（外科学专业论文）lkf5在肾细胞癌中的表达及意义.pdf

1一 目录 中文摘要1 英文摘要3 研究论文k l f 5 在肾细胞癌中的表达及意义 前言6刚舌6 材料与方法7 结果1o 附图1 1 附表13 讨论16 结论19 参考文献1 9 综述肾细胞癌疫苗发展历史及研究现状2 1 致 射31 个人简历3 2 中文摘要 k l f 5 在肾细胞癌中的表达及意义 摘要 目的：肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的3 ， 在我国泌尿系肿瘤中发病率仅次于膀胱癌，位居第二，且发病率呈逐年上 升趋势，肾癌的转移和进展是患者死亡主要原因，因此明确肾癌转移和进 展相关机制对于提高治疗效果，提高患者生存率十分重要。虽然对肾癌进 行了各方面广泛研究，但其发生、发展的生物学机制目前尚不十分明确。 k 咖) p e l 样因子5 ( 1 a r n p p e l 1 i k ef a c t o r ，i 。f j 5 ) 是一类含有锌指结构 的转录因子家族中的一员，主要参与调节细胞增殖和分化过程，其在肾癌 组织中的表达，尤其是与肾癌的发生、发展关系尚未见报道。本研究拟探 讨j 5 在肾癌组织中的表达及其临床意义。 方法： 组织标本来源：收集2 0 1 0 年3 月 2 0 1 0 年1 0 月河北医科大学第二医院泌 尿外科住院患者手术切除的5 1 例肾癌组织及2 0 例癌旁组织( 距瘤体边缘 5 c m 以外) 。其中男3 1 例，女2 0 例，年龄2 3 8 1 岁，平均年龄5 7 3 岁。全部 病例术前均未经任何放、化疗。标本均经l o 甲醛溶液固定，石蜡包埋， 4 岬厚连续切片。病理组织学分型：透明细胞癌4 1 例，乳头状细胞癌6 例， 嫌色细胞癌2 例，其他2 例。 1 应用免疫组织化学s p 法( 两步法) 从蛋白水平检测5 l 例肾细胞癌 和2 0 例正常肾组织k l f 5 基因的表达。统计染色阳性率数值及比例，制成 表格，填充数据，采用s p s s l 3 1 统计软件，l f 5 在肾癌组织和癌旁正常 组织的阳性表达率与临床病理参数之间的比较采用x 2 检验统计实验结果。 2w e s t e mb l o t t i n g 分析：将正常及肾癌组织于冰浴下匀浆，离心分离 上清，取上清液进行蛋白定量，后取蛋白提取液4 0 嵋，按比例与5 s d s 上样缓冲液混匀，煮沸，上样，进行s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳。半干转 膜法转移至p v d f 膜上。将印迹膜置于封闭液中封闭，随后与相应的一抗 及二抗反应，最后用化学发光法检测抗原抗体结合区带。用数码成像分析 系统软件对结果进行定量分析。 结果： 中文摘要 1 免疫组织化学染色结果显示： k l f 5 在肾癌组织和癌旁正常组织中均有表达。在癌组织中k l f 5 的 表达大多呈弥漫性、失去极性，染色程度增高，且多数位于胞膜、胞浆中表 达，而癌旁正常组织均仅在远曲小管及集合管细胞之胞膜、胞浆表达，染 色强度中等，且呈顶极分布。k l f 5 在肾癌及癌旁正常肾组织中的阳性表 达率有显著性差异( p = o o o o ) ，在肾癌中的表达高于正常组织。j 5 的表 达与组织学类型无相关关系( p 0 0 5 ) ，与肾癌分级之间无相关关系( p o 0 5 ) ，与临床分期成正相关( p o 0 5 ) ，在转移组织中的表达高于未转 移组织，具有统计学意义( p o 0 5 ) i na d d i t i o n ，n l ei n c r e a s e dk l f 5i sp o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i 也c l i n i c a ls t a g e ( p ，0 0 5 ) t h el e v e lo fk l f 5 证r e n a lc a r c i n o m a t i s s u e sw i t i lm e t a s t 嬲i sw 弱h i 曲e rt 1 1 a i ln om e t a s t a s i s ，s om ed i f | f e r e n c ew 嬲 s t a t i s t i c a l l ys i 盟i f i ca i l ：t ( p o 0 5 ) 2w b s t e mb l o 仕i n ga 1 1 a l y s i ss h o w e dt l l a t ，m el e v e l so f j 5p r o t e i ni i l t u i n o rt i s s u ew 嬲s i 印i f i c a n t l yh i 曲e rm a i ln o 珊a lt i s s u e ，廿1 ed i 舵豫l c ew 弱 s 洲s t i c a l l ys i 盟i 矗c 觚t ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ： l 1 1 l el e v e l so fk l f 5 p r o t e i ni nr e n a lc e l lc a r c i n o m at i s s u ew e r eh i g h e r t l l a nn o n n a lt i s s u e 21 1 1 el e v e l so fk l f 5p r o t e i ni i lr e n a lc e l lc a r c i l l o m ah a d n oc o 仃e l a t i o n w i 吐lt i l el l i s t o l o g i c a lt y p 3n l el e v e l so fk l f 5p r o t e i ni 1 1r e n a lc e l lc a r c i l l o m ah a dn oc o 盯e l a t i o n w i n ln l ef 她a n s 殍a l eo fr e n a lc e l lc a r c i n o m a 4 ，n l el e v e l so fk l f 5p r o t e i i li l lr e m lc e l lc a r c i n o m aw e r ep o s i t i v e l y c o r r e l a t e dw i t l lr o b s o n sc i i l l i c a ls t a g e 锄dm e t a s t 豁i so fr e n a lc e l lc a r c i n o m a 51 1 1 eo v e r e x p r e s s i o no f j 5p r o t e i nm a yb eai l n p o r t a mb i o l o g i c a l m 破e rf o rm ei i a s i o na n dm e t a s t 嬲i so fr e n a lc e uc a r c i n o m a ，s od e t e c t i i l g t l l ee 印r e s s i o no fk l f 5i si m p o r t a u l tt 0 勰s e s s i n g 也em e t a s t 船i sa l l dp r o g n o s i s o f l e n a lc e l 】c a r c i n o m a 4 英文摘要 k e y w o r d s ：r e n a lc e l lc a r c i n o m a ；仃i m s c r i l ) t i o n rk l f 5 ； w b s t e n l _ b l o t t i n g ；i m m u n o h i s t o c h e m i 曲叮 5 研究论文 k l f 5 在肾细胞癌中的表达及意义 - 些 翮吾 肾癌是泌尿外科常见的恶性肿瘤，在我国泌尿系肿瘤中发病率仅次 于膀胱癌，位居第二，约占全身恶性肿瘤的3 ，全世界每年因肾癌死亡 近l o 万人。肾细胞癌( r c c ) 为最常见的肾脏恶性肿瘤，约占肾肿瘤的 8 5 9 0 1 、2 】，其中约8 0 的组织学类型为透明细胞型。无症状透明细胞 经保存肾单位手术治疗后5 年及1 0 年生存率分别为9 4 4 及9 1 5 旧1 ，其中 所有分期的i c 经肾切除术后的5 年生存率在约为5 0 左右4 5 1 。然而， 肾细胞癌早期临床症状不典型，当确诊时已有近3 0 的患者发生了不同程 度的转移，预后较差1 。发生远处转移的肾癌患者的5 年生存率小于5 订， 伴有远处转移的患者中位生存时间经评价显示小于1 2 个月硌1 。因此进一步 明确肾癌的转移和进展机制对于提高临床治疗效果、延长患者生存期有十 分重要的意义。 “姗p p e l 1 i k e 因子这一名称是来源于该类蛋白共有的同源结构域一 果蝇蛋白幻却p e l ( 一个德语词，意为跛的) 的d n a 结合结构域吟1 。心卸p e l 样因子( n p p e l 1 i k ef a c t o r ，k l f ) 是锌指转录因子家族中的一个亚组， 目前共发现了2 0 个哺乳动物k l f 成员，按照发现顺序给予命名( 从k l f l 到k l f 2 0 ) 。这些k l f 转录因子广泛表达于各种细胞系中，在不同的细胞 中发挥着重要的作用，主要参与调节细胞分化、增殖、发育和凋亡等过程， 参与早期胚胎发育、癌症发生和血管形成等生理病理过程，日益受到医学 界的广泛关注n 伽。该家族成员中的k l f 5 因子是一个重要的促增殖、抑分 化调节因子，在肿瘤的形成和发展过程中发挥着重要的调控作用。目前 k l f 5 在胃癌、子宫内膜癌等方面有了相关的研究报道，但在肾癌中的表 达研究尚无报道。在不同的组织中参与细胞增值和分化的转录因子表达不 尽相同，为了观察转录因子k l f 5 在肾癌和癌旁组织中的表达情况，本实 验应用免疫组织化学s p 法、w r e s t e mb l 矾i n g 蛋白印迹法观察了_ 一f 5 在肾 癌和癌旁正常组织中的表达情况，探讨转录因子k l f 5 与肾癌之间的相关 性，对肾癌的预后和控制其复发提供临床参考。 6 研究论文 材料与方法 1 材料 1 1 组织标本：收集2 0 1 0 年3 月 2 0 1 0 年1 0 月河北医科大学第二医院泌尿外 科住院患者手术切除的5 l 例肾癌组织及2 0 例癌旁组织( 距瘤体边缘5 c m 以 外) 。其中男3 1 例，女2 0 例，年龄2 0 8 0 岁，平均年龄5 7 3 岁。全部病例术 前均未经任何放、化疗。标本均经1 0 甲醛溶液固定，石蜡包埋，取4 岬厚 连续切片。病理组织学分型：透明细胞癌4 1 例，乳头状细胞癌6 例，嫌色细 胞癌2 例，其他2 例。 1 2 仪器及试剂 l e i c a 砌2 2 4 5 型组织切片机德国l e i c a 公司 展片台m 1 2 l o德国l e i c a 公司 m 1 2 2 0 型烘片机德国l e i c a 公司 二步法免疫组化检测试剂盒 中杉公司 。 d a b 显色试剂盒中杉公司 辣根过氧化物酶标记的二抗s a n 协c r u z 公司 兔抗k l f 5 多克隆抗体s 撇c r u z 公司 w - e s t e mb l 砌n g 化学发光试剂盒s 触c r u z 公司 匀浆机p i 的公司 8 0 s 脱色摇床南京大学 酶标仪1 1 1 e 咖。公司 电泳仪美国b i o i 公司 半干式蛋白质印迹转膜槽美国b i o r a d 公司 r c 2 6 p l u s 低温离心机s o r ：讼i ，l 公司 c r l 5 d 高速冷冻离心机日立公司 超低温冰箱三洋公司 p v d f 膜m i l l i p o r e 公司 紫外分光光度仪日立公司 b i o1 d 数码成像分析系统v i l b e rl o u n n a t 公司 i d 数码成像分析系统k o d a l ( 公司 其它化学试剂进口或国产分析纯 7 研究论文 2 方法 2 1 1 免疫组织化学s p 法检测k l f 5 的表达 标本经1 0 甲醛固定，石蜡包埋，4 岬厚连续切片。免疫组化染色 采用s p 两步法： ( 1 ) 石蜡切片经6 5 热烘3 0m i n 后入二甲苯及乙醇逐步脱蜡至水。 ( 2 ) 修复缓冲液d t a ) 中浸泡，高压抗原修复2m i l l ，自然冷却。 ( 3 ) p b s ( p h 7 3 7 6 ) 中浸泡5 m i n ，倾去p b s ，滴加3 过氧化氢 孵育8 m i n ，以消除内源性过氧化物酶影响。 ( 4 ) p b s 中浸泡3 次，每次5m i i l 。 ( 5 ) 倾去3 过氧化氢，5 多克隆抗体( 1 ：2 5 ) 常温下孵育2 h 或4 过夜。 ( 6 ) p b s 中浸泡3 次，每次5 m i i l 。 ( 7 ) 滴加生物素标记的二抗，3 7 孵育2 0m m 。 ( 8 ) p b s 浸泡3 次，每次5 m i n 。 ( 9 ) d a b 显色：弃去p b s ，使用d a b 显色试剂盒( 1 m l 蒸馏水加显 色剂a 、b 、c 各一滴，混匀) ，滴加一滴至标本，显色5 1 0 m i n ，镜下观 。察，当细胞内出现棕黄色颗粒后用自来水浸泡中止反应。 ( 1 0 ) 苏木精复染2 m i n ，自来水冲洗返蓝3 m i n ，1 盐酸酒精分化， 依次放入7 0 、8 0 、9 0 、9 5 乙醇及无水乙醇l 、2 、3 各4 m i n 脱水 干燥，再放入二甲苯l 、2 、3 各四分钟进行透明，中性树胶封片。 ( 1 1 ) 镜下观察相关抗原的表达变化。 2 1 2 判断标准 以细胞胞浆出现棕黄色颗粒为阳性染色的判断标准。高倍镜( 4 0 0 ) 下， 每例选择1 0 个有代表性的视野计数，每个视野计数l o o 个肿瘤细胞，计算阳 性细胞百分比。肿瘤细胞相应部位不着色为阴性( o ) ：k l f 5 阳性细胞数 3 0 为( + + + ) ，+ + + 为低表达，+ + + 为高表达。 2 1 3 统计学处理 采用s p s s l 3 1 统计软件，k l f 5 在肾癌组织和癌旁正常组织的阳性表 达率与临床病理参数之间的比较采用x 2 检验。结果p o 0 5 ) ，与 临床分期成正相关( p o 0 5 ) ，在转移组织中的表达高于未转移组织，具 有统计学意义( p o 0 5 ) 。 2w e s t e mb l o 仕i n g 结果 在2 0 例配对的肾癌及癌旁组织中，w e s t e mb l 砷血g 区带定量分析表 明，所检测的肾癌标本中，k l f 5 的蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织。 具体表达结果：7 例癌旁组织和全部癌组织可见明显的k l f 5 表达，1 3 例癌 旁组织未见表达，癌组织中_ 一f 5 的表达比配对的癌旁组织明显强，说明 k l f 5 在肾癌的发生、发展过程中有被激活的可能。 研究论文 附图 f i g 1t h ee x p r e s s i o no fk l f 5i i lr l o m a lr e n a lt i s s u e 羽1 dc e l lc a r c i n o m a 2 0 0 f i g 2t h ee x p r e s s i o no fk l f 5i i ln o 衄a lr e n a lt i s s u ea n dc e l lc a r c i n o m a 4 0 0 1 1 k l f 5 p a c t i n 研究论文 n o r i n a lt i s s u ec a r c i n o m a n o n n a lt i s s u ec a r c i n d m at i s s u e f i g 5 t h e e x p r e s s i o no fk l f 5 i nr e n a ln o m a lt i s s u e 觚dc e l lc a r c i n o m a 2 4 l 6 2 o l 仉 仉 i a a i q a l 苗_ 2 n 函，i 磁 研究论文 附表 t a b l e 1 j 5e x p r e s s i o ni nr e n a lc e l lc a r c i n o m aa n dn o n n a lt i s s u e 组别例数 k l f 5 ( )( + ) 嘎芸尹 p 值 癌旁 肾癌 2 0 5 l 1 4 9 6 4 2拦凳 o 0 5 ) ，与临床分期成正相关( p o 0 5 ) ；与肾癌r d b s o n 临床分期及转移程 度呈正相关，具有统计学意义( p 2 4 月) ，1 例p r ( 1 2 月) ，6 例s d ( 6 1 2 月) ，中位p f s 3 3 7 月，o s 1 2 8 7 个月，说明该疫苗联合i l 2 治疗r c c s 是安全有效的，且患者耐受性表现 的很好【6 】。另一项i i 期试验中，评估了应用t r o v a x 单独治疗与联合i f n a 治疗n 眦c 的疗效，在2 3 例i c 患者进行分组治疗中发现，有2 2 例发生特 异性免疫反应，1 4 例( 联合治疗组7 例，单独治疗组7 例) s d ( 1 7 3 9 6 0 个月) ， 中位p f s 和0 s 分别达到3 8 月和1 2 1 个月，联合治疗组中有1 例p r ( 7 月) ， 由此进一步证明了该疫苗的有效性和安全性【7 1 。目前，t r o v a ) 【疫苗的期临 床研究已证实该疫苗单独应用治疗r c c 患者，其疗效与i k c 患者的生存期 存在明显正相关晗引。 最近，一项i i i 期临床试验采用m e l 觚- a 多肽疫苗辅以免疫佐剂 含 q s 2 l 和磷酰脂质( m p l ) a 】或i f a 进行免疫治疗，结果患者对其疫苗的耐 受性良好，4 9 例患者中4 例病情稳定，2 例m e l a l l a 特异t 细胞反应最强的 患者出现皮肤、淋巴结和肺转移灶的缩小。另外，v 锄t o m m e 【胡等用m a g e 3 的重组蛋白疫苗与免疫佐剂联合治疗m a g e 3 阳性的转移性实体瘤患者， 这种重组蛋白疫苗由m a g e 3 的序列与流感嗜血杆菌蛋白d ( p r o t d ) 抗 原的部分序列构成。9 5 8 ( 2 3 2 4 ) 的患者在4 次免疫后出现有意义的抗 m a g e 3i g g 抗体的反应，3 0 o 出现针对m a g e 3 的干扰素( i f n ) 水平 升高。9 0 的肾癌患者中都有c a 肽疫苗的表达【9 】，u e m u r a 等【1 0 】报道了2 4 综述 例用c a i x 抗原肽疫苗治疗的甩a - a 2 4 阳性的i i 戚c 患者，临床有效率为 3 9 ( 3 例p r6 例s d ) ，且可产生特异性的c t l s 患者大于1 2 例。另一项小鼠 模型研究【l l 】中，c 甜x a c s f 重组融合蛋白在体内外均可产生较强的免 疫应答。该疫苗的有效性和安全性现已有报道【1 2 】。有研究c a 与h s p1 1o 一起合用，进一步阻止肿瘤生长，减缓了肿瘤生长速度，不过仍然需进一 步的研究来评价其疗效【l 引。 2 2 重组病毒疫苗 病毒载体具有触发体内免疫反应的内在能力的特点，它能够在病毒感 染时的炎症反应中发出激活免疫系统时所必须的“危险信号 。理想的病 毒载体应该既安全又不会产生抗载体的免疫反应。重组病毒包括痘苗病 毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、鸟痘病毒和逆转录病毒等。在 临床试验中通常应用可以表达肿瘤的抗原，如前列腺特异抗原( p s a ) 、 癌胚抗原( c e a ) 的重组病毒，有的还用共刺激分子或细胞因子，初期实 验结果显示重组病毒疫苗在人体中是安全有效的。已有报道牛痘病毒p s a 疫苗( v a c c h l i a _ p s a ，r v p s a ) 鸡痘病毒p s a 疫苗( r f - p s a ) 在治疗前列腺 癌的临床试验中证实了该疫苗的有效性。美国东部肿瘤协作组( e c o g ) 的一项i i 期临床试验共中n 4 l ，包括6 4 例p s a 水平逐渐升高的前列腺癌患 者，应用鸡痘疫苗和牛痘疫苗的治疗后，4 5 3 的患者在1 9 1 个月中p s a 稳定，7 8 1 的患者病情无进展，4 6 o 的患者p s a 相关t 细胞水平有所增 高，且对该疫苗有很好的耐受性。这项i i 期临床试验的结果支持其曾在i 期试验中的结果，并可推进i 期临床试验。 l i p k o w 池等报道了将含有l a c z 基因的础w 载体注射到肾实质中，结 果发现l a c z 基因在靠近注射部位的肾小管内皮细胞有表达而在肾小球和 脉管系统则无表达n 卯。c h e n 等的研究也获得同样的结果n 们。迄今为止， 从v 载体的体内靶细胞似乎只限于肾小管集合系统m o u l l i e r 等，首先报道 了向肾动脉注射腺病毒载体，使近端小管细胞出现低度基因转染及通过逆 行注射将腺病毒载体引向肾盂，后者选择性地使乳头、髓质区的集合系统 细胞出现基因转移n 们。t a l ( 船e 等向肾动脉注射腺病毒载体后夹闭肾动脉， 观察到皮质近端小管细胞表达b 半乳糖激酶h 刀。y e 等报道以肾小球内皮 细胞为靶细胞，向肾动脉灌注高滴定度的腺病毒载体，其目的基因表达持 续了3 周1 引。 综述 2 3 肿瘤细胞疫苗 肿瘤细胞作为一种异己细胞，在患者体内产生微弱的免疫反应，不足 以将肿瘤细胞完全彻底消灭，所以有人将细胞因子或共刺激分子基因导入 作为疫苗的肿瘤细胞内，这样就可以产生一个微环境状态，从而克服它的 无反应性的缺陷。目前发现最重要的细胞因子是g m c s f ，它能够通过诱导 d c 的成熟来加强体内的抗原递呈效率。现在利用自身肿瘤细胞转染 g m c s f 作为疫苗已进入了i i i 期临床试验，用于治疗肾癌、前列腺癌、 恶性黑色素瘤，并已成功产生了针对各肿瘤的特异免疫应答反应。但是， 该疫苗制作过程繁琐，耗时且难度较大。另外，也有研究采用异体基因肾 肿瘤细胞作为疫苗，用于治疗的肾肿瘤细胞在体外建立细胞株后，经过基 因修饰后可作为单独的制剂使用。 j o c h a mn 鲫等在i 期临床试验中对p t 2 3 bp _ n o 3m o 期的肾癌术后患 者进行自身肿瘤细胞疫苗的免疫治疗。在治疗的5 5 8 名肾癌患者中，5 年和 7 0 个月的无进展生存率分别达7 7 4 和7 2 o ，而对照组为6 7 8 和5 9 3 ， 这表明对于能彻底根治性切除的肾癌患者术后给予自身肿瘤细胞疫苗治 疗是有益的。此外，在肾癌患者的肿瘤细胞中导入b 7 1 基因后，经皮下免 疫加i l 2 注射后，也出现了有针对肾细胞癌的免疫反应和临床疗效，i i 期 临床观察正在进行中。有研究者在一项期i 临床试验中，应用自体肿瘤细 胞导入卡介苗基因融合成的疫苗治疗术后i i 期和i 期结肠癌患者，在随后 7 6 年的随访中发现肿瘤虽然没有明显的缩小，但机体发生免疫应答的病 人总生存期和无病生存期都有所增加。 2 4 基因疫苗 通过肌注裸d 】妊表达质粒可激发免疫反应，它的机理在于d 】蛆疫苗 能够通过内源性途径将肿瘤抗原基因导入树突细胞中，然后递呈给具有引 流淋巴结功效的细胞毒性t 淋巴细胞( c y t o t o x i cc e l l s ，c t l ) ，或导入其它细 胞后被d c 交叉递呈。用编码肿瘤抗原的d n a 直接接种给患者的方法操作 既简单，且费用低，与重组病毒疫苗相比较，可避免病毒载体产生的免疫 反应导致免疫效率降低、病毒载体表位的竞争以及与活病毒相关的潜在危 险等。在d n a 编码的抗原蛋白中给予融合细胞因子形成的疫苗如g m c s f ， 或异种免疫球蛋白的恒定区，或已知具有高免疫原性携带蛋白，如破伤风 毒素的c 片段( f 疋) 都可提高疫苗的效力。t a g a w a 2 们等用带有酪氨酸酶 综述 表位的质粒向恶性黑色素瘤患者的腹股沟淋巴结局部注射，结果在治疗的 2 6 例患者中，虽然没有看到肿瘤的缩小，但是检测出了针对新的酪氨酸酶 表位的免疫应答，其中1 6 例生存期比预期的生存期有所延长，在1 2 个月的 随访中仍然存活。 2 5 树突细胞疫苗 在肾癌免疫治疗中的作用：到目前为止，树突状细胞( d c ) 可以认 为是免疫系统最有效的抗原递呈细胞( a p c ) 。d c 表面存在的瑚c 分子 可以与肿瘤抗原相结合，从而使t 细胞识别抗原。d c 表面的b 7 分子能够 给t 淋巴细胞提供协同的刺激信号。它们共同作用激活t 细胞，产生对肿 瘤的免疫效应。然而荷瘤宿主d c 或肿瘤浸润性d c 的功能缺陷，即d c 表 面的m h c 分子和共刺激分子低表达甚至不表达，使d c 无法呈递肿瘤抗 原、激活t 细胞的识别和杀伤肿瘤细胞功能。 利用肿瘤抗原蛋白、肿瘤抗原多肽、肿瘤细胞的裂解产物或肿瘤来源 的砌妊来冲击d c 的肿瘤抗原制得的疫苗现已进入临床试验了。由于肿瘤 患者产生有功能的d c 在体外可以大量扩增，d c 已成为一个应用于人体临 床试验且有吸引力的研究课题。d c 细胞疫苗的制备比基因修饰的肿瘤细 胞疫苗更容易且有效，因而促进了d c 疫苗在临床应用的前景。h e i n 等【2 1 】 在2 0 0 9 年的统计结果显示，在2 0 项非随机的临床i i i 期试验中，已经有2 5 6 例n 戚c 患者接受了d c 疫苗的治疗，所有患者不但均未出现严重的毒性 反应或自身免疫反应，而且有9 5 例患者产生了临床反应：c r4 例，p r1 2 例， s d 7 9 例。h s u 2 2 1 等报道了第一个d c 疫苗临床试验，滤泡型b 细胞淋巴瘤 患者的淋巴瘤可表达独特的b 细胞克隆受体，即独特型( i d i o t y p e ，i d ) ，此 受体能将正常淋巴细胞和淋巴瘤细胞相区分开，经肿瘤i d 特异蛋白冲击后 的外周血d c 疫苗共治疗1 0 例患者，2 例患者c r ，1 例p r 。后续研究的2 5 例患者中1 5 例出现体液抗i d 应答和t 细胞反应。 肿瘤溶解物负载d c ( t 哪o r - l y s a t ep u l s e d 绷j t o l 0 9 0 u sd ct u l y - d c )将 肿瘤细胞裂解物与d c 混合培养，然后回输机体抗肿瘤，它是一种新的生 物免疫治疗手段。肿瘤裂解物包含多价抗原，负载d c 后能诱导c t l 多克 隆放大效应，提高抗肿瘤疗效。g i t l 池b j 眩引等通过体外3 次冻、溶获得的 肿瘤裂解物和d c 共同培养。经真皮内注射t u l y d c 疫苗治疗1 4 例转移性肾 细胞癌患者，其中仅有1 例p r 。h o l t l 等眩4 1 将单核细胞起源的d c 在含有 综述 g m c s f 、i l 4 丰富介质中与自身肿瘤细胞裂解物共同培养，然后输入患 者体内。2 1 例肾癌病人中有2 例c r ，1 例p r ，7 例s d ，1 1 例肿瘤进展。全 部病人平均随访时间1 8 个月，8 例存活。肿瘤r n a 转染的树突状细胞用肿 瘤细胞1 1 1 】险队转染d c ，可减少自身抗原刺激d c 诱发产生自身免疫疾病的 危险，而且可以利用p c r 手段从有限组织中扩增到足够数量的目的 1 1 1 】心渔。一项i 期临床试验眨卯表明没有疫苗相关副作用或剂量限制性毒 性，包括自身免疫反应。7 例病人中有6 例可检测出肿瘤特异性t 细胞扩增 效应。该疫苗可诱导出t 细胞反应直接针对肾肿瘤相关抗原( t 从) ，但 对正常肾组织表达的自身抗原无任何副作用。该研究证实与肿瘤相关死亡 率很低。平均随访2 2 个月后，3 例患者因肿瘤进展死亡。 肿瘤细胞树突状细胞杂合体：利用聚乙二醇或电融合技术可将肿瘤 细胞和树突状细胞实现融合，形成杂合体。这种杂合体既能表达全部肿瘤 细胞的抗原，又有d c 抗原呈递的功能和t 细胞激活功能。一项应用自身肿 瘤细胞与单核细胞起源的d c 融合研究报告眩们显示，应用肿瘤细胞- d c 杂 合体治疗的1 7 例转移性肾细胞癌患者，4 例c r ，2 例p r ，1 例混合反应，总 反应率为4 1 。m 舭n a 2 7 3 等采用供者d c 与自体( 4 例) 或异体( 8 例) 肾癌细胞融合治疗转移性肾细胞癌，4 例s d ，没有观察到副作用。异体基 因组和自体瘤苗组无疗效差别。治疗后2 例肿瘤无变化，其中7 例出现迟发 性超敏反应。经治疗后病人的外周血淋巴细胞针对肾癌细胞的抗癌作用增 强。 在应用d c 疫苗治疗实体瘤的研究中有人将鼠的前列腺酸性磷酸酶 ( p a p ) 冲击后的d c 疫苗治疗2 l 例复发转移且血清p a p 升高的前列腺癌患 者，结果l o 例出现针对p a p 的t 细胞增殖反应。用肿瘤裂解物冲击的d c 疫 苗直接注射到1 6 例转移的恶性黑色素瘤患者的淋巴结后，1 1 例出现迟发性 超敏反应，2 例出现持续的c r 。t r e f z e r 2 8 等利用异体基因的d c 和自身肿 瘤细胞制成杂交细胞疫苗，在治疗1 7 例i i i 期和期的恶性黑色素瘤患者当 中，1 例c r ，l 例p r ，6 例s d ，这些患者生存期明显得到了延长。在应用 d c 疫苗治疗的患者外周血中，可以检测到针对各种肿瘤相关t 细胞表位的 高频率的l 细胞应答，这种免疫反应在有无临床疗效的患者中都可检测 到。治疗无效的病例应该与与肿瘤抗原表达及递呈的缺失有关口 3 问题与展望 综述 由于疫苗注射疗程多长、细胞免疫效应的分子作用机制以及临床联合 应用的相关问题等尚未完全清楚，且肾癌肿瘤疫苗的研究大多数尚停留在 实验室或i i i 期临床实验阶段，虽然一些i 期临床试验已经结束，但其 有效性和安全性尚未达标，美国的f d a 尚未批准任何肿瘤疫苗上市，目前 的肾肿瘤疫苗治疗仍然处于试验研究性质的，所以疫苗能够实际广泛应用 于临床治疗仍需假以时日。随着免疫学、肿瘤分子生物学等学科的不断发 展以及现代生物技术的不断成熟，人们有理由期望在不久的的将来，肾癌 肿瘤疫苗生物治疗将会给中、晚期肾癌患者带来新的希望，肾癌患者的生 活质量、总生存率也必将进一步提高。 1 2 3 4 5 6 7 参考文献 s o g a 、v ak ，i m a 例k ah ，y a m a s a by ，e ta 1 c d n ac l o n i n ga n d 订a n s c r i p t i o n a lp r o p e r t i e so fan o v e lg cb o x - b i n d i n gp r o t e i n ，b t e b 2 n u c l e i c a c i d sr - e sj t j n u c l e i ca c i d sr e s e a r c h ，1 9 9 3 ，2 1 ( 7 ) ：1 5 2 7 1 5 3 2 w 砒m a b en ，鼬a y a s l l im ，s 蛐删a y ，e ta 1 b t e b 2 ，ai m l p p e l l i k et r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，r e g u l a t e se x p r e s s i o no fm es m e m b n o n m u s c l e m y o s i nh e a v yc h a i nb ( s m e m b n m h c b ) g e n e c i r cr e s j t - c i r c u l a t i o n r e s e a r c h ，1 9 9 9 ，8 5 ( 2 ) ：1 8 2 1 9 l 、，觚p o p p e l h ，j 0 n i a us ，m ( b o ls w 、k c i n em e r 印y i np a t i e n t sw i t l l r e n a lc e l lc a r c i n o m a 【j 】e u ru r 0 ，1 2 0 0 9 ，5 5 ( 6 ) ：1 3 3 3 1 3 4 4 a n l a t or j ，s h i n g l e rw ，g o o n e w 莉e n am ，e ta 1v a c c i n a t i o no fr e n a lc e l l c a n c e rp 撕e n _ t sw i n lm o d i f i e dv a c c i n i a 加心l r ad e l i v e 幽gm et u l n o r a n t i g e n5 t 4 ( t r o v 觚) a l o n e o ra d m i n i s t e r e di i lc o m b i n a t i o nw i m i n t e 疵r o n a l p h a ( i f n _ a l p h a ) ：ap h a s e2t r i a l j 】j i m m m l 砒e r 2 0 0 9 ， 3 2 ( 7 ) ：7 6 5 7 7 2 h o f | 眈a nd m ，g i t l 娩b j ，b e l l d e g 眦a ，e ta 1a d o p t i v ec e l l u l a rm e r a p y 【j 】s e 缸no n c o ，l2 0 0 0 ，2 7 ( 2 ) ：2 2 1 2 3 3 w a n gq j ，h a n a d aky a n g