（林木遗传育种专业论文）苹果SSR反应体系的建立及品种资源遗传多样性分析.pdf

摘要 苹果是世界上栽培最广泛的果树之，由于苹果其有童期长、生长周期长、植株 大和自交不亲和等特点，用传统的方法进行苹果品种鉴定费时费力且费用较高。近年 来，随着分子生物学的兴起，特别是d n a 分子标记技术在苹果上的发展和应用，使 苹果品种快速鉴定成为可能，其中s s r 分子标记技术以其丰富的多态性、共显性遗 传、重复性好和操作简便等优点r 益受到人们的重视。本研究在建立和优化苹果s s r 反应体系的基础上，应用s s r 分子标记技术对4 2 份苹果品种的遗传多样性进行了研 究，在分子水平上为苹果种质资源鉴定和品种亲缘关系分析提供了依据，并对s s r 分子标记技术应用于节果品种鉴定和品种权保护的可行性进行了评价。主要研究结果 如下： ( 1 ) 对苹果品种s s r 的反应体系进行了优化，确定了最适反应体系：在2 0 l 反应体系中，m 9 2 + 、引物、和d n t p 的最适浓度分别为2 5 m m o l l _ l 、o 8 “m o l l 1 、 0 1 0m m o l l - ；反应体系中t a q d n a 聚合酶宜加入1 u ，模板d n a 应加入1 5 3 衄g 。 p c r 反应热循坏程序：9 4 预变性4m i n ：9 4 变性1 m i n 、4 8 5 5 2 退火1 m 曲、7 2 延伸1 m i n ，3 0 个循环；最后7 2 延伸5 m i n 。经多次扩增试验证明，该体系重复性和 稳定性良好。 ( 2 ) 本研究用1 2 对引物组合对4 2 份苹果品种进行了p c r 扩增，共扩增出1 6 5 条d n a 谱带，其中多态性带9 0 条，占扩增总带数的5 4 8 8 ，不同引物扩增的带数 分布在5 2 4 条之问，平均1 3 6 条。根据s s r 谱带数据统计结果，应用n t s y s 软件 进行遗传相似系数计算，4 2 份苹果品种的相似系数的变化范围在o 7 1 3 1 0 0 0 之间， 说明供试苹果种质资源间的遗传变异不大，遗传多样性偏低。利用u p g m a 法构建聚 类树状图，结果发现：在遗传距离为o 8 0 0 的阈值下s s r 标记能很好的区分除富士系 之外的全部供试品种( 系) ，将苹果品种划分为四个类群，绝大部分系谱相同或相似的 品种聚在了一起。可见，s s r 分子标记技术能够将通过常规杂交育种手段选育的品种 区分开，而且能较好地揭示品种间的亲缘关系。 ( 3 ) 利用聚丙烯酰胺凝胶( 8 ) 技术对供试苹果品种的不同引物的扩增产物进行 了检测，得到了每个品种在一组s s r 位点上的基因型图谱，从而初步建立了一个供 试苹果品种的s s r 基因型图谱库，为建立我国苹果品种的s s r 基因型数据库奠定了 基础，也证明了s s r 分子标记技术应用于苹果品种鉴定和品种权保护是可行的。 关键词：苹果；s s r 标记：品种鉴定；遗传多样性 e s t a b l i s h m e n to f s s rr e a c t i o ns y s t e ma n da n a l y s i s o fg e n e t i cd i v e r s i t yo f a p p l ec u n i v a r s a u l h o r ：x ux i n g x i n g m a j o r ：f o r e s tt r e eg e t l e t i c sa n db r d i n g s u p e 州s o r ：p r o f y a n gm i n s h e n g a b s t r a c t a p p l ei so n eo f i m p o n a i l t 舶i tt r e ei nt t l ew o r l d ，b u t 仃a d j t i o n a lg e n “c sa n db r c e d j n g c o s t sm o r et i i n e ，1 a b o ra n dm o n e yd u et oa p p l e si o n gj u v 饥j l ep 甜o da n dl i f ec y c l e ，t h e l a r g ep l a n ta n ds e l f - i n c o m p a t i b i l i t ys oo n d n am 0 1 e c u l a rm a r k e r sw e r ew j d e l yd e v e l o p e d a n da p p l i e dt ov a r i o u sa s p e c t so fr e s e a r c hi na p p l e 诵t hm o l e c u l a rb i 0 1 0 9 yb o o m i n gi n r e c e l l ty e a r s ，s oi tw a sp o s s i b l et oi d e n t i 匆a p p l ec u l t i v a r sq u i c k l ye s p e c i a l 】ys s rm a d 【e r i sh i g h l yp o l y m o r p h i c ，c o d o m i n a n kw e l l r 印e a 涮柚dc o n v e n i t + i nt h i sp 印s s r r e a c t i o ns y s t 廿no f a p p l ew a se s t a b l i s h e d 柚dt h eg e n e l j cd i v e r s i t yo f 4 2a p p l ec u l t i v a r sw a s a n a 】y z e db yu s j n gs s rm a r k 盯j no r d e rt oo 伍了b a s j s f o rg 唧1 踟r e s o u r c e s i d c i l t 讯诒t i o n ，c u l t i v a r sr e l a t i o n s h i pa i l dp l a n tb r e e d e r sr i 曲t sp r o t e c t i o n 1 1 1 em a i nr e s u l t s f m lt h i ss t u d ya r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h ef h c t o r sw h j c ha 幅孝c t e do nm es s r r c s l j l t so f a p p l ew e r es t u d i c d w c b a ds e tu p m eo p t i m i z i n gs s rr e a c t i o ns y s t 锄o fa p p l e ：e a c h2 0 斗l 锄p l 泊c a t i o nr e a c t i o ns o l u t i o n w a sc o m 州s e d2 5 m m o l l _ 。m + ，o 8 斗m o l l 埘m e r o 1 0 i i l m o l l - 。d n t p ，l u t a q p 0 1 y m c r a s e ，15 3 ( ) 1 1 9t e m p l a t e 【小a 觚dt l l eo p t i m a la n n l i n gt 锄p e r a t u o fp m e r s w e r c4 8 5 5 2 o 1 1 1 ea m p l i f i c a t i o np r o g r a m ：ap r e d e n a t i l r a l i z a t i o ns t 印o f4m i na t 9 4 f o ro n ec ”l ef 0 1 l o w e db y3 0c y c l c so fd e n a t l l r a 】i z a t i o n1 m i na t9 4 、a j l n e a l i n g l m i na t 4 8 5 5 2 、e x t e n s i o n1 m i na t7 2 a l l d5 m i na t7 2 a s6 n a le x t e n s i o ns t e p t h e r e s u l to f p c r 锄p l i 矗c a t i o ns h o w e dt l l a tt h ep c r s ”t e mh a dg o o da n ds t 曲订姐 ( 2 ) 4 2a p p l ec u l t i v a r sw e r ea i i l p l i f i e db y1 2p a i r so fs s rp r i m e r s 1 6 5b a l l d sw 盯c a m p l i 矗e da n dp o l y m o r p h i cp e r c 明t a g eo fa m p l 访c db a n d sw a s5 4 8 8 t h en u m b e ro f 帅p l m e d b 柚d s p e r p “m e r p a i rr 柚g e d 厅o m5 t o2 4 ，w i m 孤a v e r a g e o f l 3 6 b a s e d t h e s s r r c s u l t s ，c a l c u l a t i o no ft h eg c n 既i cs i m i l a r i t ys h o w e d 也a tm eg e f l ed i f f e r e n t i a t i o nw 酗 n o tr c m a r k a b l e 锄o n gc u l t i v a 峨b 船c do nn l eg 铷e l i cd i s t a l l c e 锄dt l l eu p g m ac l u s t a l l t h ep m v i d j n gc u l t i v a r s ( 1 i n e s ) e x c 印t f u j i b u dm u t a t i o nl i n e sc o u l db ei d 肌t i f i e d 舶m e a c ho t h e ra n dd a s s i f i o di n t of o u rg r o u p sa tt t l eg e n c t i cd i s t a n c eo f 0 8 0 0 m a j o r i t yc l o s c l y r e l a t e dc u l t i v a r s ( 1 i n e s ) a c c o r d i n gt 0p c d i g r e ew e r eg m u p e dt o g e t h e r ts s rm a r k e r sc o u l d j d 伽t i 母c u l t i v a r s ( 1 i n c s ) t l a tw e r ed “e l o p c dt h r o u 曲c o n y e n 石o n a l h y b d j z a t j o nb r e e d j n g m e m o d 柚ds t u d ym eg e n e t i cd i v c r s i t yo fa p p 】e ( 3 ) s s r 翻舯e n t so fl2p a i r so f 埘m c r sw 盯ed e t e c t 。db yp o l y a c r y l 锄i d eg e l ( 8 ) ， s oag e n o t y p em 印o f p r o v i d i l l gc u l t i v a r sa ta 伊0 u po f s s rl o c iw a so b t a j n e d i tw o u l dl a y o u taf o i l l l d a t i o nf o rf i l n h e rg e n o t y p ed a t a b a s e ，a l s oi n d i c a t i n g 廿l a ts s rm a r k e r sw c r e s u i t a b l ef o rv a r i e t yi d e n t 涵c a t i o na n dp l a n tb r c c d e r sr i 曲t sp m t e c t i o n k e yw o r d s ：a p p l e ；s s rm 盯k 盯s ；c u l t i v a ri d c n t i 矗c a t i o n ；g e l l e t j cd i v e r s 时 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑些壅些盘翌或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对奉研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：獠署罗、签字日期：1 一年6 月，r 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑韭壅些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑些壅些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：z 拿叛发 导师签名： 签字r 期： 6 年 拥，开签字日期：眇f 年6 月居日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： # 果s s r 反应体系的建立及品种资源遗传多样性分析 1 1d n a 分子标记研究进展 1 引言 遗传标记是生物基因型的易丁二t i l 别的表现形式，随着人类对基因从现象到本质的认识，遗传 标记逐步从简单的形态标记、细胞学标记和生化标记发展到能直接反应d n a 水平上遗传多态性 的d n a 分于标记。分f 标记t 要是指住d n a 水平上可标识的遗传标记。分子标记和其他标记相 比具有许多优点，如( 1 ) 直接ud n a 的形式表现，不受材料形式和外部条件的限制；( 2 ) 数量极多。 井分布于整个基囡组；( 3 ) 多态性高，无需专门创造特殊的遗传材料：( 4 ) 表现为“中性”，即不影响 目标性状墓田的表达，与不良性状无必然的连锁；( 5 ) 一些分f 标记表现为共显性，能鉴定纯台基 因型和杂合基闳型，提供完整的遗传信息1 1 i 。由于分子标记具有如此多的优越性，从1 9 8 0 年 b o t s t e i ne ia 一，首先提出d n a 限制性片段长度多态性作为遗传标记，特别是p c r 技术的产生p j ， 基于d n a 多态性的分子标记技术的研究和应用，在短短的加多年间发展迅猛。目前，已有2 0 多 种分子标记技术被发展和利_ l l j 。依其所川的分子生物学技术，人致可分为以s o u t l l 杂交技术为 核心的分子标记利以p c r 技术为核心的分子标记。通常将常用的r f l p ( r t c h o n 胁g i n e n l l e i l g t h p o l y m o 曲i s m ) 称为第一代d n a 分子标记：r a p d 心卸d o ma i n p l i 丘e dp 0 1 y i i l o f p h i cd n a ) 、 a f l p ( a m p l i n e d 舾g m e n ll e n 粤hp 0 1 y m o f p h i s m ) 和s s r ( s i m p l es e q u 锄c cr e p 蚰t ) 称为第二代d n a 分 子标记；而s n p s ( s j n g l en u c l e o t i d ep o l ”l o r p h i s m s ) 称为第三代d n a 分子标记。 1 1 1r f l p 标记 限制性片段k 度多态性( r e s 埘c t i o nf r a g m e t l tl 戡hp o l y m o 啦i 锄，r f l p ) ，主要是由不同个 体的等位基因之间碱基的代换、插入、缺失、重排等引起的，当利用不同的限制性内切酶酶切不 同个体基因组将d n a 时，所产生的d n a 片段的数目和大小便会不同，然后与带有标记的d n a 探针杂交，根据基因连锁关系，通过对碱基顺序差异的分析，即可确定和建立基因连锁匡l 谱。r f i p 标记呈盂德尔遗传，不受环境影响：具有共显性的特点，可区分纯合基因型和杂合基因型；非等 位的r f l p 标记之间不存在上位效应；结果稳定可靠，重复性好。可区分纯合基因型和杂合基因 型：非等位的r f l p 之间不存在上位效府；试验结果稳定可靠，重复性好，特别适用于建立连锁 图。但r f l p 标记有其不足之处，要求的d n a 量比较大，纯度也比较高，每次试验检测的位点 较少，对d n a 多态性检出的灵敏度不高，加上整个检测过程较为复杂，周期长，因而应用在大 规模的种质多样性分析上尚有一定困难。中国国内在柑桔、葡萄属植物1 4 j 等利用r f l p 技术的研 究。美国儿所大学开始联合建立柑桔的r n t 基因连锁图”j 。b e i t l l o f r 等嘲已获得桃5 个基因组 ( g e l l o m e ) 的r n j 连锁图。最近还发表了在橄榄1 7 1 和菠萝1 上利用r f i p 技术研究遗传多样性与亲 缘关系。r f i ，p 是最早发展的分子标记，至今仍被广泛应用。 1 1 2 染色体原位杂交 河北农业人学硕十学位( 毕业) 论文 染色体原1 ：奇：杂交( c h m m o s o m ei ns i | u h y b 打d l z a t i o n ) 是细胞学方法和分子杂交相结合的产物，是 指利j l i j 特异性核酸片段作探计，直接同染色体的d n a 片段杂交，在染色体上显示特异的d n a 或r n a 。原位杂交的优点是准确直观，在整个基因组d n a 或基冈组特异重复序列作探针时，可 以明显区分不同物种的染色体细成，狂鉴定远缘杂种染色体构型和结构变异、物种起源演化方面 有重复作_ i i 。 1 1 _ 3 r a p d 标记 r a p d f r a n d o ma m p i i 6 e dp o l y m o r p h i cd n a ) ，随机扩增多态性d n a ，是j w i i 】i 跏s 一1 和j w d s h 两个研究小组在1 9 9 0 年发展起来的一种遗传标记。它是以d n a 为模板，以一个随机的寡 核苷酸序列( 通常为1 0 个碱基对) 为引物，通过p c r 扩增反应，产生不连续的d n a 产物，以检测 d n a 序列的多态性。r a p d 标记不需预先知道目的d n a 序列，引物具有通用性，检测灵敏、方 便，多态性高，可以检测出r f l p 标记不能检测的重复顺序区，可填补砌也p 图谱的空缺，而且 避免了使圳放射性同位素，可在对材料无任何分子生物学研究的情况f 进行多态性分析，因而该 技术一经出现即在种质鉴定、亲缘分析及遗传育种等方面得到极为厂。泛的应用。还适用丁- 种质资 源的鉴定和分类、目标性状基冈的分，f 标记、遗传图谱的快速构建等研究，特别是在寻找与目的 基冈连锁的分子标记方面的廊l 。r a p d 标记的缺点是，它是一种显性标记，不能区分一个位点 扩增的d n a 片段是杂台的还是纯合的：稳定性差，受条1 ，| = 影响很人，对设备、条件及揲作的要 求很严格，如果达不到要求，稳定性和l 重复性就难保证。此外，由于共迁移现象的存在，有时会 使谱带的分离结果难以得到正确解释。有报道分析指出，r a p d 标记不适宜种间或亲缘较远的材 料间遗传关系的分析。沈向【l 对杏的4 3 个品种、吴树敬”对杏的2 0 个品种进行了分类；阮颖等 1 1 2 1 对李属植物的亲缘关系进行了分析：o f t i z - a 等用r a p d 技术检测六倍体和二倍体的李栽培种， 仅用了3 个随机引物就区分了3 1 个李品种：孙a n g _ x i a n gl u 等”用了6 个r a p d 引物就区分了 1 8 个桃砧木品种，聚类分析结果与以前系谱分析完全吻合，证明了r a p d 技术的正确性。 1 + 1 4i s s r 标记 i s s r ( h l t e rs i m p l es e q u e n c er 印e a t ，简单序列重复问区) 是由z i e l l ( j e 州c ze ta l 艉出的一种新的 分子标记技术，是根据基因组内广泛存在的微卫星基序设计的单一引物对基因组d n a 进行扩 增，扩增的指纹图可以同时提供基因组内多个位点的序列信息。它利用了r a p d 技术的优点和基 因组中丰富的s s r 序列信息，具有操作简单，可靠性、重复性高，d n a 模板用量少的特点。目 前，i s s r 分子标记己用于作物遗传多样性分析、图谱绘制、品种鉴定及数量性状基因座 ( q 1 1 a n t i 协t i v em i tl o s ，q 1 乙) 定位中。 宣继萍等构建了7 个苹果品种的i s s r 指纹图谱，用l s 0 6 l 和i s 0 6 2 两个引物就将它们很 好开；邱英雄等选用1 1 个引物对7 个杨梅品种和2 个无性系进行了分析，对基本品种遗传关 系进行了探讨。 2 苹果s s r 反应体系的建立及品种资源遗传多样性分析 1 1 5 a f l p 标记 a f l p ( a m p l 讯c a t i o nf r a g m e n ll e n g t hp 0 1 1 岬。咄i s m ) 扩增片段k 度多态性技术，是一种选择 性扩增限制性片段的方法，不需s o u l h e m 杂交，结合了r 】? l p 和p c r 的优点，具有r f l p 的稳定 性幕ip c r 技术的高效性。其原理是基丁对限制性片段的选择性扩增，基冈组d n a 被限制性内切 酶切割斤彳，将限制性片段两端迮上特定的般链接头( a d a p t e r ) ，根据接头序列和相邻的限制性位点 序列设计引物对限制性片段进行扩增。扩增产物经l u 泳检测后再比较两纽d n a 片段跃度的差异。 a f l p 技术的特点是多态性强，信息蕈大，稳定性强，重复性好，速度快，d n a 用量少、灵 敏度高，显性或共是性标记，不需要预先知道基冈组d n a 的信息等特征。缺点是试验程序复杂， 揲什时间k ，对试验技能及仪器设备的精密度要求高。需刚同位素等方法标记引物，对模板反应 迟钝，谱带可能发生错配与缺失，技术要求苛刻，成本较高，义是专利技术，使之在果树商业化 生产上的应川受到一定限制。应刖a f l p 银染法、荧光法在苹果枣l ”1 称猴桃j 二作了有益的尝 试。 1 1 6s s r 标记 s s r ( s i m p l es e q u e t l c er 印e a t ) 即简单序列重复，通常x 称为微甲星或者s 1 m s ( s e q u c e t a g g e dm i c r o s a l e l l i t e s ) ，也可称为s s r p ( s i m p l e8 e q u c er e l ) e a 枷1 y m o 啦i m s ) 。所谓微卫星楚指以 少数儿个核苷酸( 多数为2 4 个，也有报道为l 6 个口叫) ，为单位多次串联重复的d n a 序列口“。 在真核生物中人约每隔l o 5 0 k b 就存在1 个微甲吊。微卫星在基网组中的分砟是随机的，不仅可 以存在丁内含于中，也可以存在丁编码区和染色体的其它任一区域。在植物中微卫星重复单位的 碱基组成及拷贝数依物种不同而不同。人们发现重复序列两端为保守的d 1 q a 序列，因此可以利 _ j 和两侧区段互补的短序列引物通过p c r 扩增重复序列本身，在凝胶上显示其多态性。多态性 的山现是由于微卫星寡核苗酸的重复次数在同物种的不同基因型中差异很大以及由于重复序 列d n a 在复制时的滑动( s l i p p a g e ) 或染色单体的不等互换造成的1 2 0 ”j 。因此，微卫星可以作为d n a 分子标记。近年来，s s r 迅速应用于人类遗传 2 4 1 和许多动物研究中阻“，同时也应用于植物基因 组的研究“”。 与s s r 相近的分子标记种类还有m p p c r 口，即把与s s r 互补的寡核苷酸作为p c r 引物， 扩增的是基因组d n a 的特定片段；r a m s i j ，即用标记的s s r 探针与r a p d 扩增片段杂交： i s s r p “，即锚定微卫星寡核苷酸，用锚定微卫星核营酸作为引物，对基因片段而不是重复序列 本身进行扩增，在s s r 的5 端或3 端加上2 4 个随机选择的核苷酸，这可引起特异位点退火， 这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因片段进行p c r 扩增。 1 1 6 ls s r 引物的获得 微卫星分析的关键在于开发基因组中某个微卫星两侧的引物序列，微卫星序列的获得可从基 因组文库中获得含微卫星的阳性克隆或通过检索g e b a i l l c 、e m b l 或d d b jd 1 q a 序列数据库获 得。得到引物后进行p c r 扩增以及对扩增产物进行检测，这些内容何平i ”崤详述。值得注意的 是s s r 引物的获得途径，由于目前只有少数物种建立了d n a 文库或c d n a 文库，对于大多数物 3 河北农业人学硕+ 学位( 毕业) 论文 种而言，获得s s r 引物是很崔难的。但有试验证明许多动物间可共享某些引物如鸟类p 、哺 乳动物类p ”，同样，植物的近缘种甚至不同属也能共享某些引物，如柑橘届的不同种”、芸苔属 的不同种”以及称猴桃属的不同种p ”。 c i p r i i 等”从桃基因组文库中获得了1 7 对s s r 引物，其中8 8 的引物能在桃属的栽培桃、 油桃、罐藏桃扩增出多态性片段，而5 9 的引物可在近缘种如日本李( p m n u ss a l i c i n a ) 、欧洲李 ( pd o m c s t i c a ) 、杏( p a 唧e 1 】i a c a ) 、油桃( p 娜i c av a tl a e v i s ) 、甜樱桃( p a “u m ) 和酸樱桃( p c e r a s u s ) 上得至扩增片段，甚至其中3 个引物在苹果上也获得了d n a 扩增片段；p a n i d i p ”利用1 2 对桃 s s r 引物，检测意人利杏揣种及2 l 株实生苗，其中9 对引物的后代分离表现盂德尔分离规律， 破检测的晶种或_ | 吾代实生苗均能区别开；而s u z a n 和a m 一4 利h j 从甜樱桃、酸樱桃和桃基因组 开发的s s r 引物对黑莓p m n u ss e m t i n a ) 的遗传多样性进行研究，结果表明：被测试的8 个s s r 引物除了2 个来白桃基因组的没有扩增片段，另外2 个只扩增一条多态性带外，其余4 个引物对 所有的黑莓品种都有扩增带，且多态性丰富。除此之外，b s o s i n s k i 等i ”亦有类似的报道，这说 明果树不同种或近缘种是可以共享某些g i 物的。目前已报道的从果树基因组文库或d a t a b a s e 中获 得s s r 引物序列的树种主要有葡萄4 2 “】、猕猴桃4 ”、柑橘“4 “、苹果1 4 7 4 、桃以及鳄梨“。 1 1 6 2s s r 多态性机理 在微卫星d n a 中，突变的速率与串联重复排列的人小成正比l 。1 9 9 0 年w 曲e r 5 j 对人类 基冈组中( c a m 的研究表明，当n 低丁1 2 时，微甲星士要表现为单态行为；超过这个闽值时， 出现多态的可能性随微卫星的长度而增加。1 9 9 2 年r i c h a r 凼乖ls u t l l 酬a n 2 增山，如果s s r 中 只含少数儿个重复基元，这种重复可能维持长时间不变，一_ 口串联的拷贝数超过某个阈值，突变 的儿率会大人增加，同时也观察l q 在多位点指纹中，高分子量的带比低分子量的带更易变。s s r 在植物种问以及种内居群间、个体问存在高度多态性，在微卫星位点上检测出等位基因的数日与 微p 星的k 度有很好的线性关系。微卫星重复次数越多，检测出等位基因数目越多 。引起s s r 突变的分子机理尚在讨论之中，假说主要包括： 滑动假说在s s r 位点上等位基因长度变异的产生和高变是因为在重复序列复制过程中 d n a 聚合酶的滑动以及酶对被滑动链的错误修复m 5 ”。 不均等交换机理在有丝分裂或减数分裂时姊妹染色体之间或减数分裂时的同源染色体之间 的不均等交换1 5 q 。 重组假说支持这个假说的主要证据是在转染的哺乳动物细胞中，小卫星与微卫星表现为重 组的热点p “。 其他的推测集中在d n a 聚合酶的校对功能上，而不是单独讨论错配修复系统1 5 。 s s r 位点的突变是由于d n a 复制时两条链的滑动和以后不能修复的错误配对，这种滑动 理论被当今大多数人所接受。 1 1 6 3s s r 和其它分子标记比较分析 s s r 作为一种新的分子标记技术，人们以不同的植物为材料将其与其它分子标记尤其是 r f i j 、r 时d 和a f i p 进行了比较。结果表明：s s r 标记检铡的位点多态性水平明显高于r i 也p 标记，而且重复性优于r a p d ，与a f l p 相比不同的材料结果略有不同f ”。“。s s r 标记的等位 4 苹果s s r 反廊体系的建立及品种资源遗传多样性分析 基因变异主要来源丁基因组d i n a 复制时的滑动引起的重复序列数日的变化，而不是单碱基突变 或插入缺必造成的，因而表现出高度的多态性。虽然r f l p 、r a p d 莆la f l p 都能检测剑单碱基 突变或插入缺失，但标记对不同变异的敏感程度不同，因而可能造成不同程度多态性水平变化。 随着s s r 标记位点在图谱上的丰富，它以丰富的多态性、信息量和p c r 技术的方便性使其 表现出更犬的优势。p e i i c 等l ”1 认为a f l p 和s s r 具有r f l p 同样可靠的结果，并可实现白动化 操作，所以能够完全取代r f l p 进行遗传图谱构建，而r a p d 标记可作为有益的补充。然而a f l p 是一种显性标记，不能获得相关位点神：遗传图谱上的位置信息，如果a f l p 何点能够定位在r f l p 和s s r 连锁图谱上，那么a f l p 将是摄有效的分子标记”“。但v j r k 等”“在水稻种质资源研究中 发现，a f l p 和同t 酶聚类分析结果和传统分类较一致，r a p d 次之，而i s s r 聚类结果平传统分 类结果相差较大。虽然s s r 有诸多优点，但其引物较难获得，正如文中所论，对丁一些基冈组基 础研究较薄弱的树种可以借鉴其近缘种甚至其它物种己开发的引物，将s s r 和其它分子标记技术 结合起来，加速果树种质资源分子系统学和遗传育种学的研究进程。关于s s r 和其它分子标记的 比较分析多数是以大田作物为材料，在果树上报道根少。 此外，还有d n a 扩增指纹分析( d n a a m p l i 6 c a t i o nf i n g e r p r i n t i n g ，d a f ) ，序标位( s c q u 翱c e t a g g e d s i t e ，s t s ) ，单核苷酸多态性( s i n g l e n u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) ，酶切扩增多态性序 列( c l e a v e da f l l p l i f j e dp o l y m 叫i i cs e q u e n c e s ，c a p s ) 等分子标记的方法。 1 2s s r 技术用于果树种质资源的研究 果树童期跃、植株高人、自交不亲帚j 等致使其育种进程很慢i “，因此，利用分子标记进行辅 助选择( m o l e c u l a s s i s i la d e c t i o n ，m a s ) 在果树上比在一般草本植物上尤其重要。r a p d 技术 在果树上应用很多，如苹果【6 5 】、桃、甜樱桃6 ”、柑等。w e e d e n 【叫、相宁、王倩7 ”、束婉 旧等人对d n a 分子标记在果树上的应用作了综述，主要涉及i 帆p 、凡p d 和a f l p 几种分子标 记。本文主要介绍近年来s s r 技术作为一种新的d n a 分子标记技术在果树上的应j ：f j 现状及前景。 1 2 1 种质资源遗传多样性分析及分类 遗传多样性是果树种质资源研究的主要内容之一，较为全面地了解现有种质资源的遗传多样 性，可以减少育种工作中亲本选配的盲目性，从而提高育种效率。分子标记可以为种质资源的研 究提供几乎无限的多态性证据，成为检测遗传多样性的最有效工具。l u r o 等”应用r a p d 技术 证明了宽皮柑橘品种间高度的遗传多样性，说明在宽皮柑橘品种的演化中起主要作用的是有性杂 交和性状重组。张开春等1 7 叫用3 8 个随机引物进行r a p d 分析，获得稳定的d n a 条带1 7 3 条， 包含2 条多态性谱带，在d n a 水平上说明了无融合生殖的平邑甜茶具有高度的遗传一致性。分 子标记还可反应品种的地理差别，n o v v 等1 7 “利用r a p d 技术研究华盛顿蔓越橘遗传异质性时发 现，生长在不同地区的蔓越橘，经过长期的自然或人工选择，其基因组成发生一定程度的变化。 l a n h a m 等f 7 ”检测了醋栗1 2 种基因型的遗传多样性，结果分析表明欧洲醋栗栽培种遗传基础狭窄， 提出了必须引进其它种质资源加以改良。通过对d n a 指纹的比较以及借助相关计算机软件的聚 类分析可以对果树进行分类，f a b 嘶等1 7 7 1 对分布于地中海的1 7 个油橄榄品种用4 0 个随机引物扩 5 河北农业人学硕十。学位( 毕业) 沦文 增，经聚类分析可分为小果型和大果型两类，这一结果与形态学分类相一致。张立平等”“对葡萄 属r a p d 聚类分析表明，美洲葡萄类群可聚为一个类删，起源丁：我国的尔艰类群可分属8 个类删， 圆叶葡萄单独为一个类型。g o t o i i t l a m o t op w 也曾利州a f l p 对1 6 份葡萄资源进行分类，其结 果与以形态和地理位置为依据的分类相一致。可见分子标记在分析系谱关系、理顺分类地位中发 挥了重要作用。沈向等h 对杏进行了r a p d 分析，将4 1 个t 铺种分为5 类。是树敬筲对2 0 个杏品 种聚类结果是红丰、新世纪等亲缘关系较近的品种聚为一类，并将参试品种分为7 类，说明了 i u 心d 标记进行系谱分析和进化关系研究的有效性。林伯年等”对杨梅属植物的2 4 个材料进行 了r a p d 分析，结果是能将起源丁北美中心的蜡杨梅与起源丁中国的3 个种明显区分开，不支持 据形态学把矮杨梅分为7 个变种，同时也表明己有的杨梅品种分类系统与r a p d 聚类结果不一致， 认为杨梅分类的各种方法有待进一步研究完善。谭晓风等口“对香榧8 个主要栽培品种h r a p d 聚 类结果与传统形态学的两大类基本吻合。易干军等”“应h ；ja f l p 标记将供试的3 2 个香蕉品种聚 为6 个独立群体，其中的3 个群体仅含一个品种，另外三个群体中的品种义可分成一定数量的品 种群。易干军等f 驯用a f l p 标记对香牙蕉3 5 个品种的区分率达到j 0 0 。 12 2 种质资源起源与进化的研究 使州分子标记获得物种间d n a 水平的多态性资料，可以了解它* j 的主要遗传物质d n az 间的同源程度，进行统计分析，从而确定它们的亲缘关系和进化地位。h o m m a n 等”对阿月浑 子的r a p d 分析支持了其起源于或靠近弧洲中南部的假说。d l l i l m a m 等通过r a p d 指纹幽谱分 析，为栽培苹果( 胁 口x 咖，l o f 缸口) 起源于普通苹果( m p u m i l a ) _ 手| i 森林苹果( m s y l u e s 啊s ) 的观点提 供了新的分子证据。o m u m 等“通过r a p d 分析发现温州蜜柑与日本立花橘问的相似系数较小。 而与我国浙江黄岩本地早的相似系数较大，从而进一步确认了温州蜜柑起源于中国的观点。 e i l s t i o m 等”“对加利福利亚核桃及其收集的世界种质进行r f l p 分析，认为可将其分为两个主要 驯化群；其中，加利福利亚与法国、欧洲中部、伊朗种质资源关系较近。亲本的确立可以为育种 者选配育种亲本提供有用的信息。由于许多果树栽培品种晟初从实生苗而来，父母本不清。d n a 分子标记为亲本的确立提供了一种有效手段，h a r a d a l 猫1 根据r a p d 分析结果认为，乔纳金( 金冠 红玉) 和陆奥( 金冠印度) 两个三倍体苹果品种其减数分裂的2 n 配子是由金冠提供的，这一结果与 以前的同工酶分析结果一致。“律轻”苹果的父本因当时记载不详一直不得而知，结合r f l p 和 f u p d 分析结果确认其父本为“红玉”。程中平1 利用r a p d 分子标记技术并结合前人在形态学、 细胞学、抱粉学和酶学的研究结果，认为桃、李、杏、梅、樱类植物可划分为桃属、李属、杏属 和樱属，其中桃属是昂进化的类型，这与俞德浚将大李属细划为四个小属的观点一致岬j 。g r a h m 等p ”研究了悬钩子属饵“6 ) 的1 3 个种，使用3 7 2 个r a p d 标记，分类的结果与以前相一致，但 发现空心莓亚属u 如施如中的夏威夷利( 尼m n c 删) 具广泛的多样性，与空心莓死属( 腻口g d 6 口妇) 和实心莓属( 点证船) 都只有2 6 的相似性。 1 2 3 种质资源的鉴定 1 2 - 3 1 指纹图谱绘制和品种鉴定 6 苹果s s r 反府体系的建立及品种资源遗传多样性分析 果树人多是多年生木本植物，且主要采刚无性繁殖，k 期以来，不同地域相互引种栽培致使 出现了许多同物异名币i 同名异物现象，品种名和品种分类十分混乱。对现有果树晶种准确地鉴定 和分析是进一步科学有效地利用果树资源的基础。过去进行品种分类和鉴定主要采用比较形态 学并结合细胞学、抱粉学和酶学等方法，这些方法对关系较近的材料不能准确区分。近1 0 多年 来，发展起来的分子标记技术为品种鉴定开辟了新的技术手段。目前在果树上有关丁苹果岬“、 梨”1 葡萄| 9 5 1 、柑橘9 6 ”、桃l 、猕猴桃、李”、柿m “、：芑果1 1 ”1 批把叫等树种品种鉴定的 报道。 i2 3 - 2 突变鉴定 果树在长期的无性繁殖过秽中，形成了形形色色的突变类型，通过分子标记也可以发现众多 突变类型，多数芽变是源于原有品种的微小变化，采用形态学、同t ：酶分析难以鉴定，借助分子 标记在一定程度上可提高芽变鉴定的成功率。金勇丰等”1 用r a p d 标记分析桃品种布目早生 和其早熟芽变大观l 号基因组d n a 多态性，筛选出1 个引物可检测出两者间的多态性。x a c i i l m c r 等【1 叫与y a n g 等”明用r a p d 分别成功地鉴别出香蕉和甜樱桃的芽变系。s c o n 等【1 ”埔一次成功 地采用a f l p 技术鉴别了葡萄的体细胞变异，“对引物组合中有2 对可产生特异片段，它们可以 陋分亲本与体细胞变异。分子标记在其它突变体的鉴别上也有应_ j ，例如n y b o m 【i ”采用r j 玑p 技术研究了红星及其突变体，发现在杂交谱带的强弱上有别。张开春等i i 州曾采州r a p d 标记将 苹果品种红星和其短枝型突变体新红星等区别开。s a g a w a m 等”还鉴定了几个柑橘嵌台体。刘 成明等2 对荔枝怀枝和三月红及其焦核芽变进行了r a p d 分析分别获得了o p l 1 2 l h 5 羊 o p l 1 2 7 2 2 两个特异性片段，初步认为分别这两个片段与焦核性状有关。 1 2 3 3 体细胞杂种和外源基因渗入的鉴定 现代栽培作物的遗传基础狭窄是作物改良的一个土要障碍，通过远缘杂交、体细胞杂交等方 法导人外源遗传物质，是扩_ 人遗传多样性的主要途径。但是在导入对改良有利基因的同时，很有 可能引入与之相连锁的不利基因，利用分子标记进行检测，选育出具有外源目标性状基因、尽可 能不带或少带不利基因的新种质显得十分重要。肖顺元等”采用i 认p d 分析准确无误地鉴别了 v o j b a n e 柠檬与酸橙的体细胞杂种。史永忠等i j ”1 也成功地将r a p d 应用于体细胞杂种鉴定，而且 探明了伏令夏橙与宁波金柑属问体细胞杂种部分植株遗传上的不稳定性。珠心胚现象使柑橘合子 胚与珠心苗在苗期很难鉴别，严重阻碍相橘的杂交育种，l u m 对柠檬的实生后代r a p d 分析指 出，杂交台子茁由于有外源基因的渗入，谱带比珠心苗多，王三红等”同样利用r a p d 技术鉴 别了柑橘珠心苗和合子苗。 1 2 _ 3 4 基因型鉴定 根据亲缘关系较近的物种之间存在着编码序列( e x o n ) 的高度保守，而非编码区( h l t m n ) 存在着潜 在的多态性的原