0 r a i n 时，s k p 2 蛋白的表达量与对照相比无明显差异。同时f s h 也促进了s k p 2m r n a 的表达，加入f s h1 5 m i n 后，s k p 2m r n a 的表达明显增加，与对照组相比增加了1 1 5 6 倍 ( 尸 0 0 5 ) ，在3 0 r a i n 时，s k p 2m r n a 表达量最高，是对照组的1 7 7 6 倍( p o 0 5 ) ， 但当u 0 1 2 6 与f s h 共同作用时s k p 2m r n a 的表达明显下降，与f s h 单独作用相比降低了 5 3 0 ( p o 0 5 ) 。 综上所述，本实验可以得到如下结论： ( 1 ) f s h ( 5 0 r l g m 1 ) 以时间依赖的方式促进了s k p 2 的表达，这一作用在3 0 m i n 时达到最佳效 果： ( 2 ) f s h 通过c a m p 的产生和促进c a 2 + 的内流激活e r k l 2 级联，并通过e r k l 2 级联诱 导s k p 2m r n a 和蛋白的表达； ( 3 ) 细胞中s k p 2 的水平与p 2 7 脚1 的水平成负相关。 关键词：促卵泡素( f s h ) ；支持细胞( s c ) i 细胞增殖；s 期蛋白激酶2 ( s k p 2 ) ；p 2 7 u p l 西南大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h ee f f e c to ff s ho nt h ee x p r e s s i o no fs k p 2 ，p 27 螂1 i nc u l t u r e di m m a t u r eb o a rs e r t o l ic e l l s b a s i cv e t e r i n a r yp o s t g r a d u a t e ：g a nr u i a d v i s e r ：a s s o c i t ep r o f w a n gx i a n z h o n g a b s t r a c t s e r t o l ic e l lp l a y sa ni m p o r t a n tr o l ei ns p e r mp r o d u c t i o n i ti sn e c e s s a r yf o rac o n s t a n tr a t i oi n s e r t o l ic e l l sa n dg e r mc e l l st op r o m o t eg e r mc e l ld i f f e r e n t i a t i o n f u r t h o r m o r e ，t h en u m b e ro fs c d e t e r m i n e st h es i z eo fa d u l ta n i m a lt e s t e sa n ds p e r m sq u a n t i t y t h ep r o c e s so fs cp r o l i f e r a t i o ni s r e g u l a t e db ym a n yf a c t o r s ，i na l lo fw h i c hf s hi so n eo ft h em o s ti m p o r t a n th o r m o n e s s - p h a s e k i n a s e - a s s o c i a t e dp r o t e i n2 ( s k p 2 ) i sak e yf a c t o rt or e g u l a t i n gc e l lp r o l i f e r a t i o n , w h i c hc o u l db i n d u b i q u i t i n a t i o no f p 2 7 脚1o nt h e2 6 sp r o t e a s o m ed e g r a d a t i o na n dp r o m o t ec e l lp r o c e s s t h eo b j e c t i v eo ft h es t u d yi st oi d e n t i f yw h e t h e rf s hc o u l dr e g u l a t et h ee x p r e s s i o no fs k p 2 ， p 2 7 b v l ，a n dh o wf s hr e g u l a t e st h ep r o c e s s i nt h es t u d y , 2t o3w e e k - o l dp i g l e t sw a sc h o s e na s m a t e r i a l ，a n dt h ee x p r e s s i o no fs k p 2a n dp 2 7 脚1w e 心d e t e c t e db ya d d i n gi n h i b i t o r so fv a r i o u s s i g n a l i n gp a t h w a y s ，u s i n gw e s t e r nb l o tt od r t e c ts k p 2 ，p 2 7 k i p lp r o t e i n se x p r e s s i o n , a n dr e a lt i m e q u a n t i t a t i v ep c r d e t e c t i o no fs k p 2m r n ae x p r e s s i o n t h er e s u l t sw e t ea sf o l l o w e d ： ( 1 ) f s hp r o m o t e dt h ee x p r e s s i o no fs k p 2p r o t e i nf r o m1 5 9 0 r a i n , a n dt h ee x p r e s s i o nf os k p 2 p r o t e i nw a st h eh i g h e s ti n3 0m i n , t h e nt h ee x p r e s s i o no fs k ：p 2b e g a nt od e c r e a s e d f s ha l s o p r o m o t e ss k p 2m r n ae x p r e s s i o na f t e ra d d i n gf s h15 m i n , a n ds k p 2m r n ae x p r e s s i o nw a s s i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h ec o n t r o lg r o u pi n c r e a s e db y1 1 5 6t i m e s ( p 0 0 5 ) ，b u tu 01 2 6i n h i b i t e df s hi n d u c e dt h e e x p r e s s i o no fs k p 2m r n ac o m p a r e dw i t hf s h a l o n ed e c r e a s e d5 3 0 ( p o 0 5 ) i ns u m m a r y ，t h i ss t u d yc a nb et h ef o l l o w i n gc o n c l u s i o n s ： ( 1 ) f s h ( 5 0 n g m 1 ) p r o m o t et h ee x p r e s s i o no fs k p 2i ns e r t o l ic e l li nt i m e d e p e n d e n tm a n n e r a n dt h e e x p r e s s i o nf os k p 2p r o t e i nw a s t h eh i g h e s ti n3 0m i n ( 2 ) f s hi n d u c e ds k p 2m r n aa n dp r o t e i ne x p r e s s i o nt h r o u g hc a m pg e n e r a t i o na n dp r o m o t i n g t h ef l o wo f c a 2 + a n dt h ea c t i v a t i o no f e r k l 2c a s c a d e 0 ) t h el e v e lo fs k p 2a n dt h el e v e lo fp 2 7 砷1i sn e g a t i v ec o r r e l a t i o n i ns e r t o l ic e l l s k e yw o r d s ：f o l l i c l e - s t i m u l a t i n gh o r m o n e ( f s 两；s e r t o f ic e l l s ( s c ) ；c e l lp r o l i f e r a t i o n ； s - p h a s ek i n a s e - a s s o e i a t e dp r o t e i n2 ( s k p 2 ) ，p 2 7 _ p 1 i v 西南大学硕士学位论文文献综述 第一章文献综述 睾丸支持细胞( s e r t o l ic e l l ，s c ) 是由意大利组织学家s e r t o l i 于1 8 6 5 年发现的，它是一 种具有营养和调节生精细胞周期作用的体细胞，分布在各个时期的生精细胞之间，呈锥形， 底部较宽，贴附于基膜，顶部狭窄伸入管腔。相邻s c 基部侧突相接所形成的血睾屏障可阻挡 间质内的一些大分子物质穿过曲细精管上皮细胞之间的间隙进入管腔，起到保护精子的作用。 s c 能为发育中的精子提供激素、脂类、维生素等多种营养物质，因此作为生精细胞培养的饲 养层，s c 增殖能力的强弱直接影响了体外培养条件下生精细胞的存活时间以及分化潜力。s c 还具有良好的免疫豁免能力，共同移植s c 可延长同种异体移植物的存活时间，移入具有增殖 能力的s c 可以进一步延长异体移植物存活时间。保证正常的s c 增殖是s c 完成以上功能的 基本条件，所以，本文将阐述体外培养s c 的增殖机制，不仅可以丰富和完善雄性动物性腺的 发育生物学机制，而且还能挖掘公猪的生精潜力、降低生产成本以及延长移植器官的存活时 间、实现精子的体外培养奠定基础。 1 1 睾丸支持细胞 1 1 1 睾丸支持细胞的结构特点 睾丸支持细胞及其结构是由德国科学家e n r i c os e r t o l i 于1 8 6 5 年首先描述。s c 从生精上 皮顶端一直延伸到基底部，呈不规则锥体状，由细胞体向四周放射出许多突起，延伸到成熟 的生精细胞之间【1 1 。镜下的支持细胞的细胞核多位于基底，核大且不规则，核切迹清晰可见， 核膜多皱褶，核多呈现分叶状，呈椭圆形或不规则形，核仁明显，异染色质少，核孔多，核 质均匀。细胞浆内含有大量细胞器，如：滑面内质网、高尔基体、线粒体等，线粒体较多， 含有许多的溶酶体，自噬体和异噬泡及脂滴1 2 】。 体外培养的s c 在4 l 眨生右开始贴壁生长，培养至3 0 h 时已完全贴壁，呈刷状，液面悬浮着未 贴壁的细胞及其细胞团块主要是精细胞和支持细胞团块。至6 0 h ，细胞完全贴壁铺开，相互连 接成片，胞间交错连接，细胞呈梭形或纤维状，细胞核清晰可见，位于胞体中央及边缘，胞 质中可见吞噬的小颗粒状物质及空泡，随着培养时间延长，细胞折光性减弱，传代后生精细胞 明显减少p 4 】。 1 1 2 睾丸支持细胞的主要功能 1 1 2 1 分化、成熟和营养生精细胞 生精细胞的发育和成熟需要较高浓度的雄激素，s c 分泌的雄激素结合蛋白( a b p ) 做为雄 激素的携带者和贮存者把低浓度的雄激素收集起来，使曲细精管内的雄激素维持在一个可利 用的稳定水平，有效缓冲了管内激素浓度的波动。乳酸是生精细胞生长发育所必须的物质之 西南大学硕士学位论文文献综述 ! i ir , , 鼍置皇量量皇笪量曼量皇曼置舅鼍曼鼍曼曼曼曼曼量曼曼量曼皇曼皇曼曼邑皇皇曼曼寰量曼皇量量鼍曼量量量量曼量 一，身体自身并不能产生，而s c 在f s h 、i g f 等因子的刺激下能将葡萄糖转化为乳酸，进一 步转运到生精细胞，保证其正常分化及其成剿卯。 1 1 2 2 参与形成血睾屏障 血睾屏障又称生精上皮屏障，该屏障将曲细精管内的生精细胞分为两个生理室一基底室 和近管腔室，分别由精原细胞、细线期前期初级精母细胞和细线期以后各级生精细胞组成， 屏障的作用是将不同分裂方式的生精细胞分别开来，监护它们按照规定方式进行分裂，并且 协调同步发育的作用，这样保证了曲细精管内稳定的生理条件【6 ，7 】。此外，血睾屏障不仅能使 维持曲细精管内高浓度的睾酮，而且也能使甘氨酸、丙氨酸、天门冬氨酸等具有较高的浓度， 这对于嘌呤碱和嘧啶碱的合成具有重要的意义p l 。 1 1 2 3 合成一些精子的结构蛋白 s y l v e s t e r 等( 1 9 8 4 ) 首次报道，支持细胞合成的一种二聚体酸性糖蛋白( d a gp r o t e i n ) ，是成 熟精子的一种结构蛋白。这种糖蛋白含有两个以二硫键相连的单体组成的大分子蛋白质，间 接免疫荧光定位表明其存在于睾丸支持细胞的胞浆、晚期精子细胞、成熟精子的项体及尾部 的颈段、主段和末段中。该蛋白能使精子表面带上较多的负电荷，有助于精子顺利通过附睾 1 7 一。 1 1 2 4 分泌功能 a b p 是支持细胞合成并且分泌的特殊蛋白质之一，a b p 通过和雄激素的结合后，增高了 曲细精管中雄激素的浓度，而睾丸和附睾中高浓度的雄激素有利于睾丸精子发生和精子 在附睾中的成熟【s 】。s c 还可分泌抑制素，抑制素是一种垂体释放f s h 的负反馈调节因子； s c 分泌的曲细精管生长因子，始动曲细精管基底区内精原细胞的有丝分裂或诱导两次成熟分 裂；s c 还可以产生血纤维蛋白溶酶原激活因子，该因子激活血纤维蛋白溶酶原使之成为血纤 维蛋白溶酶，对松开支持细胞的紧密连接起到一定的作用。 除内分泌功能外，s c 还具有外分泌作用，如曲细精管内睾网液主要由支持细胞分泌，有 助于精子排向附睾。 1 1 2 5 精子释放 精子释放与支持细胞活动有关，确切机制目前仍不清楚，学说一般认为与支持细胞质中 微丝和微管活动有关。晚期的精子细胞与支持细胞胞质相连区域，精子和支持细胞膜之间发 生膜特化现象。靠近精子头部的细胞质呈长囊状突起，深深地插入支持细胞的胞浆，其下方 的内质网膨胀呈小泡状，有人称之为顶体周围复合体或叫做片状层结构。复合体由肌动蛋白 细丝组成，精子释放时肌动蛋白细丝收缩从而将精子释放入管腔，部分胞质则遗留在支持细 胞中并为支持细胞所吞噬。 2 西南大学硕士学位论文文献综述 1 1 2 6 吞噬作用 无论在体内还是体外培养的支持细胞均有较强的吞噬能力。在曲细精管的体外培养过程 中，支持细胞能快速的清除退化的生精细胞，同时伴随其胞质内包涵物的增多。在体内生精 过程中，已经证实了支持细胞可以吞噬退化生精细胞和残体的这一功能【9 1 。在生精细胞因各种 原因受到损害时，支持细胞吞噬活动便会显著增强。支持细胞的吞噬功能在维持曲细精管管 腔内环境的稳定上有一定意义f l 】o 1 1 2 7 免疫豁免 异体排斥反应是移植医学中的难题，而在睾丸中支持细胞能为发育中的生精细胞提供免 疫保护以及营养支持。睾丸是免疫豁免的基本单位，它具有支持同种异体以及异种间器官移 植的能力，有试验表明，睾丸支持细胞可以特定的表达f a s 配体的信使r n a ，对共同移植的细 胞具有局部的免疫保护功能，克服了伴随细胞移植而带来的排斥问题【9 l o 】。所以，研究s c 的 增殖机制对于延长移植物成活时间、实现精子的体外培养有十分重要的意义。 1 1 2 8 其他功能 v j l 甜等指出，支持细胞是血流和生殖细胞之间的“桥细胞”，生精过程所需要的许多物质， 包括激素都需要经过支持细胞的转运才能供给近管腔室的生精细胞。有人发现支持细胞与精 子细胞之间存在着非封闭性的间隙连接，而这种连接可能是两类细胞之间物质和信息交换的 基础。 1 2 睾丸支持细胞的增殖 在人和啮齿类动物，支持细胞的增殖开始于胚胎期。在大鼠，支持细胞于胚胎期的1 6 d 出 现增殖，并且在出生前2 d 达到最大值，数量大约为1 百万【1o 】。此后，尽管细胞的增殖活性有 所下降，但这些细胞仍具备增殖活性，在出生后1 5 d ，支持细胞的数量可达到4 千万。在1 5 d 时，支持细胞停止增殖，开始分化并且睾丸中支持细胞的数量在整个成年期都保持稳定。在 1 勉1 d ，支持细胞基本没有增殖能力，与细胞退出细胞周期的时间一致【l 。 1 2 1 研究s c 增殖的意义 一方面，s c 与发育中的生精细胞在结构上互相联系，每个s c 能支持大约3 0 5 0 个处 于不同发育阶段的生精细胞，因此，成年动物睾丸支持细胞的数量决定了睾丸的生精能力【l 引。 另一方面，体外培养具有受精能力的精子细胞是解决雄性不育的有效途径之一，而s c 具有营 养体外培养生精细胞的作用，所以，其增殖能力的强弱直接影响了生精细胞的存活时间以及 分化潜力。第三，s c 还具有免疫豁免功能，共同移植s c 可延长同种异体移植物的存活时间， 而移入具有增殖潜力的s c 则可以进一步延长异体移植物的存活时n t b 】。 3 西南大学硕士学位论文文献综述 1 2 2s c 增殖的分子机制 1 2 2 1 细胞周期的调节 细胞从生命周期的一个时期向另一个时期的进程受到g 1 、g i s 、s g 2 和g 2 m 等检测点 的调控。每一个检测点都由三个部份组成，其中d n a 合成不完整或细胞周期受损等事件属于 感受器，而信号传导途径将这些事件以信息的形式传递给效应器；效应器进而做出阻止细胞 周期进程的反应，直到这些受损的过程恢复为止。细胞周期中的检测点主要有三个，第一个 检测点是g 1 s 期，d n a 受损是主要的感受器；第二个检测点在g 2 m 期，主要是检测d n a 复制时的忠实性；第三个检测点叫做纺锤体检测点，主要检测纺锤体是否具有功能。g 1 期是 整合细胞外各种信号，调节细胞周期的关键期。当细胞的条件保证细胞能进入细胞周期时， 细胞便通过检测点，否则便进入g d 期。在生长因子的刺激下，c y c l i nd 表达并于依赖其的蛋 白激酶e d k 4 和c d k 6 结合，使下游的蛋白质如r b 磷酸化，释放转录因子e 2 f ，促进许多基因 的转录，如编码c y c l i n e 、a 和c d k l 的基因。因此，c y e l i nd 、e d k 4 e d k 6 a t 和它们的调节分 子、r b 的磷酸化是调节g l 进程的关键 1 4 , 1 5 , 1 6 1 。 g 1 s 的进程主要受到c d k 2 c y c l i ne 的调控。在这一阶段主要发生了两个分子事件：第一 是激活了e y c l i nd i 的降解，将p 2 l 1 从c d k 4 释放出来，抑制c d k 2 的活性；第二个事件是 在c d c 2 的t y r l 5 发生抑制剂磷酸化【1 7 堋。p 5 3 作为应激信息的接受器，通过诱导迫使细胞退出 细胞周期和细胞凋亡基因的转录而发挥作用，p 2 l 1 作为p 5 3 的一个靶基因，p 2 1 与 c d k 2 e y c l i n e 结合能使细胞停滞在g 1 s 期。在调节g 1 s 进程中，细胞中p 5 3 的水平是使细 胞停留在g 1 的关键因子。细胞主要是通过调节p 5 3 的降解来完成上调节其水平的，而泛素化 依赖的蛋白酶体途径是调节p 5 3 降解主要方式，其中e 3 为m d m 2 ；当d n a 损伤时可以通过 激活c h k 2 ( e h e c k p o i mk i n a s e2 ，h c d s l ) ，抑制m d m 2 与p 5 3 的结合，使p 5 3 的降解受到抑制， 从而提高其水平。c h k 2 通过a t m ( a t a x i at e l a n g i e e t a s i am u t a t e d ) 蛋白激酶使t h r 6 8 发生磷酸 化而被激活【1 9 刎。 s 的进程主要受到c y c l i nm c d k 2 的调控。电离放射提高了p 2 1 1 四的水平，同时也抑制了 c d k 的水平，并且p 2 1c l v l 可以通过降低c d k 的活性来减缓d n a 复制过程：但是如果在没有 p 2 1 c i v l 基因的细胞中，d n a 损伤后，检测仍然是完整的。因此，p 2 1 1 可能对于调节s 期的 进程并非必不可少【2 1 ，2 2 ，2 3 1 。 g 2 m 期的转化主要受到c d c 2 c y c l i nb 的调控，因此使c d c 2 c y c l i nb 处于失活状态是让 细胞保持在这一时期的关键是。这一过程主要是通过使c d c 2 的残基t 1 4 和y 1 5 发生抑制性 磷酸化，并且阻止c d c 2 5 c 磷脂酶的活性来实现的。此外，a t m 还可以通过调节c h k l 和c h k 2 的磷酸化而发挥作用，因为这两种蛋白激酶可以在s e t 2 1 6 磷酸化c d c 2 5 c ，并促使其与1 4 - 3 3 结合，把c d c 2 5 c 限制在细胞质，因此阻止细胞核中的c d c 2 c y c l i nb 发生去磷酸化。在g 2 期， p 5 3 水平上调，并诱导p 2 1 1 四，同时也抑制了c d e 2 e y c l i nb 的活性 2 4 1 。 4 西南大学硕士学位论文文献综述 m 期是一个新复制完成的d n a 分开来，使两个姐妹染体具有相同基因组的时期。这一进 程始于染色体的浓缩和聚集。当浓缩后的染色体通过着丝粒蛋白复合物与从细胞两极的中心 粒散发出的纺锤体相连时，两个姐妹染色体分别被推向细胞的两极，并且每一组染色体形成 一个新的核被膜，为胞浆的分离作准备。如果姐妹染色体分离异常，那么新生的子细胞染色 体的数目就可能异常，这一现象通常在癌细胞中经常观察到【2 5 , 2 6 1 。 染色体与双极纺锤体相连 对于维持有丝分裂的正常是必需的，假如有缺陷，那么就会启动中期或后期的检测点。在正 常的有丝分裂活动中，当最后的染色休与双极纺锤体相连时，a p c 便可能被激活，这种激活 要被c d c 2 c y c l i nb 磷酸化的a p c 与c d c 2 0 的结合1 2 7 1 。活化的a p c c d c 2 0 能降解与有丝分裂 蛋白酶s e p a r i n 相连的s e c u r i n ，降解后的s e e u r i n 被释放出来并裂解与姐妹染色体聚集相关的 蛋白，从而使姐妹染色体发生分离【2 0 】。如果姐妹染色体不能与双极纺锤体正确连接，将会启 动有丝分裂检测。m a d l 和m a d 2 能与未与纺锤体连接的染色体上发生磷酸化的着丝粒相互结 合，并通过与c d c 2 0 结合从而阻止a p c c d c 2 0 复合物形成，抑制s e c u r i n 的降解和姐妹染色 体的分离 2 1 1 1 。在正常情况下，当最后着丝粒相连时，m a d 2 与a p c c d c 2 0 的结合便结束，并 伴随着c d c 2 0 m a d 2 的相互作用减弱，染色体也开始分离【2 9 j 。h b u b l 、h b u b l r 与b u b 3 这两 种相关的蛋白激酶也可以作为m a d l 和m a d 2 的上游分子发挥作用1 2 s , 3 0 1 。p l k s ( p o l o - l i k ek i n a s e ) 在整个有丝分裂中都发挥了重要作用，它一开始通过磷酸化激活c d c 2 c y c l i n b ，并同时激活 c d c 2 5 c 磷脂酶：随后能磷酸化并激活a p c ，在此之前a p c 已被c d c 2 c y c l i nb 进行了初步的 磷酸化，导致c y c l i nb 的降解，进而使细胞退出细胞周期【3 v 印3 1 。 1 2 2 2 细胞周期蛋白的调节 细胞周期调节系统通过周期性的激活和抑制调节蛋白的活性来调节细胞周期的进程 瞰】。其中c y c l i n 依赖的蛋白激酶( e y e l i n - d e p e n d e n tp r o t e i nk i n a s e s ，c d k s ) 便是一类在细胞周 期中具有重要调节作用的蛋白激酶，在细胞周期特定时期发挥功能的蛋白能被c d k s 磷酸化， 西南大学硕士学位论文 文献综述 p r o t e i n2 ，s k p 2 ) 的泛素蛋白酶体途径是调节p 2 7 降解的主要途径【4 l 4 引。蛋白质的泛素蛋白 酶体降解途径主要由两个步骤组成：多个泛素分子与底物蛋白结合，形成泛素化蛋白；发生 泛素化的蛋白在2 6 s 的蛋白酶体上被降解。泛素与靶蛋白的结合受到三种酶的调节：泛素激 活酶( e 1 ) ，泛素结合酶2 ) 和泛素连接酶3 ) ，其中e 3 主要对识别蛋白的特异性起决定作用。 a p c c ( a n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e xo rc y e l o s o m e c ) 和s c f ( s k p l - c d e 5 3 - f - b o xp r o t e i n ) 复合 物是调节细胞周期进程中最主要的两类e 3 酶 4 3 1 。a p c c 主要调节姐妹染色单体的分离，s c f 主要调节o l s 的进程。s c f 复合物由不变的成分包括s k p l 、c u l l 和r b x l 以及可变的成 分s k p 2 、f b w 7 和t r c p l 蛋白组成。其中s k p 2 、f b w 7 和t r c p l 属于f - b o x 蛋白家族的成 员，这个家族的蛋白共同特征是含有f - b o x 基序( m o t i f ) ， 此基序是介导与其他蛋白质发生相 互作用的位点，由于首先在c y c l i nf 中发现，故命名为f - b o x 。f b o x 基序通常位于蛋白质n 端，大约由5 0 个氨基酸组成，与蛋白质c 端的其他基序结合起来共同发挥作用。人类最常见 的2 种f - b o x 基序是l e u 丰富的重复单元吣) 和w d ( t r p - a s p ) 重复单元，f - b o x 蛋白缺 少严格的一致序列。s k p l s k p 2 ，作为一种调节哺乳动物细胞g 1 s 期转换的f b o x 蛋白，其 复合体的晶体结构研究表明，s k p 2 的f b o x 由3 个g t 螺旋组成，而后面约有7 0 个氨基酸的 “l i n k e r ”构成3 个非规范的l r r 结构域，并且和另外7 个l r r 结构域相邻接。每个l r r 都 由一个a 螺旋和一个b 片层组成，共同堆积成弯曲结构，再与f - b o x 相连，整个复合体的形 状像一把镰刀，s k p l 构成刀柄，而s k p 2 就像弯曲的刀片m ，4 5 问。 作为一种原癌基因，s k p 2 能与发生泛素化的p 2 7 结合，接着磷酸化p 2 7 的t h r l 8 7 ，促使 p 2 7 在2 6 s 的蛋白酶体上发生降解，进而激活e y e l i ne c d k 2 ，促进g 1 s 的进程1 4 7 。在小鼠的 s c ，甲状腺素通过下调s k p 2 水平，可以提高p 2 7 与p 2 1 的水平，进而抑制s c 增殖【4 8 】。进一 步研究表明，细胞中s k p 2 与c k s l 的水平几乎同步变化，因此，细胞中c k s l 的水平可以通过 s k p 2 的水平来反映1 4 9 1 。由此可知，作为细胞周期的关键因子，s k p 2 能较好的反映细胞周期调 控的真实情a t 5 0 1 。 1 3 促卵泡素与睾丸支持细胞的增殖 1 3 1f s h 与f s h r f s h 属于糖蛋白激素，由一个q 亚单位以及另外一个1 3 亚单位构成，其中1 3 亚单位是决 定激素特异性的。f s h 通过与细胞上的促卵泡素受体( f s h r ) 结合而传输信号【5 1 1 ，f s h r 是 一种g 蛋白偶联受体，受体肽链中有7 个保守的q 螺旋，所以受体完整肽链需要反复穿越膜7 次。f s h r 的基因由l o 个外显子编码，其中前9 个外显子编码受体胞外区域，最后一个编码 受体跨膜区域。在雄性睾丸的曲细精管中，只有s c 具有能结合f s h 的f s h r ，f s h 先与受体 胞外区域结合，一方面f s h 的构象发生一系列调整，至最适合信号转导的结构状态；另一方 面f s h r 的跨膜区域也发生结构改变，导致与g 蛋白结合的鸟苷酸类型由g d p 转变为g t p t 记】。 6 西南大学硕士学位论文文献综述 f s h 与睾丸支持细胞上f s h r 结合后，系列的构象变化至少可以激活5 条信号途径，通过 这5 条信号通路，s c 将来自f s h 的胞外信号转化为生精细胞需要的各种因子，从而支持生精 过程。 1 3 2c a m p p k a 途径 c a m p - p k a 途径是第一个被确认的f s h 信号调控途径，也是研究最为详细的途径【5 3 】。f s h 与支s c 上的受体结合后促使g 蛋白的q 单位与g d p 分离而与g t p 结合，同时伴随与另外两 个g 蛋白亚单位p 和y 分离，a 亚单位与g t p 结合后激活了腺苷酸环化酶( a c ) ，引起胞 浆中c a m p 生成。c a m p 水平的上升促使蛋白激酶a ( p r o t e i n k i n a s ea ，p k a ) 催化亚基释放出 来，p k a 被激活后，引起p k a 靶蛋白( 包括一系列与c a