（特种经济动物饲养专业论文）中药材白僵蚕主要生产条件的优化及其指纹图谱的研究.pdf

捅安 白僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕( b o m b y xm o r il ) 4 5 龄的幼虫感染f 或人 工接种) 白僵菌( b e a u v e r i a ) 而致死的干燥体，早在神农本草经中就 有记载。白僵蚕具有熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效。 本研究对9 株白僵菌( 编号为b l 、b 2 、b 3 、b 4 、b 5 、b 6 、b 7 、b 8 、 b 9 ) 的生物学特性进行了调查，探讨了白僵蚕人工生产条件的相关问题， 分析了白僵蚕抗士的宁惊厥有效成分的提取方法和药效，并在此基础上利 用红外光谱、紫外光谱和高效液相色谱等技术对白僵蚕的指纹图谱进行了 研究。结果如下： l 对分离提纯的白僵菌进行了鉴定，确定其中有2 株为卵孢白僵菌，7 株为球孢白僵菌。对各菌株的生物学特性进行了调查。结果表明：在p d a 培养基上，不同白僵菌的菌落形态存在较大差异。b 1 营养生长( 3 9 1m n v d ) 最快，产孢量( 5 1 2 1 0 8 个c m 2 ) 最高。b l 在p d a 培养基上培养后以1 1 07 个m l 的孢子浓度感染5 龄起蚕，6d 内致死率达到1 0 0 ，和b 2 并 列为最高。以营养生长量、产孢量和致病力等生物学指标进行综合比较筛 选，b 1 为生产白僵蚕的最佳接种菌株。人工生产白僵蚕白僵菌的接种浓 度应在l 1 0 。个m l 孢子以上。 2 以有效成分草酸铵含量为指标探讨了白僵蚕僵死后时间、接种菌 种、生产蚕品种、生产季节等对人工生产白僵蚕质量的影响。结果表明： 白僵蚕僵死后，初期有效成分草酸铵含量随时间的延长而增加，5 d 以后 其含量基本维持在1 0 左右。不同菌株生产的白僵蚕，其体内草酸铵含量 差别很大，b 1 菌株生产的白僵蚕草酸铵的含量最高，达1 0 3 3 。不同蚕 品种生产的白僵蚕，体内革酸铵的含量在7 0 1 8 1 1 之间。春天生产 的白僵蚕体内草酸铵的含量最少，为8 0 1 ，晚秋生产的白僵蚕体内草酸 铵的含量最高，为1 0 1 1 。 3 以对士的宁所致的小鼠惊厥的药效和对小鼠体重的影响为指标，采 用水提、脂提和醇提对中药材白僵蚕有效成分进行提取。结果表明：自僵 蚕6 5 的醇提液对小鼠的抗惊厥作用最好，其次为水提液，脂提液和对照 无明显差别。灌胃白僵蚕不同提取液的小鼠体重都有不同程度的减少，其 中灌胃水溶性提取液的小鼠的体重减少了“8 ，灌胃脂溶性和醇溶性提 v 取液的小鼠的体重分别减少了6 1 和6 o 。从而可知白僵蚕水提对小鼠 的毒副作用较强。综合以上分析认为白僵蚕的有效提取方法为6 5 醇提。 4 采用共有峰率和变异峰率双指标序列法对白僵蚕醇提物的红外光谱 进行分析。结果表明：健康蚕醇提物的红外图谱与自僵蚕的图谱明显不同， 不同品种、不同季节的白僵蚕的图谱相似，但也存在一定差异。白僵蚕醇 提物的红外指纹图谱可以用作鉴别白僵蚕，区别不同品种和季节的白僵蚕 的一种手段。 5 将不同品种、不同季节的白僵蚕及健康蚕的水溶性提取液、脂溶性提 取液和醇溶性提取液用紫外分光光度法在2 0 0 4 0 0 呦波长范围内扫描。 结果表明：白僵蚕醇溶性提取液的紫外指纹图谱最适合用于对白僵蚕进行 鉴别。 6 用梯度洗脱高效液相色谱法 k r o m a s i lc 。柱( 5 岬，2 5 0r a m 4 6 m m ) ，流动相为乙腈一0 2 磷酸缓冲液，检测波长为2 7 0r i m ) 对白僵蚕醇 溶性提取液进行洗脱，对获取的指纹图谱数据进行相似度分析，建立了 白僵蚕的高效液相色谱指纹图谱。以图谱中7 个主要共有峰的相对保留时 间和相对峰面积为白僵蚕指纹图谱的相关技术参数，对1 0 份白僵蚕供试 品测定得出7 个主要共有峰相对保留时间重现性好，但相对峰面积有明显 差别，因此白僵蚕高效液相色谱指纹图谱也可用于评价白僵蚕的质量。 关键词：白僵菌；白僵蚕；指纹图谱；抗惊厥；草酸铵 v a b s t r a c t w 1 l i t em u s c a r d i n es i l k w o r mi s d r yb o d yw h i c hm a d et h r o u g h4 - 5 i n s t a r s i l k w o r mg r u bi n f e c t e db yb e a u v e r i aa n dr e s u l ti nd e a d i tw a sf i r s tr e c o r d e d b ys h e n n o n g b e n c a n g 咖t em u s c a r d i n es i l k w o r mh a sm a n yf u n c t i o n s u c h a sa n t i c o n v u l s i o n ，a n t i c r u o r ，e x p e c t o r a n t i nt h i sp a p e r ，s o m er e l e v a n tp r o b l e m so f b e a u v e r i a ( n o b 1 ，b 2 ，b 3 ，b 4 ， b 5 ，b 6 ，b 7 ，b 8 ，b 9 ) a n dw h i t em u s c a r d i n es i l k w o r mw a sr e v e a l e d f i r s lt h e b i o l o g i c a l c h a r a c t e ro ft h e mw a sr e s e a r c h e d s e c o n d ，p r o b ei n t op r i m a r y m a n u a lp r o d u c e dc o n d i t i o no f w h i t em u s c a r d i n es i l k w o r m t h i r d ，t h ed i s t i l l i n g m e t h o do f a n t i - c o n v u l s i o nc o m p o n e n ta n dr e m e d yi m p a c to f w h i t em u s c a r d i n e s i l k w o r mw a sa n a l y z e d l a s t ，s t u d yt h ec h r o m a t o g r a p h i cf i n g e r p r i n to fw h i t e m u s c a r d i n es i l k w o r mb yi r ，u va n dh p l c t h er e s u l t sa sf o l l o w s ： 1t h eb e a u v e r i aw h i c hh a db e e ns e p a r a t e da n dp u r i f i e dw a si d e n t i f i e d 2 s t r a i n so ft h e mw e r eb e a u v e r i at e n l l aa n d7s t r a i n so ft h e mw e r eb e a u v e l i a b a s s i a n a s o m eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sw e r er e s e a r c h e d t h er e s u l t sa s f o l l o w s ：o np d ac u l t u r em e d i u m ，d i f f e r e n tb e a u v e r i ah a sd i f f e r e n tc o l o n i a l s h a p e t h eg r o w t hr a t eo fb 1s t r a i n w a s3 9 1 m m d i t ss p o r ep r o d u c t i o nw a s 5 12 10 8 c m 2 t h i si st h eb e s ti na 1 1 b yc u l t i v a t e do np d ac u l t u r em e d i u m b 1s t r a i nu s e d1 1 07 u n i t m ls p o r e st oi n f e c t5 i n s t a rs i l k w o r mg r u b i n6d a y s ， t h el e t h i f e r o u sr a t ew a s1 0 0 i ti st i p t o pa sb 2s t r a i n i n t e g r a t e dc o m p a r e ，w e f i l t r a t e ds t r a i n st h r o u g hg r o w t hr a t e ，s p o r ep r o d u c t i o n ，d e a d l ya b i l i t y b 1i st h e b e s ts t r a i nt oi n o c u l a t es i l k w o r m m a n u a lp r o d u c e dt h i c k n e s so fb e a u v e r i ao n w h i t em u s c a r d i n es i l k w o r mi s1x10 7 m ls p o r e so rm o r e 2t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r st ow h i t em u s c a r d i n es i l k w o r m ，s u c ha st i m e ， s t r a i n ，v a r i e t i e s o fs i l k w o r m ，s e a s o nw e r es t u d i e dt h o u g ht h ec o n t e n to f ( n h 4 ) 2 c 2 0 4 t h er e s u l t sa sf o l l o w s ：w h i t em u s c a r d i n es i l k w o r mw a sd e a da s m u t t o n ，e f f e c t i v ec o m p o n e n t ( ( n h 4 ) 2 c 2 0 4 ) w o u l di n c r e a s e dw i t ht h et i m ei n e a r l yd a y s a f t e rt h e5d a y s ，t h ec o n t e n to f ( n h 4 ) 2 c 2 0 4k e p ta b o u t l 0 t h e c o n t e n to f 州h 4 ) 2 c 2 0 4i nw h i t em u s c a r d i n es i l k w o r mw h i c hm a d eb yd i f f e r e n t s t r a i n sw a sv e r yd i s s i m i l a r t h ec o n t e n tw a st i p t o pb yb is t r a i n ，w a s1 0 3 3 v i t h ec o n t e n to f ( n h 4 h c 2 0 4i nw h i t em u s c a r d i n es i l k w o r mw a s7 0 1 8 1 1 b yd i f f e r e n tv a r i e t i e so f s i l k w o r m n l ec o n t e n to f f n h 4 ) 2 c 2 0 4i nw h i t e m u s c a r d i n es i l k w o r mw a s8 0 1 i ns p r i n ga n d1 0 1 1 i nl a t ea u t u m n 3t h eb e s td i s t i l l i n gm e t h o dw a se n s u r e db yg u i d el i n eo fa n t i c o n v u s a n a n da v o i r d u p o i se x p e r i m e n to nm i c e t h ew h i t em u s c a r d i n es i l k w o r mw a s e x t r a c t e d b yw a t e r ，f a ta n de t h a n 0 1 t h er e s u l t s a sf o l l o w s ：t h ew h i t e m u s c a r d i n es i l k w o r mt h a td i s t i l l e db y6 5 e t h a n o li st h eb e s t ，w a t e ri st h e s e c o n d f a ti ss i m i l a rt oa n t i t h e s e s t h ea v o i r d u p o i so fm i c et h a tt a k e m e d i c i n e sh a sl e s s e n e dw i t hd i f f e r e n td e g r e e i tr e d u c e d11 8 t h a tt r e a t e d w i t hw a t e r jf a tr e d u c e d6 7 a n de t h a n o lr e d u c e d6 0 刀瑚s t h ew h i t e m u s c a r d i n es i l k w o r mt h a td i s t i l l e db yw a t e rw a sb a dt om i c e i n t e g r a t e d a n a l y s i s ，6 5 e t h a n o li st h eb e s td i s t i l l i n gm e t h o d 4t h ee t h a n o le x t r a c t so fw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r mw e r es t u d i e db y i n f r a r e d s p e c t r o m e t r y ，a n d t h e s p e c t r a w e r e a n a l y z e db ym e a n so ft h e s e q u e n t i a la n a l y s i si nw h i c ht w oi n d e x e s ，c o m m o np e a ka n dv a r i a n tp e a kr a t i o ， w e r ea p p l i e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h ed i f f e r e n c e so ft h es p e c t r ao ft h e e t h a n o le x t r a c t so fw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m sa n dw e l l l i v i n gs i l k w o r m sw e r e d i s t i n c t t h es p e c t r ao f d i f f e r e n tb r e e d sa n ds e a s o n sw e r ec o n f o r m e d 、v i t f le a c h o n h e r ，b u taf e ws m a l ld i f f e r e n c e se x c e p t i n f r a r e ds p e c t r o m e t r yh a sp r o v e dt o b e g o o d f o rt h ei d e n t i f i c a t i o no fw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m sa n d d i f f e r e n t i a t i o no f w h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m so f d i f f e r e n tb r e e d sa n ds e a s o n s 5f r a c t i o n se x t r a c t e db yw a t e r ，f a ta n de t h a n o lo f w e l l l i v i n gs i l k w o r m s a n dw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m so fd i f f e r e n tr a c e sa n dr e a r i n gs e a s o n sw e r e s c a n n e df r o m2 0 0n nt o4 0 0r n nw i t hu l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r y t h e r e s u l t ss h o wt h a tt h eb e s ti d e n t i f i e dm e t h o do fw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m w a su l t r a v i o l e tf i n g e r p r i n ts p e c t r ao fe t h a n o le x t r a c t s 6g r a d i e n te l u t i o nh p l c k r o m a s i lc i s ( 5 9 m ，2 5 0 x 4 6 n u n ) a n dw i t h d e t e c t i o na t2 7 0 n m ，g r a d i e n tm o b i l e s y s t e m w a s a p p l i e d w i t h a c e t o n i t r i l e p h o s p h o r i c 】w a su s e dt oa n a l y z ec a r b i n o l e x t r a c t sf r o mw h i t e m u s c a r d i ns i l k w o r m w ea n a l y z e dt h ed a t eo ft h e i rf i n g e r p r i n t sb ys i m i l a r i t y v i l l o fr a n g e f i n g e r p r i n to fw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r mw a se s t a b l i s h e d t h e c o r r e l a t i o nt e c h n i c a lp a r a m e t e r so fw h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m 1 er e t e n t i o n t i m ea n dp e a k s ，a r e ao fs e v e nm a i nc o m m o np e a kw e r eo b t a i n e d f i n a l l yt h e s a m p l e so fw h i t em u s c a r d i ns i ! k a v o r mf r o mt e n b a t c h e sw h i t em u s c a r d i n s i l k w o r mw e r ea n a l y z e d i tw a ss h o w e dt h a tt h er e p e a t a b i l i t yo ft h er e l a t i v e r e t e n t i o nt i m e sw a sg o o df o rt h em a i nc o m m o np e a ka n dt h er e l a t i v ep e a k a r e a sh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s t h ef i n g e r p r i n tc a nb eu s e dt oe v a l u a t et h e q u a l i t yo f w h i t em u s c a r d i ns i l k w o r m k e yw o r d s ：b e a u v e r i a ；w h i t em u s c a r d i n es i l k w o r m ；c h r o m a t o g r a p h i c f i n g e r p r i n t ；a n t i - c o m n a l s i o n ；斛i - 1 4 ) 2 c 2 0 4 英文缩写说明 英文中文说明 c e n t i m e t e r厘米 s q u a r ec e n t i m e t e r平方厘米 c e n t i m e t e r l波数 d a y天 g r a m克 g r a mp e rk i l o g r a m每千克克数 g r a mp e rm i l l i l i t e r每毫升克数 h o u r小时 m i n u t e分钟 m i l l i l i t e r毫升 m i l l i m e t e r毫米 m i l l i g r m a ap e rk i l o g r a m 每千克毫克数 m i l l i m e t e r p e r d a y 每天毫米数 m o l ep e rl i t e r每升摩尔数 m i l l i l i t e rp e rm i n u t e每分钟毫升数 n a n o m e t e r纳米 o p t i c a ld e l ns i t y 吸光度值 r o t m dp e rm i n u t e每分钟转数 s e c o n d秒 m i c r o g r a mp e rg r a m每克微克数 m i c r o l i t e r微升 m i c r o n微米 鹣玉h吕。 。啦舭h疵 血 一 哦一一一 m 岬。 眺肚 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人和集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位的全部和部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或其他的复制手段保存论文和 汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：至虐鬟2 导师签名：彝三兹一 日期：o o ，5 ，f f 山东农业大学硕士学位论文 引言 1 研究进展 1 1 白僵菌相关问题的研究进展 白僵菌属( b e a u v e r i a ) 是虫生真菌中最重要、最常见的属之一，属于 半知菌亚门( d e n t e r om y c o t i n a ) 丝孢纲( h y p h o m y c e t a l e s ) 丛梗孢目 ( m o n i l i a l e s ) 丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) ，是研究和应用最为广泛的真菌 菌属之一( 金伟，2 0 0 0 ) 。白僵菌对寄主昆虫致病力强，寄主广泛，在害 虫生物防治中特别受到重视( 李增智，1 9 8 8 ) 。此外，自僵菌在环保、医 药、食品和基础生命科学的研究中也发挥了重大作用( 董宏平，1 9 9 9 ；方 详年，2 0 0 1 ) 。 1 1 1 白僵菌在分类学上的研究进展 意大利学者b a s s i d e l o d 于1 8 3 5 年通过多次实验，证实家蚕的白僵病是 一种真菌在家蚕体内外增殖的结果，该菌由b a l s a m o 首先定名为自僵菌属 ( 李宏科，1 9 9 6 ：李运l 睢，1 9 8 2 ) 。自白僵菌属从葡萄孢属( b o o y t i s ) 分离 出来成为独立的属以来，其分类学位置经历了较大的变化。我国对该属的 分类基本延用m a c l e o d ( 1 9 5 4 ) 分类方法，按分生孢子的形态分为球孢自 僵菌和卵孢白僵菌两个种。球孢白僵菌有5 0 球形孢子，而卵孢白僵菌有 9 8 的卵形孢子( 胡巍，1 9 9 8 ) 。根据上述方法，m a c l e o d 将已报道的3 2 种白僵菌中的9 个种合并为球孢白僵菌 b e a m ，e r i a b a s s i a n a ( b a l s ) v u i l l 】， 5 个种合并为卯孢白僵菌 b e a u v e r i a t e n l l a ( d e l a c r ) s i e m ：常称布氏白僵 菌，且b p o n g n i a l t i i ( s a c c ) p e t c h ；或称纤细白僵菌 ，其余的种均被排除于 此属之外( 金伟，2 0 0 0 ) 。 目前，对白僵菌属的分类不仅拓宽了形态指标，而且还引入了生理生 化指标。形态指标包括孢子的形态、菌丝生长特征、菌落及孢子的颜色、 孢子形成器的特征等几方面。林华峰( 1 9 9 6 ) 根据自僵菌形态、质地、颜 色、长势等特征将其分为粉末型( 孢子型) 、绒絮型( 菌丝型) 、毛毡型 ( 弱菌丝型) 、相间型( 混合型) ，并描述了不同培养阶段菌落的特征以 及不同培养条件下菌落形态的变化，并且根据酯酶同工酶图谱将3 8 个供 中药千才白僵蚕主要生产条件的优化及其指纹闰谱的研究 试菌株化分为了1 0 个酯酶型。胡巍( 1 9 9 8 ) 对白僵菌的6 个属进行了形 态学上的描述，认为对白僵菌属的鉴定，应以形态学为主，但需兼顾生理 生化指标，才能使分类更科学更准确。目前，在这方面，有人尝试着用营 养特征( 利用碳源能力) 、同工酯酶谱分析、酶活性分析、血清学反应、 d n a 限制性酶切片断电泳分析等多种生理生化指标进行分类，这大大提 高了分类的可靠性。 1 1 2 白僵菌生物学特性的研究进展 在对白僵菌菌株进行筛选时，其生物学特性是关键。常常以产孢量、 培养性状、孢子活力等生物学特性作为优选的指标。孙继美等( 1 9 9 6 ) 用 不同培养基对不同白僵菌菌株的菌丝生长量、产孢量、孢子萌发情况以及 孢子在不同湿度下储存的发芽率、抗紫外照射能力等方面进行了试验，结 果表明：菌丝生长快的反而产孢量低，或不产孢：在湿度大的地方储存发 芽率低，干燥储存发芽率高：经紫外线照射处理后，菌落生长缓慢。张永 军( 2 0 0 1 ) 等对3 株球孢白僵菌在不同温度、p h 值和培养基上培养，结 果表明三者的最适生长温度在2 5 3 0 间，p h 在4 o 6 0 生长较好，适 量的蛋白胨或酵母浸膏可促进菌株的生长，但对葡萄糖和麦芽糖的利用能 力没什么差别，三者在p p d a ( p d a 添加1 0 9 l 的蛋白胨) 、s d a y s d a ( 萨 氏培养基) 添加酵母浸膏1 0 9 l 、s m a y ( s d a y 中用麦芽糖代替葡萄糖) 培养基上生长良好，生物测定表明3 菌株都具有较强的毒力，但最适剂量 略有差别。冯明光( 1 9 9 8 ) 通过测定1 7 株不同来源球孢白僵菌的胞外蛋 白酶活性和酯酶活性及其毒力，分析了用酶活性作为毒力指标的可靠性。 黄运霞( 】9 8 8 ) 试验证明：不同生长时期、不同培养条件的白僵菌孢子毒 力有一定差异。 1 2 白僵蚕研究进展 白僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕( b o m b y xm o r il ) 4 5 龄的幼虫感染白僵 菌( b e a u v e r i a ) 而致死的干燥体，作为中药材首载于神农本草经，又 名天虫、天蚕。迄今，单方或配伍能用于数十种疾病的防治与治疗。长期 以来，许多学者对白僵蚕的生产技术、质量控制、活性成分、药理作用、 临床应用等方面进行了深入的研究。 山东农业大学硕士学位论文 1 2 1 白僵蚕人工生产加工研究进展 根据前人在生产白僵蚕上总结出来的经验，可以把白僵蚕生产分为以 下几步：按常规方法进行家蚕饲养一直到四眠，期间进行严格的消毒工作； 养蚕期间进行菌种的制各，在家蚕5 龄饷食前，将菌种配制成一定浓度的 菌悬液均匀喷在蚕体上；保持一定的温度、湿度，按常规方法饲养；待家 蚕僵死后，及时挑出让其发僵，然后烘干或晒干：放入锅中陧火麸炒，待 微黄时出锅，过筛，冷却包装即为成品( 周学毛，1 9 9 8 ；林萍，2 0 0 4 ) 。 加工工艺上，现行方法一般为麸炒法。麸炒的目的主要是矫嗅矫味， 减少对胃的刺激，并增强化痰散结功能( 阎汝南，1 9 9 6 ) 。为了提高白僵 蚕的质量，有人在馒火麸炒的基础上进行了改进。刘杰( 2 0 0 0 ) 经过反复 研究发现麸炒白僵蚕时，加入9 5 的医用酒精，可去除白僵蚕上的蚕丝， 效果极好。高继红( 1 9 9 7 ) 发现用姜汁伴麸炒白僵蚕效果更好。沈烈行等 ( 1 9 9 5 ) 分析研究了生制、麸炒和清炒三种不同的炮制方法，结果表明清 炒法和麸炒法其成品收率无显著差异，而三种炮制品水溶性浸出物含量以 清炒品含量最高，麸炒品次之，生品最低。 1 2 2 白僵蚕质量控制研究进展 目前白僵蚕质量控制主要采用性状鉴定、显微鉴定、理化鉴定和薄层 鉴定四种方法： 性状鉴定蚕虫体类圆柱形，多弯盐皱缩。长2 - - 5c m ，直径0 5 o 7 o n l ，表面灰黄色，背有白色粉霜状的气生菌丝和分生孢子，头部较圆， 黄棕色，足8 对，体节明显，尾部略呈二分歧状；质硬而脆，易折断，断 面平坦，外层白色，中间有亮棕色或亮黑色丝腺环4 个；气微腥、味微咸 ( 姚少威，1 9 9 7 ) 。 显微鉴定将白僵蚕粉碎成粉末状，在显微镜下观察，可以看到草酸 钙结晶体存在于丝腺环内，多已破碎，呈不规则块状或多面体形块状，棱 角有时明显，大小不等，直径1 7 1 7 0l l m 。白僵菌的分生孢子占多数， 白色，球形至卵形，直径2 5 4 5g m 。虫体表面碎片易见，呈不规则块 状，边缘不整齐，淡黄色，表面可见许多白僵菌的分生孢子附着。气管组 织已成碎片，呈不规则方形或长方形，2 0 x 7 0 4 0 1 3 1p m 。内膜明显地 呈螺纹增厚，增厚的条纹呈棕黑色，粗2 5 3 5p m 。刚毛少见，黄色或 中药材白僵蚕主要生产条件的优化及其指纹图谱的研究 黄棕色，较粗大，直径1 0r a m 左右，长1 1 4 1 4 2r a m ，壁较厚。表皮组织 表面具有网络状皱缩纹理以及纹理突起形成的小尖突，有圆形小窝( 赵启 友，1 9 9 8 ) 。 理化鉴定取白僵蚕酸性乙醇提取液( 1 ：7 ) 1m l ，于荧光灯下观察， 溶液呈鲜紫色；取白僵蚕酸性乙醇提取液( 1 ：7 ) lm l ，加1 三氯化铁乙 醇溶液1 2 滴，溶液呈黄绿色：取白僵蚕甲醇提取液( 1 ：7 ) lm l ，加入 浓盐酸4 5 滴及少量锌粉，在沸水中加热3 0 m i n ，溶液呈红色。 薄层鉴别取白僵蚕粉末o 1g 加水1 0 m l ，冷浸2 4h ，过滤，滤液 分别点于同一新华层析滤纸上，以正丁醇：冰醋酸：水( 4 ：1 ：5 ) 为展开剂展 开，在层析缸中饱和2h 后展开，展距1 9 9c m ，快速干燥后用显色剂喷 雾显色，得出5 个斑点( 胡大泽，2 0 0 3 ；苗明三，2 0 0 0 ) 。 1 2 3 白僵蚕活性成分研究进展 张龙翔( 1 9 8 1 ) 测得白僵蚕的主要化学成分为：水分1 1 7 5 、灰粉 3 7 4 、脂肪4 1 4 、总糖8 2 6 、蛋白质6 4 7 3 ，在白僵蚕的挥发油中 含有1 7 0 种化学物质，含量最高的是5 ，6 一二氢一2 ，4 ，6 一三甲基一4 h 1 ，3 ， 5 一二噻嗪，分子量为1 6 3 ( 李东生，2 0 0 3 ) 。现将己经探明的成分及检测 方法综述如下： 草酸铵和有机酸白僵蚕体表的白粉中含有草酸铵，大家公认草酸铵 为白僵蚕体内的抗惊厥有效成份( 中国医学科学院药物研究所药理室与植 化神经室，1 9 7 8 ) 。丁亚平等( 1 9 9 7 ) 以高锰酸钾为滴定剂，用示波器指 示终点，在酸性介质中直接测定白僵蚕体内活性成分草酸铵的含量。白僵 菌在侵入的家蚕幼虫代谢过程中产生草酸、柠檬酸等有机酸。有机酸可以 通过消弱表皮蛋白质分子问的化学键，从而参与表皮的溶解。草酸可与表 皮中的钙相互作用，使表皮更容易被蛋白质或其它水解酶降解( 董宏萍， 1 9 9 9 ) 。 蛋白质、脂肪和酶在对白僵蚕的蛋白质作用研究中，发现其蛋白质 有刺激肾上腺皮质的作用。李振荣等( 1 9 8 5 ) 用纸层析的方法检测白僵蚕 水煎剂，以正丁醇：冰醋酸：水( 4 ：1 ：5 ) 作展开剂，o 5 的茚三酮丙酮溶液 喷雾显色，显5 个斑点。白僵蚕体内脂肪中含有不饱和必须脂肪酸( 油酸、 亚油酸和亚麻酸) ，溶有大量的酯溶性维生素。自僵菌含有甾体c 【一羟基 山东农业大学硕士学位论文 化酶系，有抑癌活性，可以合成类皮质激素( c o r t i c o i d s ) ( m i k h a i l o v v ， 1 9 9 2 ；z e ms k o ve ，1 9 9 2 ) 。王成树研究发现白僵菌至少能分泌3 种水解 酶：脂酶、蛋白酶和壳脂酶，能加快穿透受感染幼虫表皮的时间( 2 0 0 1 ) 。 家蚕发白僵病后期，在体液内生成热不稳定物质，主要成分是一些对蚕体 有毒的蛋白酶。 氨基酸白僵蚕体内含有1 7 种氨基酸，富含人体必须氨基酸。其中甘 氨酸含量最高，其次是丙氨酸、丝氨酸、酪氨酸和谷氨酸，精氨酸含量最 低( 卫功庆，1 9 9 5 ) 。它们对神经功能障碍、昏迷等病症均有很好的治疗 作用。 核苷、碱基类李伟等( 1 9 9 6 ) 将白僵蚕用水超声提取后，利用c 。柱 反相高效液相色谱法测定了提取液中的尿嘧啶、尿苷、黄嘌呤、次黄嘌呤 含量。这些核苷、碱基在生物遗传中起重要的作用，为白僵蚕的质量控制 提供了一种方法。此外，自僵蚕中还含有核酸，它是人类基本营养物质之 一。 白僵菌素白僵菌能分泌多种低分子量的毒素。其中白僵菌素有两种， 即白僵菌素i ( b e a u v e r i c i n ) 和白僵菌素i i ( b a s s i a n o l i d e ) ，属于环状多 肽类相似物。前者是由h a m i ! 首次从球孢自僵菌的菌丝体中提取到的，是 一个环状三羧酸肽，其单体为( l ) 一n 甲基苯丙氨酸( d ) 一羟基异戊酸， 分子式为c j h n 。瓯，分子量为7 8 3 。该毒素为白色针状晶体，熔点9 3 9 4 ，耐热，较稳定，在1 0 0 下保持1h 仍具有毒性，可致细胞核变形， 组织崩解( 李建庆，2 0 0 3 ) 。白僵菌素i i 是s u z u k i 分离到的，是一种环 状四羧酸肽，其单体为( l ) 一n 一甲基异亮氨酸一( d ) 一一羟基异戊酸，分子 式为c 。h m n 一0 m 分子量为9 0 8 ( 方志刚，2 0 0 1 ：武艺，1 9 8 8 ) 。杀菌试验 表明：自僵菌素对革兰氏阳性菌、霉菌、绿脓杆菌等具有明显的抑制作用， 对海洋生物呈剧毒，对蚊子幼虫等有中等强度的抑制作用，对家蚕有明显 的毒性( 王金华，2 0 0 3 ) 。 维生素白僵蚕体内富含多种维生素，如胡萝h 素、核黄索、生育酚 和视黄素等都高于谷物类食物。 中药材白僵蚕主要生产条件的优化及其指纹图谱的研究 微量元素在1 9 8 9 年和1 9 9 1 年各有一篇白僵蚕的微量元素测定的报 道。白僵蚕体内的微量元素以钙、磷、镁含量最高( 王居详，1 9 9 9 ) 。详 见表1 。 表1 白僵蚕微量元素含量 t a b l e i t h ec o n t e n t o f m i c r o e l e m e m i n w h i t e m u s e a r d i n e ( o g g g ) 元素胡氏测定 崔氏测定元素胡氏测定崔氏测定 e l e m e m t m e n s u r a t e db yn e n s u r a t e db ye l e m e n tm e n s u r a t e db ym e n s u r a t e db y h uc u i h u c u i a l08 60 1 0 5 9t i-000360 b a01 1 200 0 2 2 u-000010 c a9 8857 0 2 ly-000007 c d 0 0 0 2 5 z n0 7 200 3 8 0 c o 00 0 4 - k2 4 6 c r00 0 30 0 1 3 4 h g 00 0 1 一 c u0 0 8 8o 0 2 9 8 6s e 0 0 0 0 5 f eo8 4o0 4 2 9 s n 0 0 1 5 m g 2 7 62 5 5 3 0a s00 0 2 6 m n01 600 0 9 8 b e 0 0 0 0 3 m o 00 0 3 00 0 0 3b i 0 0 1 5 n i 00 0 50 0 0 0 0 7s b o0 0 1 p6 8 146 7 3 4 b 00 4 p b 00 3 3 - v 00 0 3 s r 01 500 0 7 5s i 8 3 4 注：为1 9 8 9 年胡乇清等测定；为1 9 9 1 年崔国叫等测定 n o t e ：b em e n s u r a t e db yh uy u qj n gr b en l e n s u l a t e db yc u ig u o y i n 微量元素中有6 种元素为人体所必需的，它们是f e 、z n 、c u 、c r 、m n 、 n i 。这些微量元素对人体生长发育及各器官各组织的正常运转都具有重要 的作用，如z n 是人体近百种酶的激活剂，且能促进r n a 、d n a 和胰素的合 成：f e 是血红素和肌红蛋白所必需的成分；m n 是骨骼的正常发育所必需 的成分等( 殷志琦，2 0 0 4 ) 。 其它在白僵蚕表皮中还含有大量几丁质，白僵蚕体内含有变态活性 激素、促蜕皮甾酮、3 羟基犬尿素等多种物质。其醇提物体外可抑制人体 肝癌细胞的呼吸。白僵蚕中的过氧麦角固醇和一羟基胆固醇有体外抗肿瘤 的作用。殷志琦等( 2 0 0 4 ) 应用硅胶柱层析和重结晶的方法进行分离、纯 6 山东农业大学硕士学位论文 化白僵蚕体内的化学成分并应用谱学方法进行了鉴定，结果分离并鉴定出 了7 种化合物，其中6 种成分为首次从白僵蚕中分离得到。 1 2 4 白僵蚕药理作用研究进展 对自僵蚕的药理研究始于2 0 世纪7 0 年代后期( 李清临，2 0 0 1 ) 。现 将研究成果总结如下： 抗惊厥作用用1 0 0 的水煎剂2 2 5e j k g 灌胃能对抗士的宁诱发的小 鼠强直惊厥，1 0 2 0g 时对电休克、戊四氮和咖啡因引起的惊厥无明显作 用( 邢少华，1 9 9 0 ) 。汤化琴( 1 9 9 2 ) 研究表明白僵蚕与氯化铵具有同样 的对抗士的宁所引起的小鼠惊厥作用。白僵蚕体内含有大量的草酸铵是其 抗惊厥作用的主要成分，除去草酸铵则抗惊厥作用消失。此外，临床应用 上还证实草酸铵对癫痫大发作有效( 黄海英，2 0 0 3 ) 。 抗凝作用自僵蚕提取液在体内、外均具有较强的抗凝作用。在体外 对凝血酶时间( t t ) 、凝血酶原时间( p t ) 和凝血活酶时问( k p t t ) 均 具有明显的延长作用，每克生药分别相当于1 0 8 、1 3 4 7 和1 4 5 0 单位肝 素。体内试验注射白僵蚕提取液的小鼠所有凝血指标均明显延长，且作用 持久。提取的抗凝血因子x a 的活性远高于抗凝血酶活性，性质更接近低 分子量肝素。其活性的表达不依赖于抗凝血酶i i i ( a t i i i ) ，x a 成分不属 于糖、蛋白质和生物碱类，推测其抗凝成分可能与水蛭素一样系一种肽类 或其它含氨基化合物。研究还发现，对模型动物静脉注射白僵蚕液后，其 血栓重量明显减轻，纤溶酶原含量、纤维蛋白原含量、优球蛋白溶解时间 明显减少，同时激活部分凝血活酶时问( k p t t ) 、凝血酶原时间( p t ) 、 凝血酶时间( t t ) ，说明白僵蚕具有促纤溶活性( 黄海英，2 0 0 3 ：彭延 古，2 0 0 1 ) 。 抗生育毛晓健( 2 0 0 2 1 进行了白僵蚕对小鼠抗生育的研究，结果表 明：白僵蚕能显著降低雌性小鼠卵巢、子宫重量及妊娠率：增加雄性小鼠 睾丸、贮精囊的重量，高剂量作用尤为明显。 催