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产小檗碱内生真菌的诱变及发酵条件的优化 摘要 以2 0 0 5 年从黄檗枝条中分离得到的产小檗碱的内生真菌s 6 为出发菌株，先经过 h p l c 检测，证实该菌株仍具有产小檗碱能力，再采用多种方式对其诱变，期望获得高 产突变株。 本实验先采用单因素诱变，包括紫外线诱变、h e - n e 激光诱变和n a n 0 2 诱变。经过 统计确定的最佳诱变条件分别为：紫外线处理1 5 0 s ，激光处理2 5 r a i n ，亚硝酸钠处理 3 0 m i n 。复合诱变包括亚硝酸钠紫外线诱变、亚硝酸钠激光诱变、紫外线激光诱变、 紫外线l i c i 诱变和激光l i c l 诱变。通过采用各种诱变方法多次诱变并筛选，再采用紫 外分光光度法检测小檗碱的含量。结果表明，各种诱变方法均可以获得正突变菌株，其 中激光l i c i 复合诱变对于s 6 菌种具有最高的诱变效率，经过该方法诱变处理过的菌株 存活率相对较大，而且突变率高，尤其是正变率高。再将通过各种诱变方法获得的高产 菌株同批培养比较，筛选出最高产菌株是经过亚硝酸钠紫外线复合诱变的s - n u 3 2 的突 变株。经过h p l c 色谱检测，测得该菌株产小檗碱能力达到1 2 2 8 m g l ，比出发菌株的 0 4 5 5 m g l 提高了1 7 0 ，菌丝干重达到5 7 2 9 l ，较出发菌株相比提高了8 1 7 。遗传 稳定性实验表明，该优良性状能够稳定遗传。 为了进一步提高目的产物产量，对筛选出的高产菌株s - n u 3 2 的培养条件进行了优 化。以生长速率和小檗碱产量为指标，筛选出的最佳培养条件为固体培养是p d a ，液体 培养基是豆芽汁培养基，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为酵母膏，最适培养温度为2 6 。 为了达到最佳配比，对碳源浓度、氮源浓度、p h 三个因素的四个水平进行了正交实验， 其中对菌体生长的影响力为p h 值最强，碳源浓度次之，最弱为氮源浓度；而对小檗碱 产量影响最大的因素为碳源浓度，其次是p h 值，最弱为氮源浓度。正交实验的结果显 示菌体生长速率与小檗碱产量最高的培养基配比完全相同，最佳培养条件为豆芽汁培养 基含蔗糖3 ，酵母膏0 2 ，p h7 0 ，温度2 6 。c 。用上述培养培养条件与出发培养基相 比较，小檗碱的产量提高了4 7 2 ，达到了1 8 1 2 m g l ，菌体生物量提高了2 4 ，达到 7 1 5 9 l 。 关键词：内生真菌；诱变；黄檗；小檗碱；培养条件优化；正交实验 m u t a g e n e s i sa n d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s o p t i m i z a t i o no fab e r b e r i n e - - p r o d u c i n ge n d o p h y t i c f u n g u s a b s t r a c t t h es t r a i ns 6w a sa ne n d o p h y t i cf u n g u sp r e v i o u s l ys e p a r a t e df r o ma m u rc o r ka n dc o u l d p r o d u c et h eb i o a c t i v ec o m p o u n db e r b e r i n el i k ei t sh o s tp l a n t t h ew o r ki n v o l v e di nt h i sp a p e ri s f o c u s e do nt h em u t a g e n e s i ss t u d yo ft h es t r a i ns 6 ，u s i n gd i f f e r e n tp h y s i c a la n dc h e m i cm u t a g e n s ， i no r d e rt og e tm u t a n ts t r a i nw i t hh i g h e rb e r h e r i n ey i e l d v a r i o u sm u t a t i o nm e t h o d sw e r eu s e dt om u t a g e n i z et h ei n i t i a ls t r a i ns 6a n dt h ec o n t e n to f b e r b e r i n e p r o d u c e db y e a c hm u t a n tw a s s u b s e q u e n t l y d e t e c t e d u s i n g t h eu l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t e r t h ee f f e c t so fb o t hs i n g l e - f a c t o rm u t a g e n e s i s ( i n c l u d i n g ，u v , h e - n el a s e r a n dn a n 0 2 ) a n dm u l t i p l em u t a g e n e s i s ( n a n o ：- u vn a n 0 2 - i a s t e r , u v - l a s t e r , u v - l i c i ， l a s t e r - l i c l ，n a n 0 2 一l i c l ) w e r ee x p l o r e di nt h i ss t u d y t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a l s i n g l em u t a g e n i cc o n d i t i o nw a s15 0 su v , 2 5 m i nh e - n el a s e ro r3 0 m i nn a n 0 2 a l lt h e c o m p o s i t em u t a g e n e s i sm e t h o d sa p a r tf r o mn a n 0 2 - l i c lw e r ea b l et oi m p r o v eb e r b e r i n ey i e l d a m o n gt h o s et r e a t m e n t s ，l a s t e r ( 2 5m i n ) - l i c ! ( 1g l ) m u l t i p l em u t a g e n sw a st h em o s te f f i c i e n t m e t h o d a l lt h eh i g h - y i e l d i n gs t r a i n sd e r i v e df r o mt h ea b o v em e t h o d sw e r et h e nc o m p a r e da n d t h es t r a i ns - n u 一3 - 2 ，m u t a g e n i z e db yn a n 0 2 - u l t r a v i o l e tm u l t i p l em u t a g e n s ，p r o v e dt ob et h eb e s t s t r a i ni nt h i ss t u d y g r o w t hr a t eo ft h es t r a i ns - n u - 3 - 2w a s5 7 2 9 l ( i n c r e a s e db y 引7 c o m p a r e dw i t ht h ei n i t i a ls t r a i n ) a n dt h eb e r b e r i n ey i e l ew a s12 2 8 m g l ( i n c r e a s e db y17 0 ) a d d i t i o n a l l y , t h ey i e l do fp r o d u c ts h o w e dn od i s t i n c tc h a n g e sa f t e rs u c c e s s i v ec u l t u r eo f10 g e n e r a t i o n s i no r d e rt of u r t h e ri m p r o v et h ep r o d u c ty i e l d ，t h ec u l t u r ec o n d i t i o n so ft h es t r a i ns - n u - 3 - 2 w e r et h e no p t i m i z e d b a s e do nt h eg r o w t hr a t ea n dt h ey i e l do fb e r b e r i n e ，t h eo p t i m a ls o l i d c u l t u r em e d i u mw a sp d aa n dt h el i q u i dc u l t u r em e d i u mw a sb e a ns p r o u t sm e d i u m t h e o p t i m u mc a r b o ns o u r c ew a ss u c r o s e ，t h eo p t i m u mn i t r o g e ns o u r c ew a sy e a s te x t r a c ta n dt h e o p t i m u mg r o w t ht e m p e r a t u r ew a s2 6 ( 2 al 16 ( 4 ) o r t h o g o n a le x p e r i m e n tw a sa l s oc a r d e do u tt o d e t e r m i n et h ee f f e c to fc a r b o nc o n c e n t r a t i o n ，n i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n ，a n dp ho nt h ep r o d u c ty i e l d a n dm y c e l i a lg r o w t hr a t e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em o s ti m p o r t a n ti n f l u e n c i n gf a c t o r st o m y c e l i a lg r o w t ha n dt h ey i e l do fb e r b e r i n ew e r ep ha n dc a r b o n s o u r c ec o n c e n t r a t i o n r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u mc u l t u r em e d i u m ( b o t hf o rt h eg r o w t hr a t eo fm y c e l i aa n dt h ey i e l do f b e r b e r i n e ) w a sd e t e r m i n e da sb e a ns p r o u t sm e d i u mc o n t a i n i n gs u c r o s e3 ，y e a s te x t r a c to 2 ， p h7 0 2 6 ( 2 t h eb e r b e r i n ey i e l dw a s4 7 2 a n dt h eg r o w t hr a t eo fm y c e l l aw a si m p r o v e db y 2 4 k e yw o r d ：e n d o p h y t i cf u n g u s ：m u t a t i o n ；a i n u rc o r k ；b e r b e r i n e , o p t i m i z a t i o no nc u l t u r e c o n d i t i o mo r t h o g o n a ie x p e r i m e n t 西北大学学位论文知识产权声明书 本人完全了解西北大学关于收集、保存、使用学位论文的规定。 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版。本人允许论文被查阅和借阅。本人授权西北大学可以将本学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所等机构将本学位论文收录到中国学位论文全文数 据库或其它相关数据库。 保密论文待解密后适用本声明。 学位论文作者签名： i 斑趁 指导教师签名： d 7 年6 月侈日。 d 7 年6 月s f t 西北大学学位论文独创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研 究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，本论文不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包含为获得西北大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：黝 0 7 年6 月, i s 日 两北大学硕十学位论文 1 1 小檗碱概述 1 1 1 小檗碱的理化性质 绪论 小檗碱( b e r b e r i n e ，b e r ) 又称黄连素，是异喹啉类生物碱，存在于小檗科、罂粟科、 毛莨科、芸香科、防己科、鼠李科6 科植物中。小檗碱分子式# ) c 2 0 h i s n 0 4 + ，分子量为 3 3 6 3 6 ，熔点1 4 5 ，极易溶于水、乙醇和甲醇，难溶于苯、乙醚和氯仿。小檗碱用不 同的碱处理，可得到醇型、醛型和季铵型等三种不同形式的小檗碱，以季铵型最为稳定 f l ，2 】 o 1 1 2 小檗碱的临床用途 图1 小檗碱的化学结构式 f i 9 1 t h es t r u c t u r a lf o r m u l ao f b e r b e r i n e 小檗碱是作为抗菌药应用于临床已有多年，疗效确切。作为是一种广谱抗菌药物， 小檗碱对多种g + 、g 、真菌、病毒、原虫、线虫都有抑制和杀灭作用【3 1 。近些年，经临 床研究证明，小檗碱除抗感染作用外，还有降糖、降血压、保肝利胆等作用，且对免疫 系统疾病也有一定疗效。 ( 1 ) 降糖作用 研究发现小檗碱可明显降低由四氧嘧啶引发患糖尿病的小鼠的血糖，可能是小檗碱 通过抑制糖原异生和促进糖醇解而产生了降血糖的作用。通过研究中药黄连及其复方对 动物血糖的影响，发现其确有降血糖功效，同时还可提高机体的刚果红廓清速率，这说 明小檗碱可能有提高机体免疫力的作用，对糖尿病及其慢性并发症的治疗有一定意义【4 】。 第一章绪论 ( 2 ) 增强免疫机能【5 】 小檗碱进入血液后，其血药浓度不易维持，说明小檗碱在动物体内抗菌作用并非完 全由于抑菌，也可能是作用于机体防铆6 1 。实验证明，小檗碱在动物体内或体外均能增 强白细胞以及肝网状内皮系统的吞噬能力，从而增强机体免疫力【刀。小檗碱对离体小鼠 淋巴细胞的增殖有明显抑制作用；小鼠体内实验表明，小檗碱能抑制体细胞免疫的迟发 型变态反应( d t h ) 和表现体液免疫的h c 5 0 【引。 ( 3 ) 利胆保肝、降谷丙转氨酶4 1 小檗碱能促进胆汁的分泌，显著提高结合型胆红素的排泄率，同时促进胆红素与葡 萄糖醛酸的结合。使用枸橼酸黄连素注射液以治疗迁延性肝炎，治疗后谷丙转氨酶下降， 有效率高达8 1 8 。而且，患者治疗前的丙谷转氨酶水平越高，治疗的效果就越好【9 1 。 此外，黄连素还具有促进肝细胞修复豹功划1 0 1 。 ( 4 ) 治疗骨质疏松 骨质疏松是由于骨密度下降，小檗碱能抑制破骨样多核细胞的形成过程以及重吸收 作用，阻止腰椎中骨矿物质密度的下降，从而起到治疗骨质疏松的功效f l l 】。 ( 5 ) 治疗高血压 小檗碱能抑制胆碱酯酶的活性，竞争性阻断q 受体，通过扩张血管作用降低心脏的 负荷，从而改善心功能，延长心室及心房的有效不应期，消除折返性心律失常。因此可 用其治疗伴有心律失常的高血压患者。临床证明，小檗碱对i 期、i i 期高血压患者具有 很好的疗效 1 2 , 2 】。 ( 6 ) 治疗高血脂症【5 】 研究表明小檗碱能通过增强肝脏超氧化物歧化酶的活性作用，降低肝脏过氧化脂质 水平以及血清甘油三脂和总胆固醇的含量，从而阻止类脂质的吸收，阻断游离脂肪酸通 过粘膜上皮细胞再脂化过程，达到治疗因脂质代谢失调引起的高血脂症的效果。 ( 7 ) 治疗心力衰竭【5 】 小檗碱可增加心肌细胞内环二磷酸腺苷的浓度，从而改善心肌的顺应性，扩张外周 血管。研究发现，小檗碱可通过增加环磷腺苷浓度提高胞浆内游离钙，从而增加心肌收 缩力作用，使心脏射血量增加。采用黄连素治疗充血性心力衰竭，可明显增加心脏指数， 延长运动时间1 1 3 l 。 ( 8 ) 防癌与抗肿瘤 小檗碱具有阻断促癌物质对潜在癌变细胞激活的作用，从而起到防癌效果。患有慢 2 两北大学硕士学位论文 性结肠炎、结肠息肉、慢性胃炎的病人，长期服用黄连素能在一定程度上防癌【1 4 】。有学 者应用黄连素、黄连素及1 ，3 - b i s ( 2 一c h l o r o e t h y ) 1 n i t r o s o u r e a ( b c n u ) 研究其抗脑肿 瘤的作用。采用集落生成率( c p e ) 对6 个人类恶性脑胶质瘤细胞株和大白鼠9l 脑胶质瘤 进行离体研究，发现黄连素或b c n u 单独使用，对b c n u 的敏感性差异有显著变化，这 说明黄连素与b c n u 联合应用对脑肿瘤细胞株的抑制有相加作用【8 1 。 ( 9 ) 抗血小板聚集 黄连素可有效抑制血小板聚集。黄伟民报道了人类首次应用黄连素治疗血小板聚集 患者，结果表明，黄连素能抑制血小板膜的a 2 受体，使血小板内c a m p 升高，有效率高 达为9 5 ，几乎可以与潘生丁合并阿司匹林的疗效媲美，且副作用小，易被人体长期接 孚【l s ，16 】 x -o 1 1 3 黄檗资源现状 作为小檗碱的重要药源植物之一，黄檗( p h e l l o d e n d r o n8 配l l l l l e l l s e r u p r ) 主要分布 于东北和华北山区及四川盆地。中药黄柏是指黄檗的干燥树皮。黄檗不仅是古老的残遗 植物，有较高的科研价值，且其木材纹理美观，切面有光泽，材质坚韧，耐湿抗腐，应 用广泛；黄檗内皮可用作染料及药用；叶能够提取芳香油；果实所含甘露醇及油脂具极 高经济价值，这些导致对黄檗资源的需求量逐年递增。但黄檗的药用成分主要存在于树 皮，黄柏的制取需要剥取生长l o 1 5 年的黄檗树皮晒制而成。但剥取树皮后4 5 年后才能 再次剥取，且黄檗生长周期长，_ 株1 0 年生的黄檗可产干树皮仅为1 5 2 0 公斤。乱砍滥 伐导致黄檗野生资源破坏极为严重，许多幼树亦难逃厄运。然而，目前黄檗的栽培技术 仍处于小农水平，不成规模，且由于栽培品种和地理环境的差异，使药材的质量难以控 制，再加上中药材二重污染的问题不好解决，这就使得人工栽培受到限制，进一步促进 了野生黄檗锐减。我国现已将野生黄檗列为三级渐危物种，严禁破坏野生黄檗，药用必 须栽培，砍伐剥皮也需经林管部门审批 2 1 。 小檗碱的另一大药源植物黄连( c o p t i sc h i n e n s i s f r a n c h ) 也由于生长缓慢，市场上 需求量大而价格飙升，从而导致自然资源锐减。而另一方面，黄连的取材部位是根皮， 连根挖掘加速了野生资源蕴藏量的下降，使药源的获得受到了一定限制。 目前，生长于植物体内的内生真菌已经得到了学术界的普遍认可，大量研究表明， 从植物体内分离出的内生真菌有可能产生和宿主植物相同或相似的活性成分，对这些内 第一章绪论 生真菌进行发酵即可获得活性代谢产物。因此，将业已成熟的发酵工程技术和植物内生 真菌进行创造性的结合，对于药用植物的新来源和内生真菌的理论研究都将是重大突破 【2 】 o 1 2 植物内生真菌的研究进展 内生真菌( e n d o p h y t i cf u n g i ) 是存在于植物体内，形成不明显侵染症状的一类真菌。 这个定义包括那些在其生活史中的某一阶段表面营寄生的腐生菌，以及对宿主暂时没有 伤害的潜伏性病原菌和茵根菌【1 7 ，1 引。由于它们生活在植物体内，又不会使宿主表现出感 染症状，所以长期以来一直被人们所忽视。有关内生真菌的研究始于1 9 世纪末，直到 2 0 世纪3 0 年代，人们发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于它们食用了感染内生 菌的牧草后，对内生菌的研究才得以广泛开展i l9 ，2 】。 1 2 1 植物内生真菌的普遍存在性及分布特征 内生茵普遍存在于目前所研究过的各种陆生及水生植物中。内生真菌最早是在禾本 科的8 0 属植物中发现，近3 0 年来，内生真菌被发现广泛存在于大批木本经济植物中，其 存在部位包括根内、树皮、枝叶、果实、花朵等几乎植物的所有部位，此后甚至在低等 的藻类、苔藓和蕨类植物中也都发现了内生真菌的存在【2 ，2 0 1 。 内生真菌生存于植物组织细胞间，部位以叶鞘和种子中最为多见，其他部位也都有 分布，其中叶片和根中较少。这些内生真菌中有些不产生孢子，它们通过生长在种子内 的菌丝体可由母代直接传给子代，所以往往在同一地区生长的同种植物，其内生真菌种 类也具有极大的相似性【2 】。但有的内生真菌在不同年龄植株和组织中的丰度和分布明显 不同，一般内生真菌的种类随着树龄的增加而丰富；而远离地面相对封闭的树冠内生真 菌的种类要比贴近地面环境开放复杂的树冠内生真菌的种类少；除此以外，湿度、季节、 周围其他植物类群以及环境的污染程度也会影响内生真菌的丰度1 2 。此外，内生真菌类 群在不同气候条件地区的分布也有明显区别1 2 。 4 两北大学硕j ：学位论文 1 2 2 内生真菌的生物学作用【2 0 】 研究发现内生真菌可通过自身的代谢产物或信号传导作用对宿主植物体施以影响， 其中有益的影响包括：促植物生长、增强植物抗逆境、抗摄食、抗其他病原微生物感染 笙 。 可。 很多内生真菌代谢产物中含有吲哚乙腈、i a a 以及细胞激素等植物生长激素或其类 似物【2 2 ，1 踟，这就使得感染了此种内生真菌的植株比未感染的植株生长加快。 此外，感染了某内生真菌的牧草可能对干旱【2 3 1 以及铝的毒害【2 4 】等环境胁迫具有更 强的抗性。内生真菌还可增强宿主对其他各种生物如致病细菌及真菌 2 5 , 2 6 】、线虫f 2 7 , 2 8 】、 昆虫【2 9 , 3 0 1 和哺乳动物【3 1 1 的抗性，可能的原因之一是这些内生真菌的次生代谢产物中含有 麦角碱、黑麦草碱和覃青毒素等物质，这会影响摄食者的口感或者对其产生毒害作用， 从而起到保护植物的作用1 2 ，3 2 。3 5 】。甚至还发生过由于内生真菌的存在增加了宿主植物 的生存竞争力，以至于在一定范围内感染了内生菌的牧草连年蔓延，而其他植物几乎无 法生长的事例【3 6 1 。除此以外，w i l s o n 和c a r r o l l 3 7 1 还发现内生真菌的存在可以减少虫瘿 的形成。 1 2 3 内生真菌的活性代谢产物 内生真菌存在于植物体内，与宿主植物长期共存，可能在宿主植物的整个生活史内 始终没表现出明确关系和影响；也可能会影响到宿主植物自身活性成分的产生过程；还 有可能直接参与产生与宿主相同或类似的活性成分。由于次生代谢途径复杂，目前的理 论尚无法明确解释这一现象，但现代理论普遍认为，产生相同或相似活性成分的可能原 因主要包括【3 8 】：( 1 ) 由于宿主植物与其内生真菌长期共同生活，各自遗传物质可能发生 相互传递，且各自代谢产物相互诱导所致。真菌的次生代谢途径与质粒有密切的关系， 质粒中的相关基因很有可能是来源于植物细胞的，而遗传信息传递过程既可能是直接接 触所致，又可能是由于能寄生在真菌与植物两者之间的微生物间接传递所致。( 2 ) 内共 生理论认为：次生代谢途径连续演化会导致有益物质进入到共生体系中，其基本生化过 程信息有时还可能传递到其它生物中去。在共生体系内，一旦次生代谢中有生化途径出 现，它就有可能被其它生物所利用，表现出相互作用和“协同进化”( c o e v o l u t i o n ) 1 3 9 。 自1 9 9 3 年s t i e r l e 等人从红豆杉( t a x u s ) 中分离到能产生紫杉醇的内生真菌以来】，人 们相继发现了能产生其它活性成分的多种内生真菌，主要包括下面几类【2 0 】： 第一章绪论 ( 1 ) 抗生素类 雷公藤( t r i p t e r y g e u mw i l f o r d i j ) 的某种内生真菌( c r y p t o s p o t c o p s i sc f q u e r c i n a ) 能 产生一种新型环肽抗生素( c r y p t o c a n d i n ) ，该抗生素对癣菌及白色念珠菌等人类病原真菌 具有强烈抑杀作用，其m i c ( m i n i m a li n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ) 与抗真菌药a m p h o t e r i c i nb 相当。从黄花蒿和蒙古蒿的茎内分离到2 株炭疽菌( c o l l e t o t d c h u ms p p ) ，其代谢物中 存在一系列对人畜以及植物病原微生物有良好抑制作用的广谱抗性化合物，其中包括首 次报道的炭疽菌酸( c o l l e t o t r i ca c i d ) 等3 种活性物质是新化合物。新酰胺生物碱( c r y p t o c i n ) 能对稻瘟病菌( p y r i c u l a d a o r y z a e ) 及其它多种植物病原真菌有很强的抑杀作用。从栎树 ( q u e r c u s s p ) 中分离到的内生真菌c y t o n a e m as p f 3 2 0 2 7 ，其固相发酵物中含有2 种新 缩酚酸类化合物( c y t o n i ca c i d sa a n db ) ，可抑制人细胞肥大病毒( h u m a nc y t o m e g a l o v i r u s ， h c m v ) 的组装。 ( 2 ) 杀昆虫物质类 禾本科植物的某些内生真菌所产生的多种生物碱能对昆虫具有杀死效应，如麦角蛋 白能够致鳞翅目昆虫的死亡。新近来自与植物b o n t i ad a p h n o i d e s 中的内生真菌 ( n o d u l i s p o d u ms p ) ，其代谢产物含有n o d u l i s p o r i ca c i d s 。n o d u l i s p o r i ca c i d s 是一种吲哚 二萜类化合物，具有杀灭大苍蝇( b l o 、v f l y ) 幼虫的活性【4 1 1 ，机理主要是通过激活昆虫的谷 氨酸门控的氯离子通道而发挥作用的。 此外，来自清华大学的j u 等【4 2 】从草熟禾( p o a a m p & ) 中分离出能产生数种对蚊子 幼虫有毒杀作用的黄酮类化合物的内生真菌。f i n d l a y t4 3 】等也从云杉等针叶树的内生真 菌的代谢产物中发现了一系列具有抗虫活性的物质。 ( 3 ) 植物生长调节剂类 在植物内生真菌代谢产物中发现如l 姐、吲哚乙腈等植物生长促进素的报道早有 所见【矧，比如大多数黄花蒿内生真菌在体外培养时都能产生对小麦和黄瓜幼苗的生长产 生不同程度的抑制或促进作用的代谢产物，对其中一种炭疽菌( c o l l e t o t d c h u ms p ) 发酵 产物的深入分析表明，该菌能产生植物生长激素i a a l 4 5 1 。 ( 4 ) 抗肿瘤活性物质类 美国学者s f i e r l e 于1 9 9 3 年首次从短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 的树皮中分离出能 够产抗癌药物紫杉醇( t a x 0 1 ) 的内生真菌新种t a x o m y c e s a n d r e a n a e ，从而开创了通过内 生真菌获得抗肿瘤药物的先河。迄今为止，人们已从短叶紫杉( t a x u sb r e v i f o l i a ) 、喜马 拉雅红豆杉( 7 = w a l l i c h i a n a ) 、欧洲红豆杉( zb a c c a t a ) 等多种植物中分离到了能产生紫杉 6 两北大学硕士学位论文 醇的内生真菌与放线菌，其中有些产量高的菌种已具商业潜力。 此外，从小檗( b e r b e r i so r e g a n a ) 叶中分离的内生真菌能产生o r e g a n i ca c i d f 4 4 与 c h a e t o m e l l i ca c i d saa n db 能够抑制f p 协e ，具有抗肿瘤能力；而来自雷公藤的内生真 菌r h i n o c l a d i e l l as p 代谢产物中还发现了3 种能对多种人肿瘤细胞有很强抑制作用的新 生物碱( c y t o c h a l a s i n s ) 【4 6 】；北美红杉内生真菌寄生曲霉( a s p e r g i l l u s p a r a s i t i c u s ) 产生的 s e q u o i a t o n ea 和b 也具有抗肿瘤活性m 。 ( 5 ) 其他类型的活性产物 雷公藤的内生真菌f u s a r i u ms u b g l u t i n a n s 产生的2 种二萜化合物s u b g l u t i n o la 和b 具有无细胞毒性的免疫抑制作用1 4 引。来自内生真菌c y t o n a e m as p 的三缩酚酸类异构体 c y t o n i ca c i da 和b 是一种新的人巨细胞病毒( h c m v ) 蛋白酶的抑制剂1 4 9 1 。曹晓纠5 0 1 等 从滇重楼根状茎中分离到3 株能合成大量甾体化合物的内生真菌，甾体化合物是名贵药 材滇重楼的主要药效成分，而滇重楼是“云南白药”、“宫血宁”等著名中成药的原材料。 此外，本实验室这些年也从多种珍稀濒危植物中获得了多种能产生宿主植物活性物质的 内生真菌，如：陈娟丽从平贝母中分离到能产西贝素的内生真创”l ，赵强从珍稀植物秦 艽中筛选得到的内生真菌具有很强的产龙胆苦苷能力【5 2 】等。 利用内生真菌的次生代谢获得药用成分，从而对缓解植物资源短缺而需求量递增 的矛盾有着重要的现实意义。微生物具有容易人工控制培养条件，繁殖周期短，繁殖系 数大，有效产量高等优点，特别是通过育种或基因工程手段改造菌种，可进一步提高产 量，使之更加适合工业生产。但是，首先在分离阶段植物体内的真菌种类复杂多样，并 生活在一起，很难做到能够分离纯化得到每一种真菌；其次，在筛选阶段，由于次生代 谢复杂，产物种类繁多，很难做到获取全部的产物并从中选择有用的成分，只能有目的 的检测是否含有目的产物，这样可能会错过很多重要成分的发现；再者，在菌种鉴定阶 段，很多离开宿主植物的内生真菌失去原来的产孢能力，并经过多种方式也无法诱导孢 子再生，这就无法用经典的形态学方法鉴定菌种，这就给菌种鉴定带来了困难；此外， 次生代谢产物一般产量极低，又难以控制，很难实现工业化生产；在菌株的传代过程中， 产活性成分的基因可能衰退甚至丢失，这也给采用内生真菌获取活性成分造成了不小的 压力。所以，这就需要我们做进一步探索和研究，但从总体水平来说，对内生真菌的研 究仅仅处于起步阶段，但随着研究的深入，内生真菌研究必将成为一个新的热剧5 3 】。 7 第一章绪论 1 3 微生物育种简述 微生物育种是运用遗传学原理和技术对某种具有特定生产目的的菌株进行改造， 以提高产品的产量和质量的一类方法。菌种选育的最终目标，就是通过人工干预，使选 出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。一般菌种选育的目标包括1 5 4 j ：提高 产量；提高产物的纯度，减少副产物和杂质；改变菌种性状包括：改善菌种生长速度和 对培养基的需求，提高斜面孢子化程度，改善菌丝体形态，采用菌球菌丝体发酵，增强 抗性等；菌种的遗传稳定性。 1 3 1 诱变育种 传统的诱变及筛选是最常用的菌种改良手段。一般来说，微生物的自发突变频率在 1 0 1 0 q 之间，经诱变剂处理微生物细胞后，突变频率可提高上百倍。诱变育种尽管 已有多年历史，但该方法简便、快捷和收效显著，仍不失为菌种选育的重要途径，被广 泛使用于发酵工业菌种的选育。诱变育种采用的诱变剂大致可分为以下四类。 ( 1 ) 物理诱变物理诱变剂主要有紫外线，x 射线，丫射线，快中子，激光，微波， 离子束等。 紫外线 紫外线能使d n a 分子形成嘧啶二聚体，从而引起双链结构扭曲，阻碍碱基间正常 的配对，此外二聚体的形成，还可能妨碍双链解开，影响d n a 的复制和转录，引起碱 基转换、颠换、缺失或移码突变等，严重时造成突变甚至导致死亡。屈二军等采用紫外 线诱变出发菌株m l 并筛选出高产纤维素酶的菌株m n l ，其分泌纤维素酶活力是m 1 的 1 8 4 倍【5 5 】。王艳萍以棒状链霉菌( s t r e p t o m y c c sc l a v u l i g e m s ) b 7 l 为出发菌株，通过紫 外线诱变育种，选育出2 株甘油耐受性正向突变株，在摇瓶条件下，其克拉维酸产量与 出发菌株相比分别提高了9 0 6 和8 8 8 ，并具有良好的遗传稳定性【5 6 1 。 x 射线及丫射线 x 射线和y 射线都属于高能电磁波，可使原子的内层电子激活并释放，导致原子离 子化后与其它原子或分子结合，造成脱氧核糖的碱基发生氧化，或者化学键断裂；电离 辐射还能导致自由基产生，这些自由基与细胞中的溶质分子相互作用，发生化学变化， 引起d n a 分子的缺失和损伤。此外，电离辐射还可能引起染色体的畸变，造成染色体 结构的缺失、易位和倒位等【5 刀。 8 西北人学硕十学位论文 激光 激光具有能量高度集中、颜色单一、方向性好、定向性强等特性。激光是通过光效 应、热效应和电磁效应的综合作用，引起生物体的染色体断裂、易位以及基因重组【5 8 1 。 张智维等使用h e - n e 激光诱变黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) ，获得一株果胶酶高产菌株。该 酶的活力为1 6 1 8 4 个酶活单位，比出发菌株提高了1 0 0 5 9 1 。马玲应用带扩束镜的低功率 h e - n e 激光装置，对柠檬酸生产菌黑曲霉的单孢子膜进行不同时间的垂直照射，激光照 射6 m i n ，黑曲霉m 2 代产酸的存活率达4 0 ，正变率高达3 7 5 【硎。 微波 微波辐射属于一种低能电磁辐射，3 0 0 m h z 3 0 0 g h z 的频率范围有较强生物效应， 它除了能引起生物体的局部温度上升，继而引起生理生化反应以外，还能使生物体产生 非温度相关的其他各种生理生化反应。在这两种效应的综合作用下，生物体可能会产生 一系列的突变效应。宋丽等采用微波对耐酸厌氧产氢菌进行诱变，获得的菌株耐酸 p h 2 8 ，其最大产氢量和最大产氢速率分别比原始菌株提高5 0 7 和4 1 7 f 6 l 】。黄娟认 为以微波作为电磁波，可引起水、蛋白质、核苷酸、脂肪和碳水化合物等极性分子转动， 导致分子间的强烈碰撞，使细胞内d n a 分子氢键和碱基堆积力受损，导致d n a 分子 的结构发生变化，最终引起遗传变异，她采用微波与紫外线复合选育的菌株产l i p s t a t i n 的能力为出发菌株的3 3 5 倍6 2 1 。 离子束 离子束对生物体有能量沉积和质量沉积的双重作用，导致生物分子发生键的断裂以 及原子移位；d n a 分子断裂、碱基缺失；染色体重复、易位、倒位等多种生物学效应， 严重时可导致生物体死亡。据报道，采用离子注入法诱变育种，具有正突变率高，致死 率低，且性状稳定的优点。王石磊等分别利用紫外线、亚硝基肌和离子注入3 种方法对 灰褐链霉菌s 1 0 0 1 进行诱变，对突变株的产酶能力进行比较，结果表明，离子注入诱变 具有正变率高( 2 0 ) 、正变幅度大( 4 0 9 ) 等优点，是该菌种一种良好的诱变剂。 ( 2 ) 化学诱变 化学诱变剂主要包括烷化剂、碱基类似物、氯化锂、亚硝基化合物、叠氮化物、碱 基类似物、抗生素、羟胺和吖啶等。 烷化剂 烷化剂种类主要有芥子气、硫酸二乙酯( d e s ) 、亚硝基胍( n t g ) ，亚硝酸乙烯亚 胺( e 1 ) 、甲基磺酸乙酯( e m s ) 、亚硝基甲基腺( n m u ) 、羟胺( n h 2 0 h ) 等，其中e m s 被 0 第一章绪论 证明是效果最好且负面影响小的诱变剂，被广泛应用于工业。烷化剂的诱变机理首先是 鸟嘌呤的0 6 位置被烷基化，形成一个带正电荷的季铵基团，从而造成烷化的鸟嘌呤与 胸腺嘧啶配对，导致碱基替换。此外，诱变剂也可与d n a 分子中的磷酸反应缩合形成 酯，这就切断了磷酸与糖分子的连接，造成染色体缺失。这些d n a 结构上的变化又可 能促使本来不表达的基因或d n a 区段被激活，表现出被掩盖的性状。张树飞i 删以e m s 逐级处理产酸性p - 甘露聚糖酶的黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) ，得到的高产菌株的酶活性 是原始出发菌株的2 1 5 倍。彭帮柱采用e m s 诱变苹果酒酵母，不仅提高了发酵的原酒 的酒精度，且酒体澄清透明，色泽金黄，具有苹果酒的典型风味【6 5 1 。 碱基类似物 碱基类似物与d n a 正常的碱基结构类似，能在d n a 复制时取代j 下常碱基而与互 补碱基配对。如5 溴尿嘧啶( b u ) 和2 氨基嘌呤( a p ) 的掺入，都能引起a t 碱基对转换为 g c 碱基对，最终导致生物体的突变。 氯化锂 氯化锂是一种碱金属卤化物，其本身并无诱变作用，但在诱变育种中与一些诱变 因子具有协同作用，于是常在复合诱变中采用【6 6 1 ，普遍认为它可能会导致极少量a t - g c 碱基对的转换或者碱基的缺失。 亚硝酸 亚硝酸能使嘌呤或嘧啶脱氨，从而改变核酸的结构与性质，造成d n a 复制过程的 紊乱。此外，h n 0 2 还可能造成d n a 双链间的交联，最终引起遗传效应。 ( 3 ) 航天诱变育种 航天育种是利用航天技术，通过返回式航天器，将种子、苗木或微生物带至2 0 0 - - 4 0 0 k m 的太空，利用宇宙射线、微重力、重粒子、高真空、大交变磁场等特殊的空间环 境诱使其发生基因突变或染色体畸变，进而选育优良品种的高新技术。自1 9 8 7 年以来， 中国科学院微生物研究所等单位，先后利用卫星搭载了真菌、酵母、放线菌、细菌等 3 0 多种微生物菌种完成太空诱变，选育出了若干能提高抗生素或酶产量的新菌种，并 已投产应用【6 7 1 。一般认为，空间诱变的主要因素可能包括有以下几点【6 7 】： 微重力假说：在宇宙空间中的重力仅为地球的百万分之一到十万分之一，这样 的微重力可能会干扰d n a 损伤修复系统的正常运行，从而增大突变几率。 空间辐射假说：太空中存在的各种质子、电子、离子、粒子、高能重粒子( h z e ) 等微粒以及x 射线、y 射线和其他宇宙射线都可能造成d n a 的损伤，其中包括碱基变 1 0 西北大学硕士学位论文 化、碱基脱落、氢键及化学键的断裂、d n a 分子与蛋白质交联，这些化学作用都可能 引起染色体结构的改变。 转座子假说：太空环境能激活潜伏的转座子，活化的转座子通过移位、插入或 丢失，导致基因变异和染色体畸变。 其它因素的复合效应：大气结构、地磁强度、压力、超真空、温度等因素与微 重力、空间辐射、转座子激活等共同作用，引起生物体内遗传物质的结构发生改变而最 终导致变异。 ( 4 ) 复合诱变 在微生物的常规诱变育种中，往往存在着突变株对单一的诱变剂诱变效果钝化的 情形，即平顶效应。而由于不同的诱变剂发生作用的位点不尽相同，因此使用多种诱变 因子进行复合诱变处理，能更好地改变菌株对诱变剂的敏感性，使所需的优良性状积累 和迭加，最终选育出高产菌株。 复合诱变形式包括：两种或多种诱变剂的先后使用、同时使用以及同种诱变剂的 重复作用。普遍认为，复合诱变具有协同效应，如果复合诱变的诱变剂能够合理搭配， 其效果往往较单一诱变好。祝子坪等对桑黄菌原生质体进行h e - n e 激光与紫外线复合 诱变处理，筛选出的s 1 菌株比出发菌株增产6 4 0 6 ；多糖含量最高的菌株s 4 比出 发菌株提高1 3 8 4 。激光紫外线复合诱变与同剂量的紫外线诱变相比，致死率明显 降低，而正突变率却提高了3 5 2 9 ，这可能是因为激光与紫外复合诱变时，低剂量的 激光激活了原生质体的酶系统，使d n a 修复能力增强，从而降低了致死率；此外d n a 分子吸收激光后振动加剧，使紫外线致突变作用增强，提高了突变率6 钔。 虽然复合诱变与单一诱变相比，在效果上具有很大优势，但因目前大多微生物， 尤其是利用次生代谢产物的真菌的遗传背景不清楚，往往在对复合诱变剂的选择上，带 有很大的盲目性。 1 3 2 原生质体融合育种【洲 基因重组是遗传的基本现象之一，菌株可经过基因重组可以获得新的遗传性状，成 为具有优良性状的菌种。基因重组自1 9 7 8 年第二届国际工业微生物遗传学讨论会上提 出与原生质体融合技术相结合以后，才获得了飞速的发展。 人们发现，采用原生质体融合技术诱变育种，在效果上有