（森林培育专业论文）石灰花楸的组织培养技术体系研究.pdf

摘要 本研究以石灰花楸( s o r b u s o t g n e r y ( s c h n ej d ) r e h d ) 成熟种子的胚和带芽茎 段、幼嫩叶片为外植体，探索石灰花楸组织培养快速繁殖的技术体系，通过正交试验设 计，并结合方差分析、新复极差检验，着重研究石灰花楸组织培养各阶段的最佳培养基 配方及培养程序。试验结果表明： ( 1 ) 利用石灰花楸成熟种子的胚作为外植体材料，初代培养以培养基1 2 m s + 2 o m g l 6 - b a + i o m g 1 n a a 的效果最好，芽的启动率可达9 0 以上。 ( 2 ) 以带芽茎段为外植体材料，最佳取材季节为春季，最适培养基为1 2 m s + 2 o m g l 6b a + o 5 m g ln a a ，启动率可达9 0 以上。 ( 3 ) 芽的增殖培养基以1 2 m s + 1 5 m g l6 - b a + i o m g ln a a 最合适，增殖系数大于4 。 ( 4 ) 用石灰花楸的幼嫩叶片为外植体材料诱导愈伤组织，最适培养基为1 2 m s + 0 5 m g l6 - b a + o 1m g ln a a + 0 5m g l2 ，4 - d ，诱导启动率达9 0 以上。 ( 5 ) 叶片愈伤组织诱导芽的最适培养基为1 2 m s + i o m g lk t + 1 o m g l6 - b a + 1 5 m g ln a a + o 5 m g li b a ，诱导率达n 9 0 以上。 ( 6 ) 生根阶段以1 2 m s + 1 0m g li b a + o 1 m g ln a a + o5g l 活性炭+ l o g l 蔗糖 的培养基最好，生根率达7 5 以上。 ( 7 ) 炼苗阶段，基质以蛭石、珍珠岩和泥炭以l ：l ：1 的比例混合效果最好，成活 率达到8 0 以上。 关键词：石灰花楸组织培养快速繁殖 日u 青 伴随着生物技术的飞速发展，利用生物技术手段进行苗木培育和育种已呈现出相当 大的潜力，近几十年来利用各种生物技术手段已成功培育出多种苗木，组织培养技术的 不断完善使一些不易繁殖的品种得以繁育，不仅节省了培育苗木的时间，同时也能培育 出一些优良的品种【1 “】。本试验所用材利石灰花楸是一种双色叶类园林植物，叶正面绿 色，背面覆白色绒毛，果为红色，有很强的观赏价值，是一种很有发展前景的园林绿化 植物。本研究利用生物技术方法对石灰花楸进行快速繁殖，探讨该捌种组织培养的方法 和最佳方案，为快速繁殖石灰花楸苗木奠定基础。 1 文献综述 1 1 石灰花楸的形态特征及开发价值 石灰花楸为蔷薇科，苹果亚科，花楸属落叶乔木，又名石灰树、石灰条子、反白树、 华盖木等。植株一般高i o 米左右，幼枝被白色绒毛，叶卵形或椭圆状卵形，长5 8 c m ， 先端急尖或短渐尖，基部宽楔形或圆形，具细锯齿，萌枝之叶具重锯齿及浅裂，上面无 毛，下面密被白色绒毛，侧脉8 i 5 对，直达齿端；叶柄长0 5 1 5 c m ，密被白色绒毛； 复伞房花序，总梗及花梗被白色绒毛；萼筒被白色绒毛：花瓣白色，果红色，椭圆形； 花期4 5 月，果期7 8 月，海拔高的地方更晚一些【5 6 1 。 石灰花楸广泛分布于陕西秦岭、甘肃南部、河南、安徽、江西、湖南、湖北、四川、 贵州、云南、广西、广东、海拔8 0 0 2 ，0 0 0 米的山坡、山谷、阔叶林内或灌丛中，均呈 单株散生状态【5 6 。在四川产于巫山、达县、宜宾、峨眉山、康定、宝兴、雅安等地的 林中或林缘【7 1 。 石灰花楸的用途广泛，是一种主要供观赏的园林树种。它的叶正面绿色、背面及各 处覆有白色绒毛，果为红色，是一种极具特色的观叶、观果树种，是一种尚未被开发利 用的优良绿化和经济林树种【8 一】；其枝条可供药用以治疗风湿和全身麻木症；木材供制 作高级家具和在车辆上应用，也可用于建筑和造船；它的耐寒性强，能耐一2 0 。c 的低温， 既可作抗寒育种材料，也可作苹果的砧木【1 0 】。 1 2 花楸的繁殖方式及研究现状 花楸属植物般采用传统育种的繁殖方式，在9 1 0 月采收成熟的种子，经播前处理 后进行播种。但种子的发芽率受诸多因素的制约，经研究发现花楸种子随沙藏时间的不 2 同其发芽率也不同，姜雁等研究发现：沙藏时间为4 4 天时发芽率仅为i ，而增加沙藏时 间至1 0 8 7 后发芽率增加到5 4 ，但是继续增加沙藏时间发芽率反而呈明显的下降趋势， 造成这种情况的原因是时间过长增加了种子内贮藏物质的消耗，从而加速了种子的老 化，因此在自然条件下散落的种子大部分不能正常发芽而成苗j 。 花楸幼苗喜凉爽、忌高温，要求生长在疏松、透气、中性或偏酸性的土壤中。人工 培育时，往往因为6 、7 月份气温过高造成幼苗死亡率高，所以用自然散落的种子很难得 到花楸栽培苗。另外，花楸在幼苗阶段需要非常精细的管理，稍有不慎就会造成较大的 损失，利用花楸种子进行育苗还存在耗时长、成型慢、且采种母树不足及种子收集困难 等缺, e l 9 1 ”。 花楸育苗的另一种常用方法是扦插育苗，但由于花楸木质化程度高，生长慢，新陈 代谢缓慢从而导致生根困难、生根率较低等缺点，利用扦插育苗存在较大的困难。因此 利用传统育苗技术进行花楸育苗和栽培存在较大的难度和局限性，近年来随着组织培养 技术的飞速发展，利用组织培养技术快速繁殖苗木不受季节、时间的影响，可大大提高 繁殖系数和工作效率，进行规模化和商业化生产 i 3 19 。但是由于到目前为止，国内外对 石灰花楸组织培养的研究还未见报道，因此需要大量研究才能确定最佳组织培养方案。 本研究就石灰花楸的组织培养进行初步探讨，以求获得快速繁育花楸幼苗的方案，为实 现工厂化育苗奠定技术基础。 1 3 蔷薇科植物组织培养研究进展 植物组织培养是在本世纪发展起来的，我国从7 0 年代开始在许多领域和方面较大规 模地开展了这方面的工作，8 0 年代开始在园艺植物的培养生产上得到应用。现在组织培 养技术广泛应用于某些蔷薇科植物( 苹果、梨等) 的育种、快速繁殖苗木、脱毒、种质 资源保存等方面。目前，在植株、器官、组织及原生质体等不同水平上均能再生出植株， 可以通过单倍体植株培养、多倍体诱导、原生质体培养及体细胞杂交来育种 2 0 t “。 2 试验材料与方法 2 1 试验材料 供试材料取自四川省雅安市雨城区，海拔在9 0 0 米左右的野生石灰花楸。 材料的预处理： ( 1 ) 胚取成熟的种子，用洗衣粉浸泡5 分钟，再用流水冲洗4 d 时，在超净工作台上 用7 0 的乙醇消毒1 5 秒，无菌水冲洗2 次，再在0 1 升汞中浸泡1 0 分钟，无菌水冲洗5 次， 3 剥开种子取出种胚待用。 ( 2 ) 带芽茎段分别在春、夏、秋三个季节取幼嫩枝条，用刀片切职带芽茎段，经流 水冲洗2 小时后，在接种台上用7 0 的乙醇浸泡1 5 秒再用o 1 升汞处理，处理时间分别为 6 分钟、8 分钟、1 0 分钟，比较其消毒效果。 ( 3 ) u t 片取春季幼嫩叶片，流水冲洗2 小时后，在接种台上用7 0 的乙醇浸泡1 5 秒再 用o 1 升汞处理8 分钟，待用。 2 2 技术路线 在查阅有关文献资料的基础上，结合花楸快速繁殖的目的，主要以花楸叶片和成熟 胚、带芽茎段为外植体材料进行快繁研究( 见图1 ) ，并根据各影响因素特点及相关关 系对不同的试验采用相应的试验设计，筛选出最优技术参数组合。 叶片一愈伤组织、 丛芽轴丛苗 一芽r 藿 完整植株斗竺兰一生根一单苗 图l石灰花楸组织培养技术路线 2 3 试验方案 利用人工气候箱培养，无特别说明，培养条件均为初代培养昼温2 5 2 ，夜温2 3 t c ：继代和生根阶段为昼温2 3 2 。c ，夜温2 1 2 。c ，光j 虽2 0 0 0 1 x ，光照l 0 j 、时天，湿 度7 5 ，p h 值为5 8 6 2 。 2 3 1 成熟胚的培养 2 31 1 初代培养试验方案 蔷薇科苹果亚科的其它植物组织培养大多采用的是m s 培养基1 2 5 】，因此本试验使用的 基本培养基是m s 培养基，并在此基础上作了一些调整，采用三因素三水平l 9 ( 3 4 ) 正交试 验设计( 见表i ) 【捌，每个处理接种七瓶，每瓶接一个胚，做三次重复，2 0 天后统计启 动率。 表1 初代培养正交试验方案l 9 ( 3 4 ) r 一t 可丽丁1 弋r i r 1 可丙厂t 啊一 12 ( 2 ，0 ) 2 ( 1 0 ) 2 13 ( 30 ) 3 ( 1 5 ) 3 2 ( 1 2 m s ) 933 2l 基本培养基：1 4 m s ，1 2 m s ，m s ，琼脂粉8 9 l ( 国产) ，蔗糖2 0 9 l ，p h 值5 8 6 2 试验采用两种激素6 一b a , i ： n a a ，每种激素设三个水平。 2 3 1 2 继代培养试验方案 表2 增殖的正交试验方案l 9 ( 3 4 ) 在初代培养基上培养得到的芽苗数量有限，需要继代培养使单苗增殖以获得大量的 5 s 2 3 (3 6 7 8 无性系繁殖材料，才能真正意义上体现组织培养快速繁殖的优势1 2 7 。28 1 。初代培养3 0 天后， 转入继代培养基中，继代培养试验采用三因素三水平i ，9 ( 3 4 ) 正交试验设计共九个处理 ( 见表2 ) ，每个处理七瓶，每瓶接一个芽，重复三次，3 0 天后统计增殖系数。基本培养 基为1 4 m s ， 2 m s ，m s ；采用两种激素6 一b a # d n a a ，每种激素设三个水平。 23 2 带芽茎段培养 2 32 】萌动展叶方案 取材分别在春( 3 月) 、夏( 7 月) 、秋季( 1 0 月) 取材，基本培养基为1 2 m s ，添加 了两种激素6b a 矛b n a a ，采用三因素三水平l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计方案( 见表3 ) ，每个处 理接种七瓶，每瓶接一个芽，三次重复，2 0 天后统计启动率。 表3 茎尖、带芽茎段萌动展叶正交设计方案： l 9 ( 3 4 ) 处理 6 一b a ( m g l )n a a ( m g l )季节 空列 2 7 3 32 】 2 32 2 增嫡培养试验方案 在初代培养基上培养，待芽生长到2 厘米左右转入继代培养基【2 9 】，与胚的增殖培养 设计方案相同( 见表2 ) ，3 0 天后统计增殖系数。 2 3 3 幼嫩叶片培养的试验方案 2 3 3 1 诱导愈伤组织试验方案 将处理好的幼嫩叶片切成0 5 0 5 c m 大d 、的切块，接入试管中，每管接种2 块，每 个处理接种七支试管。基本培养基为l 4 m s ，1 2 m s ，3 4 m s ，m s ，使用t 6 一b a ，n a a ， 2 ，4 - d 三种生长调节物质设四个水平，采用了四因素四水平l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验设计方案 6 溶湿瞅o o。o。 1 2 3 叫d 回 1 2 3 ，2 1 2 3 ，o o限0 l 2 3 均 加 n 毖 船 驰 巧 撕 ( 详见表4 ) 。 表4 诱导愈伤组织正交设计方案：l 1 6 ( 4 5 ) 2 3 3 2 愈伤组织诱导丛芽 试验采用了四因素四水平l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验设计方案( 详见表5 ) ，基本培养基为 1 2 m s ，添加了四种生长调节物质，分别为k t ，6 一b a ，n a a ，i b a ，每个处理接种七瓶， 每瓶接两块愈伤组织切块，三十天后统计诱导率。 2 34 壮苗培养 通过继代培养得到的石灰花楸丛芽都比较细弱，尤其是从愈伤组织诱导出的丛芽数 量多但都不够健壮，诱导这种芽苗生根困难而且成活率很难保证，这样就需要壮苗阶段 来改善单苗的生长状况，以利于生根 3 0 1 ”。把增殖培养基上的苗切割成单苗，转入i 2 m s 无激素培养基以利于壮苗，蔗糖2 0 9 h ，琼脂8 9 几，其间注意观察，待苗生长至l j 2 c m 左右 且达到一定的粗度时再进行生根试验。 7 ， 表5 愈伤组织诱导丛芽正交试验设计：l 1 6 ( 4 5 ) 2 3 5 生根培养 采用四因素四水平l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验设计( 见表6 ) 每个处理接种1 0 瓶，3 0 天后统 计生根率、根数及根长。 基本培养基：l 2 m s 生长调节物质：i b a ，n a a 另外培养基中添加了不同浓度的活性炭和不同浓度的蔗糖。活性炭能够吸附培养基 中的一些有害物质和杂质，并且还能够起到暗培养的作用，有利于生根【3 4 3 6 1 。 8 表6 生根培养正交试验方案l 1 6 ( 4 5 ) 2 3 6 炼苗与移栽 表7 炼苗移栽的不同基质配比方案 试管苗要从培养基移栽到土壤中，这需要要有一个逐渐锻炼适应的过程【3 7 】。由于试 管苗一直在无菌高温、高湿、低照度的环境下生长，而由于与外界环境的差异较大，移 栽前必须经过炼苗驯化才能在自然环境条件下正常生长。先将生根的试管苗打开瓶口， 在培养箱星驯化5 天，取出单苗洗净根上残留的培养基，以免培养基中的营养物质使细 菌或真菌繁殖生长，而使苗受污染死亡，然后把苗移植到不同基质( 见表7 ) 中，观察 9 组培苗的生长状况，待其生长良好时便可移栽至大田并观察统计成活率。 2 4 试验结果的观测 试验的每个过程都须在一定的时间内观测，记录材料的污染率、启动率、死亡率、 丛芽增殖系数及生根率、成活率等。 污染率= 接种污染数接种总数l 0 0 启动率= 未污染外植体启动数未污染外植体总数1 0 0 死亡率= 未污染死亡数未污染总数1 0 0 丛芽增殖系数= 茁高大于0 5 c m 的芽苗总数接种外植体数 生根率= 生根的苗数培养的苗数1 0 0 成活率= 成活的苗数移栽的苗数1 0 0 2 5 实验数据的统计与分析 米n d p s ( d a t ap r o c e s s i n gs y s t e m ，d p s ) 数据处理软件( v 3 0 1 专业版) 对试验数 据进行方差分析与极差分析、新复极差检验，多重比较等【3 8 3 9 1 。 3 试验结果与分析 3 1 成熟胚的培养 3 1 1 初代培养试验结果与分析 表8 胚的初代培养正交设计试验结果 9 0 4 4 7 6 7 1 4 9 5 2 6 6 6 6 1 9 8 0 9 8 5 7 5 2 3 7 6 2 9 0 4 6 】9 5 2 3 8 5 7 8 5 7 3 8 1 7 1 4 9 0 ，4 6 1 9 5 2 3 7 6 2 7 l9 5 4 3 6 2 5 7 6 7 7 7 3 4 5 4 7 0 5 1 8 8 6 4 0 9 6 7 7 8 4 6 3 2 6 0 8 0 7 1 9 5 5 1 8 8 4 6 3 2 6 7 7 8 6 7 7 8 3 8 1 2 5 7 6 7 7 1 9 5 5 l ，8 8 4 6 3 9 6 0 ，8 0 9 5 2 34 7 6 4 7 64 63 2 4 3 6 24 3 6 2 1 0 2 3 4 5 6 7 8 胚接种一周后丌始变绿，两周后便可观察到有芽发出。3 0 天后统计各处理的启动率 ( ) ，试验结果及数据反正弦处理结果见表8 ，方差分析见表9 。 剥反f 弦处理后的数据进行方差分析，结果表明a 因素( 基本培养基) 、b 因素( 细 胞分裂素6 一卧) 呈极显著差异，c 因素( 生长素n a a ) 呈显著差异( 见表8 ) ，这说明基 本培养基、细胞分裂素6 一b a 以及生长素n a a 对胚的芽诱导的启动率均有较大影响，进一 步对a 因素、b 因素及c 因素各水平间进行新复极差检验，结果见表1 0 、表l l 、表1 2 。 注 表9 胚启动率的正交试验方差分析表 表1 0a 因素三水平新复极差检验表 表1 1b 因素三水平新复极差检验表 山表1 0 可 表1 2 c 因素三水平新复极差检验表 到了极显著水 平，而1 2 m s 是最适合的基本培养基。 由表】l 可得出，细胞分裂素6 一b a 的浓度变化对芽启动率的影响很大，各水平间也 都达到了极显著差异，以2 o m g l 为最适浓度。 由表1 2 可得出，生长素n a a 各浓度水平试验中，0 5 m g l 与1 o m g l 两个浓度间差 异不显著，对芽启动的影响没有明显差异，而0 5 m g l 与1 5 m g l 、1 o m g l 与1 5 m g l 浓度问差异显著，以0 5 m g l 与1 o m g l 效果为好。 综上可以看出，基本培养基和6 一b a 对石灰花揪胚的启动率影响都很大，n a a 影响相 对较小，其浓度不宜过大。由方差分析和新复极差检验可知，诱导胚的启动率的最佳培 养基配方为1 2 m s + 2 o m g h6 - b a + i o m g ln a a 。对试验进行各个处理间差异显著性s s r 检验，可以得出第五个处理的效果最好( 见表1 3 ) ，启动率达到了9 0 以上。 注 表1 3 各个处理间差异显著性s s r 检验 处理均值 5 水平1 水平 7 3 7 5 6 91 7 6 4 ，2 2 5 8 7 1 5 4 7 5 5 2 8 2 4 8 1 7 4 4 5 2 4 2 6 9 人写字母表示1 差异显蔫水平，小鸣孛再夏系百恧季霸蟊爵再孚葛丽而衰j 暴j 骣不显著 3 1 2 生长调节物质对芽增殖的影响 用初代培养3 0 天左右后得到的芽茁进行继代培养，继代培养4 0 天后对增殖系数进 行统计，所使用的各种继代培养基组合都能使芽增殖为丛芽，不同生长调节物质处理对 芽增殖系数的影响见表1 4 。 利用d p s 软件对统计结果进行方差分析，方差分析详见表1 5 。由f 检验可以看出因 素a ( 基本培养基) 、因素c ( n a a ) 呈极显著差异，因素b ( 6 一b a ) 差异不显著，进一 1 2 0 船 o 0 阻 盯 w 0 a b c d e e f 瞻 g 5 2 8 4 1 6 7 9 3 步对a 、c 两因素各水平间进行新复极差检验，结果见表1 6 ，表1 7 ，并对九个处理进行 s s r 多重比较，结果见表1 8 。 表1 4 不同处理对芽增殖系数的影响结果 、处理 重复、 1 0 1 11 21 31 41 51 61 71 8 2 33 82 64 82 o31 6 2 83 6 l 2 43 92 54 32 12 91 8263 3 2 233 82 ，34 61 92 81 62 73 2 3 表15 芽增殖试验正交试验方差分析表 变异来源自由度平方和均方f 值f a 区组20 0 900 52 9 3 因素a 21 5 007 54 6 8 2 料f o0 5 ( 2 ，1 8 ) = 3 5 5 因素b 20 0 20 0 10 7 2f oo l ( 2 ，1 8 ) = 6 o l 因素c 21 6 5 68 2 85 1 5 7 7 料 误差1 80 2 90 0 1 6 总和2 62 05 8 注：$ 表示00 1 显著水平， 表示00 5 显著水平 表1 6a 因素三水平新复极差检验表表1 7 c 因素三水平新复极差检验表 由表1 6 得出，因素a ( 基本培养基) 各水平l 4m s 、1 2 m s 、m s 之间均达到极显 著差异，以1 2 m s 为增殖最适合的基本培养基。 由表1 7 得出，因素c ( n a a ) 的三个浓度水平间差异都达到了极显著水平，在浓度为 1 o m g 几时增值效果好，随着n a a 浓度的再增大，继代增殖效果不好，具有抑制作用，综 1 3 上o jj e n n a a 浓度为1 ，o m g l b 寸是增殖的最适浓度。 注：大写字母 表1 8 各个处理间差异显著性s s r 检验 异不显著 由表1 8 可看出，第1 3 号处理是试验中表现最好的，增殖系数大于4 。 由方差分析和新复极差检验可知增殖培养基的最佳组合为t 2 m s + t ，5 m g l 6 - b a + 1 o m g l n a a 。 3 2 带芽茎段的培养 32 1 不同消毒时间对外植体的影响 消毒处理接种2 0 天后进行观察记录，用0 1 升汞处理6 分钟的材料污染严重，处 理8 分钟的材料表现较好，而处理1 0 分钟的材料组织有坏死的现象，说明升汞处理时 间对材料的影响很大，处理时间以8 分钟为宜。详见表1 9 表1 9 升汞不同消毒时间材料的表现 消毒时间( m i n ) 接种数污染数污染菩i 丽 矛丽再i 甄 6 2 11 1 5 2 4 大部分污染 8 2 13 1 4 3 表现良好，少量污染 l o2】0 0 大部份材料组织坏死 3 2 2 生长调节物质和季节对芽诱导的影响 1 4 石灰花楸带芽茎段接入初代培养基后7 天左右开始萌动展叶，3 0 天后观察统计启动 率。试验结果及数据反正弦处理结果见表2 0 ，方差分析见表2 l 。 表2 0 不同处理对芽启动率( ) 的影响结果 百而f 丽一一 五夏磊j r 一夏疆r 1 夏丁_ 董页厂百爵广1 甄丁1 覆丁1 囊万一 2 0 4 7 65 2 35 23 2 1 2 2 2 3 2 4 2 5 2 6 2 3 8 3 8l 1 43 9 5 2 0 8 0 g 1 9 1 4 2 ，8 1 4 3 9 0 4 4 7 1 9 1 3 81 9 5 9 0 4 4 7 8 0 98 5 7 6 4 0 96 4 0 96 7 7 8 2 7 2 8 63 3 3 2 8 6 3 2 3 33 5 2 4 3 2 3 3 表2 1 芽启动率正交试验方差分析表 一西百i 西f 而r 1 忑广一 因素a3 8 5 8 92 1 9 29 4 1 7 3 0 十f o0 5 ( 2 ，1 6 ) ：3 6 3 因素b6 3 02 52 3 1 5 1 2 2 8 2 6 f oo l ( 2 ，1 6 ) ：6 2 3 因素c9 5 1 0 2 12 4 7 5 5 1 l 4 2 6 3 8 $ 误差1 7 8 4 41 6 1 11 5 总和】1 0 0 0 9 4 注磊菊而磕藩丽磊莉i 丽覃一 对反正弦处理后的数据进行方差分析，结果表明重复间差异不显著，说明试验结果 g ：f l 较好的重复性。由f 检验可得出，a 因素( 细胞分裂素6 一b a ) 、b 因素( 生长素n a a ) 、 c 困素( 季节) 都达到了极显著差异( 见表2 1 ) ，这表明试验所用的三个因素对石灰花 楸带芽茎段芽诱导都有较大影响。进一步对a 因素、b 因素和c 因素各水平间进行新复 1 5 2 l 2 5 5 2 3 9 1 9 9 5 舶 历 n 他 2 l 6 2 5 2 3 9 8 2 9 5 6 5 0 2 l 2 4 2 4 2 7 1 跎加地毖弘 3 9 8 2 7 4 2 3 2 7 0 极差检验，结果见表2 2 、表2 3 、表2 4 ，对九个处理进行多重比较，结果见表2 5 。 表2 2 a 因素三水平新复极差检验表表2 3b 因素三水平新复极差检验表 表2 4 c 因素三水平新复极差检验表 表2 5 各个处理间差异显著- i i s s r 检验 2 47 3 7 5 aa 2 6 6 5 3 2a a b 1 95 4 7 5 b b e 2 04 5 4 2 b c c d 2 23 9 0 3 c d d e 2 73 3 3 0 d e d e f 2 1 2 7 0 1 e f e f 2 32 0 8 0 f f g 2 58 3 5 gg 注：大写字母聂泵了丽百氯i i 泵平巧忑葬磊蟊爵寻丽葛算豆季泵手手面焉乖蕊异不显著 分析表2 2 可得出，因素a ( 6 一b a ) 各浓度水平上，1 o m g l 、2 0m g 几浓度试验效 果好，两者在5 水平和1 水平上差异都不显著，而3 0m g l 效果明显低于前两个水平， 1 6 呈极显著差异，以2 ，0m g l 浓度最合适。 从表2 3 得出，因素b ( n a a ) 各水平，随着浓度的增加，启动率越大，0 l m g l 、 05 m g l 浓度间差异不显著，而0 o l m g l 与前两个水平间差异达到极显著。 由方差分析结果( 表2 1 ) 可知季节因素对芽启动试验呈极显著差异，表明取材季节 对试验结果影响很大。进一步对季节因素各水平问显著性检验结果( 表2 4 ) 可以看出， 季节因素各水平间差异都达到了极显著，且最适宜的取材季节在春季( 三月) 。 由表2 5 可看出，第2 4 个处理是试验中的最佳处理，启动率达9 0 以上。 综上所述，石灰花楸带芽茎段芽诱导过程的最佳培养基组合为1 2 m s + 2 o m g l 6b a + o 5 m g ln a a ，春季取材最佳。 3 ，3 叶片的培养 表2 6 叶片诱导愈伤组织统计结果 1 7 3 3 1 愈伤绸织的诱导 春季3 月份取幼嫩的石灰花楸叶片，处理后接入试管，十天左右可观察到叶片的边 缘有愈伤组织出现，且生长迅速，3 0 天后记录启动率和愈伤组织的具体表现( 见表2 6 ) 。 石灰花楸叶片的初代培养采用了四因素四水平l 1 6 ( 4 5 ) 正交试验设计方案( 见表4 ) ， 将启动率( ) 进行反正弦转换得到相应的数据，并对其进行方差分析，见表2 7 。结果 表明，因素a ( 基本培养基) 、因素b ( 细胞分裂素6 - b a ) 、因素c ( 生长素n a a ) 差异 不显著，而因素d ( 2 ，4 一d ) 呈极显著差异，表明2 ，4 一d 对诱导叶片愈伤组织的影响是最 重要的，进一步对因素d 各水平间采用新复极差检验法进行比较，结果见表2 8 ，利用 $ s r 检验对各个处理间进行差异显著性检验，检验结果详见表2 9 。 表2 7 叶片诱导愈伤组织启动率的正交试验方差分析表 注： 表示00 l 显著水平， 表示0 0 5 显著水平 表2 8 d 因素四水平新复极差检验表 1 8 表2 9 各个处理间差异显著性s s r 检验 注：人写字母表示1 差异显著水平，小写字母表示5 差异显著水平，字母相同表示差异不显著 根据表2 8 得出，因素d ( 2 ，4 - d ) 的四个浓度水平，d 2 ( 0 5 m g l ) 与d 3 ( 1 o m g l ) 、 d 4 ( 2 o m g l ) 、d 1 ( o m g l ) 水平问差异显著，d 3 与d 4 两水平间差异不显著，d 2 与d 4 、d l 水平间极差异显著。由方差分析得知因素d ( 2 ，4 一d ) 是对叶片诱导愈伤组织影晌最显著 的因素，随着2 ，4 一d 浓度的增加，愈伤组织诱导率迅速增加，在浓度为0 5 m g l 时达到 最大值，在浓度为1 o m g l 和2 o m g l 时虽然诱导率仍就能达到定的水平，但是随着 浓度的进一步增加，诱导率呈下降的趋势。 由表2 9 可得出，试验中所用的1 6 个处理中以第3 5 号处理效果最好。 综上可得出结论，在石灰花楸叶片诱导愈伤组织试验中，2 ，4 - d 的影响是最大的， 1 9 基本培养基和n 从以及6b a 几乎没有影响。根据方差分析和新复极差检验可知此过程的 最佳培养基的组合为1 2 m s + 0 5 m g ，6 - b a + o 1m g ln a a + 0 5 m g l2 ，4 一d ，愈伤组织 的启动率达9 0 以卜。 332 愈伤组织丛芽诱导结果 表3 0 愈伤组织诱导丛芽诱导率统计结果 试验采用的基本培养基为1 2 m s ，添加了四种生长调节物质，分别为k t ，6 一b a ，n a a ， i b a ，每个处理接种七瓶，每瓶接种两块愈伤组织切块，三十天后统计诱导率，统计结 果见表3 0 ，并对其进行方差分析，见表3 l 。 。2 0 表3 1愈伤组织诱导丛芽诱导率的正交试验方差分析表 注：料表示00 1 显著水平，$ 表示0 0 5 显著水平 结果表明，因素a ( k t ) 、因素b ( 细胞分裂素6 - b a ) 、因素c ( 生长素n a a ) 、因 素d ( i b a ) 差异均达到极显著水平，表明四个因素对愈伤组织丛芽诱导率均起到显著作 用，进一步对四因素各水平间进行瓤复极差检验，结果见表3 2 、3 3 、3 4 、3 5 。 表3 2a 因素四水平新复极差检验表表3 3b 因素四水平新复极差检验表 表3 4c 因素四水平新复极差检验表 2 1 表3 5d 因素四水平新复极差检验表 注：大写字母表示l 表3 6 各个处理问差异显著性s s r 检验 表示差异不显著 分析表3 2 可得出，因素a ( k t ) 四个浓度水平，1 0 m g l 与1 5 m g l 之间差异不明 显，而这两者与0 ，5 m g l 、2 o r n g l 差异显著，当k t 浓度为1 o m g l 时，最适合愈伤组 织的再分化，随着浓度的继续增加，再分化率逐渐降低。 从表3 3 得出，因素b ( 6 一b a ) 四个浓度水平，1 0 m g l 与2 0 m g l 之间差异不明显， 而这两个浓度水平与0 5 m g l 、3 0 m g l 差异显著，当6 一b a 浓度为1 0 m g l 时，最适合 愈伤组织的再分化，而随着浓度的继续增加或降低，再分化率逐渐降低，浓度为3 o 兀1 9 l 时，再分化率明显降低。 从表3 4 得出，因素c ( n a a ) 四个浓度水平，最佳的浓度为1 5 m g l ，与1 0m g 儿 差异不明显，而这两者与0 5 m g l 、0 1 m g l 间差异显著。 2 2 从表3 5 得出，因素d ( i b a ) 四个浓度水平，0 ，5 m g l 与o m g l 之间差异不明显， 而这两个浓度水平与1o m g l 、2 o m g h 间差异显著，0 5 m g l 为此试验的最适浓度。 对愈伤组织芽诱导各个处理问进行差异显著性s s r 检验，结果见表3 6 ，从表中可以 看出，第5 0 个处理效果最佳。 综上可知愈伤组织诱导丛生芽的最适培养基为i 2 m s + i o m g lk t + i o m g l 6 - b a + 151 a g ln a a + o 5 m g li b a ，愈伤组织再分化率达到9 0 以上。 3 4 壮苗培养 小苗在壮苗培养基上培养2 0 天以后观察，8 0 的苗高达到2 c m 以上，而且比从前健 壮，直径增加，叶片变大，表明用无激素的培养基壮苗的过程明显有利于石灰花楸组培 苗的生根及以后的生长。 3 ，5 生根培养 表3 7 生根培养正交试验结果 处理生根率( )生根率正弦结果根长根数 6 02 9 2 6 16 7 o 6 25 5 3 6 34 8 6 47 6o 6 53 3 ，3 6 6g 5 6 75 0 o 6 83 6 o 6 98 6 7 06 2 】 7 l5 0 o 7 27 6 7 34 7 1 7 45 2 o 7 54 1 2 3 2 5 8 5 49 4 4 7 8 7 1 2 6 6 6 0 6 7 3 5 0 6 1 7 9 5 4 5 o o 3 68 7 1 7 0 5 5 1 9 4 4 5 0 0 1 6 o o 4 3 2 8 4 6 1 5 3 9 9 3 2 3 3 o 6 0 4 9 1 8 5 6 3 3 2 6 4 2 3 2 2 4 5 2 4 1 2 3 3 g 4 6 3 5 3 o 5 0 4 5 1 6 6 2 32 2 5 3 8 3 o 2 3 4 3 3 8 2 1 3 5 4 ，l 3 2 将壮苗培养后2 c m 以上的苗继续进行生根培养，观察统计不同浓度的激素、蔗糖及 活性炭对诱导生根的影响。 生根试验中，添加了i b a 和n a a 两种激素，同时添加了不同浓度的活性炭和蔗糖。 接种8 天后有根长出，3 0 天后统计生根试验结果，详见表3 7 ，从表中可以看出1 6 个处 理的根长和根数表现相差不大，所以只对生根率经反正弦处理后进行方差分析，结果见 表3 8 。 注 表3 8 生根试验正交试验方差分析表 方差分析结果表明：因素a ( i b a ) 、因素b ( n a a ) 、因素d ( 蔗糖) 差异不显著，因 素c ( a o ) 差异呈极显著，表明c 因素各水平变化对生根有极显著影响( 见表3 8 ) 。进 一步对c 因素各水平采用新复极差检验法进行比较( 见表3 9 ) 。 2 4 。 表4 0 各个处理间差异显著性s s r 检验 处理均值 5 水平 1 水平 一_一_一 一一一一 6 46 06 7 a a 5 4 9 4 5 1 9 4 4 7 8 7 4 6 1 5 4 5 0 0 4 5 o o 4 3 2 8 3 9 ，9 3 3 6 8 7 3 5 0 6 3 2 5 8 1 7 9 5 1 70 5 1 6 0 0 1 2 6 6r a b a b a b a b a b a b a b a b c a b c d b c d b c d c d c d c d d 注：火写字母表示1 差异显著水平，小写字母表示5 差异显著水平，字母相同表示差异不显著 从表3 9 中可知c 因素( 活性炭) 的四个水平，c 4 ( 2 o g l ) 与c l ( o g l ) 、c 2 ( 0 5 9 l ) 、 c 3 ( 1o g l ) 之间差异呈极显著，a c 浓度为0 5g l 和1 o g l 时效果最好，为2 o g l 时，效果不好，生根率极低。可能是因为根在黑暗的环境里生长良好，活性炭刚好提供 了这种环境，且适量浓度的活性炭可以吸附植物生根时相互产生的抑制物质，所以有利 于根的生长，但过大浓度的活性炭也会导致大量有益物质被吸附，对生根产生较大的抑 制作用。对生根培养各个处理间进行差异显著性s s r 检验，结果见表4 0 ，从表中可以看 出，第6 4 个处理效果最佳。 根据方差分析和新复极差检验可知，生根的最佳培养基为1 1 2m s + i o m g li b a + 0 i m g ln a a + o 5 9 l 活性炭+ l o g l 蔗糖。 2 5 c “ 旺 眦 d d 曲 曲 曲 曲 曲 曲 比 比 _ 8 列 北 酊 盯 ， 阱 阳 娩 n 盱 佰 鹋 晒 仡 3 6 炼苗与移栽 不同基质对炼苗成活率的影响，试验结果见表4 1 。 表4 不同基质对移栽成活率的影响 基质砂蛭石：珍珠岩：泥炭( 1 ：1 ：1 ) 腐殖质土 从表4 可以得出，最有利于移栽的基质为蛭石：珍珠岩：泥炭= l ：1 ：1 ，成活率 高达8 0 以上，其次是腐殖质土，成活率为5 0 ，效果最差的是砂，成活率只有3 0 。 3 7 小结 本试验以石灰花楸成熟种子的胚和带芽茎段、叶片为外植体，探索石灰花楸组织培 养快速繁殖的技术体系，通过正交试验设计，结合方差分析、新复极差检验，着重研究 石灰花楸组织培养各阶段的最佳培养基配方及培养程序。结果表明： ( 1 ) 利用石灰花楸成熟种子的胚作为外植体材料，初代培养以培养基1 2 m s + 2 o m g l 6b a + i o m g ln a a 的效果最好，芽诱导的启动率可达9 0 以上。 ( 2 ) 以带芽茎段作为外植体材料，最佳的取材季节为春季，最适培养基为 1 2 m s + 2 o m g l6 - b a + o 5 m g ln a a ，启动率可达9 0 以上。 ( 3 ) 芽的增殖培养基以1 2 m s + i 5 m g l6 - b a + i o m g ln a a 最合适，增殖系数大于4 。 ( 4 ) 用石灰花楸的幼嫩叶片为外植体材料诱导愈伤组织，最适培养基为1 2 m s + 0 5 m g l 6 - b a + o 1m g ln a a + 0 5 m g l2 ，4 一d ，诱导启动率达9 0 以上。 ( 5 ) 叶片愈伤组织诱导芽的最适培养基为1 2 m s + i o m g lj ( t + i o m g l 6b k + 1 5 m g i n a a + o 5 m g li b a ，诱导率达到9 0 以上。 ( 6 ) 生根阶段以1 2 m s + 1 0m g li b a + o 1 m g ln a a + 0 5g l 活性炭+ l o g l 蔗糖 的培养基最好，生根率达7 8 以上。 ( 7 ) 炼苗阶段，基质以蛭石与珍珠岩、泥炭以1 ：1 ：1 的比例混合的效果最好，成 活率达到8 0 以上。 2 6 4 讨论 4 1 外植体种类和取材时间对试验的影响 按照细胞全能性学说，从植物体上取下的材料中，所有的活细胞都能够继续进行 分裂，并能再生出完整植株。但由于受植物遗传特性、生理生态特性以及外界环境条件 等的影响，要使每个细胞的全能性都表现出来，各种植物的要求都不同i 4 0 。”。尤其是木 本植物的组织培养，更要考虑外植体的种类m4 ”。本试验选取石灰花楸不同器官为接种 外植体，包括成熟种子的胚、带芽茎段以及石灰花楸的幼嫩叶片，分别利用这些外植体 材料研究石灰花楸组织培养及快速繁殖的最佳培养方案。综合各个试验结果可以看出： 各种外植体材料均能较好的诱导丛生苗的产生，芽诱导率均达到9 0 以上。然而以石灰 花楸幼嫩叶片为外植体的试验中，虽然也能通过愈伤组织最终诱导出丛生苗，但所诱导 出的丛生苗细弱，生根及成活都不容易，所以以带芽茎段和胚作外植体最好。 季节因素对芽启动试验有极显著影响，不同的取材季节对结果影响很大。而季节因 素各水平间差异都达到了极显著，晟适宜的取材季节在春季。这可能是因为春季外植体 生长旺盛，细胞分裂速度快，从而有利于芽的诱导。 4 2 升汞消毒时间对石灰花楸茎段的影响 石灰花楸茎段对升汞消毒时间的要求比较严格，时间过短，污染率高，消毒效果不 好，而处理时间太长则会伤害植物组织，造成组织坏死，在最初的试验中曾采用过5 分 钟、8 分钟、1 1 分钟、1 4 分钟，结果处理了5 分钟的材料污染严重，而处理了1 1 分钟、 1 4 分钟的材料几乎全部变黑，后来选用6 分钟、8 分钟、l o 分钟进行试验，最终得出适 宜的处理时间为8 分钟。 4 3 基本培养基的选择 不同植物有不同的生物学特性，对营养的要求也不同，只有满足了它们各自的要求 才能f 常生长 4 “，因而在离体培养条件下选择适宜的培养基对植物组织培养特别重要。 木本植物组织培养试验中应用最广的是m s 培养基，大多采用m s 、改良m s 以及m s 盐类 减量式”。本试验选用了：1 4 m s 、1 2 m s 、3 4 m s 、m s ，结果表明以1 2 m s 作为基本培 养基在石灰花楸培养的各个阶段都表现良好，这说明石灰花楸组织培养的最适基本培养 基为 2 m s 。 4 4 生长调节物质的影响 在离体培养过程中，植物外植体的内源激素水平不断变化，生长素类物质存在着极 性运输现象，导致其在植物体内分布特异性的改变，这一变化与器官发生和愈伤组织形 2 7 成密切相关陆49 、。不同生长调节物质在试验中的作用，随试验目的的不同而发生变化。 长期以来，生长素与细胞分裂素的比值决定着芽和根的分化，被广泛应用于组织培养中。 一般来说，在一定范围内，当生长素与细胞分裂素比值高时，有利于生根，比值低时有 利于发芽，中间比值利于愈伤组织的诱导和分化i 而2 ，4 - d 对愈伤组织的诱导作用明显 1 3 t 1 4 , 5 0 5 。 以石狄花楸成熟种子的胚作为外植体材料，初代培养以培养基1 2 m s + 2o m g l 6 b a + i o m g ln a a 的效果最好，芽诱导的启动率可达9 0 p 以上。而以带芽茎段作为外植 体材料，最适培养基为1 2 m s + 2 o m g 1 6 - b a + o5 m g ln a a ，启动率可达9 0 以上。由这 两个试验结果可以看出，虽然两个试验采用的外檀体材料不同，但是芽诱导的最佳培养 基基本相同，基本培养基均为 2 m s ，6 - b a 的浓度均为2 0 m g l ，n a a 的浓度略有差异， 以成熟种子的胚为外植体的试验中，经方差分析和多重比较得知n a a 浓度在0 5 m g l 和 1 0 m g l 两水平上没有显著差异；而以带芽茎段为外植体的试验中，n a a 浓度在 0 0 1 0 5 m g l 范围内，随着浓度增加，芽的诱导率逐渐增高。以叶片诱导愈伤组织时， 2 ，4 一d 的浓