（法医学专业论文）hif1α、igf1与脑损伤时间关系的实验研究.pdf

山西医科大学顼士学位论文 h i f 1 a 、i g f 1 与脑损伤时间关系的实验研究 摘要 目的：探讨大鼠脑损伤后低氧诱导因子一1 a 和胰岛素样生长因子一l 表达的变化规律，旨为 法医病理学中脑损伤时间的推断提供科学的参考依据。 方法：健康成年w i s t a r 大鼠7 2 只，体重( 2 5 0 _ + 1 0 ) g ，雌雄不限，随机分为对照组、假 手术组、伤后2 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、2 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 、1 4 d 组，每组6 只。参照f e e n e y s 法建立大鼠脑损伤模型，在伤后各时间点灌流固定处死大鼠，矢状面取材。通过h e 染色 和冰冻切片免疫组织化学法( s a b c 法) 对各组h i f - l a 、i g f - 1 蛋白的表达进行检测，用 b i 一2 0 0 0 图像分析系统测定阳性反应物平均灰度，用s p s s l l 5 统计软件进行统计学处理。 结果：正常对照组神经细胞偶见h i f - l a 表达，i g f - i 表达呈弱阳性。脑损伤后h i f - i a 和 i g f 1 的表达主要位于大脑皮质、脑干和海马的神经元细胞和神经胶质细胞中，并以神经 胶质细胞为主，各部位变化趋势基本一致。伤后2 h 损伤区周围神经细胞可见h i f 1 a 蛋白 阳性表达增加，6 h 后表达明显增强，2 4 h 达高峰，随后阳性反应细胞逐渐减少，7 d 后仍可 见少量表达，1 4 d 后恢复( 与对照组比较p = 现0 5 3 ) ；损伤后6 h 可见i g f - 1 蛋白表达增加， 损伤后1 2 hi g f - 1 表达显著增加，伤后3 d 达到峰值。此后逐渐回落，伤后1 0 d 表达仍高 于对照组( p 移0 1 ) ，伤后1 4 d 基本恢复正常( 与假手术组比较p 钮0 6 ) 。损伤组与对 照组及各相邻损伤组之间比较有统计学差异伊 移0 5 ) 。 结论：脑损伤后h i f - i a 、i g f l 蛋白的表达具有一定的时间规律性，可望运用于法医学推 断脑损伤时间。 关键词：低氧诱导因子一i a ，胰岛素样生长因子一1 ，法医学，脑损伤时问 山西医科大学硬士学位论文 s t u d yo ft h er e l a t i o nb e t w e e nh i f - l ao ri g f - 1e x p r e s s i o n s a n db r a i ni n j u r yt i m e a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ee x p r e s s i o no fh y p o x i ai n d u c i b l e f a c t o r - 1 c t 、i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - ia n dt h eb r a i ni n j u r yt i m ea f t e rc e r e b r a lc o n t u s i o n m e t h o d s ：7 2w i s t a rr a t sw 眦d i v i d e dr a n d o m l yi n t o3g r o u p s ：n o r m a lc o n t r 0 1 s h a mo p e r a t i o n a n di n j u r yg r o u p t h er a t so fi n j u r yg r o u pw e r et h e ns u b d i v i d e di n t o2 、6 、1 2 、2 4 ha n d2 、3 、 5 、7 、1 0 、1 4 da f t e ri n j u r y ae x p e r i m e n t a ls e v e r ec e r e b r a lc o n t u s i o nm o d e lw a se s t a b l i s h e d ，u s i n g s a b ci m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o da n dc o m p u t e ri m a g ea n a l y s i s ，t h ee x p r e s s i o no fh i f l a 、 i g f - 1p r o t e i ni nd i f f e r e n tt i m ea f t e rb r a i n 面u r yw e r ev a l u e d r e s u l t s ：t h ee x p r e s s i o no fh i f h xc a l lb ef o u n do c c a s i o n a l l yi nn o r m a ln e u r o n s 砒t h ec e r e b r a l c o r t e xo fc o n t r o lg r o u p ，i n c r e a s e da t2 ha f t e rc e r e b r a lc o n t u s i o ni nr a t s ，a n dk e p ti n c r e a s i n gw i t h t h ep r o l o n g a t i o no fi n j u r yt i m e ，r e a c h e dt h em a x i m u ml e v e la t2 4 hw i t hah i g l ll e v e lt i l l7 d p o s t - i n j u r y t h ee x p r e s s i o no fi g f 1p r o t e i nc o u l d b ed e t e c t e df a i n t l ye x p r e s s e d i nm o s tn e u l o n s a tt h ec e r e b r a lc o r t e xo fc o n t r o lg r o u p ，i n c r e a s e da t6 ha f t e ri n j u r ya n dp e a k e da t3 di nc o r t e x ， h i p p o c a m p u sa n d b r a i ns t e m t h ei n t e n s e l ys t a i n e dc e l l sp e r s i s t e di nah i g hl e v e la f t e r7d a y s ， a n ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ( p 0 0 5 ) e v e np r e s e n t e db e t w e e nc o n t r o la n dl o dp o s t - i n j u r y a t1 4 d t h ee x p r e s s i o no fh w l 啪di g f 一1 p r o t e i nr e t u r n e dn o r m a l s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e si n h i f - l o a n di g f 一1p r o t e i nw e r ep r e s e n tb e t w e e nc o n t r o lg r o u pa n de x p e r i m e n t a lg r o u p s ( p o 0 5 ) c o n c l u s i o n ：e x p r e s s i o no fh i f i a a n di g f li sc o r r e l a t e dw i t l lp o s t - t r a u m a t i ci n t e r v a l sa f t e r c e r e b r a lc o n t u s i o ni nr a t s ，s u g g e s t i n gt h a tt h ee x p r e s s i o no fh i f l aa n di g f 一1m a yb es e r v e da s t h em a r k e r sf o rt i m i n go fb r a i nc o n t u s i o ni nf o r e n s i cp r a c t i c e k e yw o r d s ：h y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o r l i t ，i n s u l i n - l i k eg r o w t hf a c t o r - 1 ，f o r e n s i cm e d i c i n e ，b r a i n m j u r yt i m e n 山西医科大学颈士学位论文 刖 青 颅脑损伤是法医实际工作中最重要的损伤和最常见的死因之一。随着经济的发展、社 会的转型及各种利益冲突的加剧。刑事犯罪中颅脑损伤的案例逐年上升，颅脑损伤后不同 时间细胞形态学变化及分子生物学表现是法医学的重要研究课题。在各种原发性脑损伤致 死案例中，闭合性脑损伤是最常见和最主要的死因。即使是“轻度”的脑损伤也能因发生 于脑干或继发弥漫性脑水肿和脑疝形成而死亡。此时脑损伤的病理形态学改变轻或不明 显，不容易与非脑外伤伴发的渗出性出血和死后人为现象相鉴别而致使鉴定困难或引起争 议。同时脑损伤早期损伤经过时间的判断对先后受多人致伤头部而死亡的案例，在司法审 判时要求确定不同人的因果关系或责任关系有着重要意义。故对闭合性脑损伤进行损伤时 问的推断已成为现实的迫切需要，准确的时间推断可为侦查提供线索，为审判提供证据， 是法医尸体检查中首要解决的问题。 目前推断脑损伤时间主要用免疫组织化学、原位杂交、逆转录聚合酶链反应( r t _ p c r ) 、 实时荧光定量p c r 等方法定性定量探讨脑损伤后一些蛋白质及其m r n a 的表达与时间变化 的规律性。这些被研究的蛋白包括：c - f o s 和c - j u n 蛋白、b a x 蛋白、b c l - 2 和f a s - l 蛋白、热 休克蛋白7 0 ( h s p 7 0 ) 、纤维连接蛋白( f n ) 、胶质纤维酸性蛋白( g f a p ) 、s - 1 0 0 蛋白、 波形蛋白( v i m ) 、载脂蛋白e 等及其相应的m r n a 表达情况；神经生长因子( n g f ) 、胶质 源性神经营养因子( g d n f ) 、神经营养因子( m r f s ) 、成纤维细胞生长因子( f g f ) 、转化 生长因子( t g f ) 、血小板衍生生长因子、凋亡调节因子c a s p a s e 一3 、核转录因子n f - r b 等细 胞因子及其受体的表达变化；还有，一氧化氮合成酶( n o s ) 、烯醇化酶( n s e ) 、环加氧酶 c o x 一1 和c o x 一2 等。现已证明在脑损伤后上述蛋白及其m r n a 、细胞因子及其受体的表达 均增强，并有一定的时间性变化，进一步的研究有可能将它们用作脑损伤经过时间的推断。 目前利用人体尸检材料的研究较少，仅见少数脑损伤尸检材料星形胶质细胞( a s t ) 、s 一1 0 0 蛋白及g f a p 的研究。生物芯片是近十年发展起来的根据生物分子间特异相互作用的原理， 将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对d n a 、r n a 、多肽、蛋白质以及其它生物成 分的高通量快速检测。它可以同时、快速、重复地检测基因组范围的众多基因在m r n a 表 达水平的变化。应用这种新技术有可能使脑损伤的研究上升到一个新水平“】。 推断脑损伤时间，要解决两个问题，一为损伤发生于生前或死后的问题；一为损伤后 存活时间的问题。传统方法主要是以损伤后脑组织病理形态学改变为依据：早期表现为脑 组织出血、挫碎、神经细胞肿胀、变性、胞核浓缩、突触减少，逐渐发展为神经元坏死、 胞核溶解、挫伤灶液化等。在实际工作中具有很大的主观性和不精确性。随着现代分子生 物学技术的广泛应用，探索更客观和更精确的闭合性脑损伤时间推断正成为研究的热点。 本研究通过h i f l a 和i g f - 1 免疫组化染色观察结合计算机图像分析技术分析脑损伤后大脑 皮质、脑干和海马等部位的细胞形态学变化，研究h i f 1 a 和i g f - 1 与脑损伤后经过时间的 关系，分析其变化规律，旨为脑损伤的法医学鉴定及损伤经过时间的推断提供参考。 山西医科大学硬士学位论文 1 1 主要仪器试剂 第一章材料与方法 1 1 1 主要佼器 大鼠脑立体定位仪北京硕林苑科技有限公司 b i 2 0 0 0 图像分析系统成都泰盟科技有限公司 自动磨刀机( m d j - 4 b )天津航空机电公司 l e i c ac m l 8 5 0 型冰冻切片机德国l e i c a 公司 电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司 海尔b c d - 2 6 8 低温冷冻冰箱青岛海尔集团有限公司 格兰氏1 7 升机械型微波炉广东格兰氏集团有限公司 电热恒温干燥箱湖北省黄石市医疗器械厂 1 1 2 实验动物与主要试剂 健康成年w i s t a r 大鼠山西医科大学实验动物中心 h i f - l a 蛋白多克隆抗体武汉博士德公司 i g f - i 蛋白多克隆抗体北京莱博生物实验材料研究所l a 0 8 0 4 s a b c 免疫组化试剂盒北京莱博生物实验材料研究所 d a b 显色试剂盒北京莱博生物实验材料研究所a r l 0 2 2 磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、p b s 液、枸橼酸钠、枸橼酸均为国产分析纯 1 2 实验动物分组和模型制备 1 2 1 实验动物分组 健康成年w i s t a r 大鼠7 2 只，体重( 2 5 0 - - + 1 0 ) g ，雌雄不限，随机分为对照组、假手术 组、伤后2 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、2 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 、1 4 d 组，每组6 只。 1 2 2 损伤组动物处理 1 2 2 1 参照f e e n e y s 法”建立大鼠脑损伤模型大鼠称重后，3 的戊巴比妥钠 ( 4 0 m g k g ) 腹腔注射麻醉，大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部，正中切开顶部头皮，在人 字缝前方3 m m ，颅骨中线旁3 m m ，钻直径为5 m m 的圆形骨窗。保持硬脑膜完好无损，采用 自由落体打击装置，以4 0 9 重锤从2 0 c m 高处下落打击。术后动物常规进食。 1 2 2 2 灌流固定及取材在伤后规定时间( 2 h 、6 h 、2 4 h 、2 d 、3 d 、5 d 、7 d 、1 0 d 、 1 4 d ) ，大鼠麻醉后开胸，剪开心尖部，以细管穿刺至主动脉并牢靠固定，剪开右心耳， 由穿刺管快速灌注生理盐水4 0 0 m l ，待自右心耳流出液为无色液体后，用4 多聚甲醛p b s 液5 0 0 m l ( p h 7 4 ，先快后慢) 灌流固定约2 t j , 时，再用1 0 蔗糖p b s 液3 0 0 m l 灌流脱水。开颅 取脑，矢状面取材。 1 2 3 对照组、假手术组动物处理 对照组直接灌流固定，处死；假手术组仅行颅骨钻孔，术后l d 处死；开颅取脑，矢状 切面取材。 1 2 4 冰冻切片 取材后用4 多聚甲醛固定g h ，2 0 5 蔗糖脱水2 4 d , 时，3 0 蔗糖脱水2 4 d , 时，o c t 包埋剂 包埋，l e l c ac m l 8 5 0 型冰冻切片机连续切片，片厚1 0 1 x r a 。 1 3 研究方法 1 3 1 大体观察 处死大鼠后，取出脑组织，于损伤区横向切开，观察损伤区矢状切面。 1 3 2 常规睢染色 脑组织经4 多聚甲醛固定2 4 h ，脱水包埋，连续切片，常规h e 染色，光镜下观察形 态学改变。 1 3 3 免疫组织化学染色方法 切片后置室温3 0 m i n 风干，泡丙酮2 0 m i n ，p b s 液洗3 m i n x3 次；掏橼酸盐缓冲液 ( p h 6 o ) 微波炉抗原修复1 5 m i n ，室温下冷却切片约3 0 m i n ，p b s 液洗3 m i n x3 次；3 h 2 0 2 甲醇液室温孵育1 0 m i n ，p b s 液洗3 m i n x 3 次；3 7 b s a 封闭液封闭2 0 m i n ，不洗，直接 加一抗( h i f - l a 浓度1 ：1 0 0 ，i g f - i 浓度1 ：2 0 0 ) ；4 冰箱过夜，p b s 液洗3 m i n x 3 次； n - - 抗3 7 2 0 m i n ，p b s 液洗3 m i n 3 次；加s a b c 试剂3 7 2 0 m i n ，p b s 液洗5 m i n 4 次； d a b 显色；脱水、透明、中性树胶封片。 1 3 4s b c 免疫组化图像分析和统计学处理 应用b i 一2 0 0 0 图像分析系统对h i f - l a 和i g f 1 蛋白s a b c 免疫组化染色结果进行分析。 数据统计处理采用s p s s l1 5 软件包进行统计处理。各组均数的比较行单因数方差分析 ( a n o v a ) 和q 检验，用最小显著差法( 1 e a s ts i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ，l s d ) 作两两比较。 以p 0 0 5 为有显著性差异。数据以均数标准差( j s ) 表示。 第二章结果 2 1 大体观察 实验组可见蛛网膜下腔、测脑室出血，脑组织出血，挫碎。 2 2h e 染色 正常对照组神经元细胞形态、结构正常，核染色较淡、圆形，核仁明显；实验组可见 蛛网膜下腔、侧脑室、脑组织出血，皮层及皮层下白质内可见小挫伤灶。部分甚至可见到 冲击侧海马及丘脑等部位有挫伤灶。所选切面各部位均可见程度不一的神经元皱缩，染色 3 山西医科大学硬士学位论文 较深，核深染，核仁消失，突触减少，神经元细胞周围出现空隙，逐渐发展为神经元坏死、 胞核溶解。胶质细胞大量增生，有明显脑水肿表现。 2 3 川f _ 1 a 和i g f - 1 免疫组化染色 2 3 1h i f 一1 旺蛋白免疫组织化学染色 在正常对照组中，神经细胞偶见h i f l a 表达，假手术组h i f - l a 表达略增高，但与对 照组比较无统计学意义( p 铂嬲易。在实验组中，脑损伤后2 h ，出现h i f - l a 表达增加， 伤后6 h 可见表达h i f - l a 的神经细胞显著增多，呈弥漫性表达，主要在细胞浆表达，于2 4 h 达高峰，7 d 后仍有少量表达，1 4 d 后恢复( 与对照组比较p = n 聊) 。其余损伤组与对照组 及各相邻损伤组之间比较有统计学差异伊 识0 5 ) ，见表2 1 。 2 3 2i g f - 1 蛋白免疫组织化学染色 正常对照组大脑皮质i g f 1 只有弱表达，假手术组略多于对照组( p = 现0 5 4 ) 。损伤后 6 h 可见i g f - 1 表达增加，损伤后1 2 hi g f o l 表达显著增加，伤后3 d 达到峰值。此后逐渐回落， 伤后1 0 d 表达仍高于对照组( p 移0 1 ) ，伤后1 4 d 基本恢复正常( 与假手术组比较尸= 现0 6 ) 。 表达呈弥漫性，以脑干、皮质、海马最明显，胞浆和胞核均有表达，各部位变化趋势基本 一致。损伤组与对照组及各相邻损伤组之间比较有统计学差异伊 识口砂，见表2 1 。 表2 - 1 大鼠脑损伤后不同时段h i f - i a 和i g f - 1 蛋白的表达 t a b l e2 - 1e x p r e s s i o no f h i f - l o a n di g f - ip r o t e i ni nt h ed i f f e r e n t p e r i o d sa f t e rc e r e b r a lc o n t u s i o n h 正- l e t 的表达i g f l 的表达 分组例数平均灰度值分组例数平均灰度值 对照组 69 4 2 5 1 3 9 对照组 61 2 2 4 7 1 8 3 假手术组 69 7 6 3 2 7 6 假手术组 6 1 2 1 4 9 5 1 8 2 h 组61 1 8 2 3 1 8 0 6 h 组61 3 5 。0 5 4 - _ 2 2 2 6 h 组 6 1 2 3 7 8 o 8 9 1 2 h 组61 4 3 9 0 2 9 3 1 2 h 组 6 1 3 6 1 9 1 2 4 2 4 h 组 6 1 6 6 4 3 2 3 0 2 4 h 组 6 1 5 5 1 5 5 6 0 2 d 组 6 1 7 7 4 6 2 8 0 2 d 组 61 5 0 3 7 5 0 0 3 d 组61 9 0 2 3 2 4 2 3 d 组 61 4 6 1 6 3 5 8 5 d 组61 7 8 5 3 2 3 6 5 d 组61 2 7 2 4 4 7 2 7 d 组61 6 8 8 2 2 3 9 7 d 组 6 1 0 5 8 8 2 6 9 ，l o d 组 6 1 4 7 7 8 1 1 6 2 1 4 d 组 69 8 8 4 2 9 0 1 4 d 组 6 1 3 2 3 8 2 2 4 洼：表示与对照组比较有统计学意义( ， n ；a 表示与对照组比较无统计学意义( p ) 晓0 0 3 n o t e ：i n j u r y g r o u p sc o m p a r e d w i t h n o r m a lc o n t r o lg r o u p ：( p 乱n ，) ：a ( ，) n n ，) 4 山西医辩大拿磺士学位论丈 f i g1 ： h i f _ 1a 的表达与脑损伤时间的关系 f i g2 ： i g f - 1 的表达与脑损伤时间的关系 5 山西医科大学磁士学位论文 第三章讨论 3 1 实验动物模型的选择 理想豹脑损伤动物模型制作方法应具有以下五个方面的特点。1 ：( 1 ) 再现性好，即应 再现所要研究的人类脑损伤的特征；( 2 ) 重复性强，即用同一方法相同的致伤量作用于同 种动物的同一部位能复制出相近程度的脑损伤；( 3 ) 可定量分级，即打击力度可自由控制， 用同一方法不同程度的致伤量作用动物脑同一部位产生不同程度的脑损伤，致伤量大小与 脑损伤程度成线性关系：( 4 ) 适应性广，即一种方法既能复制多种类型的脑损伤，又能在 多种实验动物上应用；( 5 ) 操作简单。学者们根据研究的需要，建立了多种颅脑损伤的动 物模型，其中以落体打击法和液压冲击法应用较广泛。液压损伤法受外界因素如动物头颅 发育的差异影响小，稳定性和重复性好，致伤量可测定，伤情可分级，可复制多种类型的 脑损伤。但其致伤机制与人类不尽一致，不适宜颅脑损伤的力学研究。 自由落体脑损伤是一种机械性损伤，由于损伤部位局限和所造成的局部脑损伤性质与 临床上见到的脑挫裂伤相似，使其具有一定的优点：( 1 ) 动物于伤后出现短暂呼吸暂停， 后自行恢复。伤后l 小时动物的行为和饮食基本恢复正常，未出现神经系统体征。( 2 ) 均有 相同程度的局灶性皮质挫裂伤及蛛网膜下腔出血。( 3 ) 血脑屏障破坏发生最早，随后缓慢 恢复。( 4 ) 伤后出现脑水肿，伤后3 0 分钟1 小时较明显。 f e e n e y s 法可按实验要求复制出部分与临床相近的颅脑损伤模型，但也有其局限性。1 ： ( 1 ) 压迫时间不一致，甚至存在持续压迫，影响实验的重复性；( 2 ) 用g c f 并不能反映脑组 织机械变形量，也不能代表脑的外力量，g c f 大小与脑损伤程度不呈线性关系。( 3 ) 脑损伤 模型以局部为主，与临床散在的损伤病灶稍有差异。( 4 ) 麻醉后大鼠头部受撞击时的运动 方式与临床颅脑损伤有一定差距。虽然f e e n e y s 法建立闭合性脑损伤模型有以上缺点，但因 为其简便易行，控制性好，可定量，仍是一种实验研究中广泛应用的经典方法。 几点须注意：麻醉时应严格按照体重计算麻药量。开骨窗时，将右侧颞肌稍向外 分离，否则面积太小，不易扩大骨窗。选择前囟后约1 5 m m 为佳，靠内侧易损伤上矢状窦， 导致大出血；太靠外侧，则受力面不平，易导致脑损伤受力不均，损伤程度大小不一，且 易引起脑膨出。闭合骨窗可防治感染，开放骨窗可缓解颅内高压，促进大鼠脑功能恢复， 在实验中可考虑统一使用。严格控制每一实验环节，灌注时注意勿损伤心脏，插管准确， 以免标本提取失败。 3 2h i f _ 1 吐、i g f _ 1 与脑损伤 h i f - l a 表达增加是缺血缺氧早期首发的分子水平的适应性反应，它作为调节基因蛋 白，可以促进许多效应基因的表达，介导与缺氧有关的各种生理反应。h i f l a 可通过调节 血红素加氧酶( h e m e o x y g e n a s e - 1 。h o 1 ) 、血管内皮生长因子( v e g f ) 、内皮素一1 ( e t 1 ) ， 6 山西医科大学硕士学位论文 2 型n o s ( i n o s ) 等基因的表达，增加血流量，促使炎症发生“1 。这些变化旨在使细胞、组 织发生适应保护性改变，以度过危险阶段，为随后的适应、修复过程提供条件“1 。f r e r e t 等”1 在大鼠脑持续缺血损害2 4 h 后人工给予可诱导h i f 1 a 表达增加的药物去铁铵，结果发现可 以显著降低脑组织缺血后损害的面积( 一2 8 ) ，提示h i f - i a 有脑保护作用。脑损伤后，脑 组织缺血缺氧所致的氧化应激可以诱导h i f - l a 的表达升高，从而促使细胞凋亡、防止细胞 坏死、甚至能够刺激细胞增殖。于如同等。1 用液压冲击大鼠脑损模型探讨h i f l a 在颅脑损 伤后的表达，结果在对照组有少量细胞出现h 。l a 弱阳性表达，外伤后3 h ，受伤区、伤灶 周围水肿区和海马均出现细胞浆阳性表达，2 4 、4 8 h 达高峰，逐后有表达降低趋势。本研 究发现脑损伤后h i f - l a 的表达与前述研究结果一致。在对照组神经细胞中偶见h i f 1 a 表 达，伤后2 h 在伤灶周围水肿区、脑于和海马均出现阳性表达增加，2 4 h 达高峰，1 4 d 后恢复。 因损伤区、脑干和海马都是对缺血缺氧敏感的组织，这也证实h i f - l c t 与脑损伤后缺血缺氧 有关。脑损伤后神经细胞处于缺血缺氧敏感期，可通过抑制蛋白酶体降解h w l e t 和提高 h w l a 的转录活性两种途径，实现h i f - l a 表达持续增高”。随后细胞对缺氧适应，蛋白 酶体降解途径被中断，故出现h i f - l c t 表达下降趋势。 i g f - i 作为新的脑保护因子，在正常脑组织中有十分广泛而低水平的表达，在脑损伤时 被激活，其在脑组织中的表达和分布发生显著变化，可通过诱导神经营养因子、释放抑制 性神经递质、降低大脑温度、增加脑血流量等启动内源性神经保护机制，还可通过抑制神 经元凋亡而起中枢直接保护作用“”。i g f - 1 可促进星形细胞和小胶质细胞增生，星形细胞通 过提供神经营养因子，在支持神经元和胶质细胞存活中起重要作用。活性小胶质细胞通过 释放细胞因子、生长因子、细胞外基质分子，在损伤的中枢神经系统中建立一个再生前环 境，这对损伤后中枢神经系统的组织修复很关键“”。本研究发现脑损伤后i g f - 1 表达增加， 3 d 达峰值，3 7 d 一直持续高表达，对脑损伤后神经元的修复、胶质细胞的增生起重要作用。 脑损伤后，神经胶质细胞逐渐活跃起来，对神经组织起保护、修复、营养等作用，故 伤后表达h i f - l c t 和i g f 一1 蛋白的阳性细胞中神经胶质细胞占主要地位。目前认为缺氧对 h i f - l a 的调节不在m r n a 水平，而在蛋白翻译后水平，由于h i f 1 a 蛋白表达需从基因调控 到转录、翻译等多个步骤，故在脑损伤早期没有h i f - l a 蛋白表达的明显增多，而在中、后 期，h 1 n 蛋白表达增多较明显。研究证实1 g f - i 和h i f - l c t 之间存在相互作用，i g f - 1 可 以诱导h i f - i c t 蛋白表达增加，其作用是通过磷脂酰肌醇3 一激酶( p i 一3 k ) 和m a p k 途径来 实现的，i g f - i 对h i f 1 a 的调节在转录后水平，可诱导核内h i f l a 蛋白合成增加“”。脑挫伤 后h i f - l a 表达增加在先而i g f 一1 表达增加在后，可见在脑损伤早期h i f l a 表达增加主要是 缺血缺氧的刺激，随后i g f - 1 可能参与了诱导h i f l a 蛋白表达增加的机制。但伤后2 4 h h i f 1 a 表达开始下降后i g f - 1 的表达仍然继续上升直到3 d 后才开始下降，这说明在这一阶 段，h i f - i a 的降解作用远远超过了其合成。 山西乐辩大学硕士学位论文 第四章结论 本实验用免疫组织化学方法对脑损伤后不同时间h i f - l a 和i g f - 1 的表达进行了研究。实 验结果显示脑损伤后h i f - l c t 和i g f 1 表达有一定的时间规律性：脑损伤后2 h 出现h i f - i a 表达 增加，2 4 h 达高峰，1 4 d 后恢复；脑损伤后6 h 可见i g f - 1 表达增加，伤后3 d 达峰值，此后逐渐 回落，伤后1 4 d 基本恢复。本实验结果提供了脑损伤后h i f 1 a 和i g f - 1 表达变化的时问规律 性，使h i f - i a 和i g f - 1 作为一种客观指标用于法医学鉴定中脑损伤时间的推断成为可能。 8 山西医科大学硬士学位论文 【8 】 【9 】 【1 0 】 【1 l 】 【1 2 1 1 3 】 【1 4 】 【1 5 】 参考文献 张益鹄法医颅脑损伤的研究进展【j 】中国法医学杂志，2 0 0 2 ，1 7 ( 2 ) ：1 2 0 1 2 3 f e c n e yd m ，b o y e s o nm g ，l i m ar t 。e ta 1 r e s p o n s e st oc o r t i c a li n j u r y ：i m e t h o d o l o g y a n dl o c a le f f e c t so f c o n t u s i o n si nt h er a t 【j 】b r a i nr e s ，1 9 8 1 ，2 1 1 ( 1 ) ：6 7 7 7 夏胜海，秦启生，陈新山脑损伤动物模型制作方法的研究现状【j 】jj i l t 医学院学报， 2 0 0 0 。1 5 ( 2 ) ：4 9 5 1 王清华，徐如祥，李良平，等大鼠不同程度脑损伤模型的建立【j j 创伤外科杂志， 2 0 0 0 ，2 ( 1 ) ：4 2 - 4 4 张荣军，游潮，蔡博文，等f e e n e y s 法建立大鼠闭合性脑损伤模型及评估【j 】中国 修复重建外科杂志，2 0 0 5 ，1 9 ( 1 2 ) ：1 0 1 5 1 0 1 8 h e l l w i g - b u r g e lt ，s t i e h ld p ，w a g n e ra e ，e ta 1 r e v i e w ：h y p o x i a i n d u c i b l ef a c t o r - 1 ( h i f - 1 ) ： an o v e lt r a n s c r i p t i o nf a c t o ri ni m m u n er e a c t i o n s j ji n t e r f e r o nc y t o k i n er e s ，2 0 0 5 ，2 5 ( 6 ) ： 2 9 7 3 1 0 s e m e n z ag h i f 一1a n dh u m a nd i s e a s e ：o n eh i g h l yi n v o l v e df a c t o r j 1 g e n e sd e v e l o p m e n t ， 2 0 0 0 ，1 4 ( 1 6 ) ：1 9 8 3 1 9 9 1 f r e r e tt 。v a l a b l es 。c h a z a l v i e ll ，e ta 1 d e l a y e da d m i n i s t r a t i o no fd e f e r o x a m i n er e d u c e s b r a i nd a m a g ea n dp r o m o t e sf u n c t i o n a lr e c o v e r ya f t e rt r a n s i e n tf o c a lc e r e b r a li s c h e m i ai n t h er a t j e u r jn e u r o s c i ，2 0 a 1 6 ，2 3 ( 7 ) ：1 7 5 7 1 7 6 5 于如同，高立达，官鹏，等脑创伤后缺氧诱导因子一l 表达及其对细胞凋亡的调控 作用【j 】中华实验外科杂志，2 0 0 2 ，1 9 ( 1 ) ：1 5 1 6 f e d e l ea o ，w h i t e l a wm l ，p e e td j r e g u l a t i o no fg e n ee x p r e s s i o nb yt h eh y p o x i a i n d u c i b l ef a c t o r s 【j 】m o li n t e r v ，2 0 0 2 ，2 ：2 2 9 2 4 3 s e m e n z ag l h i f - i ，0 2a n dt h e3p h d s ：h o wa n i m a lc e l l ss i g n a lh y p o x i at ot h en u c l e u s 【j 】c e l l ，2 0 0 1 ，1 0 7 ：1 - 3 s e m e n z ag l h w - 1a n dm e c h a n i s mo fh y p o x i as e n s i n g 【j 1 c u r ro p i nc e l lb i o l ，2 0 0 l ， 1 3 ：1 6 7 1 7 1 b h a v es v ，h o f f m a np l p h o s p h a t i d y l i n o s i t o i3 - o hk i n a s ea n dp r o t e i nk i n a s ea p a t h w a y s m e d i a t et h ea n t i a p o p t o t i ce f f e c to fp i t u i t a r ya d e n y l y l c y c l a s e a c t i v a t i n g p o l y p e p t i d ei n c u l t u r e dc e r e b e l l a r g r a n u l en e u r o n s ：m o d u l a t i o nb ye t h a n o l j j n e u r o c h e m ，2 0 0 4 ，8 8 ( 2 ) ：3 5 9 3 6 9 c a oy ，g u n na j ，b e n n e tl ，e ta 1 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o r ( i g f ) 一l s u p p r e s s e s o l i g o d e n d r o c y t ec a s p a s e 一3a c t i v a t i o na n di n c r e a s e sg l i a lp r o l i f e r a t i o na f t e ri s c h e m i ai n n e a r - t e r mf e t a ls h e e p j jc e r e bb l o o df l o wm e t a b ，2 0 0 3 ，2 3 ( 6 ) ：7 3 9 7 4 7 f u k u d ar ，h i r o t ak ，f a nf ，e ta 1 i n s u l i n l i k eg r o w t hf a c t o rli n d u c e sh y p o x i a - i n d u c i b l e 9 嘲 网 吲 嘲 旧 山西医辩大学硬士学位论文 f a c t o r1 - m e d i a t e dv a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o re x p r e s s i o n ，w h i c hi sd e p e n d e n to n m a pk i n a s ea n dp h o s p h a t i d y l i n o s i t o l3 - k i n a s es i g n a l i n gi nc o l o nc a n c e rc e l l s ( j 1 jb i n l c h e m ，2 0 0 2 ，2 7 7 ( 4 1 ) ：3 8 2 0 5 - 3 8 2 1 i 1 0 山西医科大学焉士学位论文 附图： 大鼠脑损伤后不同时间h i f - 1o 蛋白的表达情况 ( 1 ) 对照组偶见h i f - i a 阳性表达( 2 ) 假手术组与对照组比较无差别 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍)( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) ( 3 ) 伤后2 hh i f - i a 阳性表达增加“) 伤后6 hh i f 1 n 阳性表达明显增加 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍)( 大脑皮质i h c 2 0 0 倍) 山西医科大学硬士学位论文 ( 5 ) 伤后2 4 hh i f 1 n 阳性表达达高峰( 6 ) 伤后3 dh i f l a 阳性表达情况 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍)( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) ( 7 ) 伤后7 d 有少量h i f 1 a 阳性表达( 8 ) 伤后1 4 dh i f l a 表达恢复正常 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍)( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) 山西医辫大学磺士学位论文 大鼠脑损伤后不同时问1 6 f - 1 蛋白的表达情况 ( 9 ) 对照组i g f 1 表达呈弱阳性 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) q d 伤后1 2 hi g f l 刚性表达显著增加 ( 大脑皮质i h c 2 0 0 倍) ( 1 3 ) 伤后7 di g f 1 阳性表达情况 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) a 毋假手术组i g f 一1 表达与对照无差别 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) 伤后3 di g f - 1 阳性表达达高峰 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) ( 1 4 ) 伤后1 4 di g f - i 表达恢复正常 ( 大脑皮质i h c x 2 0 0 倍) 附录( 本文已发表) ： 1 2 9 4 例心源性猝死的回顾性分析 【摘要】目的探讨心源性猝死的诱因、病因、发生规律及发病机制。方法利用e x c e l 统计软件回顾性分析1 2 9 4 例心源性猝死案例资料。结果心源性猝死的诱因以精神刺激、 活动、劳累、便秘、饱餐、睡眠、饮酒等多见，占8 7 8 ；冠心病( 6 5 5 3 ) 、风心病( 8 9 0 ) 、 心肌炎( 6 1 6 9 6 ) 、心肌病( 4 8 7 ) 、肺心病( 3 5 1 ) 、高心病( 1 7 9 ) 为心源性猝死的六大死 因，占9 0 3 8 ；在l 天2 4 4 时中6 一1 2 时猝死的发生率高于其它时间段。结论心源性猝死 的法医学鉴定除要进行详细的尸体解剖外，还要对死者的相关资料如基础疾病、诱因、年 龄、死亡时间等进行分析，这样不仅有助于得出正确的鉴定结论，还可为以后的科研工作 积累资料。 【关键词】心源性猝死：法医病理学；法医学鉴定 r e t r o s p e c t i v ea n a l y s i so f1 2 9 4c a s e so fs u d d e nc a r d i a cd e a t h a b s t r a c t o b j e c t i v et oe x p l o r et h ei n d u c e df a c t o r s ，p a t h o g e n y , r u l e ，m e c h a n i s mo f s u d d e nc a r d i a cd e a t h ，m e t h o d sa n a l y z er e t r o