（外科学专业论文）fhl1在慢传输型便秘结肠组织中的表达及意义.pdf

| l i i ii i ii l l lti ii iii ii il y 17 6 9 2 14 目录 一、摘要 中文论著摘要1 英文论著摘要”4 二、英文缩略语”7 三、论文 前言”8刖舌”5 实验材料与方法“9 实验结果( 附论文图片) l1 讨论l3 结论15 四、本研究创新性的自我评价16 五、参考文献17 六、附录 综j 苤19 在学期间科研成绩2 7 致谢2 8 个人简介2 9 中文论著摘要 f h l l 在慢传输型便秘结肠组织中的表达及意义 目的 便秘是多种疾病的病理过程引起的一种复杂的症状。目前临床上通常将便秘 分为3 类：慢传输型便秘；出口梗阻型便秘；混合型便秘。而慢传输型便秘占 慢性便秘的4 5 5 ，是临床上比较常见的一种类型。理论上消化道任何部位对其内 容物传输减慢都可能导致便秘，但实际9 5 的传输减慢发生在结肠，所以慢传输 型便秘又称为结肠慢输型便秘，于1 9 8 6 年首次提出，是一类以结肠动力减弱、结 肠传输时间延长为主要特点的顽固性便秘，好发于儿童和老人，可引起恶心、呕 吐、食欲下降、腹痛、腹胀，甚至肠穿孔，以及心脑血管方面的疾病。随着现代 生活节奏加快，生活水平提高，饮食结构改变及社会人口的老龄化，慢传输型便 秘发病率逐年上升，已经成为影响现代人们生活质量的常见疾病之一。慢传输型 便秘是一类最常见的顽固性便秘，人们很早就对其病因展开研究，但因为慢传输 型便秘的发生受多种因素影响，其病因非常复杂，所以迄今为止尚未完全明确。 我们从蛋白分子水平寻找慢传输型便秘的发病机制，以达到对其早期治疗提供必 要的前期基础。 蛋白质组学是一个新兴的研究领域，其核心在于大规模地对蛋白质进行综合 分析，通过对某物种、个体、器官、组织或细胞的全部蛋白质性质包括表达水平、 结构、翻译后修饰、细胞内定位、蛋白质相互作用等的研究，对蛋白质所执行的 生理性、病理性生命活动做出最精细、最准确、最本质的阐述。蛋白质本身的存 在形式、活动规律仍依赖于直接对蛋白质的研究来解决。因此，直接研究蛋白质 的变化具有不可替代的意义。而且，随着蛋白质组学的研究进展，表达蛋白质组 学是现今应用最为广泛的蛋白质组学研究模式。该策略的技术路线是双向电泳建 立蛋白质图谱用专业图像扫描分析软件进行图像分析通过质谱及蛋白质数据信息 处理技术进行蛋白质的鉴定与分析。 我们采用双向电泳技术对结肠慢传输型便秘与正常结肠组织的蛋白质进行分 离，通过软件分析和质谱生物信息学方法寻找疾病相关蛋白质，在蛋白质水平探 讨结肠慢传输型便秘发生机制，并对差异蛋白f h l i 进行w e s t e r n b l o t 检测，为结 肠慢传输型便秘早期诊断和治疗提供基础资料。 方法 一、临床资料及标本的采集 实验所用的标本均来自中国医科大学附属盛京医院，行全结肠手术切除慢传 输型便秘8 例，术前诊断符合罗马i 标准，年龄4 2 6 2 岁，中位年龄5 3 岁，对照组 标本8 例，( 由于结肠造瘘和结肠息肉等在我院行结肠手术的患者8 例正常结肠组 织，均无便秘病史) 年龄3 7 6 5 岁，中位年龄5 2 岁。标本离体后立即投入液氮中，2 4 小时后移入8 0 深度冰箱备用。 二、结肠慢传输型便秘与对照组结肠组织蛋白质组差异分析 1 、提取结肠全层组织的总蛋白质，b r a d f o r d 法进行蛋白定量。 2 、等电聚焦使用e t t a ni p g p h o ri i 等电聚焦仪。聚焦后的胶条经两步平衡后进 行s d s p a g e 电泳，考染、扫描后用i m a g e m a s t e r2 dp l a t i n u m6 0 软件进行图像 分析，寻找差异蛋白点。 3 、切取差异点并进行质谱和生物信息学分析。 三、f h l l 在慢传输型便秘结肠和对照组结肠中表达情况分析 1 、提取结肠全层组织的总蛋白质，b r a d f o r d 法进行蛋白定量。 2 、用w e s t e r n b l o t 方法验证该蛋白在结肠中的表达情况，进一步分析f h l l 与结肠慢传输型便的相关性。 结果 一、结肠慢传输型便秘与对照组结肠组织双向电泳图谱差异分析 结果 使厍j p h 3 - - - 1 0 ，2 4 c m 胶条获得了重复性较好的双向凝胶电泳考染图谱，结肠 慢传输型便秘和正常对照组的蛋白识别数分别为1 0 8 0 + 5 1 和1 2 8 0 - j ：3 0 个，各凝胶中 斑点平均匹配率分别为7 0 4 - 5 ，统计分析使用t t e s t 法，选取蛋白斑点表达差异 2 大于2 倍( r a t i o 2 ) ，t - t e s tp 2 ) ，t - t e s tp 2 ) ，t - t e s tp 0 0 5 的斑点作为研究蛋白。鉴定出1 5 个蛋白 点，共1 4 种蛋白，一种重复蛋白，蛋白表达下调的有9 种蛋白，共上调的有5 种蛋 白。 根据m a l d i t o f t o fm s 二级质谱分析结果，鉴定出f h l l 蛋白为明显的下 调蛋白，蛋白评分为4 4 7 分。经w e s t e r n b l o t 进一步验证，结果发现，在慢传输型便 秘结肠组织中f h l l 的表达下调。( 见表1 和图1 ) 表l ，蛋白质谱鉴定回报表 2 t a x1 d g ) 6 0 6g e n e s y m b o l - - f h l li s o f o r m1o f f o u r 3 t a x j d 两6 0 6g e m _ s y m b o l = - c d n af l j 5 2 5 6 1 ，h i g h l y s i m i l kt of o u ra n dah a l f l i md o m a i n sp r o t e i ni 4t a xi d = 毋6 0 6g - e r i e s y m b o i = h n r n p a 2 8 1p u t a t i v e u n d 强盯嵋把f i 孺dp r o t e i nh n r n p a 2 b l 5t a xi d 一) 6 0 6c h i n e _ s y m b o l = h b bh e m o g l o b i ns u b u n i t b e t a 6 t a x _ l 汹s 0 6c u m e _ s y m b o l = k r t lk e r a l i n ，t y p e c y t a s k e l e t a l1 7 t a x _ l d - - 9 6 0 6g e n es y m b 0 1 2 h s p b ih e a ts h o c k 讲d t c i n b e m - i 8 9 l o l l 1 2 1 3 t a x1 d 一) 6 0 6g e n e _ s y m b o l = l g k ci g k cp r o t e i n t a x _ l 删g e n e _ s y m b o l - - h b bl q e m o 剖l o b i ns u b u n i t b e t a t a xi d = 9 6 0 6o e n e _ s y m b o i = f t lf e r r i t i n t 戤j d = 9 6 0 6c _ n m e _ s y m b o l = f g bf i b r i n o g e nb e t a t a x1 d 。9 6 0 6g e n es y m b o l - - - s e r p i n a ll s o f o r m3o f t a x1 d 。9 6 0 6g e n e _ s y m b o l = a g r 2a n t e r i o rg r a d i e n t2 h o m o l o g ( f r a g m e n t ) 1 4t a xi d = 9 6 0 6g e n e _ s y m b o l = f o bf i b r i n o g e nb e t a i p i 0 0 6 4 7 2 0 7 i p l 0 0 9 2 2 7 6 9 i p l 0 0 9 1 6 5 1 7 i p l 0 0 6 5 4 7 5 5 i p i 0 0 2 2 0 3 ” i p l 0 0 0 2 5 51 2 i p l 0 0 6 5 4 7 5 5 i p l 0 0 3 7 5 6 7 6 i p l 0 0 2 9 8 4 9 7 i p i 0 0 8 6 9 0 0 4 i p l 0 0 8 9 3 8 8 1 3 1 8 7 2 8 8 7 24 7 71 0 0 2 8 0 7 8 18 7 4 1 91 0 0 3 4 1 8 1 4 9 0 24 6 61 0 0 1 5 9 8 8 36 7 5 3 0 61 0 0 6 5 9 7 8 8 1 61 1 71 0 0 2 2 7 6 8 55 9 84 0 3 1 0 0 2 5 6 2 9 9 1 5 9 8 8 3 2 1 2 8 2 8 5 5 8 9 2 3 3 4 7 3 3 6 1 9 9 5 0 6 1 5t a xi d = 9 6 0 6g e n e _ s y m b o l = c l c a lc a l c i u m - a c t i v a t e d i p l 0 0 0 1 4 6 2 5 1 0 0 1 0 6 1 c h l o r i d ec h a n n e lr e g u l a t o r1 6 1 5 6 7 5 5 7 8 5 4 5 0 4 9 0 3 8 5 4 5 9 7 2 4 61 0 0 7 7 7 3 3 0 5 5 0 2 0 7 5 2 7 2 4 2 3 8 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 l o o l o o 1 2 墨 专砖 a 为对照组结肠组织 p * r + 1 - ： 。 1 3 - a c t i n 翟出。上 一，_ _ f h li 啼 一 b 为慢传输型便秘结肠组织 图1 ，双向电泳图及w e s t e r n 图 讨论 随着后基因组时代的到来，蛋白质组学得到了空前的发展，双向电泳具有高 通量、半定量以及能同时给出蛋白质分子量、等电点及修饰等信息的优点，因而 成为蛋白质组研究的核心技术。我们采用双向电泳和质谱技术分离并鉴定慢传输 型便秘病人结肠全层组织差异表达蛋白质，共鉴定出1 5 个蛋白点，共1 4 种蛋白， 一种重复蛋白，蛋白表达下调的有9 种蛋白，上调的有5 种蛋白。其中有对细胞 凋亡起调节作用的热休克蛋白，有参与调节细胞生存、转录和信号转导等重要生 物学功能的发育调节蛋白质f h l l 等。 s t c 是一类以胃肠动力减弱为主要特点的顽固性便秘，目前病因及发病机制 13 冀蓬i 礓q 灞毳霉。：爹，蛰 尚未完全清楚，可能为一种病因产生多重机制所致，也可能由多种因素协同所致， 目前公认的病因主要有一下几点【8 】： l 、精神、心理因素影响 2 、c a j a 【l 间质细胞的变化 3 、肠道神经的变化 4 、平滑肌功能障碍 5 、神经递质和受体的改变 6 、自身免疫的发生 7 、外源性神经毒素作用 8 、激素的异常等。 而结肠的动力传输功能受到抑制或者破坏在s t c 的发生，发展中起着重要的 作用。 平滑肌是胃肠道活动的最终效应器，其协调功能的缺失将导致结肠动力改变， 近来的研究已经证实，肠道功能异常患者平滑肌存在结构及形态学上的改变9 1 。 包括不同程度的纤维化、肌纤维的增生或萎缩以及肌细胞空泡形成等，这些异常 可能是原发的，也可能是继发的。平滑肌的形态异常和运动失调会直接影响到结 肠的收缩。 f h l ( f o u ra n dah a l f l i md o m a i n ，4 个半l i m 结构域) 家族属于l i m 超家族。 l i m 结构域由约5 0 个氨基酸残基组成，富含半胱氨酸，形成2 个锌指结构【10 1 。l i m 是3 种转录因子l i n l l 、i s l 1 和m e c 3 的缩写，其保守的半胱氨酸、组氨酸残基形 成具有z n 2 + 结合1 2 1 袋的稳定三级结构，能介导蛋白质问的相互作用f l l 】。f h l 家族 蛋白只含有l i m 结构域，由4 个半l i m 结构域组成，即含有氨基端半个l i m 结 构域和其后的4 个l i m 结构域。f h l 蛋白通过与其他蛋白的相互作用，在胚胎发 育、细胞分化和细胞骨架形成中具有重要作用。另外，f h l 蛋白还可介导转录因 子、信号通路蛋白和细胞骨架蛋白间的相互作用【1 2 1 。 目前发现f h l 家族由f 眦1 - f h l 4 和a c t a c t i v a t o ro fc r e mi n t e s t i s ，睾丸 c r e m ( c a m p 效应元件调制蛋白) 激活蛋白】等5 个成员组成，在人类中还没有发现 小鼠f h l 4 的同源物。f h l 蛋白间的氨基酸序列同源性很高，为4 0 - - , - 6 0 。f h l 1 4 家族成员在细胞和组织中特异表达f h l l 1 3 1 和f h l 3 1 卅在骨骼肌中的表达水平相 对较高，但在心肌【1 5 】中亦表达：f h l 2 1 6 】主要在心脏中表达，在骨骼肌中表达水平 相对较低：；f h l 4 1 7 】和a c t 1 明在睾丸中特异表达。f h l 家族成员在不同组织中的 差异表达可能决定了它们在这些组织中的生物功能 f h l 家族成员通过l i m 结构域与多种蛋白质相互作用，如结构蛋白、激酶、 转录因子等，而这些结合常与生理功能密切相关。因此，对f h l 家族生物学功能 的探索主要是通过与其相互作用蛋白的分离来实现的。而f h l l 与肌球蛋白结合 蛋白c 在肌纤维膜共定位【1 9 1 ，与肌球蛋白竞争同肌球蛋白结合蛋白c 的相互作用。 并调节肌球蛋白结合蛋c 的活性，在肌小节装配中具有重要作用。而肌球蛋白是 肌原纤维粗丝的组成单位，存在于平滑肌中，在肌肉运动中起重要作用。 目前关于f h l l 主要集中在肿瘤方面，大量文献表明f h l l 是一种肿瘤抑制因 子 2 0 1 【2 l 】，在s r c 和c a s 作用的下游特异性阻止锚定不依赖细胞的生长和转移。s r c j l 匝 过抑$ 1 j f hl 1 来促进肿瘤细胞生长。f h l l 的表达在脑、乳腺、肝脏、肺、肾脏、 前列腺和皮肤等数种人组织肿瘤中被抑制。f h l l 在人绝大多数腺癌、大细胞癌及 支气管肺泡癌组织中的表达明显下调。目前国内外没有关于f h l l 蛋白与慢传输型 便秘的相关研究，因此研究f h l l 通过何种途径影响结肠收缩以及基因转录翻译方 面的调控，对进一步了解慢传输型便秘的发病机制及治疗具有重要的意义。 结论 l 、应用双向电泳技术获得了重复性较好的慢传输型便秘和正常对照组结肠蛋 白质双向电泳图谱。分析期间差异，并坚定出f h l l 等1 4 种蛋白。 2 、进一步验证表i 韭j f h l l 在慢传输型便秘结肠组织中的表达是下调的。 1 5 研究创新性的自我评价 l 、应用双向电泳技术分析了慢传输型便秘和正常对照组结肠蛋白质组差异表 达情况，并通过质谱鉴定和生物信息学分析，坚定了1 4 种差异表达蛋白质，为进 一步研究慢传输型便秘的发病机制提供了可借鉴的方法和背景。 2 、用w e s t e r nb l o t 分析方法，进一步证实了f h l l 在慢传输型便秘结肠组织中 的表达是下调的，为进一步研究此蛋白是否与与肌收缩作用有关及f h l l 通过何种 途径影响结肠收缩以及其基因转录翻译方面的调控打下基础，对进一步了解慢传 输型便秘的发病机制及治疗具有重要的意义。 1 6 参考文献 lb h a r u c h aa e , p h i l i p ss f s l o wt r a n s i tc o n s t i p a t i o n j c a s t r o e n t e r o lc l i nn o r t ha m , 2 0 0 1 m a r , 3 0 ( 1 ) ：7 7 - 9 5 2 徐爱忠，彭洪云慢传输型便秘的病因研究进展 j 国际外科学杂质，2 0 0 7 ，1 ( 3 4 ) ：1 8 2 1 广西医学，2 0 0 6 ，2 8 ( 9 ) ：1 4 8 3 - 1 4 8 5 3a n d e r s o nn p r o t e o m ea n d p r o t e o m i c s ：n e wt e c h n o l o g i e s ，n e wc o n c e p t s ，a n dn e w w o r d s j e l e c t r o p h o r e s i s ，1 9 9 8 ，1 9 ( 1 1 ) ：1 8 5 3 - 1 8 6 1 r e f e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 4 2 5 1 3 2 7 3 3 。 4 l i l l e yk s ，r a z z a qa ，d u p r e ep , e ta 1 t w o - d i m e n s i o n a lg e le l e c t r o p h o r e s i s ：r e c e n ta d v a n c e si n s a m p l ep r e p a r a t i o n ，d e t e c t i o n , d e t e c t i o na n dq u a n t i t a t i o n j c u r r e n to p i n i o ni nc h e m i c a l b i o l o g y , 2 0 0 2 ，6 ( 1 ) ：4 6 - 5 0 5梁列新功能性胃肠病和罗马诊断标准 j 广西医学，2 0 0 6 ，2 8 ( 9 ) ：1 4 8 3 1 4 8 5 6 g o r ga ，o b e r m a i e rc ，b o g u t hg e ta 1 t h ec u r r e n ts t a t eo f t w o - d i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i sw i t hi m m o b i l i z e dp h g r a d i e n t s j e i e c t r o p h o r e s i s ，2 0 0 0 ，2 1 ( 6 ) ：1 0 3 7 1 0 5 3 7c a n d i a n og , b r u s c h im ，m u s a n t el ，e ta 1 b l u es i l v e r ：av e r ys e n s i t i v ec o l l o i d a lc o o m a s s i e g - 2 5 0s t a i n i n gf o rp r o t e o m ea n a l y s i s j e l e c t r o p h o r e s i s2 0 0 4 ，2 5 ：1 3 2 7 - 3 3 8 何俊堂，刘海峰慢传输型便秘的发病机制研究进展 j 西南军医，2 0 0 5 ，7 ( 5 ) ：1 0 2 2 2 5 9l a w s o nd ，h a r r i s o nm ，s h a p l a n dc f i b r o b l a s tt r a n s g e l i na n ds m o o t hm u s c l es m 2 2 a l p h aa r e t h es a m ep r o t e i n , t h ee x p r e s s i o no fw h i c hi sd o w n - r e g u l a t e di nm a n yc e l ll i n e s j 】c e l lm o t i l c y t o s k e l e to n , 19 9 7 ，3 8 ( 3 ) ：2 5 0 - 2 5 7 1 0s a n c h e z g a r c i a1 r a b b i t t s t h t h el i md o m a i n ：an e ws t r u c t u r a lm o t i ff o u n di nz i n c - t i n g er l i k ep r o t e i n s 【j 】t r e n d sg e n e t ，19 9 4 ，10 ( 9 ) ：315 2 0 11o s t e n d o r f fh p , p e i r a n or i ，p e t e r sm a ，e ta 1 u b i q u i t i n a t i o n - d e p e n d e n tc o f a c t o re x c h a n g eo n l i mh o m e o d o m a i n t r a n s c r i p t i o nf a c t o r s j n a t u r e ，2 0 0 2 ，4 1 6 ( 6 4 8 5 ) ：9 9 - 1 0 3 1 2m i c h e l s e nj w ，s c h m e i c h lk l ，b e c k e l em c ，e ta 1 t h el i mm o t i f d e f i n e sas p e c i f i c z i n c - b i n d i n gp r o t e i nd o m a i n j p r o cn a t la c a ds c iu s a ，1 9 9 3 ，9 0 ( 1 0 ) ：4 4 0 4 - 8 1 3l e es m , l ih y , n ge k , e ta 1 c h a r a c t e r i z a t i o no fab r a i n s p e c i f i cn u c l e a rl i md o m a i np r o t e i n ( f h l l b ) w h i c hi sa na l t e r n a t i v e l ys p l i c e dv a r i a n to f f h l i j g e n e ，1 9 9 9 ，2 3 7 ( 1 ) ：2 5 3 6 3 1 4l e es m , t s u is k ，c h a r tk k ，e ta 1 c h r o m o s o m a lm a p p i n go fas k e l e t a lm u s c l es p e c i f i c l l m - - o n l yp r o t e i nf h l 3t ot h ed i s t a le n do ft h es h o r ta l t no fh u m a nc h r o m o s o m e1 叨s o m a t c e l lm o l g e n e t , 19 9 8 ，2 4 ( 3 ) ：19 7 2 0 2 1 5k n o b l a u c hh ，g e i e rc ，a d a m ss ，e ta 1 c o n t r a c t u r e sa n dh y p e r t r o p h i cc a r d i o m y o p a t h yi na n o v e lf h l lm u t a t i o n j a n nn e u r o l2 0 1 0 j a n ；6 7 ( 1 ) ：1 3 6 - 4 0 1 6c h a nk k , t s u is k ，l e es m ，e ta 1 m o l e c u l a rc l o n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no f f h l 2 ，an o v e ll i m d o m a i np r o t e i np r e f e r e n t i a l l ye x p r e s s e di nh u m a nh e a r t 叨g e n e ，19 9 8 ，210 ( 2 ) ：3 4 5 - 5 0 1 7 1 7 m o r g a nmj , m a d g w i c kaj t h ef o u r t hm e m b e ro ft h ef h lf a m i l yo fl i mp r o t e i n si s e x p r e s s e de x e l u s i v e e l yi nt h et e s t i s j b i o c h e mb i o p h y sr e sc o m m u n , 1 9 9 9 ，2 5 5 ( 2 ) ：2 5 1 - 5 18f i m i a g m ，d ec e s a r ed ，s a s s o n e - c o r s i p a f a m i l y o f l i m - o n l yw a n s c r i p t i o n a l e o a c t i v a t o r s ：t i s s u e - s p e c i f i ce x p r e s s i o na n ds e l e c t i v ea c t i v a t i o no fc r e ba n dc r e m j m o l c e l lb i o l ，2 0 0 0 ，2 0 ( 2 2 ) ：8 613 - 2 2 1 9g u e n e a ul ，b e r t r a n da t , j a i sj p m u t a t i o n so ft h ef h li g e n ec a u s ee m e d ，- d r e i f u s s m u s c u l a rd y s t r o p h y j a mjh u mg e n e t 2 0 0 9s e p ；8 5 ( 3 ) ：3 3 8 - 5 3 2 0 郭俊堂f i l l 家族与肿瘤的关系 j 生物技术通讯，2 0 0 8 ，1 9 ( 3 ) ：4 4 3 4 4 4 2 1 丁丽华f i l l 家族研究进展 j 生物技术通讯，2 0 0 7 ，1 8 ( 6 ) ：9 8 9 9 9 1 综述 蛋白质组学在消化系统疾病中的应用 蛋白质组( p r o t e o m e ) f l ：t 澳大利亚学者w i l k i n s 和w i l l i a m s 等于1 9 9 4 年提出， 指的是由基因组编码的全部蛋白质【1 1 。蛋白质组学( p r o t e o m i c s ) 已在消化系统疾 病中有了较为广泛的开展和研究，主要集中于早期新标记物的寻找，并在疾病的病 因、病理生理及预后、新药靶方面做了许多相关的研究。现对蛋白质组学在消化 系统疾病中的应用进展综述如下。 一、蛋白质组学的研究内容和研究方法 蛋白质组学是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的- f 7 新型学科，其目的 是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态， 了解蛋白质之间的相互作用和联系，揭示蛋白质功能和细胞生命活动规律。蛋白 质组学主要涉及两个方面的内容： l 、是表达蛋白质组学，是在整体水平上研究生物体内蛋白质表达的变化，是 对细胞或组织中蛋白质表达量化谱的反映，即将细胞、组织中的蛋白质，建立定 量表达图谱或表达序列标签图谱，在整个蛋白质组水平上为研究细胞通路、疾病、 药物相互作用和一些生物刺激引起的功能紊乱提供依据，对寻找疾病诊断标志、 筛选药物靶点、毒理学研究等具有重要作用。 2 、是细胞图谱蛋白质组学，又称为相互作用蛋白质组学，即确定蛋白质在亚 细胞结构中的位置，进而研究蛋白质在细胞内的行为、运输及作用，并进一步建 立起各种细胞类型和状态的物理图谱，这对确定蛋白质功能和新的疾病诊疗靶位 极有价值。 根据不同的研究目的，蛋白质组的研究方法也不同。蛋白质组学最基本的技 术是蛋白质分离技术和鉴定技术。其中双向凝胶电泳是最常用的蛋白质分离技术， 该技术是根据蛋白质的不同特点分为两相分离蛋白质： ( 1 ) 第一相是等电聚焦( i s o e l e c t r i cf o c u s ，i e f ) ，根据蛋白质等电点( p i ) 不同进 行分离； 1 9 子质 显差异，均适用于相对分子质量在1 0 0 0 0 - - 1 5 0 0 0 0 的蛋白质。此外，双向高效柱 层析、毛细管电泳也是分离蛋白质组分的有效方法。 蛋白质组学另一基本技术是蛋白质的鉴定技术，即质谱技术。质谱技术的基 本原理是样品分子离子化后，根据不同离子间质荷比( m z ) 差异来分离并定分子 质量。对蛋白质和多肽而言，质谱技术就是要确定一个蛋白质或多肽的分子质量。 而由此所获得的信息，涉及的领域已远远超过了检测分子质量这一简单应用。因 为分子质量是一个蛋白质、多肽或氨基酸最基本的特征，而且这种特征是专一的。 不同的氨基酸组成、不同的氨基酸序列、不同的修饰方式、不同的蛋白质问的结 合方式、不同的位点差异都可以在蛋白质的分子量上得以体现。因此，对蛋白质 以及组成蛋白质的多肽、氨基酸的分子质量测定实际上就是对蛋白质种类、结构 和性质的鉴定。 目前用于蛋白质鉴定的质谱主要有两种：基质辅助激光解吸电离飞行时间质 谱( m a l d i t o p m s ) 和电喷雾质谱( e s i m s ) 。前者可以得到酶解肽段的分子量，获 得蛋白质的肽质量指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e r - p r i n t ，p m f ) ，然后通过相应的数据 库搜索来鉴定蛋白质，后者采用串联质谱的方法可以进行肽的测序，得出肽段的氨 基酸序列。目前国际上比较流行的研究蛋白质组学的步骤为：细胞或组织的可融 性蛋白_ 2 d e 一2 d e 胶蛋白质点_ 胰蛋白酶上原位消化感兴趣点内的蛋白质_ 多肽混合物一纳喷一液相色谱质谱( e s i m s ) 基质辅助的激光解析电离飞行时间 质谱( m a l d i t o p m s ) 分析_ 肽指纹图谱( p ) 一数据库搜索_ 蛋白分析。生物信 息学是蛋白质组研究的一个不可缺少的部分，其在蛋白质组学中的研究有两个重 要应用：一是构建和分析双向凝胶电泳，二是数据库的搜索与构建。目前应用最 普遍的是n r d b 和d b e s t 数据库。生物信息学的发展已给蛋白质组研究提供了更 方便有效的计算机分析软件，最近发展的质谱数据直接搜寻基因组数据库，使得 质谱数据可直接进行基因注释、判断复杂的拼接方式。另外，对肽序列标记的从 头测序软件也十分引人注目。正是由于上述各项技术的快速发展，使得人们大规 模的研究数以万计的蛋白质的组成和功能成为可能。 2 0 二、蛋白质组学在消化系统疾病中的应用 1 、结直肠癌裴海平等1 2 j 应用2 - d e 和质谱技术筛选大肠癌与正常肠组织的差 异表达蛋白，在癌组织中明显高表达的有3 0 个点，选择1 6 个点进行了质谱鉴定， 包括谷胱苷肽s 转移酶、肝型脂肪酸结合蛋白、热休克蛋白等蛋白质。这些差异 表达蛋白可能作为大肠癌早期诊断的候选生物标志物。s t u l i k 等【3 】- 【4 】比较分析正常 结肠组织、结肠息肉和结肠癌的组织标本的2 - d e 凝胶图像谱，找到了5 7 个差异 点，选择其中1 8 个高丰度的点作质谱分析，发现e f 2 、m n s o d 和n m 2 3 在结肠 癌中特异性高表达。张英男等【5 】用等电聚焦s d s 聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对分析 结直肠癌原发灶，癌旁肠黏膜和肝转移灶中蛋白质表达差异，结果显示结直肠癌 肝转移灶中蛋白质表达与癌原发灶、癌旁肠黏膜相比差异有显著性。对肝转移灶 中一个特异蛋白质点行质谱检测，发现其与细胞周期蛋白4 2 ( c d c 4 2 ) 同源。并用 w e s t e r n 杂交检测2 5 例结直肠癌标本，癌旁肠黏膜中c d c 4 2 表达检测为阴性。在癌 原发灶中c d e 4 表达阳性率为1 6 。肝转移灶中检测c d c 4 2 表达阳性率为1 0 0 。 故考虑c d c 4 2 作为结直肠癌肝转移相关蛋白，对癌细胞生物学行为改变有重要影 响，可促进肝转移的发生。 2 、炎症性肠病b a r c e l o 等 6 1 为了探讨细胞因子介导的蛋白质在炎症性肠病中 的作用，应用双向凝胶电泳和质谱分析的方法，比较了暴露于丫干扰素、白介素 1 p 、白介素6 前后的用$ 3 5 放射性标记的结肠上皮细胞的蛋白质组表达，发现与 正常黏膜相比，和色氨酸代谢有关的吲哚胺2 、3 二氧化酶在c r o h n 病和溃疡性结 肠炎中都过表达，而在憩室炎中表达与正常黏膜一致。我们认为这有可能是治疗 炎症性肠病的一条新的途径。 3 、慢传输型便秘汪兴伟等为探讨慢传输型便秘大鼠结肠黏膜损害阶【8 1 的发 病机制应用蛋白质组学与双向电泳技术分离并鉴定出3 种结肠下调差异蛋白即肥 大细胞蛋白酶、线粒体琥珀酸脱氢酶、二肽酶。肥大细胞蛋白酶、线粒体琥珀酸 脱氢酶、二肽酶在慢传输型便秘大鼠结肠组织中的表达明显下调，提示慢传输型 便秘大鼠结肠组织免疫反应性减弱，线粒体氧化还原功能障碍在慢传输型便秘的 发生、发展中可能起重要作用，慢传输型便秘大鼠肠道蛋白质的消化、吸收功能可 能存在一定程度的障碍。肥大细胞蛋白酶是肥大细胞内最丰富的一种特异性中性 2 1 蛋白酶，是一种特异性肥大细胞标志物，肥大细胞作为一种抗原呈递细胞【9 】，在 免疫系统中起着很重要的作用。在胃肠生理及相关疾病中，胃肠道黏膜肥大细胞 具有重要的生理作用，肥大细胞和肠道神经间相互作用代表了肠道生理及对抗原 反应的神经、免疫相互作用。动物实验发现，肥大细胞活化与肠道功能紊乱的关 系密切，肥大细胞参与大鼠肠功能紊乱的调节【l o 】。肥大细胞是神经免疫轴的固有 成分，电镜下可见肥大细胞与含神经肽p 物质和降钙类基因相关肽等感觉神经纤 维密切相连，这些神经肽参与疼痛的病理生理，并诱发肠道传输功能失调。而释 放p 物质的s p 能神经元属肽能神经元，胞体存在于结肠肌间神经丛内，发出的纤 维分布至肠壁各层，其末梢释放p 物质能抑制胃肠道黏膜分泌，刺激肠道运动， 属兴奋性神经元。在该实验中，慢传输型便秘大鼠结肠组织肥大细胞蛋白酶的表 达明显下调，表明肥大细胞数目减少或肥大细胞功能减低，结肠组织免疫反应性 减弱，提示肥大细胞在s t c 结肠运动功能紊乱中可能具有重要作用。二肽酶 ( d i p e p t i d a s e ) 是消化道中来源于小肠腺的可将二肽水解成2 个氨基酸的一种肽酶， 其在不同的生物中具有不同的特异性。二肽酶在肠黏膜细胞消化中起重要作用， 它和氨肽酶、羧肽酶一起将小肠腔内的蛋白完全水解成为氨基酸。在该实验中， 慢传输型便秘大鼠结肠组织二肽酶的表达明显下调，可能与蛋白质在肠道的消化、 吸收障碍及氨基酸的代谢减弱有关，提示慢传输型便秘大鼠结肠组织蛋白质的消 化、吸收功能存在一定障碍。线粒体琥珀酸脱氢酶是细胞有氧代谢的中间酶，与 线粒体氧化还原功能有关，与细胞能量代谢密切相关。线粒体是进行生物氧化、 维持细胞生命的“能源供应站”。病理情况下，缺氧可损伤线粒体，而线粒体受损又 可导致细胞能量代谢障碍。慢传输型便秘大鼠结肠组织线粒体脱氢酶的表达明显 下调，说明细胞能量代谢减弱，细胞有氧代谢不活跃，可能与线粒体氧化还原功能障 碍有关。提示线粒体氧化还原功能障碍在慢传输型便秘的发生、发展中起重要作 用。 4 、汪兴伟，刘海峰等对慢传输型便秘大鼠结肠黏膜上调蛋白的分离与鉴定实 验中通过蛋白质组学与双向电泳技术分离鉴定出3 种差异蛋白即： 蛋白点a 1 经m a l d i t o f 质谱鉴定数据库搜索m a s c o t ，结果提示蛋白点a 1 为类肌钙蛋白c a l p o n i n ( c a p ) 。蛋白点a 2 经m a l d i t o f 质谱鉴定数据库搜索 m a s c o t ，结果提示蛋白点a 2 为组蛋白h 2 b 。蛋白点a 3 经m a l d i t o f 质谱鉴定 数据库搜索m a s c o t ，结果提示蛋白点a 3 为鼠醛酮还原酶蛋白类似物( r a k b 蛋白 类似物) 。 5 、胆管癌s r i s o m s a p 等【l l 】通过比较胆管癌和肝细胞癌的2 - d e 凝胶电泳图像 分析，发现c k 8 ，c k 1 8 在胆管癌和肝细胞癌中均表达，c k 7 、c k 1 9 仅在胆管 癌中表达，并且通过1 - d e 免疫测定，半乳凝素3 仅在胆管癌中高表达，作者认 为c k 7 、c k 1 9 、半乳凝素3 有可能成为鉴别胆管癌和肝细胞癌的有用的标记蛋 白。 6 、胰腺癌i m a m u r a 等【1 2 】运用蛋白质组学对胰腺癌细胞t g f p 信号转导通路 进行了研究。他们首先利用r n a 干扰技术敲除了t g f p 信号转导通路中的关键 基因s m a d 4 ，然后联合应用2 - d e 和m a l d i t o p 质谱技术对敲除了s m a d 4 基因 的胰腺癌细胞和未经处理的胰腺癌细胞进行了比较蛋白质组学研究，发现了1 0 个 新的蛋白质。它们是t g f b 作用的新靶点，具有调节细胞骨架、细胞周期及氧化 应激的作用，有望为胰腺癌提供新的治疗靶点。s h e k o u l l 等【13 j 联合l c m 和2 d e 对正常和胰腺导管腺癌上皮细胞蛋白表达谱进行比较，发现9 种差异表达蛋白质， 其中5 种蛋白质在肿瘤细胞中表达上调，4 种蛋白质在正常胰腺上皮细胞表达而 在肿瘤细胞中不表达或微弱表达。进一步对胰腺癌中表达上调的蛋白质进行鉴定 发现其中之一为钙结合蛋白s 1 0 0 a 6 ，该蛋白在正常胰腺导管上皮不表达，有望成为 诊断胰腺癌的分子标记物。 三、蛋白质组学技术在其他消化系统疾病中的应用 l 、病毒性肝炎h e 等【1 4 】用蛋白质组学的方法寻找h b v 感染导致肝炎的血清 标志物，通过对比正常和h b v 感染患者的血清，发现结合珠蛋白1 3 和以链、载 脂蛋白a i 和a i v 、a l 抗胰蛋白酶、t r a n s t h y r e t i n 和d n a 拓扑异构酶i i p 等7 种蛋 白水平发生了改变，这些蛋白改变不仅表现在量上而有些蛋白的表达模式或特异 性也发生了改变。龙云铸等【1 5 】先应用双向凝胶电泳获得1 4 例乙型肝炎病毒相关性 肝细胞癌组织和非癌组织的蛋白质表达谱，在癌组织的蛋白表达图谱中发现具有 鉴别癌组织和非癌组织的蛋白质组模式，再应用该模式对4 8 例未知的癌组织和非 癌组织的2 - d e 图谱进行检测，结果未知的癌组织和非癌组织图谱均得到有效鉴 定，灵敏度和特异性均为1 0 0 。这种蛋白质组的模式有望成为在高危人群和普通 人群中对恶性肿瘤进行筛查的工具。 2 、肝硬化k a w a d a 等【1 6 】通过对大鼠星状细胞的蛋白质组进行分析，发现了 一种新蛋白s t a p ( s t e l l a t ec e l la c t i v a t i o na s s o c i a t e dp r o t e i n ) ，它只在星状细胞中被检 测到，在纤维化肝中分离到的体内激活星状细胞和体外原代培养的活化星状细胞 中高表达，可能通过清除过氧化物发挥抗纤维化作用。x u 等b 7 采用 s e l d i t o p m s 的方法寻找大鼠模型肝硬化分级的生物标志物，通过对8 只正常、 2 2 只硫代乙酰氨导致肝硬化和5 只胆管结扎导致肝纤维化大鼠的血清进行分析， 发现1 个分子量为3 4 9 5 的蛋白，该蛋白在肝硬化过程中量持续下降。经质谱鉴定， 该蛋白与1 个富含组氨酸的糖蛋白同源。 四、展望 综上所述，蛋白质组学已经在消化系统疾病中有了较为广泛的开展和研究， 主要集中于早期新标记物的寻找，并在疾病的病因、病理生理及预后、新药靶方 面做了许多相关的研究。运用蛋白质组学分析人慢传输型便秘的差异蛋白，并对 其作出鉴定，从而深入研究慢传输型便秘的发病机制、