（基础兽医学专业论文）乳及乳品中唾液酸含量的检测.pdfVIP

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论学位 文题目 乳及乳品中唾液酸含量的检测硕士 级别 学 学生 冯君 科导师 姓名专 基础兽医学李宏基、杨国宇 姓名 业 学位论文 否 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了丈中特别加 以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，指导教师对 此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明 确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：沼老师虢导师签名：季够罨 日期游占月y 阳日期：如嚼年月2 之日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷本和电子版 本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离开河南 农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单位为河南农业 大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农业大学所有，否则， 承担相应的法律责任。 一1 研究生签冬7 怎磊导师签名：季客麓学院领导签名：、由引 只期瓣月习同期小彤年6 月酮同期跏向群月y 穷 致谢 在论文完成之际，首先向我尊敬的导师李宏基副教授表示衷心的感谢和崇高 的敬意。三年来，李老师以渊博的学识、敏锐的眼光、严谨的治学态度在专业理 论知识上给予精心指导、热情启迪和严格要求：学业上给予引导、鞭策和鼓励； 生活上给予无微不至的照顾和关心。恩师的谆谆教诲及言传身教使我在掌握了许 多知识和技能的同时开阔了视野，活跃了思维，树立了正确的科研态度，这些都 将使我受益匪浅。在此，谨向恩师表示深深的谢意和衷心的祝愿，祝愿李老师一 生幸福、安康! 论文完成过程中，得到王星所教授、王艳玲教授、刘兴友教授、杨国宇教授、 刘太宇教授等老师的耐心指导和仔细审阅。衷心感谢本教研室的韩立强、王月影、 惠参军、王林枫、朱河水等老师对本课题给予宝贵建议和热情引导；中心实验室 的黄晓书副主任，高级实验师田玮老师等给予实验仪器上的大力支持和热心帮 助；硕士研究生李卫华、李岩、乔新安、李平、王静、王伟杰、林茂旺、耿娟、 李雪华、张岚、都军霞、范沛、何静卫等在实验和生活中都给予了大力帮助。还 有学校和院领导对我三年来研究工作的关心和支持。这份诚挚的情意是我永远的 财富，在此，衷心祝愿以上老师和同学心想事成、身体健康! 还要特别感谢我的家人，正是由于他们无私的关爱、默默地支持、正确道路 的指引，才铸就了今天的我。他们在物质上的帮助和精神上的鼓励，我都铭刻在 心! 衷心祝愿天下所有父母永远健康、幸福! 最后，向所有关心、支持我的老师、亲人和朋友表示深深的谢意! 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 摘要 本试验共分二个系列，系列i 建立了一种快速、简便、准确、高效的测定牛奶中唾液酸( s i a l i c a c i d ) 含量的方法；系列研究了不同时期牛奶中( 初乳、常乳、末乳) 的唾液酸动态变化模式 及奶粉中唾液酸的含量测定。 系列i 牛奶中唾液酸含量测定的方法建立 建立了一种准确、简便、快速的测定牛奶中唾液酸含量的高效液相色谱法。以s y m m e t r yc - 柱( 4 6 r a m 2 5 0 r a m ，5 l im ) 为固定相，柱温；3 5 ，以1 0 9 6 四氢呋喃水溶液( 含0 2 磷酸) 一乙腈 ( 9 2 ：8 ) 为流动相，在波长2 3 0 n m 处检测唾液酸的含量。分别从以下几个影响因素来优化反应条件： 从扫描波长、作用时间、温度等探讨最佳反应条件。在l o m l 的牛奶中加入1 5 m l 的三氯乙酸可以 使牛奶中的蛋白质沉淀完全，经离心后在上清液与沉淀中分别加入4 0 m l 和3 5 m l 的0 i m o l l 的 硫酸在8 0 条件下反应1 2 0 r a i n 可以使牛奶中与蛋白质结合的、与低聚糖结合的唾液酸完全释放， 然后调节p h 值到5 ，旋转蒸发，定容至l o m l ，过滤，取滤液i m l ，再加入1 0 m g m l 邻苯二氨盐酸 盐溶液( 用0 2 m o l l 硫酸氢钠溶液溶解) i m l ，在8 0 条件下，作用时间5 0 r a i n 衍生基本反应完 全。结果是线性范围为2 0 5 0 0ug m l ，线性回归方程式为y = 6 3 7 5 4 x 一2 7 7 6 5 8 ，相关系数r = o 9 9 9 3 ， 批内变异系数为1 4 9 ，批间变异系数1 9 8 。在样品中加入低、中、高三种不同浓度的标准品 溶液，所有样品的低加标量标准品的平均回收率在9 3 9 8 以上；中加标量标准品的平均回收率均 在9 6 3 3 以上；高加标量标准品的平均回收率均在1 0 0 9 7 以上。结果表明本法简便、快速、无 需梯度洗脱、分离效果好，适用于牛奶及乳品中唾液酸含量的检测和研究。 系列不同时期牛奶中唾液酸的动态变化模式及奶粉中唾液酸含量的测定 采取不同时期的牛奶( 初乳、常乳、末乳) ，分别检测其含量，初乳中唾液酸的总量参考值 为7 6 0 8 3 1 3 4 2i ig m l ；常乳中唾液酸总量1 i i 4 3 2 0 6ug m l ；末乳中的唾液酸总量 7 9 3 6 2 4 l 弘g m l 。奶粉中的唾液酸含量为4 7 6 4l lg g ，结果表明，初乳、常乳、末乳中与蛋 白质结合的唾液酸含量依次呈现下降的趋势：游离的和与低聚糖结合的唾液酸含量也呈现依次下 降的趋势，但初乳中的唾液酸含量最高。 关键词：牛奶；唾液酸；n 乙酰神经氨酸；检测；高效液相色谱法 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 第一部分：文献综述 1 唾液酸的研究进展 唾液酸( s i a l i c a c i d ，s a ) 最早由b l i x u l 从唾液腺粘蛋白中提取分离得到，因而命名为唾 液酸。尔后，k l e n k 由神经甙脂( g a n g l i o s i d e s ) 中分离出结晶性的多羟基氨酸，并命名为神经 氨酸( n e u r a m i n i ca c i d ) 。日本的山川民夫将在红细胞膜的研究中分离得到的一种物质命名为 h e m a t a m i n i ca c i d 。山川等又从马的血清中分离得到s e r o l a c t a m i n i ca c i d ，经结构分析确认这 些化合物实际与唾液酸为同一类物质。1 9 5 7 年，b l i z 等提出把这些氨基糖酸的基本结构 ( 5 - a m i n o - 3 ，5 - d i d e o x y - d - g l y e r o - d - g l a c t o n o n u l o p y r a n o s o n i ca c i d ) 命名为神经氨酸，而把 神经氨酸的一系列酰化物叫唾液酸。随着唾液酸衍生物的不断发现及合成研究进展，1 9 8 4 年小仓 治夫等拉1 提议将唾液酸的定义扩大，还包括神经氨酸的各种衍生物。 唾液酸广泛存在于生物的各种组织中，是构成细胞膜表面的复合糖复合物的组成成分，通 常在糖蛋白和糖脂的末端以糖甙的形式存在。特别是在脑、神经组织、血液、颌下腺、粘蛋白、 初乳中存在较多，有时在血清、体液和尿中也能发现游离的唾液酸。在大部分哺乳动物组织中发 现的唾液酸主要是n 乙酰神经氨酸( n - a c e t y l - n e u r a m i n i ca c i d ，n e u 5 a c ，图卜1 ) 。在马和狗的 血清中还发现有n 一羟乙酰基神经氨酸( n - g l y c o l o y l n e u r a m i n i ca c i d 。n e u 5 g c ) 。在脊椎动物和 低等动物( 如墨鱼、虾等) 的体内也含有各种唾液酸，如在鲑鱼卵中发现有唾液酸的类似物 3 - d e o x y d - g l y c e r o - d - g l a c t o - 2 - n o n u l o p y r a n o s o n i ca c i d ( 1 n ) 存在。从某种大肠菌中( 如 ec o li k 2 3 5 ) 也发现有n e u s g c 的复合体存在1 。还有报道从大豆及紫花苜蓿种子的水解产物亦发 现有n e u 5 g c ，尚有待进一步证实。唾液酸的食物来源主要是母乳，尤其是初乳中的含量最高，可 以寡聚糖、糖蛋白和糖脂形式存在。唾液酸在牛奶中主要有3 种状态h 1 ：与蛋白质结合状态、游 离状态和与低聚糖结合状态。最新报道证明唾液酸也是一种天然的大脑营养素，它能促进婴儿的 记忆和智力发育。最新的科学研究也证实了母乳中所含的唾液酸含量比普通配方奶粉高，基于这 个发现，美赞臣公司最近首次推出“唾液酸计划 ，即在奶粉中提高唾液酸含量。另外，唾液酸 及其衍生物在医药上也有重要的功能，它是一种止咳祛痰剂，对于中心和外周神经性疾病以及脱 髓鞘病均有疗效，以唾液酸为先导进行生物活性物质的探索已成为新药研究的一个新领域，唾液 酸及其衍生物在治疗流感、神经性疾病、炎症、肿瘤等方面均有很重要的应用价值。 、爹。乏一h r i - i n 州气丢广、 m尸h明 ? h 汤o 2 多己一h 磊芦、 3 一d e c j x y l _ ) - g l y c e r o - d g 工a c o m2 一 n o n u l o p y r a n ) e o ni ca c i d ( k f - ，n ) ( 3 j 图1 - 1 天然唾液酸的结构 2 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 两9 1 - 1t h e 岫m 贮胁o f m t 叫s a 1 1 母乳及乳品中唾液酸的研究简况 1 1 - l 早期的大脑发育及营养需求 大脑发育所需求的营养物质的作用受到人们的普遍关注。大脑的生长发育包括树突数量的迅 速增加、突触连接、神经胶质细胞数量的增加和髓鞘形成等，在妊娠2 6 周龄时达到高峰。在出 生后的第一年一直保持着较高的水平嘲。在这个关键时期，大量生理的、生化的、心理发育的根 基被形成，并且可能影响到成年期的各种活动h 3 。脑的迅速发育就需要从饮食中获得大量营养物 质，尤其是对于早产的婴儿! 人母乳中含有大量的各种营养物质，包括丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等去满足婴儿的 能量和营养需求弧剀。母乳中还包含着细胞活素类物质，生长因子和激素等物质影响着婴儿的生长 发育。它们能够增强婴儿机体的免疫反应和防护病原菌的侵袭h 1 。最近的研究表明婴儿出生后头 一个月的营养供给对于婴儿的认知能力，尤其是在语言技能方面的影响十分重要哺一1 。研究还表明， 母乳喂养早产儿与奶粉喂养早产儿相比，八岁时的母乳喂养儿的智商要高于奶粉喂养j l 哺1 。长链 多不饱和脂肪酸( l c p u f a s ) 尤其是d h a ( 二十二碳六烯酸) 已经成为这一研究领域的重点h 】，当 然还有其它的一些因子能够促进大脑的发育。本论文研究的主要是唾液酸( n - a c e t y l n e u r a m i n i c a c i d ，n e u s a c ) ，它的化学名叫n 一乙酰神经氨酸，它是一个在神经系统发育和其功能结构维护方 面所必需的九碳糖。有意义的是自然界中人乳中的唾液酸含量是最丰富的，因此研究者认为唾液 酸对于大脑发育和认知能力的培养具有十分重要的作用。 1 1 2 唾液酸的化学性质及分析 唾液酸家族大约由5 0 个成员组成阳，所有的衍生物都是带负电的9 碳糖神经氨酸，属于糖类， 由于带负电荷，因此它能被阴离子交换层析柱纯化分离，现在已经能得到纯品，这也给进一步的 研究带来了方便! 在人体中发现的唾液酸主要是来自于n 一乙酰神经氨酸的分支，n 一乙酰基经过羟 基化作用变成n 一羟乙酰基神经氨酸( n e u 5 g c ) ，这种衍生物在类人猿体内也可以找到悖1 。u c s d 的 研究组发现，除了人以外的所有哺乳动物，细胞表面存在n _ 乙酰神经氨酸( n e u s a c ) 和n 一羟乙 酰基神经氨酸( n e u 5 g c ) 两种形式。接着他们又发现了人类缺少n e u s g c 是由于一个基因的小小 突变，在其它哺乳动物当中，这个基因编码一种名为c m p - n e u 5 a c 羟化酶的酶，这种羟化酶通过 添加一个氧原子催化c m p - n e u 5 a c 到c m p - n e u s g c 的转变。没有这个酶，人类细胞就没有n e u s g c 而是有更多的n e u s a c 。 在动物体内，n e u 5 a c 和n e u s g c 的不同比例是来源于不同的种族差异、组织差异、个体差异 ”训。唾液酸分子可以在多个位点被取代，可以通过o - 乙酰基、0 _ 甲基化、o _ 硫酸酯或磷酸纤维素， 引发更广泛的亚型出现。由于在糖链的5 号位置上羟基代替了氨基，从而导致了2 一酮- 3 - 脱氧唾 液酸在鱼卵中的发现。 唾液酸在动物体内是普遍存在的，常常占据着细胞表面糖蛋白和糖脂等低聚糖链的末端。并 且在配糖体的化学和生物学功能的多样性方面发挥着重要的作用8 1 。唾液酸相对强的酸性( 平均 3 冯君乳及乳品中唾液黢含量的捡渊 p k a = 2 6 ) 有利于唾液酸与其相结合的碳水化合物糖链的自动水解伽。由于所带负电的唾液酸通 常位于细惹表面多聚糖的束燃，所以它们是和其它纲臆上生物诧学复合物接触鹃首要分子之一 i t 2 。唾液酸可以通过增加粘蛋白的粘饿、结合和主动转运带电离子如钙离子、维持细胞膜结构等 方面来保护细胞内皮。并且在隐蔽病毒的识别位点和充当生物学靶点方瑟发挥着双重作用阻1 3 1 。 1 1 3 曦液酸在母乳和婴儿奶粉配方中的浓度 母乳中含有大量的唾液酸化的低聚糖，然而在牛奶和婴儿奶粉配方中却发现唾液酸化的低聚 耱量狠少。在整个哺育婴，乙的过程中，初乳( 癸歹0 出生蘑l 一6 天静乳) 中的总唾液酸的含量大约 是1 5 5 0 m g l ，过渡乳( 婴儿出生后7 - 1 0 天) 中总唾液酸的含量大约是1 0 7 0 m g l ，婴，乙出生后一 个胃窝兰个胃母乳孛的总唾液酸的含纛分别是6 1 0 m g l ，3 2 0 m g l h 射。预产鳙蓠的母翼中总唾液酸 的含量要比哺乳期头三个月母乳中总唾液酸的含量高1 3 - 2 3 左右n 盯。由于婴儿奶粉配方是基于牛 奶基礁之上的，所以婴歹l 奶粉配方中熬唾液酸含量要比母乳中唾液酸的含量少褥多纠踟。基于牛 奶基础之上的婴儿奶粉配方是为正常分娩期的婴几设计的，其中乳清与酪蛋囱的比例是2 0 ：8 0 ， 唾液酸的含量是非常少的，大约有6 5 m g l 。对予早产的婴儿奶粉配方中的唾液酸含量是1 9 5 m g l ， 随后降低为1 3 4 m g l 娃q 。目前没有一个婴儿奶粉配方能够仿制母戮在整个泌乳期间的动态变化规 律设计的。在婴儿分娩后头墨个月的母乳中，7 3 8 的唾液酸是和游离的低聚糖结合在起的， 与蛋自震结合豹仅淹2 3 。鲻，游离形式存在的唾液酸为2 娲h 钳。然褥，在牛奶基础上设计麓婴歹毛 奶粉配方，7 0 9 6 的唾液酸是和蛋白质结合在一起的，c a r l s o n 引也得如同样的结论。并且，y a b e 等 人n 也证明了母乳中糖蛋自c d 3 6 上含有多聚唾液酸( 筠a ) 。在分娩屠第7 天劐6 个月的母翼孛 多聚唾液酸的含量在很大程度上是保持不变的n 。母乳当中含有乙酰神经氨酸，然而许多婴儿 奶粉配方是基于牛奶基础上设计出的，2 5 的唾液酸是以n 一糖基神经氨酸的形式存在的n 靠埘1 ，因 此，新生婴几摄取的唾液酸楚n - 糖基神经氨酸。日粮中，尤其是羔羊肉、猪肉和牛肉含有大量的 n 一糖基神经氨酸。因此，有规律的摄取这些物质可以获得充足的唾液酸，还可以提高机体的免疫 能力珏铂。对予薪生的婴，毛长期摄入泌耱基神经氨黢的结栗还没有检溅凄来。总之，母巍中所含酌 唾液酸是独特的，具有种族特异性，它是一种天然的生物学功能复杂的营养物质，不是奶粉制造 裔所能模仿代替的。 1 1 4 唾液酸在新生儿体内的合成 人类自身能够会成内源性的唾液酸，u d p 一舯乙酰氨基麓萄糖一2 一差向异构酶是糖酵解产物合 成唾液酸的关键性限速酶。最近，研究入员通过实时定量p c r 检测出了u d p - 渺乙酰氨基葡萄糖- 2 - 整向异构酶n 一乙酰甘露糖激酶的基因在3 7 日龄仔猪体内的表达，并且证实了肝脏是合成唾液酸 鼢主要器官瑚。在大鼠和几内亚猪体内，强卜n 一乙酰氨基葡萄糖一2 一差 句异构酶是呈发育型调节 的，即在出生时保持较低的活性，在出生后1 5 天表现出较高的活性怛。因此我们推测由于婴儿 藤霪手蕴积其他器官还没有豫成年人郡样发育成熟，萁合成凌源性睡液酸的能力是很有限的陇，箧 此新生婴儿需要足够的外源曛液酸去满足大脑快速发育的需要。研究表明初乳中的唾液酸的含黉 楚葛墨常丰富的，并奠随着泌乳簸的延长星现逐渐+ f 酶的趋势引。焉箍，唾液酸蝥酶( 能够使唾液 4 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 酸从唾液酸糖结合物分离出来) 的活性在大鼠肠粘膜内是很高的嗌1 。 1 2 唾液酸的代谢及其对动物中枢神经的影响 1 2 1 唾液酸的代谢 母乳中含有婴儿大脑发育所需要的唾液酸。然而硅铝层唾液酸的消化吸收机制仍然不能被人 们完全理解。母乳中的低聚糖似乎避免了在婴j m , 肠内溉鹳1 和仔猪体内心们的消化和吸收，但是这 些完整的低聚糖链是在结肠内迅速通过结肠微生物群的发酵而导致低聚糖的降解从而使唾液酸 释放出来，唾液酸从低聚糖链上分解下来也可能在其它肠道发生。在其它的一些物种中，肠粘膜 唾液酸苷酶的活性在哺乳期是最高的，并且与乳中唾液酸的含量呈正相关阱。由于唾液酸占据着 母乳中低聚糖链的末端位置，所以即使糖链的剩余部分抵制消化也会被自动水解的u 引。运用放射 性标记物n - 乙酰神经氨酸经过给啮齿类动物和猪口服或向腹腔内注射，结果表明只有少部分的唾 液酸是以结合的形式存在的。在大鼠幼仔中，用放射性元素标记的唾液酸结合物一硅铝乳糖 ( 一种在人乳中发现具有较高浓度的三糖) ，在注射后6 小时大部分被快速地吸收，3 0 停留在 组织中，还有约3 在大脑中心 ，在3 曰龄的仔猪体内，经过标记的游离形式的唾液酸经静脉给 药后2 小时，只有o 2 3 被吸收进入大脑体内嗽1 。被标记的唾液酸进入大脑，8 0 的唾液酸都 集中在突触小体的位置汹3 。血清白蛋白可能有携带神经节苷酯穿过血脑屏障的功能泓3 ，这就意 味着神经节苷酯结合的唾液酸通过血液运输被大脑摄取利用。 通过细胞培养的方法，可以来解释神经细胞是如何摄取唾液酸的机制，人类的各种细胞都拥 有一个有效的机制从周围的介质中去吸收游离的唾液酸，这些细胞包括b 淋巴细胞群、骨髓自血 病变异体、皮肤成纤维细胞和神经细胞瘤群哺瑚3 。唾液酸被人体吸收进入细胞的机理是由于细胞 的胞饮作用和溶酶体的运载作用 1 9 , 3 s j 。蛋白质结合的唾液酸也是通过胞饮作用被吸收的呻3 ，旦 进入细胞，唾液酸就会被溶酶体的唾液酸酶所分解，然后被转运到细胞液中，唾液酸残基在细胞 核里被激活后，被转运到高尔基复合体中整合成配糖体啪1 。人类脑细胞( 像神经元、星形胶质细 胞) 也能够摄取唾液酸，它能够改变细胞的行为功能。事实上，唾液酸前体物质及其衍生物对主 要的神经细胞培养物都有重要的影响，它能够抑制。7 3 和促进轴突的生长嘲1 ，抑制口l3 叼或者促进 跚j 们多聚唾液酸的合成，并且能改变多聚唾液酸抗原决定簇结构驺 。 l ，2 2 唾液酸对动物中枢神经的影响 1 2 2 1 哺乳动物补充唾液酸对学习行为的影响 重复给啮齿动物补充唾液酸，实验表明可以提高其学习和记忆力乜7 引】m o r g a n 和w i n i c k h 2 】 已阐述了在大鼠幼仔中注射唾液酸后其行为发生改变，这与脑中唾液酸量的增多是相关的。通过 使用y 型迷津法可以使这些影响持续到成年期纠。然而，当在大鼠生长迸发阶段注射唾液酸，脑 中唾液酸的含量不会上升也不会引起行为的改变3 1 。因此，通过饮食获得的唾液酸对于正在生长 发育的大脑的影响是有限的，因为大脑的发育是受时间决定的。另外，由于环境冈素的影响也会 刺激大鼠脑内唾液酸含量的增加4 1 ，这些结果就暗示着大脑中唾液酸的浓度在决定动物的行为方 面发挥着重要的作用。然而，婴儿大脑神经发育与母乳中含有唾液酸之间的关系还没有被探究。 5 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 最近，我们证实了在日粮中添加与蛋白质结合的唾液酸可以提高仔猪在迷宫里的学习和记忆 能力。通过给仔猪饲喂不同浓度的唾液酸，然后在迷宫里给它们一个简单的或者一个困难的视觉 信号来评估它们的学习能力，结果表明饲喂高剂量组的仔猪在迷宫里所犯的错误是最少的。因为 仔猪是人类婴儿的理想模型，尤其是对于早产的婴儿哺1 。研究结果表明仔猪和用母乳喂养的婴儿 在其生物化学和认知水平方面有着极为相似的变化。 对于人类，足月分娩的和早产的胎儿用母乳喂养5 个月其体内唾液酸的含量是用婴儿奶粉喂 养的两倍嘲，训。对于突然性死亡的婴儿，其结果表明：用母乳喂养儿大脑内的唾液酸浓度要比奶 粉喂养儿体内唾液酸的含量高的多嘲3 。因此，从受试人的调查结果来看，母乳中的外源性唾液酸 可以显著提高脑神经节苷脂、身体及组织中糖蛋白的唾液酸化作用，这将有助于报道母乳喂养几 其神经发育和智力水平要比奶粉喂养儿具有优势。 1 2 2 2 中枢神经系统中的唾液酸 哺乳动物神经细胞膜上的唾液酸含量要高于体内其他组织细胞膜上的含量，并且唾液酸在细 胞膜上的位置和含量在大脑发育过程中不断发生着变化啷 。大脑内的唾液酸6 5 都是和神经节 苷脂结合在一起的，3 2 的唾液酸是和糖蛋白质结合在一起的，只有不到3 的唾液酸是以游离 的形式存在的呻1 ，神经节苷脂属于糖鞘脂类化合物，它包含一个亲水的硅铝带低聚糖头簇和一个 由鞘氨醇和脂肪酸组成的疏水的神经酰胺，大脑内6 - 1 0 的总油脂都是由神经节苷脂构成 的。在成年人的大脑内，g u l 、6 d l a 、g d l b 、6 t l b 占总神经节苷脂的8 0 9 0 。对于人类，神经节 苷脂的浓度从妊娠第l o 周开始到婴儿出生后五年其浓度增加大约3 倍。神经节苷脂在同一时期 内能增加1 2 - 1 5 倍，而g m l 和6 d l a 最快增长发生在树突齿状结晶、轴突生长、突触发生的时期。 唾液酸单体可以组成长链的多聚唾液酸，极少数哺乳动物的蛋白质能够贮藏多聚唾液酸，多 聚唾液酸转移酶s t 8 i a i i 和s t 8 i a i v 能够合成多聚唾液酸并且能够携带它们埔引。虽然大鼠脑内的 钠离子通道能够携带多聚唾液酸邛3 1 ，但是在大脑内多聚唾液酸的主要传递者还是神经细胞粘附分 子( n u e r a lc e l la d h e s i o nm o l e c u l e ，n c w ) ，在大脑内与蛋白质结合的唾液酸中，多聚唾液酸 占据着重要的比例，在刚出生的大鼠体内可以达到3 0 旧3 ，然而在出生后6 8 天又降到1 0 - 1 4 “5 5 1 ，在2 8 日龄的大鼠体内只有4 e 4 1 , n c a m 对于多聚唾液酸独特的性质能够影响细胞的活 性，它包括对细胞的迁移，轴突的生长与分支，神经元的再生、突触的可塑性等方面旧翩】。 神经细胞粘附因子在胚胎发育过程中具有高度的聚唾液酸化作用，高度酸化的细胞由于空间 障碍和细胞间负电的排斥作用不能够互相粘附。邻近多聚唾液酸链的排斥作用导致分子的膨胀， 从而占据着较大的空间位置啷1 。这就阻碍了相对神经细胞粘附因子和细胞表面其它因子的结合 ( 图1 - 2 ) 。因此大脑在早期的发育过程中有高度的可塑性。相反，成年人的神经细胞粘附因子 聚唾液酸化作用不强。然而，在大脑的其它一些区域，像海马、嗅球区等终生都具有高度聚唾液 酸化作用的神经细胞粘附因子。多聚唾液酸在海马内的表达有助_ 丁突触连接的改型，有助于神经 元的迁移引。海马区域和内侧颞叶的周围区域在很大程度上对于短期记忆的形成和记忆巩同具有 十分重要的作用。 6 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 l r h r j c 嵋i 咖 r f 嗣啪 c 二，i f t f l l 0 7 l l r 牛，一眠 茹o j d j h 圈1 - 2p s a - n c 捌对于细胞结构的影响 f l g l - 2i n f l u e n c eo fp s a - n c h mo c e i ls u r f a c e s 1 2 2 3 唾液酸影响学习和记忆力的机制 食物中的唾液酸是如何影响动物学习和记忆力的? 通常对于幼龄的哺乳动物来说，通过在饮 食中补加唾液酸可导致其大脑中神经节苷脂结合的唾液酸与蛋白质结合的唾液酸的含量增加，这 就意味着提高神经节苷脂和糖蛋白的唾液酸化作用可以调节动物的学习反应。m o r g a n 和w i n i c k 早期的研究3 也发现了大部分的唾液酸都位于突触这个位置。这就意味着唾液酸可能影响着阳 性神经递质的移动、递质的释放、和突触形态学的改变c 2 7 , z s , 嘲。最近，研究人员发现唾液酸剂量 反应对在迷津训练中受训仔猪的大脑中海马s t 8 s i a l v 和g n e 的表达有影响。饮食中唾液酸含量 的增加与在受训中的仔猪体内聚唾液酸转移酶的表达量的增加是相对应的啪1 。大脑的正常发育与 学习活动可能要增加唾液酸化结构物质的需要量，包括大脑神经节苷脂和神经细胞粘附因子。然 而，在不同的唾液酸化结构物质之间的协同作用和潜在的间接影响就证实了唾液酸对动物体内学 习和记忆力的影响。 神经节苷脂在学习和记忆形成过程中的作用已经在啮齿类动物上试验过了，在我们过去发表 的论文当中我们讨论了神经节苷脂影响学习和记忆力形成的可能机理口朝，长期以来一个被人们所 公认的突触传递模型在( 图1 3 ) 中被表示出来。该图描述了神经节苷脂末端唾液酸残基在突触 上怎样和钙离子共同作用调节神经传递，钙离子是神经反应中的一个重要介质 7 1 , 7 2 3 0 多聚唾液酸 在大脑里与蛋白质结合的唾液酸中占重要比例，尤其是在新生的婴儿体内脚1 。细胞里的唾液酸浓 度调节着多聚唾液酸的表达引，对于受训的动物提高其体内的唾液酸水平也将有可能提高其多聚 唾液酸的水平。因此，与蛋白质结合的唾液酸化物质是一种与动物学习行为有关的糖蛋白。 7 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 i 卜 棚蕞灏黼 ? j 一； 、：一，二j ? 一、，7 ，一，鼻? ：7 ，： 审 翔l r 一誉蔫垒孵薹螽麓固蟪翳一蔫番毒豪裹爨 。，“n 1似n 17r 一，r “ p o , d t s y n a p ! i c i ，d o i a l r j 譬o d 圈1 - 3 神经节苷腊上的唾液酸对于神经传递的作用 f i 9 1 - 3r o l eo fs i a l i ca c i d0 1 1g a n g l t o s i d e si nn e u r o t r a n s m i s s i o n 对于神经节苷脂，不管是嗜同种的( 当两个相反的n c a m 分子结合) 还是嗜异染的( 当其它 的种类结合到n c 删) ，当被高度聚唾液酸化时就可以阻碍它们与其它物质的结合( 图i - 2 ) ，多聚 唾液酸能通过空间位阻和排斥其它的多聚唾液酸化的细胞来阻止其不恰当的神经连接。多聚唾液 酸在树突的表达有助于其生长和引导其与靶细胞的连接。当表达n c a m 的突触前神经元在表达或 者不表达n c a m 的突触后神经元面前，突触前神经元对于n c a m 表达的突触后神经元都将形成更多 的突触连接口钔。换句话说，突触连接的最大稳定性和突触连接的形成都将优先于表达n c a m 的突 触后神经元。多聚唾液酸在突触连接上也发挥着重要的作用。去除多聚唾液酸、废除表达n c a i i 神经元的突触连接的优先形成，缺少n c a m 的突触后神经元与不同的n c a m 亚型相互转染从而导致 了突触连接的更大密度盯射，因此多聚唾液酸在n c a m 上的存在有助于决定有多少突触连接的存在， 而突触连接的强度将取决于突触后神经细胞。 为了使突触连接更稳定些，多聚唾液酸可能被除去m 1 ，当突触连接发生在多聚唾液酸减少或 者缺失的情况下，一系列细胞内反应，像轴突过度生长、转录、活力下降等将会发生h 7 例。因此， 在突触发育过程中，聚唾液酸化的多样化程度将保证突触的合适连接。从海马和嗅球上的观察， n c a m 上的多聚唾液酸有助于大脑突触的可塑性。从缺少n c a m 小鼠的嗅球观察，多聚唾液酸的含 量也有着极大的减少呻1 ，并且海马区神经纤维分布和改变的轴突连接是紊乱的徊，在小鼠体内， 特异性的去除多聚唾液酸将会导致神经束的不正常、渐进性脑积水以及出生后生育力和生长发育 的不正常m 。 长时增强效应( l o n g - t e r mp o t e n t i a t i o n ，l t p ) 描述了当用高频率的刺激诱导时，突触连 接的效率可能会提高，这一现象被认为l t p 是目前研究学习和记忆细胞机制极为理想的模型和电 生理指标阳巩鼬j 。多聚唾液酸在l t p 中的作用通过去除小鼠体内的n c a m 已经被研究8 引，d i t y a t e v 等1 7 柚记录了海马切片培养可以提高经l t p 诱导后突触后神经元的密度和突触的数量。使用内氮处 8 冯君 乳及乳品中唾液酸含量的检测 理的切片，但不处理多聚唾液酸，经l t p 诱导其联合的形态学变化不会发生玎5 。因此，穿孔突触 的形成是依靠于多聚唾液酸，多聚唾液酸的再次表达可以修复l t p 旧，在去除内氮后多聚唾液酸 的再次表达的快速循环是受神经元和突触的活性状态控制的。事实上，海马区周围和内部的神经 元数量显示了在学习时多聚唾液酸会有一个瞬时的增加。 成年大鼠在学习、空间迷宫m 髓帆蚓、条件性恐惧嘲1 、溴觉学习阻吲过程中海马区域的聚唾 液酸化作用有一个短暂的提高嘲一u 。聚唾液酸化的作用程度在学习结束后1 4 小时又回到原来的水 平删，聚唾液酸化作用在小鼠体内同样有一个短暂的提高哺1 。在学习过程中，聚唾液酸化作用的 短暂增强具有依赖性和特异性，因为在动物训练前给予东莨菪碱，动物没有表现出相似的聚唾液 酸化作用改变m 1 ，聚唾液酸化的作用程度没有随着学习任务的困难而继续增强，在训练后的1 2 小时内不管学习行为是否达到改善，都表现出相似的聚唾液酸化作用程度。除了海马区域的细胞 以外，内嗅区皮层的神经元还有隔内侧细胞核都表现出在训练后其聚唾液酸化作用增强啪蚴。也 就是说短暂的聚唾液酸化作用发生在处理加工信息过程中而不是发生在贮存信息过程中删。大量 的研究发现都证实了这个反应，现在人们普遍认为神经元聚唾液酸化作用的频繁变化是导致突触 可塑性变化的重要事件，而突触的可塑性变化又是记忆力巩固所必需的懈3 。 1 3 唾液酸的生物学功能研究 1 3 1 唾液酸能提高婴儿的记忆力和智力水平n 朝 在人体中，脑中唾液酸含量最高。记忆力作为神经系统功能表现在对外界刺激的反应程度和 神经冲动的传导速度。这种信息传递及神经冲动的传导必须通过突触来实现，可见稳定的突触连 接是记忆力形成的结构基础，而唾液酸正是作用于大脑细胞膜及突触的脑部营养素。这就意味着 唾液酸在神经系统中担负着特殊使命，它可促进神经细胞的分化、发育和神经再生作用，参与突 触传递、维持细胞的正常机能，参与记忆学习功能。因此，足够的唾液酸供应对于低出生体重儿 脑功能的正常发育尤其重要。婴幼儿自身合成的唾液酸并不足够，如何增加婴幼儿脑部唾液酸含 量呢? 研究发现外源性唾液酸哺。，即通过饮食补充唾液酸可以增加脑部唾液酸含量。在另一项对 于母乳喂养儿和人工喂养儿的比较研究中发现，母乳喂养儿唾液中唾液酸含量比人工喂养儿高。 这些发现提供了生物化学机制来解释以前所发现的母乳喂养可以促进智力发育的研究。 1 3 2 唾液酸使唾液粘蛋白具有润滑作用 众所周知，唾液之所以具有润滑作用。主要归因于其中含有粘蛋白，而富含唾液酸和硫酸盐 的唾液粘蛋白，使整个分子形成粘弹性凝腔，具有润滑口腔软硬组织、减少咀嚼、吞咽和说话时 的机械摩擦力等作用墙羽。现在的研究表明：唾液粘蛋白的润滑功能与其糖基中唾液酶的存在有关。 h a t t o n 等研究显示唾液糖蛋白的润滑力部分依赖于其碳水化合物单位，因为去糖基的p r p s ( 富脯 蛋白) 润滑力明显下降。l e v i n e 等哺 测量了几种唾液糖蛋白在磨牙颈部的润滑力，结果表明 m g l ( 高分子量粘蛋白) m g 2 ( 低分子量粘蛋白 p r p s 。该学者还对天然唾液及几种含粘蛋白和不含 粘蛋白的人：1 i 唾液润滑力作了比较。结果显示含粘蛋白的人工唾液润滑力最接近天然唾液旧引。这 些研究说明唾液中的粘蛋白是润滑口腔的主要因素。唾液粘蛋白的粘稠与其分子所含的唾液酸密 9 冯君 乳及乳品中唾液酸含量的检测 切相关。由于羧基的存在使唾液酸分子带负电荷是其重要特性。在糖蛋白分子中，s a 常常密集于 肽链的一个区段，给大分子构象和物理性质带来明显影响。例如，羊颌下腺粘蛋白分子中，约有 8 0 0 个双糖结构密集在肽链的一端，负电荷的互斥作用，使分子伸展呈刚性棒状结构，再加上较 强的水合能力，增强了溶液的粘度。若用酶或温和酸水解除去唾液酸，使粘度大幅度降低。类似 的情况亦存在于消化道、呼吸道、泌尿生殖道、眼角膜等处的粘蛋白中。显然唾液酸的存在与这 些糖蛋白大分子所执行的润滑、湿润、保护功能密切相关。 1 3 3 唾液酸使唾液粘蛋白具有调节口腔微生物的作用 许多研究证实，唾液能迅速封闭进入口腔环境的微生物，尤其是特异的唾液大分子如粘蛋白 能与特异的微生物选择性相互作用。唾液粘蛋白的碳水化合物成分在微生物的非免疫性清除中起 主要作用，这种作用可能涉及到酶和位于微生物表面的杆物血凝素。微生物与粘蛋白的作用是凝 集作用，使其不能附着于宿主组织。粘蛋白中的寡糖可能与宿主动组织上的结合部位在结构上相 似，因此可能对微生物的附着产生竞争性抑制。在这种情况下，不能找到适宜附着部位的细菌， 由于唾液流动的冲刷和吞咽而迅速被清除。 迄今有研究表明，位于粘蛋白分子上大量不同的碳水化合物侧链是微生物与粘蛋白相互作用 的粘附部位删。毒素、微生物可以识别这个特异的碳水化合物结构并优先与之结合。目前，最具 特征的例子可能是几种口腔链球菌与粘蛋白之间的相互作用。唾液酸是粘蛋白碳水化合物中的三 糖，它与血链球菌的粘附器有很大的亲和力而相互作用h 射。在此过程中，唾液酸作为接受器( 受 体) 、血链球菌表面杆物血凝素样蛋白序列为附着素( 粘附器) 。粘附器和受体的互补性分子以 立体化学方式发生作用，导致细菌的附着或凝集。有研究证实，人类颌下舌下腺唾液以依赖唾 液酸的方式凝集几种口腔链球菌。进一步的研究表明，m g 2 能在溶液中与链球菌相互作用导致凝 集，或吸附于固体表面导致对链球菌的粘附。相反，m g l 不能与链球菌相互作用。此差异可能是 m g 2 所含的唾液酸较m g l 高之故。 粘蛋白不仅能与细菌相互作用，还能与病毒相作用，如流感病毒，h i v 等。唾液粘蛋白中的 终未唾液酸能与感冒病毒作用，从而封闭病毒对宿主细胞的附着。在这一过程中起作用的是n 一乙 酰神经氨酸：粘蛋白中还含有其他形式的唾液酸如n 一糖基神经氨酸( n - g l y c o l y l n e u r a m i n i ca c i d ) 就不能起到这种作用。b e r g e y 等娜研究表明唾液粘蛋白可抑制h i v 的复制。尤其是m g 2 能凝集h i v 病毒颗粒并使其传染力下降7 5 ，说明粘蛋白中的唾液酸在抑s t j h i y 传染方面起一定作用。 1 3 4 唾液酸有遮盖恶性肿瘤抗原决定簇的作用 长期以来，人们对恶性肿瘤逃避机体免疫监控系统的机制进行了大量的研究。有学者认为， 恶性肿瘤细胞膜上唾液酸含量的增加，有可能起到遮盖肿瘤抗原决定簇的作用。曾有学者把小鼠 纤维肉瘤的细胞用n a n a 酶将胞膜上的s a 水解去除后，接种于带有同型瘤的小鼠身上，发现使带瘤 鼠的瘤体消失。这种反应具有特异性，即当使用与带瘤鼠的肿瘤同型的瘤细胞经酶处理后接种才 能使小鼠的瘤体消失而使用不同型的瘤细胞虽经同样处理亦无效n 引。有人把s a 所起的这种作用 称为“抗识别作用”( a n t i r e c o g n i t i o n ) 或“遮蔽效应”( m a s k i n ge f f e c t ) ，实际上，“抗识别” 1 0 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 或“遮蔽”是s a 参与细胞识别的一种方式，有着一定的生理或病理意义。 1 3 5 唾液酸可作为肿瘤标志物 许多研究发现带瘤动物及肿瘤患者的瘤体及血液中唾液酸含量增加并随病情的加重而升高， 随病情的缓解而降低，从而被作为恶性肿瘤存在和发展监控的一个指标，并且被广泛地应用于很 多肿瘤的诊断和疗效监控。但是目前唾液酸的测定多见于其他部位的肿瘤，在口腔颌面外科领域 的资料较少，有待进一步研究。 1 3 6 唾液酸的抗早老性痴呆作用 如前所述，唾液酸在脑中含量很高，可能与神经传导和兴奋有关，脑中大量存在的唾液酸与 神经细胞的生长和突起延长有关。一些神经性疾病，如早老性痴呆( a l z h e i m e r s 病) 、老年痴呆症 以及精神分裂症患者血液或脑中的唾液酸含量下降。经药物治疗康复后，其含量又显正常，由此 表明s a 能参与神经活动。最近，人们试图合成一些s a 衍生物，用于某些神经性疾病的治疗。 1 3 7 唾液酸的前景展望 唾液酸关于学习、记忆和大脑发育的营养重要性研究还有很长的路要走，虽然许多研究已经 证实了外源性唾液酸在大脑认知和发育过程中具有十分重要的作用。但是还没有关于人类临床试 验的报道，而且，和人类婴儿极为相似的动物模型仔猪，还要求去检测母乳中唾液酸的代谢 率和食物中的唾液酸是如何影响大脑发育和认知的机理，磁共振影像( m a g n e t i cr e s o n a n c e i m a g i n g ，m r i ) 目前正在被用于检测早期的营养供给对于大脑结构和认知功能之间的影响，现在 有可能从分子生物学、生物化学、遗传学和生理学角度去检测唾液酸对大脑的影响。目前的研究 已经证明了母乳中的唾液酸是婴儿大脑的早期发育和认知功能的微量营养素。 1 4 唾液酸测定方法的研究进展 目前，牛奶中唾液酸的测定方法主要有分光光度计法，原理是利用酸水解释放牛奶中的唾液 酸，通过聚丙烯酰胺凝胶柱除去糖类的干扰。利用c u 2 + 和c r 3 + 协同催化唾液酸与问苯二酚显色， 用乙酸乙酯一正丁醇萃取有色物质，在6 1 5 n m 处进行测定。由于该方法比较繁琐、灵敏度较低、 影响因素多等缺陷，因此就迫切需求建立一种新的方法去检测牛奶中唾液酸的含量。而在医学中， 人体内的唾液酸检测方法有多种，现将这些方法作一综述，供研究与选用参考。 1 4 1 比色测定法 1 4 1 1 改良t a b 比色法 1 9 8 3 年，d e n n y 等饽对w a r r e n 的t a b 比色法进行了改良，其基本原理是：血清或组织样品 用稀硫酸溶液水解使唾液酸游离，游离的唾液酸被高碘酸钠氧化后与t b a 共煮形成有色化合物， 该化合物在5 4 9 n m 处有最大吸收峰，通过与标准品n a n a 比较求得其含量。方法中以硫代硫酸钠 代替w a r r e n 方法中具有强致癌作用的亚砷酸钠，用于终止高碘酸钠的氧化作用，避免了亚砷酸 钠对人体的危害。该法摩尔吸光系数e = 5 4 1 0 3 ，具有操作简便、安全无毒等优点，但脱氧糖类 ( d o r ) 对测定的干扰与w a r r e n 方法相似。1 9 9 1 年，朱翔等嗍对上述方法进一步改良后，用于血 清脂质结合唾液酸( l i p i d b o u n ds i a li ca c i d ，l s a ) 的测定。血清l s a 沉淀，用稀硫酸水解沉 冯君乳及乳品中唾液酸含量的检测 淀物，使唾液酸游离，然后按类似d e n n y 法测定，比色波长为5 5 1 n m 。该法n a n a 浓度在3 7 5 6 0 0 m g l 范围内线性良好( 间9 9 9 7 ) ，摩尔吸光系数= 1 1 2 x1 0 3 ，较w a r r e n 法和d e f r a y 法更灵 敏、安全，适合临床常规检测。 1 4 1 2 改良问苯二酚比色法 s v e n n e r h o l m 的间苯二酚比色法主要用于血清l s a 的测定，因其操作较简单，为不少人所采 用n 伽。其不足之处是灵敏度较低( = 2 8 8 x1 0 3 ) 。1 9 8 7 年，蒋谷人等1 0 1 1 对测定条件作了若干改 良，增加了显色强度，提高灵敏度1 7 4 倍( = 4 9 5 xi o ) 。其基本原理是：血清用冷氯仿一甲醇 液提取，提取液中加入磷钨酸使l s a 沉淀，沉淀物直接与间苯二酚一盐酸显色剂共煮，形成蓝色 化合物，该化合物用丁酸乙酯一正丁醇液提取后在7 2 1 分光光度计上以波长5 8 0 n m 比色测定。该 法与改良t a b 比色法相比，操作较简单，但灵敏度明显低于t a b 法。 1 4 1 35 - 甲基间苯二酚比色法 最近，汪洪亮n 嘲报道用5 一甲基间苯二酚显色法测定血清s a 含量。线性范围0 5 o m m o l l 。 回收率为9 8 i - 一i 0 1 6 ，批内c v = 2 1 0 ，摩尔吸光系数= 7 6 1 0 3 ，最