（蔬菜学专业论文）番茄抗叶霉病分子机理及抗病相关基因分离技术体系的建立.pdf

浙江大学博士学位论文番茄抗叶霉病分子机理及抗病相关基因分离技术体系的建立 摘要 番茄( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) 对叶霉病( c l a d o s p o r i u mf u l v u m ) 的抗性是番茄抗c f u l v u m 基因( 和互补的cf u i v u m 无毒基因( a v r ) 产物进行识别互作，激活下游抗病信号传 导，并活化各类防卫反应基因表达的结果。c f - 9 与c f - 4 蛋白的氨基酸序列9 1 以上一致，而a v r 9 与a w 4 则没有明显的同源性，a v r g c f - 9 和a v r 4 c f - 4 介导的过敏性坏死( h y p e r s e n s i t i v er 豁p o n s e ， h r ) 在坏死产生时间、方式和强度上表现明显差异。a v r 9 c f - 9 番茄苗中h r 产生早，扩展慢，产 生的过敏性坏死斑小而多，分散，在叶脉上较少见。而a v r 4 c f - 4 苗中h r 产生迟，扩展快，产生 的过敏性坏死斑少，多产生于主脉，常沿叶脉迅速扩大成坏死区，最终导致整个子叶的萎蔫脱落。 导致两种a v r c f 苗产生不同h r 的原因，可能是c 厂表达的差异，和或盯下游信号传导途径的差 异。本研究以通过杂交获得的携带a v r 9 c f - 9 或a v r 4 c f - 4 基因对的番茄为材料，观察降温过程中 a v r 9 c f - 9 和a v r 4 c f - 4 番茄幼苗子叶h r 坏死产生过程的异同；通过e d n a a f l p 分析，比较和分 离克隆c f 9 和c f - 4 下游信号传导相关基因( 片段) ，并对分离到的部分相关基因进行功能分析， 建立对c d n a - a f l p 片段直接进行抗病相关性验证的t r v 介导的v i g s 分析体系；比较分析植株 发育、温度以及互补无毒基因对c f - 9 和c f - 4 基因表达的影响；以便增进对c f - 9 和c f - 4 介导h r 和抗病性产生的分子机理的理解，并为采用基于c d n a - a f l p 片段的基因沉默技术快速大量分离 鉴定植物抗病相关基因奠定基础。获得的主要研究结果如下： ( 1 ) 对a w c f 番茄幼苗产生h r 的特性进行显微观察和比较分析，发现高温3 3 c 抑制a v r c f 番茄中h r 的产生，5d 苗龄的a w 9 c f l 9 和a w 4 c f - 4 幼苗从3 3 。c 降温到2 0 。c 培养后4h 和1 6h 有少许细胞被锥虫蓝染成蓝色，两者分别在降温1 2h 和4 8h 后大片组织被染成蓝色，说明 a v r g c f - 9 和a v r 4 c f - 4 番茄苗分别于降温后4h 和1 6h 后开始产生h r ，至1 2h 和4 8h 形成典型 h r 。 ( 2 ) 采用上述a w c f 番茄苗通过温控产生h i ( 的系统，对分别为a w 4 、c f - 4 、a v r 4 c f - 4 、a v r 9 、 c f - 9 ，a v r 9 c f - 9 的6 个基因型番茄苗经高温和降温处理后所取样品进行c d n a - a f l p 分析。通过 5 1 2 对选扩组合对1 2 个样品共得到2 7 94 8 0 个明显c d n a - a f l p 条带，其中表现和不表现h r 时 差异表达的a c e ( a v r c f - e l i c i t e d ，e i t h e ri n d u c e do rr e p r e s s e d ) 条带为3 6 7 个。在这些差异表达条带 中，2 4 9 个为a v r 4 c f - 4 和a v r 9 c f i 9 番茄苗产生h r 时均诱导表达，1 1 8 个为产生h r 时表达均受 抑制。共克隆差异表达最显著的序列1 8 9 个，均已登录g e n b a n k 核酸序列数据库，登录号分别为 c d 5 7 9 0 9 9 - 。c d 5 7 9 1 6 4 ，c k 3 4 8 2 8 6 - 一c k 3 4 8 3 9 0 ，以及d n 9 5 6 2 1 5 d n 9 5 6 2 2 5 。这些差异表达片段 对应基因分别编码抗病蛋白，以及与h r 细胞坏死、信号传导、防卫反应、转录调节、代谢，和 蛋白合成等相关因子。此外，共获得e d n a 全长序列9 个，因其皆为a v r c f 诱导表达，故称为 v 摘要 a c i ( a v r l c f l i n d u c e d ) 基因，登录号分别为d q 0 5 6 4 3 3 d q 0 5 6 4 4 2 。其中，a c l l 4 编码钙调磷酸酶 类磷酸酯酶( c a l c i n e u r i n l i k ep h o s p h o e s t e r a s ef a m i l yp r o t e i n ) ，a c l 2 5 编码木葡聚糖特异性真菌内源 葡聚糖酶抑制子蛋白( x y l o g l u c a n s p e c i f i cf u n g a le n d o g l u c a n a s ei n h i b i t o rp r o t e i n ) ，a c l 2 9 编码6 0 s 核糖体蛋白l i o ，a c l 3 6 编码酮戊二酸苹果酸转运蛋白( o x o g l u t a r a t e m a l a t e t r a n s l o c a t o r ) ，a c l 3 7 编码细胞色素b 5 5 9 ，a c l 3 9 编码胞质核糖体蛋白s 1 3 ，而a c l l 3 ，a c l l 9 和a c i l l 2 编码功能朱知 的蛋白。c d n a - a f l p 差异显示结果表明，虽然3 6 7 个a c e 片段在a v r 9 c f - 9 和a v r 4 c f - 4 苗中表 现与不表现h r 时差异表达的趋势( 即同样被h r 诱导或抑制) 一致，但其中4 2 8 ( 1 5 7 3 6 7 ) a c e 片段在丽类h r 中差异表达的强度不同，绝大多数( 1 3 5 1 5 7 ，8 6 慨) 在a w 4 c f - 4 苗中差异 表达程度更显著。这些结果说明，c y - 4 和c f - 9 下游信号传导途径涉及的基因很可能一致，但它们 表达的精细调控可能有一定区别。 ( 3 ) 对a c l 2 9 在h r 产生前后和胁迫处理后的表达进行分析，发现在只含a v r 9 、c f - 9 ，a v r 4 或c f - 4 基因不产生h r 的番茄苗中，a c l 2 9 在苗龄为3d 及以前的小苗中微弱表达，但在4d 后 表达明显增强。在有互补a v r c f 基因对存在因而产生h r 的幼苗中，a c l 2 9 表达比上述对照强， 且a v r 9 c f - 9 和a v r 4 c f - 4 番茄苗之间，a c l 2 9 表达时序和强度都有明显差异，在a v r 9 c f - 9 幼苗中 的表达早于a v r 4 c f i 4 幼苗，但在a v r 4 c f - 4 苗h r 产生后，a c l 2 9 的表达比同样大小的a v r 9 c f - 9 苜中更强烈。说明a c l 2 9 表达与植株的发育和过敏性坏死程度相关。另外，重金属离子处理微弱 诱导a c l 2 9 的表达。盐渍和干旱强烈抑制其表达，而机械损伤处理后的表达与未处理的对照相当。 这说明6 0 s 核糖体蛋自l 1 0 可能参与植物的发育、h r 和逆境反应的调控。 ( 4 ) 分别将差异片段2 9 和1 4 亚克隆入t r v 介导的基因沉默载体p y l l 5 6 ，以番茄t p d s 基 因的v i g s 沉默体系为对照，对c y 二9 和c f - 4 基因型植株进行沉默分析，发现正对照植株表现白化 症状，说明植株体内t p d s 基因已被沉默。片段2 9 沉默后出现严重的发育迟缓和矮化现象，而片 段1 4 沉默后没有发现明显症状。这说明核糖体蛋白编码基因a c l 2 9 可能参与植株的发育调控， 而编码类似钙调磷酸酶的磷酸酯酶编码基因a c l l 4 则可能与发育无关。采用基于c d n a - a f l p 片 段的基因沉默技术快速大量分离鉴定植物抗病相关基因的策略是可行的。 ( 5 ) 分别对c f - 9 、a v r 9 c f - 9 ，c f - 4 和a v r 4 c f - 4 基因型番茄幼苗在ld 、3d 和5d 的高温培 养后进行降温处理，经n o r t h e r n 杂交分析表明，在不存在互补无毒基因的情况下，c f - 9 在各处理 中均未见表达，而c f - 4 的表达量则随着幼苗培育天数和降温时间的延长而增加；当互补无毒基因 存在时，c 厂基因的表达强于只含a v r 或盯的对照小苗。两者的表达均随幼苗培育天数和降温时 间的的延长而迅速增加。降温处理后，c f - 9 进入大量表达的时期早于c f - 4 ，但c f - 4 的表达峰值明 显高于前者。这说明发育、温度和无毒基因与( - 厂基因的表达密切相关，且c f - 9 和c f - 4 对这些因 子影响的反应无论从时序上还是强度上均有区别。 关键词：番茄；l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ：叶霉病；c l a d o s p o r i u m f u l v u m ；抗病基因；劬无毒基 因；a v r ；过敏性坏死( h r ) ；发育；温度；c d n a - a f l p ；基因表达；t r v ；病毒介导的基因沉 默( v i g s ) ：a c e ：a c i ；6 0 s 核糖体蛋白l i o ；类似钙调磷酸酶的磷酸酯酶。 v i 浙江大学博士学位论文番茄抗叶霉病分子机理及抗病相关基因分离技术体系的建立 a b s t r a c t t h er e s i s t a n c eo ft o m a t o ( l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u mm i l l ) a g a i n s tt h el e a fm o u l df u n g a lp a t h o g e n c l a d o s p o r i u m f u l v u mi si n i t i a t e db yt h er e c o g n i t i o no fcf u l v u ma r i v u l e n c e ( a v r ) e l i c i t o r sb yt o m a t oc f r e s i s t a n c eg e n ep r o d u c t s ，w h i c ha c t i v a t e st h ed o w n s t r e a ms i g n a l i n g ，r e s u l t i n gi nd e f e n s e - r e l a t e dg e n e e x p r e s s i o n o v e r9 1 o ft h ea m i n oa d d so f c f - 9a n dc f - 4p r o t e i n sa r ei d e n t i c a l ，w h e r e a sn os i g n i f i c a n t s e q u e n c eh o m o l o g yi sf o u n db e t w e e na v r 9a n da w 4p r o t e i n s h o w e v e ra v r 9 c f - 9 - a n da v r 4 c f - 4 i n d u c e dh y p e r s e n s i t i v ec e l ld e a t hi nt o m a t os e e d l i n g si sd i s t i n c ti nt h et i m eo fi n i t i a t i o n ，t h es p e e do f d e v e l o p m e n ta n dt h et i s s u e st h a th ro c c u r s t h eh ri nc o t y i e d o n so fa v r 9 c f - 9s e e d l i n g si n i t i a t e s e a r l i e r , s p r e a d ss l o w e r , d e v e l o p i n gm o r es c a t t e r e ds p o t s ，l e s sa s s o c i a t e dw i t hv e i n s ，w h e nc o m p a r e dw i t h t h a to f a v r 4 c f - 4s e e d l i n g s t h ed i f f e r e n th rc o u l d b ec a u s e db yt h ed i f f e r e n te x p r e s s i o no ft h ec f g e n e s a n d o rd o w n s t r e a ms i g n a lt r a n s d u c t i o n t ot e s tt h eh y p o t h e s i s ，t h i st h e s i sr e s e a r c he m p l o y e dt h ea v r c f t o m a t os e e d l i n g st oc o m p a r et h ea v r c f - d e p e n d e n th rd e v e l o p e da f t e rt h eg r o w t ht e m p e r a t u r es h i f t f r o m3 3 0 ct o2 0 0 c ，i n v e s t i g a t et h et r a n s c r i p tp r o f i l e su p o nt h eh rd e v e l o p m e n tt h r o u g hc d n a - a f l p ， a n di s o l a t ea n dc l o n et h et d f s ( t r a n s c r i p td e r i v e df r a g m e n t s ) d i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h eh r * a n dt h e h r - s e e d l i n g s e x p r e s s i o no fs o m et d f sw a sa s s a y e di nd e t a i l s y s t e mo ft r v - i n d u c e dg e n es i l e n c i n g b a s e do nt h ec d n a - a f l pt d f st oi d e n t i f yt h er o l ei nr e s i s t a n c eo ft h eg e n e sc o r r e s p o n d i n gt ot h e t d f s ，w a se s t a b l i s h e d i na d d i t i o n ，t h ee f f e c to fd e v e l o p m e n t ，t e m p e r a t u r ea n dt h ec o g n a t ea v ro nt h e e x p r e s s i o no fc f 9a n d 呼彳w a sc o m p a r a t i v e l ys t u d i e d i n o r d e rt om a k ed e e pi n s i g h t si n t ot h e m o l e c u l a rm e c h a n i s mo fc f 9 - a n dc f i 4 - d e p e n d e n th ra n dr e s i s t a n c e ，a n dm a k eag o o db a s i so nt h e f u t u r es t u d i e so ni d e n t i f i c a t i o na n di s o l a t i o no fp l a n tr e s i s t a n c e - r e l a t e dg e n e se m p l o y i n gt h es t r a t e g y b a s e do ng e n es i l e n c i n gu s i n gt h er e c o m b i n a n ts i l e n c i n gv e c t o rd i r e c t l yi n s e r t e dw i t ht h ec d n a - a f l p t d f s t h em a i nr e s u l t sa l ea sf o l l o w s ： ( 1 ) t h eh ri na v r 9 c f - 9a n da v r 4 c f - 4s e e d l i n g sw a sc o m p a r e dt h r o u g hm i c r o s c o p i ca n a l y s i s i t w a sf o u n dt h a th i g ht e m p e r a t u r e ( 3 3 0 c ) a t t e n u a t e st h eh rd e v e l o p m e n ti nt h ea v r c f t o m a t os e e d l i n g s s o m ec e l l sw e r es t a i n e db l u eb yt h ed y et r y p a nb l u e4h ra n d1 6h rp o s tt e m p e r a t u r es h i f tf r o m3 3 0 ct o 2 0 0 ci nt h ea v r 9 c f - 9a n da v r 4 c f - 4s e e d l i n g s ，r e s p e c t i v e l y m o r ea n dl a r g es t a i n e dc e l lp a t c h e sw c r e o b s e r v e d12h ra n d4 8h rp o s tt e m p e r a t u r es h i f ti nt h ea v r c fs e e d l i n g s ，r e s p e c t i v e l y t h i sr e s u l t i n d i c a t e st h a tt h eh ri si n i t i a t e d4h ra n d16h rp o s tt e m p e r a t u r es h i f t ，a n dt y p i c a lh rs p o t sd e v e l o p12 h ra n d4 8h rp o s tt e m p e r a t u r es h i f ti na v r 9 c f - 9a n da v r 4 c f - 4s e e d l i n g s ，r e s p e c t i v e l y ( 2 ) c d n a - a f l pa n a l y s i sc o n d u c t e df o rt h es e e d l i n g sc a r r y i n gas i n g l ea v rg e n eo rc fg e n eo ra v i i m a t c h i n ga v r c fg e n ep a i rs a m p l e db o t ha t3 3 。ca n da f t e rat e m p e r a t u r es h i f tt o2 0 。c t r a n s c r i p t p r o f i l e sw e r ec o m p a r e di nh l ra n dh ws e e d l i n g s t d f sd i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nt h eh r + a n dt h e h r - s e e d l i n g sw e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d o v e r2 7 94 8 0b a n d sf o rt o t a l l y12s a m p l e sa p p e a r e di nt h e c d n a - a f l pa s s a y a m o n gt h e s e ，3 6 7a c e ( a v r c _ c _ c _ c _ f - e l i c i t e d ，e i t h e ri n d u c e do rr e p r e s s e d ) t d f ss h o w n d i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ni nh r + a n dh r - s e e d l i n g s ，a m o n gw h i c h2 4 9s h o w ni n d u c e de x p r e s s i o nw h e r e a s 1 18s h o w nr e d u c e de x p r e s s i o ni nb o t hh l ra v r 9 c f - 9a n da v r 4 c f - 4s e e d l i n g s 18 9t d f ss h o w i n gm o s t s i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a le x p r e s s i o ni nh r + a n dh r - s e e d l i n g s w e r ec l o n e da n ds e q u e n c e d 1 1 1 es e q u e n c e s w e r ed e p o s i t e da tg e n b a n kn u c l e o t i d es e q u e n c ed a t a b a s eu n d e rt h ea c c e s s i o nn u m b e r sc d 5 7 9 0 9 9 - c d 5 7 916 4 ，c k 3 4 8 2 8 6 c k 3 4 8 3 9 0 ，a n dd n 9 5 6 215 d n 9 5 6 2 2 5 t h eg e n e sc o r r e s p o n d i n gt ot h e18 9 t d f se n c o d e sar e s i s t a n c ep r o t e i na n dp r o t e i n si n v o l v e di nh r c e l ld e a t h ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，d e f e n s e r e s p o n s e ，t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n ，m e t a b o l i s ma n dp r o t e i ns y n t h e s i s i na d d i t i o n ，9f u l l - l e n g t he d n a s e q u e n c e sw e r eo b t a i n e d ，a n dn a m e da c g e n e sf o ra v r c _ c _ c f i i n d u c e dg e n e s t h e s es e q u e n c e sw e r e d e p o s i t e da tg e n b a n ku n d e rt h ea c c e s s i o nn u m b e r sd q 0 5 6 4 3 3 d q 0 5 6 4 4 2 a m o n gt h e m ，a c i s1 42 5 ， 2 9 ，3 6 , 3 7a n d3 9e n c o d e sac a l c i n e u r i n l i k ep h o s p h o e s t e r a s ef a m i l yp r o t e i n ，ax y l o g l u c a n - s p e c i f i c f u n g a le n d o g l u c a n a s ei n h i b i t o rp r o t e i n ，a6 0 sr i b o s o m a lp r o t e i n l 10 ，a n o x o g l u t a r a t e m a l a t e t r a n s l o c a t o r , ac y t o c h r o m eb 5 5 9a n dac y t o p l a s m i cr i b o s o m a lp r o t e i ns13 ，r e s p e c t i v e l y , w h e r e a sa c l s i3 1 9a n d1 1 2c o d e sf o rp r o t e i n sw i t hu n k n o w nf u n c t i o n r e s u l t so ft r a n s c r i p tp r o f i l i n ga s s a yr e v e a l e d t h a ta l t h o u g ha l l3 6 7 彳c et d f ss h o w e dt h es a m et r e n df e i t h e ri n d u c e do rr e p r e s s e d ) o fd i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o nb e t w e e nh r 十a n dh r - s e e d l i n g s ( e i t h e ra v r 4 c f - 4 o ra v r 9 c f - 9 - d e p e n d e n t ) 4 2 8 o ft h e a c et d f s ( 1 5 7 3 6 7i nt o t a l ) s h o w e dq u a n t i t a t i v e l yd i f f e r e n te x p r e s s i o ni nt h et w ot y p e so fh r 十 s e e d l i n g s t h em a j o r i t yo ft h e s e ( 13 5 15 7 ，8 6 0 ) d i s p l a y e ds i g n i f i c a n t l yg r e a t e rd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o n ( e i t h e ri n d u c e do rr e p r e s s e d ) i na v r 4 c f - 4h r 十s e e d l i n g st h a ni na v r 9 c f - 9h r 十s e e d l i n g s t h e s er e s u l t s d e m o n s t r a t et h a tt h es p e c t r u mo ft h eg e n e si n v o l v e di nt h ec f 9a n dc f 4d o w n s t r e a ms i g n a l i n gm a yb e i d e n t i c a l ；h o w e v e r , t h ef i n e - t u n e dr e g u l a t i o no ft h e s eg e n e sm i g h tb ed i f f e r e n td u r i n gd e v e l o p m e n to f a w 9 c f i 9 - a n da v r 4 c f - 4 一d e p e n d e n th ra n dr e s i s t a n c e ( 3 ) t h ee x p r e s s i o n0 f 4 c 刀9u p o nd e v e l o p m e n to fh ra n du n d e rs t r e s sc o n d i t i o n sw a sa n a l y z e d i t w a sf o u n dt h a ti nt h es e e d l i n g sc a r r y i n gas i n g l ea v ro rc f g e n e ，a n dt h u ss h o w i n gn oh r ，a c l 2 9w a s w e a k l ye x p r e s s e di nt h e3 d - o l da n dy o u n g e rs e e d l i n g s ，b u ts t r o n g l ye x p r e s s e di nt h e4 d - o l da n do l d e r s e e d l i n g s e x p r e s s i o nw a ss t r o n g e ri nt h es e e d l i n g sc a r r y i n gam a t c h i n ga v r c f g e n ep a i ra n dt h u sa b l e t od e v e l o ph r ，a n dd i f f e r e di nt h et i m e - c o u r s ea n dp r o f u n d i t yi na v r 9 c f - 9a n da v r 4 c f - 4s e e d l i n g s i t w a se x p r e s s e de a r l i e rb u tl e s ss t r o n g l yu p o nd e v e l o p m e n to fh ri na v r 9 c f - 9s e e d l i n g sc o m p a r e d 谢m t h a ti na v r 4 c f - 4s e e d l i n g s ，i n d i c a t i n gt h a td e v e l o p m e n ta n dh ra f f e c t st h ee x p r e s s i o no fa c l 2 9 i n a d d i t i o n ，e x p r e s s i o no f a c l 2 9w a sw e a k l yi n d u c e db yh e a v ym e t a lt r e a t m e n t s ，s t r o n g l yr e p r e s s e db ys a l t a n dd r o u g h tt r e a t m e n t s ，b u tn o ta f f e c t e db y w o u n d i n gt r e a t m e n t s t a k e nt o g e t h e r , t h e s er e s u l t sr e v e a l t h a tt h er i b o s o m a lp r o t e i nl 1 0m a yb ei n v o l v e di nr e g u l a t i o no f d e v e l o p m e n t , h ra n ds t r e s sr e s p o n s ei n v i i i 浙江大学博士学位论文番茄抗叶霉病分子机理及抗病相关基因分离技术体系的建立 p l a n t s ( 4 ) t d f s1 4a n d2 9a n dat p d sf r a g m e n t 舔ap o s i t i v ec o n t r o lw e r es u b e l o n e di n t ot r v - d e r i v e d g e n es i l e n c i n gv e c t o rp y l l5 6 ，r e s p e c t i v e l y s i l e n c i n ga n a l y s i sw a sc o n d u c t e di nc f 4a n dc f 9t o m a t o p l a n t s p h o t o b l e a c h i n gp h e n o t y p ew a so b s e r v e di nt h ep l a n t si n f i l t r a t e dw i t ha g r o b a c t e r i u mt r a n s f o r m e d w i t hp y l l5 6 ：t p d s , d e m o n s t r a t i n gt h a tt h ee n d o g e n o u sp d s g e n eh a sb e e ns i l e n c e di nt h e s ep l a n t s ，t h e p l a n t si nw h i c ht h eg e n ec o r r e s p o n d i n gt ot d f2 9 ( s u p p o s e dt ob ea c l 2 9 ) w a ss i l e n c e ds h o w ns e v e r e d e v e l o p m e n tr e t a r d a t i o na n dd w a r f i n g ，w h e r e a gt h ep l a n t si nw h i c ht h eg e n ec o r r e s p o n d i n gt ot d f1 4 ( s u p p o s e dt ob et h ea c l l dw a gs i l e n c e d ，d i dn o ts h o w na n yv i s i b l es y m p t o m t h i sr e s u l tr e v e a l st h a t t h i sg e n es i l e n c i n gs y s t e mw o r k sf o rc d n a - 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4g r a d u a l l y e n h a n c e dw i t ht h ei n c r e a s i n gg r o w i n gd a y sm a i n t a i n e da t2 0 0 ca n dt h el o n g e rg r o w i n gh o u r sa f t e rt h e t e m p e r a t u r es h i f t i na v r c f s e e d l i n g s ，h o w e v e r , b o t hc f g e n e sw e r ee x p r e s s e dm o r es t r o n g l yt h a ni nc f s e e d l i n g s t h ee x p r e s s i o no fb o t hgg e n e sr a p i d l ys t r e n g t h e n e dw i t ht h ei n c r e a s i n gg r o w i n gd a y s m a i n t a i n e da t2 0 。ca n dt h el o n g e rg r o w i n gh o u r sa f t e rt h et e m p e r a t u r es h i f t a f t e rt e m p e r a t u r es h i f t ，t h e e x p r e s s i o no fc f 9w a gm o r er a p i d l yb u tt h ep e a l 【l e v e lw a gl o w e rc o m p a r e dw i t ht h a to f ( 乒彳t h e s e r e s u l t sd e m o n s t r a t et h a td e v e l o p m e n t , t e m p e r a t u r ea n dt h ec o g n a t ea v ra f f e c tt h ee x p r e s s i o no fb o t hc f g e n e s ，b u tt oad i f f e r e n te x t e n t k e yw o r d s ：t o m a t o ；l y c o p e r s i c o ne s c u l e n t u m ；l e a fm o u l d ；c l a d o s p o r i u mf u l v u m ；r e s i s t a n c eg e n e ；c f , a v i r u l e n c eg e n e ； a v r ；, h y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e ；d e v e l o p m e n t ；t e m p e r a t u r e ； c d n a - a f l p ；g e n e e x p r e s s i o n ；t o b a c c or a t t l ev i r u s ( 删；v i r u s i n d u c e