（分析化学专业论文）高灵敏生物传感器的研究与应用.pdf

硕士学位论文 摘要 随着基因组计划、蛋白质组学的研究进展，生命科学的迅速发展对分析化学 提出了大量的新课题，对多肽、蛋白质、核酸等生物大分子的分析，已成为现代 生物分析化学发展的最重要前沿领域之一。蛋白质的定量测定和单碱基突变的确 认对人体相关疾病的诊断以及发病机理的研究具有非常重要的意义。 在本研究论文中，主要基于核酸适体技术建立了高灵敏、高特异的检测低浓 度蛋白质的荧光免疫分析技术以及利用等位基因p c r 原理实现d n a 目标链中单碱 基突变的检测。具体内容如下： ( 1 ) 通过抗体抗原核酸适体质粒d n a 复合物的特异性识别与双链质粒d n a 与荧光染料s y b rg r e e ni 的嵌合作用实现血小板衍生增长因子b b ( p d g f b b ) 的 检测。其中，核酸适体一质粒d n a 复合物可通过质粒p u c l 9 与p d g f b b 的核酸适体 的延伸引物片段杂交制备。生物识别反应在微孔板中进行，p d g f b b 抗原与微孔 板底部预包被的p d g f b b 抗体免疫反应后，加入核酸适体质粒d n a 复合物与抗原 形成夹心复合物。引入d n a 双链染料嵌合s y b rg r e e ni 后，抗体抗原核酸适体 质粒d n a 三元夹心复合物可产生强荧光，其荧光强度可用于定量测定p d g f b b 浓 度。此方法成功实现了对人血清中p d g f b b 的定量检测。 ( 2 ) 发展了一种基于等位基因特异性延伸的电化学检测单碱基突变的方法。通 过巯基自组装技术构建传感器界面。当引物与模板完全匹配时，发生等位基因特 异性延伸反应，产生二茂铁标记型产物，并形成发夹结构。该产物特异性地与电 极上的捕获探针杂交，在电极上出现二茂铁的特征还原峰；峰电流大小与目标链 浓度对数成线性关系。而引物末端与模板不匹配时，等位基因特异性延伸反应不 能进行，电极上无二茂铁还原峰出现。使用该方法对b 地中海贫血基因的一2 8 位点 突变的情况成功地进行了检测。 ( 3 ) 建立了一种新的纳米金增强伏安免疫分析方法。以人免疫球蛋白g ( h i g g ) 为模型，将羊抗人免疫球蛋白g ( g a hi g g ) 固定于电极表面构成免疫传感器界面。 固定化抗体与分析目标物h i g g 发生免疫反应而将h i g g 捕获，利用夹心法将纳米金 标记的g a hi g g 结合于电极表面。通过纳米金催化氯金酸还原可在电极表面形成 更大的纳米金颗粒，从而大大增加电极表观面积，改善电极表面的电化学吸附行 为，再用差示脉冲法对电极进行表征，可实现目标物的高灵敏度定量检测。 关键词：核酸适体；血小板衍生增长因子；等位基因特异延伸；单核苷酸多态性； 金增强；免疫分析 i i 高灵敏生物传感器的研究与应用 a b s t r a c t w i t ht h eh u m a ng e n o m ep r o je c ta n dp r o t e o m i c sr e s e a r c hp r o g r e s s ，t h er a p i d d e v e l o p m e n to fl i f e s c i e n c eb r i n gf o r w a r dt oal a r g en u m b e ro fn e wi s s u e sf o r a n a l y t i c a lc h e m i s t r y t h e 锄a l y s i so fb i o l o g i c a lm a c r o m o l e c u l e ss u c ha st h ep e p t i d e s ， p r o t e i n s ，n u c l e i ca c i d sh a sb e c o m eo n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf r o n t i e ra r e a si nt h e m o d e r nd e v e l o p m e n to fb i o c h e m i c a la n a l y s i s q u a n t i t a t i v ed e t e m i n a t i o no fp r o t e i n a n dr 印i di d e m i f i c a t i o no fs i n g l e - b a s em u t a t i o n sa r eo fp a r t i c u l a ri m p o r t a n c ef o rt h e p a t h o g e n ya n de a r l yt h e r a p yo fc o r r e s p o n d i n gd i s e a s e s i nt h i st h e s i s ，w ep r o p o s e dan e ws p e c i f i c ，s e n s i t i v ef l u o r e s c e n c ei m m u n o s e n s i n g m e t h o db a s e do na p t a m e r - p l a s i m i dc o m p l e xa m p l i f i c a t i o nf o rt h em i c r o a n a l y s i so f p r o t e i na n dan o v e le l e c t r o c h e m i c a lm e t h o df o rd n ap o i n tm u t a t i o nd e t e c t i o nb a s e d o na l l e l e - s p e c i f i ce x t e n s i o nw h i c ha r ed e s c r i b e di nf o l l o w i n gs e c t i o n s ： ( 1 ) w ed e v e l o p e dan e ws i m p l e ， s e n s i t i v em e t h o dw h i c hu t i l i z e dt h es p e c i f i c r e c o g n i t i o nb e t w e e na n t i b o d ya n da n t i g e na sw e l la sa p t a m e r p l a s m i dc o m p l e xa n dt h e i n t e r c a l a t i o no fn u o r e s c e n c ed y es y b rg r e e nii nt h eg r o o v eo fd u p l e xp l a s m i dd n a i nd e t e c t i o no fp d g f - b b t h ea p t a m e 卜p l a s m i dd n a c o m p l e xc a nb ep r e p a r e dw i t h e 嬲ev i ah y b r i d i z a t i o no ft h ep l a s m i dv e c t o rp u c l9w i t ht h ee x t e n s i o no fa na p t a m e r t op d g f - b b t h ei m m u n o a s s a yw a s p e r f o r m e di nt h em i c r o t i t e rw e l l si nw h i c hr a b b i t a n t ip d g f - b ba n t i b o d yi si m m o b i l i z e d t h ep d ( f b ba n a l y t ei s c a p t u r e db yt h e p r i m a r ya n t i b o d ya n dt h e ns a n d w i c h e db yt h e 印t a m e r - p l a s m i dd n ac o m p l e x t h e i n t r o d u c t i o no fn u o r e s c e n c ed y es y b rg r e e nia h o w sf o rt h ed e t e c t i o no ft h e s a n d w i c h e d i m m u n o c o m p l e x o f a n t i b o d y a n i g e i l a p t a m e r p l a s m i dc o m p l e x t h e p r o p o s e dm e t h o do f f e r sas e n s i t i v ed e t e c t i o nf o rp d g f b bi ns e r u m ( 2 ) an o v e le l e c t r o c h e m i c a lm e t h o db a s e do na l l e l e s p e c i f i ce x t e n s i o ni nd e t e c t i o n o fp o i n tm u t a t i o nh a sb e e np r o p o s e d b r i e f l y ，a l l e l e s p e c i f i cp r i m e rp e r f e c t l ym a t c h i n g w i t h t e m p l a t e c a nb ee x t e n d e dt or e s u l ti na ni n c r e a s eo f c u r r e n t ， w h e r e a s a l l e l e - s p e c i f i cp r i m e rm i s m a t c h i n gw i t ht h et e m p l a t ea t3 t e r m i n a lb a s e sc a n n o tb e e x t e n d e dt or e s u l ti nau n c h a n g e do ft h ec u r r e n t t h ep r e s e n ta p p r o a c hh a sb e e n d e m o n s t r a t e dw i t ht h ei d e n t i f i c a t i o no fas i n 9 1 e - b a s em u t a t i o ni n - 2 8s i t e ( at og ) f o r p - t h a l a s s e m i ag e n ea n dt h ew i l dt y p ea n dm u t a n tt y p ew e r es u c c e s s f u l l ys c o r e d ( 3 ) w ed e v e l0 ：p e dan o v e lv o l t a m m e t r i ci m m u n o s e n s i n gm e t h o db a s e do nc o l l o i d a l g o l de n h a n c e m e n t t h i sm e t h o dd e m o n s t r a t e st h ei m p l e m e n t a t i o no fas a n d w i c h i i i 硕士学位论文 i m m u n o a s s a yo fam o d e la n a l y t e ， h u m a ni m m u n o g l o b u l i ng( h i g g ) ， u s i n gt h e c o l l o i d a lg o l d l a b e l e dg o a ta n t i - h u m a ni m m u n o g l o b u l i ng ( g a h i g g ) a s t h ed e t e c t i o n p r o b e t h ee l e c t r o l e s sc a t a l y t i cd e p o s i t i o no fg o l di o n s o nt h eg o l dn a n o p a r t i c a l s e n l b l e st h eg r o 、t ho ft h eg o l dn a n o p a r t i c a l sa tt h ee l e c t r o d es u r f a c e t h ed e v e l o p e d m e t h o di s e x p e c t e dt oh o l dg r e a tp r o m i s ei ni m m u n o s e n s i n gd u et ot h ee a s eo f i m p l e m e n t a t i o n ，h i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y k e y 、 ，o r d s ：a p t a m e r ；p d g f - b b ；a u e l e s p e c i n ce x t e n s i o n ；s n p s ；i m m u n o a s s a y ； g o l de n h a n c e m e n t 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：朋年t 们刀日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密囤。 ( 请在以上相应方框内打“”) 日期：沙了年岍刀日 日姆：川啮确静峙弈幂 、， 名名签签者师作导 硕士学位论文 第1 章绪论 随着人们生活水平的日新月异，临床诊断、环境保护、食品和医药等领域的 科技发展，在分析过程中越来越多地需要对被分析物进行快速、在线、痕量的分 析和监测。过去的数十年里，大量的研究都集中在开发可快速实时检测的生物传 感器上。特别是近2 0 多年来，传感器技术领域有了很大的进展，生物传感器以其 出色的灵敏度以及高度的选择性引起了广泛的关注。 1 1 生物传感器 传感器是一种信息获取与处理的装置。对物质成分传感的器件就是化学传感 器，它是一种小型化的、能专一和可逆地对某种化学成分进行应答反应的器件， 并能产生与该成分浓度成比例的可测信号。生物传感器是在化学传感器的基础上 发展起来的，最先问世的生物传感器是酶电极。到目前为止，生物传感器大致经 历了3 个发展阶段：第一代生物传感器是由固定了生物成分的非活性基质膜( 透 析膜或反应膜) 和电化学电极所组成；第二代生物传感器是将生物成分直接吸附 或共价结合到转换器的表面，而无需非活性的基质膜，测定时不必向样品中加入 其他试剂；第三代生物传感器是把生物成分直接固定在电子元件上，它们可以直 接感知和放大界面物质的变化，从而把生物识别和信号的转换处理结合在一起。 生物传感器作为直接或间接检测生物分子、生理或生化过程相关参数的新方法， 由于具有灵敏度高、选择性好、响应快、操作简便、样品需要量少、可微型化、 价格低廉等特点，已在生物医学、环境监测、食品医药工业等领域展现出十分广 阔的应用前景。 1 1 1 生物传感器工作原理 d 捌o q 电强 酶 微生物羹瓤 黼 绷胞或 箨吟 热敏电阻 缎绠 抗原藏 巍露 f l 瓣应晶 信号处理嚣 f i g1 1s c h e m a t i ci l i u s t r a t i o no fab i o s e n s o r 原理是：当待测物质与生物敏感膜( 含有能与目标物进行选择性作用的生物 高灵敏生物传感器的研究与应用 活性组分) 接触时，生物活性组分与目标物之间相互作用产生生物学反应信息。 换能器则能敏感捕捉反应信息，并将其表达为可检测的物理信号。产生的电化学、 光学、热学、压电学等响应信号，其大小与分析物含量或浓度存在定量关系，从 而实现对待测物质的定量检测。 1 1 2 生物传感器的分类 生物传感器一般可以从以下三个角度来进行分类1 2 j ： ( 一) 根据传感器输出信号的产生方式，可分为： 1 、生物亲合性生物传感器【3 】。此类传感器利用免疫试剂对之间专一性识别或 键合性质来对抗原、半抗原或抗体进行检测，它检测的是热力学平衡的结果。 2 、代谢性或催化性生物传感器【4 5 】。此类生物传感器利用固定到电极表面的 酶的专一性和催化性，在接近中性和室温条件下对特定底物产生作用，直接检测 酶催化产物的电化学信号或通过电子媒介获取响应信号，它检测的是整个反应动 力学过程的总效应。 ( 二) 根据生物传感器中生物分子识别元件上的敏感物质的属性可分为：酶传 感器【6 1 、微生物传感器【7 1 、细胞传感器【8 】、免疫传感器【9 1 、d n a 传感器【1 0 】等。 ( 三) 根据生物传感器的信号获取方式，可分为： l 、电化学生物传感器。按测量信号不同，电化学生物传感器又可分为电流型 【1 1 1 、电位型【1 2 】和电导型【13 1 。电流型酶传感器的原理是利用固定在电极表面上的酶 对酶底物的催化氧化或还原，产生可在电极上还原或氧化的组分，获得电流信号 ( 有时这一过程需要外加电子媒介) ；电位型传感器是基于离子选择性电极原理而 发展起来的，固定到电极表面酶对底物催化，产生离子型物质，能引起指示电极 电位改变，电位变化关系遵循n e m s t 方程；电导型传感器利用酶催化底物反应， 导致反应体系中离子种类及浓度的变化，从而引起溶液导电性的改变，以溶液电 导率为响应信号。 2 、光化学生物传感器【h ，l5 1 。此类传感器以光学信号变化量为测定信息，由于 可利用的光学信号很多，包括光吸收、反射、散射、荧光、磷光、化学发光、表 面等离子体共振等。 3 、压电生物传感器【1 6 】。用压电晶体检测质量的依据是，压电晶体的振荡频率 与其表面质量的变化有关，在一定的条件下，晶体的共振频率与吸附的物质呈线 性关系。在压电晶体生物传感器内，晶体上涂有生物受体，后者与被分析物有选 择性反应。这类传感器主要利用免疫和酶反应检测挥发物质。 4 、热传导生物传感器【1 7 】。通过特殊的量热设备来测量由于化学和生物反应导 致反应体系的热量变化，此变化值大小与分析物浓度相关。 硕士学位论文 1 1 3 生物传感器中生物组分的固定化方法 生物传感器由生物敏感元件和信号转换器两个主要部分组成。生物传感器的 选择性主要取决于生物敏感材料，而灵敏度的高低则与信号转换器的类型、生物 材料的固定化技术等有很大的关系。因此在生物传感器的构建中，其关键技术之 一就是如何将生物分子稳定、高活性地固定到换能器表面。选择理想的固定方法 应该满足以下几个条件： a 固定后的生物识别分子仍能保持良好的活性。 b 生物膜与转换器须紧密接触且能适应多种测试环境。 c 固化层要有良好的稳定性与耐用性。 d 减少生物膜中生物组分的相互作用以保持其原有的高度选择性。 为了研制价格低，灵敏度高，选择性好和寿命长的生物传感器，生物识别分 子固定化技术显得非常重要。 经过近2 0 年的发展，已经建立了对各种不同生物功能物质的固定化方法，大 致可划分为：物理或化学吸附法【1 8 2 们、包埋法【2 1 2 5 1 、共价键固定法【2 6 2 引、交联法 【2 9 3 0 1 。其中吸附法的特点是方法简便、操作条件温和，不足之处是生物分子与固 定表面结合力弱。由于转换器表面取向的不规则分布，因此使制得的生物传感器 易于发生生物分子的泄漏或解脱，灵敏度低，重现性差。包埋法操作条件比较温 和，膜的孔径和形状可以随意控制，对生物组分活性的影响比较小，缺点就是需 要控制很多实验因素。共价键固定法是通过特殊键的形成而将生物分子固定化于 固体表面，因而不易发生分子的泄漏，并且改善了分子在表面的定向、均匀分布 状况。但生物分子易失活、操作复杂、耗时、成本高。交联法是通过多官能团试 剂( 如戊二醛) ，使吸附的生物分子以共价结合的方式结合至固体表面。该法的缺点 主要是反应难以控制，形成的酶蛋白质层蓬松、坚固性差，所需生物样品量多。 随着膜技术的发展一些新型的成膜技术例如分子自组装技术3 1 1 ，溶胶凝胶技术【3 2 ， 3 3 1 ，纳米粒子修饰技术【3 4 ，3 5 1 等也开始广泛应用于制备生物传感器。 1 2 免疫传感器 免疫是生物体识别和清除抗原型异物的一种生理性反应。免疫分析 ( i m m u n o a s s a y ) 是指利用抗原与抗体之间高特异性的反应( 即免疫反应) 实现对抗 体、抗原或相关物质进行检测的分析方法。从本质上说，免疫分析法是一种形式 特殊的试剂分析法，它的起点是抗体成为分析试剂。在免疫分析的发展和应用中， 免疫分析所指的抗体己超出了抗体的原始意义，它泛指所有与待测分子特异结合 的蛋白质分子，包括免疫球蛋白、受体和其他结合蛋白质。免疫分析在临床化学 高灵敏生物传感器的研究与应用 分析中占有极其重要的地位，有着广泛的应用。由于免疫分析的高特异性，因而 能用于复杂样品如尿液、血液等的分析，且操作简单，所以免疫分析技术在临床 实验室和化学分析实验室很受重视。 1 2 1 免疫分析法 基于抗原和抗体本身结合前后物理和化学性质的变化建立的免疫分析方法为 非标记免疫分析，如压电免疫分析法等。但是，作为分析信号，这种物理和化学 信号难以直接被检测，因此免疫反应中引入探针系统以实现检测，以探针信号的 变化来间接的得到抗原抗体反应的信息，进行对抗原或抗体的分析。当然，引入 探针在大多数情况下不可避免的带来了检测相对过量标记试剂的分离问题，因而 标记免疫分析法又分为均相免疫分析和非均相免疫分析法。通常来讲，均相免疫 分析虽然不需要分离，但往往灵敏度不高，非均相免疫分析法虽然需要分离手续， 但可以极大地提高分析的灵敏度，降低检测限，适合于检测含量很低的分析物。 目前，在这些方法中，非均相免疫分析法依然是免疫分析的主流 36 1 。标记技术中 的标记物主要有放射性同位素( 3 h ，1 2 5 i ) 、酶( 辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶) 和 荧光素( 异鲁米诺、鲁米诺、异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明) 三大类，此 外还有化学发光剂( 甲基丫啶酯) 、金属离子( 铁、锰、铬、铅、钻、镍和镧系元素 e u 3 + 、t b 3 + 、s m 3 + ) 。因此根据标记物和检测方法的不同，可将相应的免疫分析技 术称为放射免疫分析( r a d i oi m m u n o a s s a y r i a ) ，酶免疫分析( e n z y m ei m m u n o a s s a y ， e i a ) ，荧光免疫分析( f l u o r o i m m u n o a s s a y ，f i a ) 、发光免疫分析( l u m i n e s c e n t i m m u n o a s s a y ，l i a ) 、金属免疫分析( m e t a l l o i m m u n o a s s a y ，m i a ) 、电化学免疫分析 ( e l e c t r o c h e m i c a l i m m u n o a s s a y ，e c i a ) 等等。免疫分析技术由于存在分析时间长、 分离分析操作繁琐及对分析操作技能要求高或所用仪器、试剂价格昂贵不便于分 析系统的集成化、微型化，不能满足实际生物样品分析的在线、快速检测的要求。 以免疫分析技术为基础而发展起来的免疫传感器的应用，大大地推动了免疫分析 技术在医学、临床、生物、化学、环境、农业、工业等领域的应用和发展【3 7 。4 。 1 2 2 免疫生物传感器分类 免疫生物传感器按换能器分为以下几类： 1 2 2 1 光免疫生物传感器 光免疫生物传感器包括表面等离子体( s p r ) 、紫外、荧光、化学发光、拉曼散 射、光声等免疫传感器；表面扫描免疫转感器，如原子力显微镜技术( a f m ) 1 4 2 1 ； 光免疫传感器具有很高的传输信息容量，检测安全，信号稳定等特点，但另一方 面使用的仪器和药品价格昂贵。目前借助于化学发光的光纤免疫传感器已用于许 多抗原和抗体的测定，如雌二醇、q 一干扰素、总i g g 和抗流感病毒抗体。 硕士学位论文 1 2 2 2 压电免疫生物传感器 压电晶体免疫传感器是最常见的一种质量测量式免疫传感器，1 9 7 2 年s h o n s 等人首先在石英晶体表面涂覆一层塑料薄膜以吸附蛋白质，成功制备了用于测定 牛血清蛋白抗体的压电晶体免疫传感器，从而使压电现象用于免疫测试的想法成 为现实。但是开始阶段该类传感器大多只限于气相测定，即晶片在样品缓冲液中 与待测物反应后，还需取出干燥后才能测定频率变化，这样可使晶片起振较容易， 避免非特异性吸附对结果的影响，取得较好的线性关系。但这增加了操作时间， 且干燥过程中对蛋白质活性有损害，会缩短传感器的寿命。自从1 9 8 0 年，k o n a s h 和b a s t i 锄n s 【4 3 j 首先实现了压电晶体在液相中的成功起振，压电液相生物传感技术 得到了飞速的发展。姚守拙等【4 4 】发现溶液的电导也影响压电晶体的液相频率响应。 他们通过考察压电晶体在4 7 种纯有机溶液、水与有机混合溶液以及电解质溶液中 的频率响应情况，提出了介电常数( l ) 和电导两个参数对晶体振荡频率响应的 作用，使液相压电传感经验方程式更趋完善。 压电生物传感器的应用领域非常广泛，包括临床诊断、工业控制、食品和药 物分析、环境保护以及生物技术等【4 5 铷】。1 9 7 2 年，s h o n s 等人【5 l 】最早将压电传感 器和免疫反应结合起来，研制了第一个压电免疫传感器。从这以后，出现了大量 关于压电免疫传感器的研究和应用。到目前为止，压电生物传感器己经被应用到 临床诊断、工业控制、食品和药物分析、环境保护等众多领域，其检测的对象包 括细菌【5 2 - 53 1 、病毒【5 4 56 1 、蛋白质5 7 1 等等。 1 2 2 3 表面等离子共振免疫生物传感器 表面等离子共振技术( s p r ) 是目前免疫传感器中适用范围最广的一种换能器。 具体的做法是：在等离子体共振装置表面上修饰一层抗体，当抗原抗体识别反应 发生时等离子共振装置的折射率就会发生位移，位移的大小和位置与反应的特性 有关。等离子体共振装置的主体可以是一块棱镜，也可以是一块镀了金属膜的透 镜。用s p r 技术进行免疫分析，可以识别抗原的种类，测定抗原的浓度，获得抗 原抗体结合的动力学常数。测定抗原抗体亲和力的动力学常数，不仅可以研究结 构和功能的关系，而且对选择不同抗体用于治疗、检测、诊断等都具有非常实用 的价值。用s p r 法测定人抗i g g 检测下限低达2 1 0 。1 2m o l l 。s p r 还可用于体积 较大病毒的免疫研究和疾病诊断，s p r 免疫传感器已成功地运用到性激素球蛋白、 梅毒和流感病毒的测定。 1 2 2 4 电化学免疫生物传感器 电化学免疫传感器是一种将特异性抗原一抗体免疫结合信号转化为相应的电 信号的检测换能装置。按照测量信号的不同，可以将其分为：电位型免疫传感器、 高灵敏生物传感器的研究与应用 电流型免疫传感器、电导型免疫传感器和电容型免疫传感器。 ( 1 ) 电位型免疫传感器，这种传感器是基于电位变化来进行免疫检测的【5 弘6 1 j 。 通常以离子选择电极、气敏电极作为基体电极，酶作为标记物用来催化底物的反 应，使底物释放出离子或气体，待测抗原( 或抗体) 的浓度与酶催化产物在基体 电极上的响应相关，其检测限可达到肛gm l 。 ( 2 ) 电流型免疫传感器，电流型传感器由于其具有很高的灵敏度，因此在电化 学免疫传感器中占据着重要的地位f 6 2 ，6 3 1 。该类传感器的原理主要有竞争法和夹心 法两种，由于抗原抗体通常没有电化学活性，需要使用标记物标记的抗原抗体， 从而能够把这种生物结合信号转化为电信号。 ( 3 ) 电导型免疫传感器，化学反应产生或消耗的离子，能使溶液的导电能力发 生改变。y a g i u d a 【6 4 】用电导法测定了尿中的吗啡，解决了原来吗啡测量设备昂贵、 费时、麻烦的问题。但电导法易受被测样品离子强度和缓冲液容积的影响，且难 以克服非特异吸附。 ( 4 ) 电容型免疫传感器，近十几年来随着相关科学技术的发展，一些新型的电 化学免疫传感器相继涌现。其中电容型免疫传感器便是其中较为引入注目的一种 【6 5 1 。电容型免疫传感器是以测定界面电容变化作为分析和研究的手段。当电极插 入溶液中，电极溶液界面的行为近似为一平行板电容器，在给定的电势下其双层 电容c 表示： c = o a d 为平板电容器中介质的介电常数，o 为真空介电常数，a 为平板的面积，d 为 平板间距。在免疫分析中，当、o 、a 视为恒定的前提下，由于在传感器界面上 形成了抗原抗体复合物，相应的生物敏感膜厚度d 值增大，导致被测定的膜电容下 降，由此可以建立目标物的定量检测方法。 免疫传感器已逐步应用于临床检验、环境保护、食品和药物及农业分析等领 域 6 6 ，6 7 1 。y u a n 等删报道了一种无标记的检测日本脑炎疫苗的电流型免疫传感器。 a b o u l e n e i n 等【6 9 】使用电流型免疫传感器测定人体中甲状腺激素的含量。p a r k 等【7 0 】 报道了一种用于检测食品中沙门氏细菌的电流型免疫传感器。g u i l b a u l t 等【7 1 】制备 了一种高灵敏度，快速自动分析的免疫传感器用于阿特拉津的测定，检测限达到 1 1 “gl 一。z h o u 等【7 2 】报道了一种基于萘酚膜修饰的电流型传感器，用于日本血吸 虫的检测。 1 2 3 免疫传感器的应用及发展趋势 免疫检测技术对基础研究和临床诊断中蛋白质的检测和定量分析发挥了极大 的作用，通常基于抗体的免疫分析系统被视为检测特定抗原的一种通用的和有力 的工具，用来检测各种不同的分子和细胞分析物，同样也用于临床诊断【_ 7 3 】。然而， 还有众多的分析物，它们在癌症、传染病和生物化学过程中都是非常重要的生物 硕士学位论文 标记物，但是却因为在人体的体液中或组织中存在的浓度太低而无法用传统的免 疫方法检测出来。为了突破这个限制，提高传统免疫分析方法的灵敏度，多种可 供选择的方法被提出来，包括发展更强大的荧光染料和发光基体用于e l i s a s 分析， 实现信号放大如酪胺沉积【7 4 】和金属银沉积【7 5 1 。但是在试验中经常要求有更高的灵 敏度和分析的特异性，特别是当分析被能获得的样品所限制，或是抗原的浓度相 当低的时候7 6 1 。免疫p c r 【7 7 ，7 8 1 和免疫r c a 【7 9 1 等技术作为可以替代e l t s a s 的方法 成为一个高灵敏度的平台用于提高抗体抗原识别时的信号。 1 3d n a 生物传感器 1 3 1 基因与基因诊断 自1 9 5 3 年w a t s o n 和c r i c k 发现生物遗传分子脱氧核糖核酸( d n a ) 的双螺旋 结构，建立生物遗传基因的分子机理以来，有关d n a 分子的识别、测序一直为人 们所关注。基因控制着人类生命的生老病死过程，随着对基因与癌症及其他与基 因相关病症的了解，在分子水平上检测易感物种及基因突变，对于疾病的治疗及 预测也有着重要的意义，并可望实现对疾病的早期诊断乃至超前诊断。 基因诊断是通过直接探查基因的存在状态或缺陷对疾病做出诊断的方法。基 因诊断的探测目的物是d n a 或i 矾a ( 核糖核酸) 。前者反映基因的存在状态，而 后者反映了基因的表达状态。目前，基因诊断的方法学研究取得了很大进展，先 后建立了限制性内切酶酶谱分析、核酸分子杂交、限制性片段长度多态性连锁分 析、聚合酶链反应( p c r ) ，以及近年发展起来的d n a 传感器及d n a 芯片技术等。 传统的诊断方法是先发现疾病的表型，再把基因产物即蛋白质或其抗体氨基酸序 列弄清楚，运用分子生物学技术分离该基因，并通过测序确定突变部位，这适合 于已知突变与疾病的关系。对于生物特征不明疾病用此方法显然不行。自2 0 世纪 9 0 年代启动人类基因组计划以来，这一领域目前己取得相当大的进展，d n a 传感 器及d n a 芯片被应用于d n a 测序、突变检测、基因筛选、基因诊断以及几乎所有 应用核酸杂交的领域【8 0 抛】。 1 3 2d n a 传感器的设计原理及分类 d n a 生物传感器主要由两部分组成，即分子识别器( d n a ) 和换能器。识别 器主要用来感知样品中是否含有( 或含有多少) 待测物质，转换器则将识别器感 知的信号转化为可以观察记录的信号( 如电流的大小、频率变化、荧光和光吸收 的强度等) 。在待测物、识别器以及转换器之间由一些生物、化学、生化作用或物 理作用过程彼此联系。其设计原理是在电极上固定一条含有十几到上千条核苷酸 的单链d n a ( 即s s d n a ) ，通过d n a 分子杂交，对另一条含有互补碱基序列的d n a 进行识别，结合成双链d n a ( 即d s d n a ) 。杂交反应在敏感元件上直接完成，换能 高灵敏生物传感器的研究与应用 器将杂交过程所产生的变化转化为电信号，根据杂交前后电信号的变化量，推断 出被检测d n a 的量。d n a 生物传感器不仅能测定d n a 的浓度，还能识别部分碱基 的排列顺序，可确定微生物的种属，这是一般生物传感器所不具备的特性，按换 能器转换信号的不同可以将d n a 生物传感器分为d n a 光学传感器、d n a 压电传感 器、d n a 电化学传感器等等。 ( 1 ) d n a 的光学传感器 目前主要有荧光光纤d n a 传感器、表面增强拉曼基因探针和表面等离子体共 振d n a 传感器三种。 a b e l 等【8 3 】研制了自动光学d n a 传感器系统，其原理是用亲和素或链霉亲 和素将生物素标记探针固定在光纤表面，利用石英光纤损耗场的荧光激发和检测， 实现探针与荧光素标记互补链杂交的现场监测，灵敏度可达1 3 2 p m o l 。与荧光检测 相比，表面增强拉曼检测具有更高的灵敏度。因此利用表面增强拉曼( s e r s ) 试剂 修饰制备的基因探针，可无需放大直接用于基因检测。d u n c a n 等【8 4 】报道了灵敏度 达o 8p m o l 的s e r s 基因探针。n a r a y a n a 等【s 5 】将具有光谱选择性和高灵敏度的 s e r s 技术与p c r 技术结合，应用于h i v g a g 基因的检测。虽然s e r s 技术所需设 备较昂贵复杂，但基于其极小的光谱带宽( 半峰宽 l n m ) ，可望实现在一个芯片上 用多个s e r s 基因探针同时检测多个靶基因，而这是一般光学检测技术( 如荧光检测 的半峰宽5 0 1 0 0 n m ) 所难以做到的。表面等离子体共振( s p r ) 基因传感器基于s p r 对传感器表面变化的敏感，无需杂交指示剂也不用对d n a 标记，直接现场监测杂 交过程。p e t e r l i n z 等【8 6 j 报道用两色s p r 谱实现d n a 杂交的非标记现场定量检测。 j o r d a n 埔7 j 报道将扫描s p r 测量和显微s p r 技术联用，用以表征金膜表面d n a 杂交吸 附的s p r 信号。 ( 2 ) 压电d n a 传感器 压电基因传感器的研究是压电生物传感器应用的一个热点【8 8 1 。这方面的工作 主要集中在用石英微量天平( q c m ) 研究d n a 的杂交反应。f a w c e t t 等人【鹳】最先开始 用压电传感器来检测d n a 杂交反应，他们在传感器表面固定多聚肌苷酸( p o l yi ) 和 多聚腺苷酸( p o l ya ) ，分别检测多聚胞苷酸( p o l yc ) 和多聚尿苷酸( p o l yu ) 。以后 的研究工作一般都采用特定碱基序列的d n a 片断作为探针。o k a h a t a 等人【9 0 1 用 2 7 m h z 的q c m 作核酸的杂交动力学研究，测定了相关的动力学常数。他们还检测 了各种影响杂交反应的因素，包括：错配碱基的个数、核酸链的长度、杂交温度、 溶液离子强度。f u n a d o 和t h o m p s o n 【9 l 】在传感器表面固定2 5 m e r 的核酸探针，分别 与互补的核酸链、非互补的核酸链、单个碱基错配的核酸链进行杂交。实验表明 传感器的响应能够区别互补和单个碱基错配的情况。t 0 m b e l l i 等【9 2 】用硫醇右旋糖 苷修饰金表面，再结合链球菌抗生素，固定2 3 m e r 的核酸探针进行实验，也得到 硕士学位论文 了同样的结论。t h o m p s o n 的研究小组用3 2 p 作为标记，对杂交反应的结果进行检测 【9 3 1 。结果表明，由杂交反应产生的质量变化远远大于s a u e r b r e y 公式估计的质量变 化，这主要是由于杂交过程中边界性质的变化引起的。他们还用阻抗分析与流动 注射分析结合的方法对杂交过程实时监测，研究d n a 和r n a 杂交的动力学【9 4 1 。为 了提高压电d n a 传感器的灵敏度，研究者设计了各种方法。b a r d e a 等人【9 5 】用三种 方法来放大信号：d n a 结合物上加a n t i d n a 抗体的方法、生物素亲和素结合的 方法、酶的方法，并用于检测t a y s a c h s 基因变异。肽核酸p n a 与d n a 有完全相 似的化学结构，也可以用作杂交探针【9 6 1 。与d n a 探针相比，p n a 探针具有杂交特 异性好，时间短的特点。 ( 3 ) d n a 电化学传感器 电化学d n a 传感器一般由一个固定d n a 片段的电极和用于检测的电活性杂交 指示剂构成【9 7 1 。其原理( 图1 4 ) ：在适当条件下，利用两条互补的d n a 单链间的 特异性相互作用，使电极表面上已知序列的d n a 片段( d n a 探针) 与溶液中的待测 序列d n a ( 靶序列) 发生杂交，通过杂交前后电活性指示剂的电化学响应的变化进 行测定【9 8 】。在电极表面的d n a 双螺旋结构形成后，该传感器还可用于检测那些与 d n a 双链有着特殊亲和力的电活性小分子。 + ，、厂、 似皇堡型矍f 苎塑型f1 娩 l ll ll ，v 、- ， uu 固定u v 蒜姒片断 互补的单链蹦 - - - - - - - - - - - - - 杂交 杂交指示剂 嵌入 双链d n 囤 f i g 1 4s k e t c hd i a g r a mf o rt h ep r i n c i p l eo fe i e c t r o c h e m i c a d n ab i o s e n s o r a 直接电化学法 d n a 中有的碱基具有电化学活性，可制备直接用电化学方法检测目标d n a 的 基因传感器，这样的方法比较简便。通常利用的碱基是鸟嘌呤，它较易发生电化 学氧化反应。因d s d n a 双螺旋结构外侧的脱氧核糖阻碍内侧碱基的电化学反应， 所以鸟嘌呤的电化学氧化信号在杂交后明显下降【9 9 】，根据这个特点可设计出无标 记( 或无试剂) 的电化学基因传感器【1 0 们，但是这种方法灵敏度较低。 b 电化学活性的杂交指示剂作为识别物 杂交指示剂是能够选择性区别d s d n a 、s s d n a 的一类物质，其与d s d n a 结 合后仍保持电化学活性。通过测定其氧化还原峰电流和峰电位可以识别和测定 高灵敏生物传感器的研究与应用 d n a 分子。常用杂交指示剂有邻菲咯啉钴【1 0 1 1 、联吡啶钴1 0 2 1 、道诺霉素1 0 3 1 等。 c 在寡聚核苷酸上标记电化学活性的官能团作为识别元素 合成的带有电化学活性基团的寡聚核苷酸与电极表面的靶基因选择性地进行 杂交反应，在电极表面形成带有电活性官能团的杂交分子，通过测定其电信号可 以识别和测定d n a 。x u 等【1 0 4 】用氨基二茂铁标记探针d n a ，壳聚糖吸附法固定探 针，测定了d n a 的杂交。w a n g 等【1 0 5 】采用量子点标记d n a ，并用溶出伏安法检测， 与普通伏安法相比，该法有很高的灵敏度，能获得有效的背景补偿，提高了序列 检测能力，能方便地同时检测三种靶序列。 d 在d n a 分子上标记酶作为识别元件。 当标记了酶的s s d n a 与电极表面的互补s s d n a 发生杂交反应后，由于酶具 有很强的催化功能，可以通过测定反应生成物的变化量间接测定d n a 。 l u m l e y w b o d y e a r 等【1 0 6 】采用辣根过氧化物酶标志探针d n a ，通过测定具电化学活 性的酶催化产物响应电流测定d n a 杂交，这种方法将酶催化放大作用引入d