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浙江大学硕士学位论文白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 摘要 白菜( b r a s s i c ar a p as s p c h i n e n s i s ) 类蔬菜绝大部分属于冬性一年生蔬菜作物，需要经历一 个低温阶段才能顺利完成发育转变。在低温阶段，感温先期抽薹是生产上一个迫切需要解决的问 题。培育晚抽薹品种是解决这一问题的根本途径。菜心是白菜类蔬菜的一个变种，对低温要求不 严格，在华南地区可以周年生产，是代表极端早抽罄的一类白菜类作物。 本研究以冬性类型上海青普通白菜和无冬性类型四九菜心杂交的f 2 代为材料，根 据基于性状的分析法，利用f 2 群体抽薹开花分布的两个极端构建极端早抽墓开花池和极端晚抽薹 开花池，利用a f l p 分子标记技术，筛选二者基因组的差异，以期获得与熟性或抽嚣性状有关的 分子标记。同时对人工春化条件下耐抽薹材料上海青白菜花芽形态分化进行观察，运用同源 基因克隆法克隆拟南芥的重要开花时间基因的正向同源基因，比较其编码序n l n 内含子序列的 异同，为白菜抗抽薹育种，研究抽薹开花相关基因的功能打下基础。主要结果如下： ( 1 ) 对f 2 代极端早抽薹开花池和极端晚抽越开花池进行b s a a f l p 分析，获得5 条早花池 或晚花池特异条带，其中差异条带e 2 a a g m 8 一c t t 3 1 7 和e 6 一a c g m 6 。c t g 2 6 6 仅在极端晚抽薹开 花池出现：而e 3 - a c a m 1 一c a a z 9 5 、e 8 a g g m 3 c a g 2 7 0 、e 8 - a g g m 4 一c a t l 7 4 仅在极端7 - 开花池 出现，分别将e 3 - a c a m 1 - c a a 2 9 5 、e 8 - a g g m 3 一c a g 2 7 0 和e 6 - a c g m 6 - c t c 2 6 6 转化为s c a r 标 记和c a p s 标记。用3 个标记对f 2 代分离群体的转化结果表明，s c a r 标记e 3 m 】s c a r 2 7 1 平 e 8 m 3 s c a r 推测与一个控制早开花的q t l 连锁，分别位于该q t l 的两侧，遗传距离分别为 2 8 5c m 和2 1 - 3c m 。 ( 2 ) 分别用上海青进行人工低温春化处理，观察花芽形态分化进程。结果表明低温处理 2 0d ，上海青已开始从营养生| 殳向生殖生长过渡。 ( 3 ) 四九菜心与上海青的b r c f l c 的编码序列几乎完全一致，四九菜心与上海 青的b r c f l c 的第一个内含子序列差异也很小。 ( 4 ) 低温处理2 0d 时，b r c f l c 的表达已经非常弱，此时茎端形态为己开始向生殖生良过渡， b r c f c a 和b r c f t 随着低温处理时间的延长表达有增强趋势；b r c f c a 与b r c f l c 的关系不明显； b r c f t 的表达模式与b r c f l c 相反。 关键词：白菜；开花时间；春化：分子标记；a f l p ；s c a r l l l 浙江大学硕士学位论文白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 a b s t r a c t b r a s s i c ar a p as s p c h i n e n s i sv a t c o m m u n i sa n db r a p as s p c h i n e n s i sv a t p a r a c h i n e n s i si st h e e x t r e m er e p r e s e n t a t i v eo ff l o w e r i n gh a b i t ，a n dt h ef o r m e ri saw i n t e rb i e n n i a l ，a n dn e e dap r o l o n g e d p e r i o do fc o l dt i m e ，ap r o c e s sn a m e dv e r n a l i z a t i o nt oi n d u c ef l o w e r i n g ，t h el a t t e r , h o w e v e r , i sas u m m e r a n n u a ld o s en o tn e e dv e r n a l i z a t i o nt oi n d u c ef l o w e r i n g i nc u l t i v a t i o np r a c t i c e ，p r e m a t u r eb o l t i n gi s s e r i o u sp r o b l e mt h a tn o to n l yc a u s eag r e a to fl o s si np r o d u c t i o n ，b u ta l s or e d u c et h ec o m m e r c i a lv a l u e s ob o l t i n g r e s i s t a n c ei sa ni m p o r t a n tb r e e d i n gg o a l i nt h ep r e s e n ts t u d y , af 2s e g r e g a t i n gp o p u l a t i o nd e r i v e dac r o s sb e t w e e na f l o w e r i n gc h i n e s e c a b b a g ec u l t i v a t s i j i u 佃r a p as s p c h i n e n s 扫v a t p a r a c h i n e n s i sc v , s o i u ) a n dc h i n e s e c a b b a g e p a k c h o ic u l t i v a r s h a n g h a i q i n g 忸r a p as s p e h i n e n s i sv a t c o m m u n i sc v , s h a n g h a i q i n g ) w a sd e v e l o p e d f o r t h e t h es t u d yo f g e n e t i cc o n t r o lo f f l o w e r i n g t i m e at r a i t - b a s e da n a l y s i sm e t h o d o l o g y , b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i sr b s a ) w a sa d o p t e dt om a k eu pt w o b u l k st h a tw e r ec o m p o s e do fi n d i v i d u a l so fe x t r e m ee a r l yf l o w e r i n ga n de x t r e m el a t ef l o w e r i n g b u l k e d s e g r e g a n ta n a l y s i si nc o m b i n a t i o no f a f l pt e c h o n e q u e sw a su s e dt os c r e e nt h et w ob u l k sf o rd i f f e r e n t i a l b a n d st h a tm a yb ec a n d i d a t em a r k e ra s s o c i a t e dw i t he a r l yf l o w e r i n gh a b i to rl a t ef l o w e r i n gh a b i t o nt h e o t h e rh a n d ，s h a n g h a i q i n g w a sa r t i f i c i a l l yv e r n a l i z e df o r t h es t u d yo nt h em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o n o ff l o r a lb u di nc h i n e s ec a b b a g e p a k - c h o i ，m e a n w h i l er n aw a se x t r a t e df r o mt h es a mo f s h a n g h a i q i n g p a k - c h o ia td i f f e r e n tt i m ep o i n to fv e r n a l i z a t i o nt r e a t m e n t ，a n df r o mt h el e a fo f n o n v e r n a l i z e d s h a n g h a i q i n g a n d s i j i u t h a tw a su s e df o rt h ec l o n i n go f v e r n a l i z a t i o n r e l a t e dg e n eb y p c rm e t h o da n df o rt h ee x p r e s s i o na n a l y s i so ft h e mb yr t - p c ri nt h ed i f f e r e n td i f f e r e n t i a t i o ns t a g eo f b u d t h em a i nr e s u l tw a sl i s t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) s e v r a ls p e c i f i ca f l pb a n d sb e t w e e nt w ob u l k sw e r eo b t a i n e db yb s a - a f l pa n a l y s i s a m o n g t h e m ，e 2 一a a g m 8 一c 丁r 3 1 7a n df a a c g m 6 一c t c 2 6 6i ss p e c i f i ct ot h ee x t r e m el a t ef l o w e r i n gb u l k sa n d p a t e n t s h a n g h a i q i n g ：a n de 3 - a c a m 1 c a a 2 9 5 ，e 8 - a g g m 3 一c a g 2 7 0 ，e 8 一a g g m 4 - c a t i7 4 i s s p e c i f i ct ot h ee x t r e m ee a r l yf l o w e r i n gb u l k sa n dp a t e n t s i j i u t h e n ，t h r e eo ft h e mw a sc o n v e n e dt o s c a ro rc a p sm a r k e r , a n dw e r en a m e de 3 m i s c a r 2 7 l ，e 8 m 3 s c a r t s ia n de 6 m 6 c a p s 2 s w l 6 s t h e s e g r e g a n ta n a l y s i si nf 2s e g r e g a t i n gp o p u l a t i o ns h o we 3 m is c a r 2 7 1 a n de 8 m 3 s c a r i s ji sl i n k e dt oa p u t a t i v ef l o w e r i n gt i m eq t l ，f l a n k i n gi to nb o t hs i d e ，b e i n ga w a yf r o mi t2 1 3c ma n d2 8 5c m ( 2 ) s h a n g h a i q i n g w a sa r t i f i c i a l l yv e r n a l i z e df o r t h es t u d yo nt h em o r p h o l o g i c a ld i f f e r e n t i a t i o no f v 浙江大学硕士学位论文 白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 f l o r a lb u di nc h i n e s ec a b b a g e p a k - c h o i ，t h er e s u l t ss h o wt r e a t m e n tf o r2 0da t4 ci ss u f f i c i e n tf o rt h e t r a n s i t i o nf r o mv e g e t a t i v eg r o w t ht or e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n t ( 3 ) t h en u c l e o t i d es e q u e n c eo fi n t r o n1o f s h a n g h a i - q i n g a n d s i j i u s h o wn os u b s t a i n t i a l d i f f e r e n c e r t - p c ra n a l y s i so ft h ee x p r e s s i o no ff l o w e r i n gt i m e r e l a t e dg e n e sb r c f l c ，b r c f c aa n d b r c f ts h o w st h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f b r c f l ci sr e d u c e dg r a d u a l l ya n dw a sa tv e r yl o wl e v e la f t e r2 0 d a y so f v e m a l i z a t i o nt r e a t m e n t ，a n dw a su n d e t e c t a b l ea f t e r3 0d a y so f v e r n a l i z a t i o nt r e a t m e n t w h i c hi s c o n s i s t e n tw i t ht h ef a c tt h a tt r e a t m e n tf o r2 0da t4 ci ss u f f i c i e n tf o rt h et r a n s i t i o nf r o mv e g e t a t i v e g r o w t ht or e p r o d u c t i v ed e v e l o p m e n tt h ee x p r e s s i o no f b r c f tw a sp r o g r e s s i v e l ye n h a n c e d w h i c hs h o w a i li n v e r s ee x p r e s s i o np a t t e mc o m p a r e dw i t ht h a to f b r c f l c t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f b r c f c aw a so n l y s l i g h t l ye l e v a t e dw i t ht i m e k e yw o r d s ：c h i n e s ec a b b a g e - p a k - c h o i ；f l o w e r i n gc h i n e s ec a b b a g e ；b r a s s i c ar a p as s pc h i n e n s i s a f l p ；f l o w e r i n gt i m e ；m o l e c u l em a k e r ：s c a r ；v e r n a l i z a t i o n 浙江大学硕士学位论文白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 缩写词( a b b r e v i a t i o n ) a f l p b p b s a c a p s e d n a d d e p c d n a d n t p e d t a h n ，t g k b l b m l n n i l p c r r a c e r a p d r f l p r p m r t - p c r s s c a r s d s s s r a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s b a s ep a i r b u l k e ds e g r e g a t i o na n a l y s i s c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e s c o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d a y d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p o s p h a t e e t h y l e n ed i a m i n e t e t i a a c e t i ca c i d h o u r i s o p r o p y l t h i o 一8 - d - g a l a c t o s i d e k i l o b a s e l u r i a b e r t a n ir e e d i u m m i n u t e n e a ri s o g e n i cl i n e s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n a e n d s r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o p h i s m i cd n a s r e s 仃i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m s r o t a t i o np e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep c r s e c o n d s e q u e n c ec h a r a c t e r i z e da m p l i f i e dr e g i o n s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，s s r 扩增片段长度多态性标记 碱基对 分离群体分组分析法 酶切扩增多态性序列 互补脱氧核糖核酸 天 焦磷酸二乙酯 脱氧核糖核酸 脱氧核糖核营三磷酸 乙二胺四乙酸 小时 异丙基硫代b 。半乳糖苷 千碱基对 l b 培养基 分钟 近等基因系 聚合酶链式反应 快速扩增e d n a 末端 随机扩增多态性d n a 限制片段长度多态性 每分钟转速 反转录聚合酶链式反应 秒 序列特征化扩增区域 十二烷基磺酸钠 简单序列重复 缩写词 s t s t b e t e t t i s x - g a l l i s e q u e n c e - t a g g e ds i t e t r i s - h c i ，b r o i ea c i d ，e d t ab u f f e r t e b u f f j r t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o - 4 c h l o r o - 3 - i n d o l y l b d g a l a c t o s i d e 序列标签位点 t r i s h c l ，硼酸，e d t a 缓冲液 t e 缓冲液 三( 羟甲基) 氨基甲烷 5 一溴- 4 - 氯- 3 一吲哚一b d 一半乳糖苷 致谢 本论文的研究工作是在曹家树教授的悉心指导下完成的，在论文的选题、实验的 设计以及论文的写作等每个环节上都倾注了大量的心血。导师严谨的治学态度、忘我 的工作精神、敏毒兑的洞察力、渊博的学识、高尚的人格、平易近人的作风、孜孜以求 的工作态度时刻激励着我，并使我终生受益。在此毕业之际，谨向恩师的教诲表示衷 心的感谢! 在学习和研究过程中，浙江大学蔬菜研究所细胞与分子生物学实验室中工作和学 习的卢钢副教授、向壬 口老师、余小林老师、叶纨芝老师、王永勤博士、符庆功硕士、 邓俭英硕士、崔辉梅博士、黄科博士、吴才君老师、刘乐承老师、王玲平博士、虞慧 芳博士、洪薇、剥叫呆娟、周生茂、姚详坦、帅琪峰、陈石头、董德坤、黄鹂、王华新、 张驶、庄晓英、邹凤莲、张艳、冯壮志、孟秋峰、张强、武涛、王神云、李建勇、任 彦、宋江华、张丈波、李晋豫、张豫超、叶意群、邹清成、丁淑丽、李焰焰、田爱梅、 蒋明、赵建平、刘婷婷、张亚锋、管文磊、邹宜静等老师和同学在我的实验和写作过 程中给予了大力帮助。在此，对所有关心、支持和帮助过我的老师、同学和朋友一并 表示衷心的感谢。 感谢我的父母、家人和朋友在我攻读学位期间对我的研究、学习和生活所给予的 理解和支持。 最后，谨向参加本论文评阅、答辩的各位专家致以最真诚的感谢l 黄细讼 2 0 0 6 年6 月1 日于杭州华家池 浙江大学硕士学位论文 白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 1 j 一 日u吾 白菜( b r a s s i c ar a p as s p c h i n e n s i s ) 类蔬菜有着丰富的变种、类型和品种，其中开花时间是 非常重要的一个方面。绝大部分变种需经过低温春化才能实现营养生长向生殖生长的转变。普通 白菜和菜心同属中国白菜不结球白菜亚种中的两个变种。根据曹家树等( 1 9 9 4 ，1 9 9 7 ) 的研究和 依古籍考证，菜心和普通白菜都是由菜油兼用的“薹心菜”演化而来。“薹心菜”分别在华南沿海、 长江流域和华南两广的生态条件下演化形成分蘖菜、紫菜薹和菜心，在太湖地区优越的自然条件 和栽培条件下形成植株直立、叶片发达的普通白菜。菜心是南方特产蔬菜之一，在两广地区栽培 有一定历史，在蔬菜周年供应上有重要地位。菜心发育对温度的适应范围很宽，在华南地区一年 四季均可抽薹开花，甚至在海南岛最炎热的夏季( 月平均气温2 7 - 2 8 * ( 2 ) 栽培也可以在较短时间 内顺利发育。因此可认为菜心发育转变对低温的要求不高。普通白菜变种的几乎所有品种必须经 过春化作用才能完成成花转变。菜心是白菜的一个变种，不需低温春化就可以完成成化转变。可 能在长期与环境互作演化中逐渐失去了此功能。同是白菜的两个变种，菜心为什么可以不经低温 春化就能正常抽越开花、完成生长转变? 在与环境的相互适应和作用中，它们基因组中控制这一 性状( 春化) 的区域到底发生了哪些改变? 通过二者基因组的比较分析，揭示控制春化需求这一 性状的基因组区域差异，找出与春化性状有关的分子标记在理论上对于揭示开花时间天然变异 ( 多样性) 的分子基础和实际应用上抗抽薹育种是一项很有意义的工作。 抽薹开花是农业生产上的一个重大问题，抽薹开花对于植物自身而言关乎生殖上的成功，对 于农业生产而言则关乎到生物产量和产品品质。对于以营养器官为产品的作物来说，足够| 吏时间 的营养生长是确保产量的前提，即便不以营养器官为产品的物种，适当的推迟开花，亦于生殖上 是有利的。先期抽薹在十字花科作物的栽培实践上是一个倍受关注的问题。先期抽越不仅降低了 生物产量，而且影响到产品的品质。抗抽薹育种是十字花科作物的一个重要的育种目标。 开花习性是一种重要的适应性状，不同地区起源的物种进化出了多样的开花习性。与白菜类 蔬菜同属十字花科的拟南芥，广泛分布于北半球的大多数地区，拟南芥又极其丰富的自然生态型， 不同生态型开花时间上存在巨大差异。遗传研究表明，拟南芥天然生态型的开花习性( 一年生 二年生) 主要与两个位点有关：f r 和f l c 。这两个位点的显性等位基因赋予拟南芥二年生习性 ( 强冬性) 。而这两个位点的任何一个发生功能丧失或减弱则逐渐向一年生习性过渡。普通白菜 变种的冬性类型与菜心变种在开花习性上表现为两个极端，非常类似于拟南芥。借鉴同一个科的 拟南芥上已获得的研究成果，无论是已获得的认识还是研究的手段方法，无疑可以加迷白菜相关 领域的研究进程。 浙江大学硕士学位论文 白菜开花时问相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 抽薹开花时间的变异对植物种适应不同的自然环境和农业环境具有重要的适应意义。抽整开 花时间是一个数量性状，由于在生物学上及农业生产上的意义，在芸薹属物种中，春化需要及开 花时闻q t l 的定位一直是受到关注。这方面的报道也比较多。在丑o l e r a c e a 中，c a m a r g o 等( 】9 9 6 ) 检测到两个q t l s 与开花时间和开花时间指数有关。在b r 口p n , 中两个q t l s ( 野w 和v f r 2 ) 决定 二年生习性( t e u t o n i c oa n do s b o r n1 9 9 5 ；o s b o me ta 1 ，1 9 9 7 ) 。在bn a p u s e p ，两个q t l s ( v f n l 和 v f n 2 ) 控制春花敏感的开花时间，且这两个q t l s 所在的区域与雪愀中携带v f r l 和v f r 2 的区域 同源( o s b o me t a l ，1 9 9 7 ；b u t r u i l l ee l a l ，1 9 9 9 ) 。q t l sv f r 2 和v f n 2 也与拟南芥第5 染色体末端 含有开花时间基因c o 皤删 西( c o ) 、e m b r y o n i c f l o w e r ，( e m f l ) 、f 屏1 1 f l o w e r i n g l o c u s c ( f l c ) 的区域同源( b a g e r c r a n t ze ta l ，1 9 9 6 ；o s b o me ta l ，1 9 9 7 ) 。最近，有证据表明br a p a 开花时间基因v f r 2 与拟南芥的f l c 同源( k o l ee t a l ，2 0 0 1 ) 。a x e l s s o n 等( 2 0 0 1 ) 认为芸整种多个 开花时i u t q t l s 可能是一个祖先基因c 0 重复加倍的结果。 尽管遗传图谱的发展和q t l 定位是研究数量性状的重要方法，但未来的研究将主要针对单个 性状，在考虑效率的前提下，降低研究的成本是一个重要的考虑的因素。选择性基因型分析法 ( s e l e c t i v e g e n o t y p i n g ；l a n d e re t a l ，1 9 8 9 ) 和分离群体分组分析法( b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ，b s a ； m i c h e l m o r ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 是研究单个性状的既能利用群体所提供的信息又最大限度降低实验成本 的方法，尤其是b s a 法是基于性状的q t l 初步定位的一种简便而廉价的策略。 a f l p 是近年来迅速发展起来的一种分子标记技术，重复性好、多态性高，能够在同一个p c r 反应中检测大量的遗传位点，因此特别适合于与近等基因系或b s a 分析相结合寻找与目标性状连 锁的分子标记，并构建目标基因所在区域的精细遗传图和物理圈。 本研究利用一个普通白菜品种上海青和菜心品种四九菜心的f 2 分离群体，尝试运用b s a 方法结合a f l p 标记技术研究开花时间的相关性状，以期找到与开花时间基因相关的分子标记， 为白菜抗抽薹育种提供参考。另外对上海青进行人工春化处理，观察花芽形态分化进程，并 确定最佳低温处理时间，为白菜人工春化加代提供参考。在花芽分化过程中，提取不同低温处理 时段的茎尖r n a ，并反转录为c d n a ，用同源基因克隆法克隆拟南芥春化相关基因的正向同源基 因，运用r t - p c r 分析花芽分化过程中它们的表达状况及相互之间可能的关系，探讨白菜春化的 可能的机制。 2 浙江大学硕士学位论文白菜开花时间相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 1 文献综述 1 1 植物开花转变研究进展 开花转变可能是被子植物生活周期中最富戏剧性的发育变化，对一年生植物尤其如此，因为 在生活周期中它是仅开一次花的短生命植物，成花诱导不仅表明繁殖的开始，同时也意味着衰老 的来临。因此植物必须正确地调控开花进程，以确保其在正确的时间开花，从而完成种子发育和 繁殖进程。 1 1 1 影响开花转变的环境因子 开花转变的研究表明，开花是在内外信号的控制之下完成的。一些物种的开花时间主要受环 境因子的影响。植物利用利用季节变化保证其在适当的时间开花，环境因子向植物传递有利于繁 殖和种子成熟的信息。这些因子包括光( 光周期、光质、光强) 、低温( 春化) 以及营养和水分的 供给状况；而另一些物种对环境因子不敏感，开花受内源信号控制，它们必须达到一定年龄和大 小才能开花。 光是影响成花诱导的重要环境因子。光包括光周期、光强、光质3 个方面。光为光合作用所 必需，为成花提供物质基础。光周期对于诱导植物成花来说是最关键的外界环境因素。很多植物 只有在合适的光周期下才能诱导开花，这在开花具有较强季节性的植物中尤为明显。拟南芥是一 个兼性( f a c u l t i v e ) 的长日植物，长日对开花有明显促进作用。光质对拟南芥的成花亦有影响，蓝 光和远红光促进开花，红光抑制开花( b a g n a l le t 口f ，1 9 9 2 ) 。 温度是影响植物成花的另一重要环境因素。在温带地区，冬性和两年生植物需要经过低温处 理才能诱导或加速开花，这一过程通常称之为春化( v e r n a l i z a t i o n ) 作用。如果这些植物不经历一 个低温阶段，则开花进程将会大大推迟，有些植物种甚至对春化作用有绝对需求不经春化不能 开花。春化作用的一些显著特点是：( 1 ) 春化作用部位在茎端，而且发生感应的时间和产生效应 的时间间隔很大；( 2 ) 春化过程是长时间的量变过程，代谢方式有严格的顺序性和多步骤性；( 3 ) 春化效应可被高温解除，即所谓脱春化作用，脱春化作用的条件是低温处理必须是亚适量的；( 4 ) 春化状态一旦建立，春化效应一直保持在生长点，并且通过有丝分裂过程稳定地传递下去，当植 物其他内外因子合适时，促进开花。但春化效应不会随减数分裂等有性生殖过程传递给后代( 种 康等，1 9 9 9 ) 。 除了光与春化作用外，还存在一些非决定性的环境因子，如矿质营养、水分、酸碱度和化学 物质均会影响植物的成花诱导。逆境能诱导开花，如营养缺乏、干旱、栽植密度过大都能诱导开 l 文献综述 花。植物在逆境下的发育进程加快，产生种子，后者较植株自身更容易度过逆境( l e wa n d d e a n ， 1 9 9 8 ) 。 1 1 2 植物向生殖生长转变的模式 许多年来，生理方面的研究产生了关于开花时间控制的三个模式( l e v ya n dd e a n ，1 9 9 8 ) 。 ( 1 ) 开花素学说开花素( f l o r i g e n ) 学说认为，控制开花的物质开花素在适宜的光周 期条件下在叶中产生，通过韧皮部传递到顶端分生组织，促进茎端开花。该假说基于通过嫁接可 以实现物质或信号从生殖状态的供体( d o n o r ) 枝条向营养状态受体( r e c i p i e n t s ) 枝条传递。可通 过嫁接传递的开花抑制物的鉴定，产生了竞争性“抑成花素”( a n t i f l o r i g e n ) 这一概念。人们花了 多年时间去寻找成花素，其化学性质至今仍部清楚。 ( 2 ) 营养物质转移学说 由于不能从同化物中分离到假设的成花素导致了营养物质转移学 说( n u t r i e n t d i v e r s i o nh y p o t h e s i s ) 的产生。该学说认为，适宜的诱导处理导致向顶端分生组织转 移的同化物增加，从而诱导开花。 ( 3 ) 多因子控制模式多因子控制模式( t h e m u l t i f a c t o d a l c o n t r o lm o d e l ) 抛弃了在成花转变 过程同化物是唯一起重要作用的成分的观点。这一模型认为，许多开花促进物和抑制物，包括植 物激素和代谢产物，都参与了发育阶段转变的控制( b e r n i e r ，1 9 8 8 ) 。根据这一模型，只有限制因 子与抑制因子在适宜时间达到适当浓度时开花才会发生。这一模型指出在不同的遗传背景和，或在 特定的环境条件下，开花的限制因子是不同的，并试图以此来解释开花反应的多样性。 1 1 3 与开花转换有关的基因 影响开花期早晚的基因被称为开花时问基因( f l o w e r i n g t i m eg e n e ) 。通过对拟南芥突变体和 不同天然生态型进行遗传分析，研究者鉴定了大量的影响开花时间的基因位点开花时间基因。 开花时间基因可以决定植物对日照的长度和春化作用等环境因子作出反应，它们突变以后能够使 开花时间提前或延后( j a c k , 2 0 0 4 ) 。 1 1 3 1 晚开花突变 已有1 3 个与晚开花突变体相关没有其他多效性的基因被鉴定，它们是c o ( c o s t a n s ) 、g 1 ( g i g a n t e a ) 、l d ( 三l ! 打a i 【d e p e ( d e ( ，) 、f c a 、f d 、f e 、f h a 、f l d 、f ：列、f v e 、f w a 和刀( k o o r r m e e fe ta t , 1 9 9 1 ) 。根据对光周期、春化作用和对富远红光应答的反应，将迟开花突 变体分成3 个组：第一组包括血、一8 、j 印、f y 、l d 和，w ，这些突变体对环境刺激的应答大大强 于野生型，春化处理几乎可以完全解除这些突变体迟开花的表型；第二组包括一、弦、一日和声， 这些突变体对光周期有强烈的应答，但对春化和富远红光反应很弱，与野生型相似；第三组包括 c o ，g i 和历口，这些于变体对长日光周期、春化以及富远红光均不反应。 1 1 3 2 早开花突变 已筛选出的没有明显多效性的早花突变体有p 卯( e a r l y f l o w e r i n g ，) 、p 妮( e a r l y f l o w e r i n g ) 、 p 叫，( e m b r y o n i c ：7 0 w e r l ) 、e m f e ( e m b r y o n i c 加w e r 2 ) 、t f l ( t e r m i n a l f l o w e r l ) 和棚，这些突变 4 浙江大学硕士学位论文白菜开花时问相关基因的分子标记及春化相关基因的克隆和表达分析 的表现型为莲座叶和花序的节数减少，说明它们的野生型基因产物的功能是抑制成花转变( s u n g 4 f 1 9 9 2 ) 。 1 1 3 3 开花时间的天然变异 拟南芥来自不同地区的生态型开花时间存在明显差异。冬性一年生类型开花通常要求低温的 诱导，而夏性一年生类型或r c ( r a p i d f l o w e r i n g ) 类型开花不需要低温诱导。研究发现冬性类型 与夏性类型的区别主要在两个位点：f r i i i f l c 。脚口凡c ，直点的显性等位基因协同赋予春化需 要( b u mb ta 1 ，1 9 9 3 a ；l e ea n da m a s i n o ，1 9 9 3 ；c l a r k ea n dd e a n ，1 9 9 4 ) 。绝大多数天然早花生态型 携带隐性矿潜位基因，含有两个缺失之一，破坏了f 脯开放阅读框，提示早花生态型源于晚花生态 型通过f 足肤活( j o h a n s o ne t 以，2 0 0 0 ) 。 1 1 4 控制开花转换的遗传途径 多种环境的和内源的输入信号调控着植物开花的时间。通过对拟南芥开花时间控制的分子遗 传分析，已经确定了一个数量上控制开花时间转换的完整的网络。这个框架为理解不同繁殖策略 的进化以及各种开花途径是如何通过季节变化而相互作用的认识提供了基础。 多种环境的和内源的输入信号交织在一起来调控顶端分生组织的发育命运。对环境作出反应 而改变形态的能力，是植物和动物的基本区别。植物大部分的发育发生在胚胎发育之后，在生长 点和根尖分生组织中不断地产生分裂和分化活跃的细胞。叶原基和花原基出现在茎顶端分生组织 的侧面，开花转换是受花分生组织特征基因，如l e f 、a p t 、c a l 和f u l 控制的( k i e f f e r a l ，2 0 0 1 ) 。 开花时间的研究已经阐明了参与多种环境和内源暗示响应的各种途径，还有它们是如何整合起来 正向调控花分生组织特征基的。在分子遗传学研究不断深入的基础上，拟南芥各种开花途径的调 控网络已经被逐步清晰。多种输入信号依赖数量水平上的相互作用来决定究竟是哪一种开花途径 占优势，这也可以用来解释植物对环境变化的反应、形态的可塑性及不同繁殖类型的进化( g o r d o n a ，2 0 0 2 ) 。 根据开花时间突变体对环境因子如春化和光周期的响应，结合上位遗传分析，已经确认在拟 南芥上至少有四条开花促进途径( l e v ya n d d e a n ，1 9 9 8 ；h e n d e r s o ne t a l ，2 0 0 4 ；b o s se t a l ，2 0 0 4 ) 。 1 1 4 1 长日光周期促进途径 这条途径中起作用的基因包括光信号受体基因光敏色素基因p h y a - e 和隐花色素基因c r y l 和c r y 2 ：昼夜节律钟基因e 口3 、t o c l 、c c a l 、l i - 1 t 、联f ，、z t l 等；光周期途径基因g ，和 c o ，以及下游开花信号整台基因基因刀、s c 0 1 。c o 是特异性对光周期做出反应的基因，光周 期途径始于光受体，像p h y a 和c r y 2 ，光受体引发的信号与昼夜节律钟互作，产生昼夜节律。 光和昼夜节律钟组分最终导致c o 的激活，c o 的转录水平呈现昼夜节律( s u a r e z - l o p e ze ta l ， 2 0 0 1 ) 。c o 突变体在长日条件下晚开花，在短日条件下开花时间与野生型类似。过量表达c o 导 致开花提前( p u l l e r i l le ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 1 1 4 2 春化途径 1 文献综述 低温对开花的促进作用，称为春化。许多有春化需求的物种，其开花也被长的光周期促进， 这种光周期需要提供了另一种保证，即在晚被短日条件下不能开花。许多植物种类采取春化的繁 殖策略，以确保它们咀营养件的形式安全越冬，而在春无适宜的条件下开花。春化作用只是提供 了一种开花的可能性，它只是为开花做准备，本身并不引起开花。也就是说，低温处理和开花有 明显的时间分隔，这表明春化有渐成基础( l e v ya n dd e a n ，1 9 9 8 ；g o r d o n 甜, 2 0 0 2 ；b o s sa 1 ，2 0 0 4 ) 。 研究发现冬性类型与夏性类型的区别主要在两个位点：f r 和f l c 。f r i 和f l c 位点的显性 等位基因协同赋予春化需要( b u me t a l ，1 9 9 3 a ；l e ea n da m a s i n o ，t 9 9 3 ；c l a r k ea n dd e a n ，1 9 9 4 ) 。 最早发现f r t 是主要的开花抑制因子，随后的研究发现f r i 抑制开花是通过促进f l c 表达所 致。功能丧失突变m 体抑制f r i 对开花的效应。 f l c 编码一个m a d s _ b “转录因子f m i c h a e l sa n d a m a s i n o ，1 9 9 9 b ：s h e l d o ne ta t , 1 9 9 9 ) ，f l c 主要在分裂活跃的区域如芽和根的顶端分生组织( 感受低温春化效应的部位) 表达( m i c h a e l sa n d a m a s i n o ，2 0 0 0 ) ，以种类似变阻器的量的方式抑制开花( m i c h a e l sa n d a m a s l n o ，1 9 9 9 a ；s h e l d