（植物病理学专业论文）本氏烟泛素延伸蛋白基因的功能分析.pdf

游江大学醺士学链论文 本氏潮泛索踅律蛋鑫基嚣鹃凌熊分橱 摘要 泛素u b i q u i t i n ) 是在生物申普遍存在的释由7 6 个氨基黢鳃成的小分子量 蛋白。它通过对靶标蛋蠹进行泛素饯修饰，在2 6 s 蛋白酶体的捧慝下将靶标蛋白 降解，或通过与包含各静泛素结合结构域u b i q u i t i nb i n d i n gd o m a i n 蟪蛋巍昀 互作调节蛋白的细胞定位、活性以及蚤白的相互作用，从而参与备种生物学功能 的调控。泛素延伸蛋白( u b i q u i t i ne x t e n s i o np r o t e i n ，u e p ) ，是氨端一个泛素分 子孝羧端一个棱糖体簧壹分子鸯融合蛋壹。泛素延伸蛋壹在植物生物学功髓皆爵 调控律爝及其作蕉机理还不清楚。本研究宽隆了一个本氏耀( n i c o t i a n a b e n t h a m i a n a 泛素延伸蛋蠹基嚣，采用癌毒诱导昀基因沉默( v i r u si n d u c e dg e n e s i l e n c i n g ，v i g s ) 静超表达等多种谖节基嚣表达蕊技术方法研究了其对奉氏烟生 长发育、细胞坏死、抗瘸性和抗逆性等重要生物学功能的调控作用及其作用机理， 获得以下主要结果： 1 采用r t - p c r 方法克隆了一个本氏烟泛素延伸器白基因n b u e p 。n b u e p c d n a 编码区长4 7 1b p 。n b u e p 蛋臼为氨端7 6 个氨基酸的泛索分子和羧端8 0 个氨墓酸的s 2 7 a4 0 s 类核糖体蛋盘分子的融合蛋白。n b u e p 与烟草n i c o t i a n a t a b a c u m ) u e p 基蔷t u q g 3 f a j 2 2 3 3 2 9 ) 和本氏烟昀一个u e p 基因( a y 9 1 2 4 9 4 ) 昀核替酸序列翟源性羧高，一致攀分别达9 6 和9 1 ，分别只有1 5 个和霹2 个 棱苷酸不阍。 2 分析了瘸害抗性诱导期处理淡及病辣辏接种对n b u e p 基因表达翡影响。 病害抗性诱导裁b t h 、s a 和乙烯车处理以及蘸核病菌( s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m 和黑胫病菌( p h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c av a t n i c o t i a n a e 接赣改变了n b u e p 基淫及 其单体n b u b i 和n b r l p 基因在本氏烟植株中的表达，其中n b u e p 基因及其单 体n b u b l 基因在各种处理后表达改变的动态都很相似。 3 采用烟草脆裂病毒t o b a c c or a t t l ev i r u s ，t r - v ) 诱导的基西漉默技术分 析了n b u e p 基因在本氏烟生长发育、坏死和抗病性等方面的生物学功能发现， n b u e p 及其n b u b l 序列昀基因沉默处理导致植椿迅速产生坏死，处理后羹s 天 导致全棣死亡；褥n b r l p 戆沉默处理不导致系统性坏死，但严鬟择割了檬株翡 l l 渍江大学磺士孥笾论文本氏潮泛索筵静豢鑫基溺懿功辘分析 生长和发育，新生叶不能完全扩展，畸形，并完全阻止了a v r 4 c f - 4 介导的过敏 性坏死反应妁产生。 4 采用瞬时超表达技术分析了n b u e p 基因在本氏烟细胞坏死、抗病性及耐 盐性等方薅翡生物学功能。发瑰，n b u e p 基因的超表达导致强烈蕊本氏耀细脆 坏死，但其单体基嚣n b u b i 彝n b r l p 的超表达裂不影镌本氏烟细施坏死。n b u e p 基因及n b u b i 和n b r l p 的超表达增强了本氏烟对黑胫病菌的抗性，但对蘸核病 蘅的抗性没有显著影响。此外，齑浓度n a c i 捧铡了n b u e p 超表达介导鲍细胞 坏死。n b u e p 及其n b u b i 和n b r l p 的超表达晦低了奉氏烟昀耐盐性。 综上所述，n b u e p 基因可能通过其单体产物n b u b i 和n b r l p 在植物生长 发育、细胞坏死，恭病性和抗逆性等重要生物学动能审起重要谖控作用。 美键词：泛素延伸蛋白；泛素；核糖体蛋蠹；坏死；拭癔性；辩盐幢；本氏烟； 饼s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ；p h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a t n i c o t i a n a e 濒选大学硕七学霞论文本氏烟泛索延 枣蛋自綦瓣的功能努提 a b s t r a c t u b i q u i t i ni sau b i q u i t o u s l ye x i s t e ds m a l lm o l e c u l a rp r o t e i no f7 6a m i n oa c i d s 。i t d e g r a d e sp r o t e i n s 、析t hu b i q u i t y l a t i o nm o d i f i c a t i o ni n2 6 sp r o t e a s o m e d e p e n d e n tw a y , o ra l t e r sp r o t e i nl o c a l i z a t i o n ，a c t i v i t ya n di n t e r a c t i o n s t h r o u g hi n t e r a c t i n gw i t h p r o t e i n sw i t hu b i q u i t i nb i n d i n gd o m a i ni n2 6 sp r o t e a s o m e i n d e p e n d e n tw a y , t h e r e b y r e g u l a t e sav a r i e t yo fb i o l o g i c a lp r o c e s s e s 1 y o i q u i t i ne x t e n s i o np r o t e i n ( u e p ) i sa f u s i o np r o t e i no fa nu b i q u i t i nm o l e c u l ei nt h ea m i n ot e m 娃n a la n dar i b o s o m a lp r o t e i n m o l e c u l ei nt h ec a r b o x y lt e r m i n a l 。t h er e g u l a t o r yr o l ea n di t sm e c h a n i s mo fu e pi n p l a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e sa r es t i l lu n c l e a r i nt h i st h e s i ss t u d y , a l lu e pg e n ew a s c l o n e df r o mn i c o t i a n ab e n t h a m i a n a i t sr o l ei n d e v e l o p m e n t ，n e c r o s i s ，d i s e a s e r e s i s t a n c ea n ds t r e s st o l e r a n c ei n b e n t h a m h 2 n aw a ss t u d i e de m p l o y i n gv i r u s i n d u c e dg e n es i l e n c i n g ( v i g s ) a n do v e r e x p r e s s i o nt e c h n i q u e s t h em a i nr e s u l t sa l e 基sf o l l o w s ： 1 a nu e pg e n ew a sc l o n e df r o mn i c o t i a n ab e n t h a m i a n aa n dd e s i g n a t e da s n b u e p 。i th a da no p e nr e a d i n gf r a m eo f4 7 1b p 。n b u e pw a saf u s i o np r o t e i no fa n u b i q u i t i nm o l e c u l eo f7 6a m i n oa c i d si ni t sa m i n ot e r m i n a la n das 2 7 a4 0 s t y p e r i b o s o m a lp r o t e i nm o l e c u l eo f8 0a m i n oa c i d si ni t sc a r b o x y lt e r m i n a l t h en u c l e o t i d e s e q u e n c eo fn b u e ph a dt h eh i g h e s ti d e n t i t y , 9 6 a n d91 r e s p e c t i v e l y , t oa n t a b a c u mu e pg e n et u q g 3 ( a j 2 2 3 3 2 9 ) a n da nn b e n t h a m i a n au e pg e n e ( a y 9 12 4 9 4 ) ，晰t hd i f f e r e n c eo fo n l y15a n d4 2n u c l e o t i d e s ，r e s p e c t i v e l y 2 e f f e c to ft r e a t m e n t sw i t hp l a n td i s e a s er e s i s t a n c ee l i c i t o r sa n di n o c u l a t i o n s w i t hp a t h o g e n so nn b u e pg e n ee x p r e s s i o nw a si n v e s t i g a t e d e x p r e s s i o no fn b u e p a n di t sc o m p o n e n t sn b u b ia n dn b r l pi n 髭b e n t h a m i a n ap l a n t sw a sa l t e r e du p o n s p r a y i n gt r e a t m e n t sw i t hs o l u t i o n so fp l a n td i s e a s er e s i s t a n c ee l i c i t o r sb t h ，s aa n d e t h y p h o na n di n o c u l a t i o n sw i t haf u n g a lp a t h o g e ns c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u ma n da l l o o m y c e t ep a t h o g e np b t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a ln i c o t i a n a e t h ea l t e r a t i o no f e x p r e s s i o np a t t e r n so fn bu e pa n di t sc o m p o n e n tn bu b ib yt h et r e a t m e n t sa n d i n o c u l a t i o nw a sv e r ys i m i l a r i v 濒汪大学硕：学位论义零氏烟泛素延 孛凝自基阂的功能分耩 3 f u n c t i o n so fn bu e pi nd e v e l o p m e n t n e c r o s i sa n dd i s e a s er e s i s t a n c ei n b e n t h a m i a n aw e r ea n a l y z e de m p l o y i n gt o b a c c or a t t l ev i r u s ( t r v ) i n d u c e dg e n e s i l e n c i n gt e c h n i q u e t r v - i n d u c e dv i g si n d u c t i o nt r e a t m e n t sf o rn b u e pa n di t s c o m p o n e n tn b u b il e dt or a p i dn e c r o s i s ，r e s u l t i n gi nw h o l ep l a n td e a t h7 - 8d a y sp o s t a g r o - i n f i l t r a t i o n ；w h i l et h et r e a t m e n tf o rn b u b id i d n o tc a u s es y s t e m i cn e c r o s i s ，b u t s e v e r e l yi n h i b i t e dp l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t ，m a k i n gt h en e w l yf o r m e dl e a v e s d e f o r m e da n du n a b l et o d e v e l o p i n t of u l ll e a v e s ，a n d c o m p l e t e l y b l o c k e d a v r 4 c f - 4 - d e p e n d e n th y p e r s e n s i t i v er e s p o n s e 4 t h er o l eo fn b u e pi nn e c r o s i s ，d i s e a s er e s i s t a n c ea n ds a l tt o l e r a n c ei n1 9 b e n t h a m i a n aw e r e e x a m i n e d e m p l o y i n go v e r e x p r e s s i o nt e c h n i q u e t r a n s i e n t o v e r e x p r e s s i o no fn b u e p c a u s e ds t r o n gn e c r o s i s ，w h i l et r a n s i e n to v e r e x p r e s s i o no f n b u b la n dn b r l pd i dn o tr e s u l ti na n yn e c r o s i s 。o v e r e x p r e s s i o no fa l lt h r e eg e n e s e n h a n c e dd i s e a s er e s i s t a n c eo ft h eo o m y c e t ep a t h o g e np h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a t n i c o t i a n a eb u tn o tt ot h ef u n g a lp a t h o g e ns c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m a d i t i o n a l l y , h i 曲 c o n c e n t r a t i o no fn a c lc o m p r o m i s e dt h en b u e p - m e d i a t e dn e c r o s i s o v e r e x p r e s s i o n o fa l lt h r e eg e n e sd e c r e a s e ds a l tt o l e r a n c ei n b e n t h a m i a n a t a k e nt o g e t h e r , n b u e pm a yp l a ya ni m p o r t a n tr o l ei nd e v e l o p m e n t ，n e c r o s i s ， d i s e a s er e s i s t a n c ea n ds t r e s st o l e r a n c ei n b e n t h a m i a n at h r o u g hf u n c t i o n i n go fi t s c o m p o n e n t sn b u b ia n dn b r l p i nb o t hs e p a r a t ea n di n t e r a c t i v ew a y s k e yw o r d s ：u b i q u i t i ne x t e n s i o np r o t e i n ；u b i q u i t i n ；r i b o s o m a lp r o t e i n ；n e c r o s i s ； d i s e a s er e s i s t a n c e ；s a l tt o l e r a n c e ；n i c o t i a n ab e n t h a m i a n a ；c y , s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ；p h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a r n i c o t i a n a e v 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成聚。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰霉过的磅究成果，也不包含为获褥滥姿蠢茎或其他教育枫搦的学位或 证书蔼馥嗣过的材料。与我一网工作的阕志对本研究所做的任俺贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学链论文作者签名：豪硗戳 签字邈期：五妒多年善熙芳露 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者究全了解滥姿盘堂有权傺留并岛国家有关部门或机 构送交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏基堂 可以将学使论文的全部或部分蠹容编入有关数据库进行检索翔传播，可i 以采翔影 印、缩邵或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 傈密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：家谚铍 导师签名： 寨韵轰 签字爨期：2 器垂怠年胃f 譬隧签字匿期：砌器年多胄，苫目 濒汪天学醺士学位论文零氏矮泛索惩律蠢盘摹嚣羲秘籀分橱 致谢 在浙大的两年学习时间匆匆而过，回想起来，有许多事情让我终生难忘，短 短两年麴时闻，不仅健我学到了许多知识，而且邈领悟了诲多傲人的道理，这两 年的时光会成药我以蜃永远的嚣忆。 非常感谢我的导师蔡新忠教授，藜老师严谨的治学态度翔认真、钻研的工作 作风深深的影响着我，蔡老师在我实验不顺利时和在论文写作的关键时候给予了 很多指导帮帮助，在生活上逛给予缀多关心，借就机会离蔡老雾器表示深深魏感 耄 。 感谢嬲雪平教授、郑经武教授、攀红叶教授、宋凤鸣教授、陈至良教授和毛 碧增教授所给予的帮助，他们对科研的热爱深深的感染着我，在此对他们致以最 诚挚酶祝福。 我的实验和论文褥到了徐秋芳师姐很多的帮助，在此表示深深的感谢。 感谢本实验室的张悫新、曹文渊、周鑫、黎飞、臧宪朋、沈徐辉以及沈城城 对我科研上酶帮助以及生活上的关心，感谢师兄王长眷对我心理上的开导。 感谢严淼淼、梅圆圆、张志芳、壬继业、刘辉志、王晓娥、张慧娟、张燕、 赵磊、毛克克对我实验的帮助和支持，两年里，因为实验麻烦你们不少，非常感 谢! 感谢和我一起在莲舍1 1 9 生活了两年酶李颜蔓、董阿娜以及避静对我生活上 的帮助和关键时候给予我的支持和理解。 感谢华东师大的张可灵，你是最理解我的人，我们会是生的挚友；感谢福 建农林大学的任寞真，我嬲是曾经的舍友，也会是永远戆髓发；感谢南京农业大 学的松峰，虽然两年爨联系不多，但仍觉得我们应该是心有灵犀、心照不宣的。 感谢参加本论文评阅、答辩和对本论文提出宝贵意见的专家和同行。 最后要感谢的是身在远方麴亲爱翡爸爸妈妈和弟弟，你们对于我来说是最重 要的入，没有你翻的理解，我不可麓是今天豹舀强，弥销斡爱是我一生最宝费酶 财富，即使全世界都抛弃了我，你们也会接纳我，你们的爱是我前进的动力，无 论遇到多么大的网难，只要有你们的爱，我就无所畏惧。 宋晓毅 2 0 0 8 年s 冀于浙江天学警察池 灞汪大学颂二 二鬻篷论突零炙矮泛素筵爨骚窘基蕊瓣功熊分褥 本氏烟泛素延伸蛋白基因的功能分析 1 植物的抗病性 第一部分文献综述 重1 植物基西对基因的抗病性 植物抗病惶其有多种表蕊形式，其中病原物无毒基因 孛则有5 个( d c l l 、2 a 、2 b 、3 、4 ) ( m a r g i s ae ta l 。，2 0 0 6 ) 。d c l 作用导致多糟不同小分 子r n a 的形成，对拟南芥的研究结果表明，不同d c l 切割形成不同大小种类的 s i r n a ，在不同种类病毒诱导的v i g s 和抗病毒中的作用和重要性也各不相同。 d n a 病毒侵染激活所有4 种d c l 产生3 类大小的s i r n a ，即分别由d c l i 和 d c l 4 作用产生2 i n t ，由d c l 2 作用产生2 2 n t 、以及由d c l 3 作用产生2 4 n t 的 s i r n a 。焉盈所占吃铡和重要性由高到低依次黄d c l 3 、d c l 4 、d c l 2 、d c l l ， 然恧r n a 病毒侵染主要激活d c l 4 作用产生2 i n t 的s i r n a ，在d c l 4 失活情况 下，植物可以激活d c l 2 和d c l 3 分别产生2 2 n t 和2 4 n t 的s i r n a ，从而启动v i g s ， 降解病毒。另外发现，远离病毒侵染点的系统性v i g s 依赖于d c l 4 的作用，作 6 濒篷大学矮士学位论文本茨烟泛豢廷 枣虽叁基闲鳇功能分析 阁产生2 i n t 的s i r n a 可能作为潜在的信号，激活依赖于r d r 6 和d c i a 的s i r n a 信号扩增和随着的基因沉默和病毒转录本降解( d e l e r i se ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 植物孛存在多个a g o ，如拟南芬中由l o 个，它们特异性与不同小分子r n a 捆结合，参与植物基因沉默和生长发育等的调控。a g 0 1 选择性地与m i r n a ， 内源t a - s ir n a 和转基因源s i r n a 结合，但不与来自病毒的s i r n a 或涉及染色 质沉默的2 4n ts i r n a 相结合。a g 0 1 参与m i r n a 和s i r n a 介导的p t g s 、发育 和抗病病毒调控。a g 0 4 与来自转座元件和重复元件的s i r n a 结合，参与调控 r n a 指导的d n a 甲基化、转录永平的r n a 沉默以及细菌抗病性a g 0 6 与异 染色质襁关s i r n a 的积累有关，并在r n a 指导的d n a 甲墓化和转录水平昀r n a 沉默中起重要作用。a g 0 6 的功能与a g 0 4 部分重叠。a g 0 7 为t a - s i r n a 的产 生和稳定所必需，并参与发育调控。a g 0 1 0 在维持茎端分生组织中的未分化茎 细胞中起重要作用，但与p t g s 无关。a g o 不同成员在v i g s 中的作用尚不明 确，有待进一步的研究 另外，r n a 病毒和d n a 病毒诱导的v i g s 产生机理在d s r n a 的合成等步 骤明曼不同d n a 病毒诱导昀v i g s 扁始遭程中d s r n a 的合成依赖予植物体内 的r d r p r d r , r d r 6 s d e l s g s 2 以及功能未知的s g s 3 ，蜀d n a 病毒诱导的v i g s 癌始过程中d s r n a 的合成则不依赖于植物体内的这些因子，恧是由病毒叁身的 r d r p 合成。更多不同种类的病毒贪导的v i g s 机理的研究将增进对v i g s 机理 的理解。 2 1 2v l g s 载体 可被开发用于v i g s 载体的病毒必须符合凡个条件。一个是能系统性的侵染 植物寄主，并在植物内复制增殖，且最好能均匀积累于器官内各种组织，比如叶 片的叶肉组织，以便下游基因功能鉴定操作，如浸润农杆菌等。二是决定侵染复 制、转移等必不可少的组分集中于较少的亚基因组内，否则操作过于繁琐，不适 宜于大规模基因鉴定和功能分析研究。现有的载体病毒一般只有2 种核酸亚基因 组，如t r v ，壹r n a l 和r n a 2 组成。根据用以梅建载体的病毒性质，v i g s 载 体大体上可分为r n a 病毒栽体、d n a 病毒载体和卫星病毒载体。 用于构建v i g s 载体的r n a 病毒种包括t m v 、马铃薯x 病毒( p o t a t ov i r u s x ，p v x ) 、烟草脆裂病毒( t o b a c c or a t t l ev i r u s ，耵w ) 、大麦条纹花叶病毒( b a r l e y 7 濒江大学矮学位论文本氏惩泛豢延傍鬣鑫基戮的功裁分析 s t r i p em o s a i cv i r u s ，b s m v ) 、豌豆早枯病毒( p e ae a r l yb r o w n i n gv i r u s ，p e b v ) 、杨 树花叶病毒( p o p l a rm o s a i cv i r u s ，p o p m v ) 、番茄丛矮病毒( t o m a t ob u s h ys t u n t v i r u s ，t b s v ) 、以及2 0 0 6 年后开发的黄瓜花畸病毒( c u c u m b e rm o s a i cv i r u s ， c m v ) 、菜豆荚斑驳病毒( b e a np o dm o t t l ev i r u s ，b p m v ) 和雀麦花叶病毒b r o m e m o s a i cv i r u s ，b m v ) 已被开发用于v i g s 载体构建的d n a 病毒包括番茄金色花叶病毒( t o m a t o g o l d e nm o s a i cv i r u s ，t g m v ) 、大白菜曲叶病毒( c a b b a g el e a f c u r lv i r u s ，c b l c v ) 以及菲潲本薯花叶病毒 a f r i c a nc a s s a v am o s a i cv i r u s ，a c m v ) 曼者均为单链环 形d n a 病毒，出d n a - a 和d n a b 2 种核酸成分组成，已分别被应用于本氏烟、 拟嘉芥和木薯的基因沉默。 还有一类v i g s 载体构建自卫星病毒，目前报道的有2 个，一个是由r n a 病毒t m v 的卫星病毒构建成的s v i s s 系统，另一个是由d n a 病毒中国番茄黄 化曲叶病毒( t o m a t oy e l l o wl e a fc u r lc h i n av i r u s ，t y l c c n v ) 的伴随卫星分子 d n a l 3 构建成的d n a m l 3 载体。d n a m l 3 载体可用于烟草属多个种和番茄等多种 茄辩植物。 2 1 3 影响v i g s 沉默效率的主要因子 影响沉默效率的因子主要有v i g s 载体中插入的目的片段的序列和大小，重 组v i g s 病毒载体导入植物的方法、沉默处理时寄主生育期和沉默处理后的植株 培育条件等。 不同的病毒载体需要和容忍插入的譬的e d n a 片段长度不霹，一般地，插入 目的片段大小p 2 3 0 0 5 0 0 b p 为宜，最多不超过1 。5 k b ，否则片段太大会导致v i g s 载体病毒移动受阻和外源片段丢失( b u r c h 。s m i t he ta 1 ，2 0 0 4 ) 另外，插入片段 - 9 目的基因至少要有连续2 3 b p 完全相n ( t h o m a se ta 1 ，2 0 0 1 ) ，两者序列同源性越 高，v i g s 效果越好。如果要对整个基因家族进行沉默，被选择的插入片段必须 是该基因家族所共有的序列( l ur e ta 1 ，2 0 0 3 b ) 。 不同的基因沉默载体在同一作物上沉默适温不胃，同一载体在不同寄主上沉 默也有不同适i g ( s z i t t y ae ta l ，2 0 0 3 ) 。对于t 料恧畜，摆对低温有利于它余导的基 因沉默。其中在本氏烟上需要2 5 。c 左右( b u t c h s m i t he ta l 。，2 0 0 4 ) 。 一般较小的苗期时进行v i g s 诱导接种，基因沉默成功率较大。比如，用 8 濒江丈学矮士举谴论文本氏烟泛綮廷 牵蛋盘基隗懿功辘分析 瓢w 病毒载体接种番茄时最佳苗龄为出土盾2 3 周( e k e n g r e ne ta 1 ，9 _ 0 0 3 ) ，太大 和太小都不容易进行有效沉默。 v i g s 载体的植物导入方法直接影噙病毒戆初始积累量，进褥影响基匿沉默 的起始，因而显著影响v i g s 沉默效率。不同v i g s 载体病毒的接种方法不同 目前常用的接种方法主要包括机械接种、金属粒子轰击和农杆菌介导的接种。 r n a 病毒的体外转录产物或其侵染叶片的提取物，常采用机械接种方法导入植 物。例如在大麦上b s m v 就采用此种方法。d n a 病毒沉默载体的导入常采用粒 子轰击法，镶知t g m v 、c b l c v 及a c m v 2 1 4 v i g s 的在植物基因功能鉴定中的应用现状 v i g s 应用最活跃的领域是植物抗病性相关基因的鉴定和分离，尤其是基因 对基函抗性( g e n e - f o r - g e n er e s i s t a n c e ) 相关基因的功能分析方面，这得益于多数 基因对基因抗性的一个标志性防卫反应过敏性坏死反应( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e ，h r ) 薅臣不阕檀物辩类阙r a v r 下游信号传导途径保守。将互补麓r a w 基匿对分别克隆入双霓表达质粒，转化农杆菌后，导入植物叶片，或将表达a v r 的农杆菌或病原细菌本身导入含互补尺基因的植物，即可导致r a v r 特异性诱发 的h r 坏死。比较野生型和v i g s 植株的h r 坏死产生强度，即可明确被沉默基 因在该r a v r 诱发的h r 产生中的作用。根据该思路，大量基因在多个r a v r 互 作，包括p t o a w p t o ，融e v x , n 理m 1 4 , c f a v r 等，介导的h r 和抗病性中的作用已 得到鉴定。 从v i g s 筛选分析对象角度来看，看l ； 下3 种v i g s 分析策略：第一释是以檀物 的c d n a 文库建筛选对象的大规模分析。h 等( 2 0 0 3 ) 以v i g s 载体p v x 构建 本氏烟e d n a 文库，通过v i g s 测试了约5 0 0 0 个e d n a 在p r o 介导的h r 和抗 病性中的作用。发现其中7 9 个e d n a 抑制p t o 介导的h r ，但只有6 个能抑制 p t o 介导的对ps y r i n g e 的抗性，其中3 个编码h s p 9 0 ，另外一个为n r g l ，编码 一个具有与典型的c c - n b s l r r 类r 蛋白一样结构域的蚤白。随后研究发现 h s p 9 0 不仅在p t o ，而且在救和余导的h r 和抗病性中起重要作用。此外， l i u 等以v i g s 载体t r v 构建本氏烟e d n a 文痒，通过v i g s 测试了约1 5 0 0 个 c d n a 在n 贪导的h r 和抗病性中的作用。发现b e c l i n l 介导的细胞皂噬途径 负调控h r ，并在植物抗病性中起重要作用。第二种是以抗病性产生与否差异表 9 濒江大学碛学位论文本氏烟泛豢延 牵爨自基嬲的动辘分援 达的c d n a 序列库为筛选对象的较大规模分析。该策略已在番茄抗叶霉病相关基 因鉴定中得到了很好昀应用。英雷j o n e s 实验室和荷兰j o o s t e n 实验窒分别以4 2 个和1 9 2 个c f - 9 和c f i 4 余导的h r 产生与否差异表达的e d n a 痔列荛对象，分 别鉴定获得番茄抗叶霉病关键基因3 个和2 0 个，煎孝包括a c i k l 蛋白激酶和 e 3 泛素连接酶；后者则包括一个具有与典型的c c - n b s l r r 类r 蛋白一样结构 域的蛋白n r c l ，h s p 9 0 ，1 个核g t p a s e 以及1 个l 1 9 核糖体蛋白。第三种是通 过选择某个或少量候选基因，随后采用v i g s 鉴定其功能的策略。研究发现： r a r l ，e d s l ，n p r l n i m i ，s g t l ，h s p 9 0 ，以及一些蛋白激酶包括n p k i ，w i p k ， s 1 p k ，n t m e k l 和n t m e k 2 ，c o p 9 s i g n a l o s o m e 等在奔导的h r 和威抗病性孛 起重要作用( j i ne ta 1 ，2 0 0 2 ，2 0 0 3 ；l i ue ta l 。，2 0 0 2 b ，2 0 0 2 c ，2 0 0 3 ，2 0 0 4 ；p e a r te ta ， 2 0 0 2 a ，2 0 0 2 b ；s h a r m ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。s g t l m 堰j 。转录因子t g a l a 和t g a 2 2 ， 一组m a p 激酶包括m e k l m e k 2 n t f 6 和w i p k 等在p r o 介导的h r 或抗病 性中起作用，s g t l 和h s p 9 0 为m i 。1 介导的抗线虫和蚜虫所必需，而s g t l n t m e k 2 ，c i t r x 及a c i k l 则在c f - 9 和c f i 4 介导的h r 和抗病性中起重要作用。 此外，采用b s m v 介导昀v i g s 技术证明了r a r i s g t l 和h s p 9 0 在小麦抗咔 锈菌基因l r 2 1 介导的抗性，以及在大麦抗臼粉瘸基嚣m l a l 3 介导的抗性中均起 重要作用。 除了基因对基因抗性相关基因的鉴定和筛选外，v i g s 还被用于其他类型抗 病性和防卫反应相关基因的功能鉴定研究发现，s g t l 和h s p 9 0 不仅与多个r 基因介导的h r 和抗性相关，而且在非寄主抗性中也起重要作用，此外，b b r b o h a 和曰也与本氏烟对p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s 的非寄生抗性相关，通过v i g s 还发现 蛋自磷酸酶2 a ( p p 2 a ) 抑制植物防卫反应和类似h r 昀细胞坏死。 另外，v i g s 还被斑用予抗虫信号传导途径、抗旱信号传导途径以及植物甾 酵合成途径、光合作用途径，已经纤维素合成途径的分析。 此外，一些有关植物生长发商，呼吸代谢等方面的基因也相继通过v i g s 技 术得到了克隆，例如，诱发烟草n f l ( n i c o t i a n a 凡毗e y ) 基因沉默之后，引起 次生、三生侧枝、花表型异常；薄片卷曲、花序变形、无雄蕊、无瓣等异常表型 ( r a t c l i f f fe la 1 ，2 0 0 1 ) 。又如，在植物叶绿体中，存在一个质体醌- n a d h 氧化 还原酶n d h ) 复合物，抑制n d h 的表达，将会促遗叶片的衰老两酯m i g u e lz a p a t a l o 濒汪丈孥硕擎链论文本氏烟泛豢廷 枣装鑫基因的功辘分析 2 2r n a i 作用机制 r n a i 作用机割模型包括起始阶段和效应阶段。在起始阶段，d s r n a 进入细 胞的方式可以是外源导入或者转基因、病毒感染等。引入的d s r n a 被核酸酶 r n a s d l i 家族中特异识别d s r n a 的d i c e r 酶，以一种a t p 依赖的方式逐步切割成 长约2 1 - 2 3n t 的由正反义链组成的双链小分子干扰r n a ( s i r n a ) ，且每条单链的 3 端都带有2 个突出昀菲配对碱基( 多数是u u ) 。s i r n a 又被称为弓 导r n a ( g u i d e r n a ) ，是识别靶r n a 的标志。s i r n a 的生成瘩动了r n a i 反应。在效应阶段， s i r n a 结合一个核酶复合物，形成所潺的r n a 诱导的沉默复合物( r n a - i n d u c e s i l e n c i n gc o m p l e x ，r i s c ) 这个核酶复合物由内切核酸酶、外切核酸酶、解旋酶 和同源r n a 搜索活性蛋白四种成分组成。激活该复合物需要一个a t p 依赖的将 s i r n a 解双链的过程，活化以后的r i s c 定位到与s i r n a 中的反义链互补的靶 m r n a 转录本上，并在距离s i r n a 3 端1 2 个碱基的位置切割m r n a 。另外， 通过遗传分析方法发现，线虫中的r d e - i 、m u t - 7 和d n a r n a 解旋酶及其他 p a z a ： i w i 蛋白也参与到该除段酶反应。 3 泛素延伸蛋白基因功能的研究现状 3 1 泛素的结构组成和进化 g o l d s t e i ne ta 1 ( 1 9 7 5 ) 从牛胸腺中分离到一种小分子的蛋白质，后来发现这 种蛋白质广泛存在于各种真核生物中，因其在不同种属中有极其相似的结构，所 以命名为泛索( u b i q u i t i n ) 。泛素由7 6 个氨基酸组成，相对分子量为8 6k d 。真核 细胞串编码泛素的基因以两种形式存在( w a r n e rj 1 9 8 9 ) 一种是多聚泛素基因 o l i u b i ) ，编码一个壶可达到1 0 0 个不间断连接的泛素重复，这些重复的泛素通 过蛋白酶水解释放出单体泛素；第二类基因的表达产物是一个泛素分子的c 一末 端连接着5 2 5 3 或7 6 8 1 个进化上非常保守的氨基酸组成的扩展肽，称为泛素 延伸蛋白( j e n t s c he ta 1 ，1 9 9 1 ) 。真核生物中的泛素延伸基因分为两类：一类c 末 端与5 2 或5 3 个氨基酸的蛋白质融合，这类融合的蛋白与核糖体l 4 0 ( r i b o s o m a l l 4 0 ) 有很高昀同源性；另一类与7 6 8 0 个氨基酸的蛋白质融合，这类融合的蛋 灏江大学矮擎位论文本氏耀泛豢延 枣蛋幺基嚣豹功挠分析 囱质与核糖体$ 2 7 a 蛋白( r i b o s o m a l $ 2 7 a ) 有很高的同源性。 多聚泛素的编码单元在不同种和种内都有变化；泛素延伸蛋白在尾巴昀编码 序列和长度上都有不溺，但两瓣蛋自融合尾巴在在基本氨基酸残基鸶成分、核定 位信号孝富半胱氨酸方匿和其它核酸结合蛋皇有很高姆相似性( l u r i dpke t a 1 ，1 9 8 5 ；o z k a y n a ke e ta l 。，1 9 8 7 。c 端昀4 个氨基酸残基( l e u - a r g g l y g l y ) 对 泛素的功能非常重要。在活体内，这个基因的翻译产物被c 端的水怨酶快速和 精确的裂解( w i l k i n s o n1 9 9 7 ) 。c 端延伸蛋白是成熟梭糖体的组分( f i n e l e ye t a 1 1 9 8 9 ) ，在这个融合中单体泛索的功能还不清楚，但它可能是一个分子伴侣 泛素延伸蛋白有不同长度的c 端( c a l l i se ta 1 ，1 9 9 0 ；j o n e sa n dc a n d i d o1 9 9 3 ) ， 然而，这些蛋白昀c 。端都含有4 个氨基酸残基，这与出现在核酸结合蛋白的 z i n c f i n g e r 域一致( k l u ga n dr h o d e s 1 9 8 7 ) ，并且在核定位上由一致的序列，在 不同的种中有很高的戮源性。 在真核生物中，多聚泛素基因编码非常保守的蛋白，泛素延伸蛋白中编码泛 索的蛋白不保守，这些蛋白与$ 2 7 a 和l 4 0 融合。泛素的不保守性在愿生动物、藻 类、变形虫、真菌和线虫中都有发现( c a t