（病理学与病理生理学专业论文）hif1α与pinch、vegf在人喉鳞癌中的表达及意义.pdf

目录 i | i i ii ii iii i ii iii if ill| 19 018 6 7 中文摘要l 英文摘要4 研究论文h i f 1 q 与p i n c h 、v e g f 在人喉鳞癌中的表达及意义 前言8日l j 舌芍 材料与方法9 结果1 2 附图16 附表2 3 讨论3 0 结论3 2 参考文献3 3 综述p i n c h 蛋白在肿瘤中的研究进展 3 5 致谢4 2 个人简历4 3 中文摘要 h i f 1 a 与p i n c h 、v e g f 在人喉鳞癌中的表达及意义 摘要 目的：探讨h i f 1 a 、p i n c h 和v e g f 在人喉鳞癌的表达及其临床病理 意义。 喉癌为头颈部常见恶性肿瘤之一。目前已广泛证实低氧是肿瘤微环境 的一个重要特征，是造成肿瘤侵袭转移和实体瘤对化疗、放疗产生耐受的 重要因素。在低氧过程中肿瘤细胞是通过特异性转录因子一低氧诱导因子 1 a ( h y p o x i ai n d u c i b l ef a c t o rla l p h a ，h i f 1 a ) 过表达来维持氧和代谢的 平衡稳定，促进自身生长和转移。其在肿瘤的发生、发展、转移以及肿瘤 治疗耐药等方面发挥重要作用。 p i n c h ( p a r t i c u l a r yi n t e r e s t i n gn e wc y s t e i n e h i s t i d i n er i c hp r o t e i n ， p 烈c h ) 蛋白为新近发现的一个信号传导整合蛋白，其靠两个双锌指结构 域将整合素和生长因子信号传导系统连接起来，在整合素和生长因子信号 传导中起着十分重要的接头联结作用。初步研究表明其在肿瘤的发生、发 展特别是浸润转移中可能有重要作用。 血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , v e g f ) 被认为 是作用最强、特异性最高的促血管生成因子之一，可以刺激内皮细胞分泌 集中蛋白酶和蛋白酶活化因子，导致血管基底膜降解，使细胞得以入侵周 围基质，进而迁移、增殖，形成新生血管。新生血管不仅是肿瘤生长的必 需条件，同时也是肿瘤细胞浸润、转移的必要条件。大量研究表明v e g f 与 促进血管形成和肿瘤转移密切相关。 h i f 1 a 是调节肿瘤细胞适应缺氧的核心因子，参与多种基因的转录调 控和肿瘤细胞缺氧的适应过程，促进肿瘤的发生和进展。h i f 1 a 是否同样 调节喉鳞癌组织中p i n c h 和v e g f 的表达；p i n c h 在喉鳞癌的发病过程中 是否通过调节v e g f 的表达介导肿瘤的进展? 目前尚不清楚。 因此，本研究采用免疫组化方法检测了h i f 1 a 、p i n c h 和v e g f 在 人喉鳞癌的表达情况，并分析三者与喉癌临床病理参数之间的关系；探讨 h i f 1 a 与p i n c h 和v e g f 的表达与喉鳞癌的发生、发展及转移是否发生 了同步改变；以及三者之间的相互作用关系，分析其在喉癌中的作用。 中文摘要 方法：5 0 例喉鳞癌组织及标本切缘、经病理证实为正常喉粘膜组织 1 0 例作为对照。取自河北医科大学第一医院及第四医院2 0 0 8 年9 月1 日 至2 0 1 0 年8 月3 1 日术前未经放化疗的声门型及声门上型喉鳞癌病人，所 有标本均经两位副高以上职称的病理科医生复查确诊。采用免疫组织化学 方法检测喉鳞癌患者鳞癌组织及癌旁正常组织中h i f 1 a 及p i n c h 、v e g f 的表达情况，分析与临床病理指标间的关系及三者之间的相互关系。 结果： 1h i f 1 a 在人喉鳞癌组织和癌旁正常组织中阳性表达率分别为7 2 ( 3 6 5 0 ) 、1 0 ( 1 1 0 ) ；h i f 1 a 在人喉鳞癌组织中的表达显著高于癌旁 正常组织( p 0 0 5 ) 。 h i f 1 a 在高分化鳞癌中的表达阳性率为5 2 1 7 ，明显低于中、低分 化鳞癌，随癌细胞分化程度的降低其表达增强( p 0 0 5 ) ；h i f 1 a 在淋巴 结转移组与无淋巴结转移组中的表达阳性率分别为8 5 2 9 ( 2 9 3 4 ) 、 4 3 7 5 ( 7 1 6 ) ，两者相比差异有统计学意义( p 0 0 5 ) ；但是其表达与 患者的年龄、性别、临床分型及临床分期无关。 2p i n c h 在人喉鳞癌组织和癌旁正常组织中阳性表达率分别为8 4 ( 4 2 5 0 ) 、2 0 ( 2 l o ) ；p i n c h 在人喉鳞癌组织中的表达显著高于癌旁 正常组织，差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) 。 p i n c h 蛋白在高分化鳞癌中的表达阳性率为6 9 5 7 ，明显低于中、 低分化鳞癌，随癌细胞分化程度的降低其表达增强( p o 0 5 ) ；p i n c h 在 淋巴结转移组与无淋巴结转移组中的表达阳性率分别为9 4 1 2 ( 3 2 3 4 ) 、 6 2 5 0 ( 1 0 1 6 ) ，两者相比差异具有统计学意义( p 0 0 5 ) ；而其表达与 患者的年龄、性别、临床分型及临床分期无关。 3v e g f 在人喉鳞癌组织和癌旁正常组织中阳性表达率分别为6 6 ( 3 3 5 0 ) 、1 0 ( 1 1 0 ) ，差异具有统计学意义( p o 0 5 ) 。 v e g f 蛋白在高分化鳞癌中的表达阳性率为5 6 5 2 ，明显低于中、 低分化鳞癌，其表达随癌细胞分化程度的降低而增强( p o 0 5 ) ；v e g f 在淋巴结转移组与无淋巴结转移组中的表达阳性率分别为7 9 4 1 ( 2 7 3 4 ) 、3 7 5 0 ( 6 1 6 ) ，两者相比差异具有统计学意义( p o 0 5 ) ； v e g f 蛋白表达与患者的年龄、性别、临床分型及临床分期无关。 4 在人喉鳞癌组织中，h i f 1 a 的表达与p i n c h 、v e g f 表达呈显著 中文摘要 正相关( p o 0 5 ) ；p i n c h 与v e g f 表达无明显相关性。 结论： 1h i f - l o t 、p i n c h 和v e g f 在人喉鳞癌组织中均高表达，随肿瘤的分 化程度降低其表达显著增高。三者在喉鳞癌的侵袭转移中具有重要作用。 2h i f l a 、p i n c h 和v e g f 在人喉鳞癌的表达与淋巴结转移有关，考 虑h i f l a 表达的显著上调伴随p i n c h 与v e g f 表达的显著升高，可能对 人喉鳞癌组织的生长、侵袭起一定促进作用。 关键词：喉鳞癌；h i f 10 【；p i n c h ；v e g f ；侵袭；转移 英文摘要 t h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a ls i g n i f i c a n c eo fh i f l a ，p i n c ha n d v e g fi nh u m a n l a r y n g e a lc a r c i n o m a a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oe v a l u a t et h ee x p r e s s i o na n dc l i n i c a la n dp a t h o l o g i c a l s i g n i f i c a n c eo fh i f - la ，p i n c ha n dv e g fi nh u m a nl a r y n g e a lc a r c i n o m a l a r y n g e a lc a r c i n o m ai so n eo ft h em o s tc o m m o nm a l i g n a n tt u m o ri n t h eh e a da n dn e c k h y p o x i a ，a ni m p o r t a n tf e a t u r eo ft u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t ， h a sb e e nw i d e l yc o n f i r m e dn o w h y p o x i ai st h em a i nf a c t o rf o rt u m o r i n v a s i o n ， m e t a s t a s i sa n dt o l e r a n c et oc h e m o t h e r a p ya n dr a d i a t i o nt h e r a p y i nt h ep r o c e s s o fh y p o x i a ，t h e o v e r e x p r e s s i o n o fh y p o x i a i n d u c i b l ef a c t o r - 1a ( h i f le t ) s u s t a i nt h es t a b i l i t yo fo x y g e na n dm e t a b o l i z et h r o u g hs p e c i f i ct r a n s c r i p t i o n f a c t o r , t h e np r o m o t et h eg r o w t ha n dm e t a s t a s i so fi t s e l f , w i h i c hp l a y sa n i m p o r t a n tr o l ei nt u m o ro c c u r r e n c e ，d e v e l o p m e n t ，m e t a s t a s i sa n dr e s i s t a n c et o c a n c e rt r e a t m e n t p i n c h ( p a r t i c u l a r yi n t e r e s t i n gn e wc y s t e i n e h i s t i d i n er i c hp r o t e i n ) ，a n i n t e g r i ns i g n a l i n gn e w l yd i s c o v e r e d ，p l a y sa ni m p o r t a n tr o l eo f j o i n tc o u p l i n g i ni n t e g r i na n dg r o w t hf a c t o rs i g n a lt r a n s d u c t i o n i tj o i n st h ei n t e g r i na n d g r o w t hf a c t o rs i g n a lt r a n s d u c t i o nb yd o u b l ez i n cf i n g e rd o m a i n p r e l i m i n a r y s t u d yh a v ei n d i c a t e dt h a t p i n c hm i g h tp l a ya l l i m p o r t a n tr o l ei nt u m o r o c c u r r e n c e ，d e v e l o p m e n t ，e s p e c i a l l yi n v a s i o na n dm e t a s t a s i s v e g f ( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ) i sc o n s i d e r e da so n eo ft h e s t r o n g e s te f f e c ta n ds p e c i f i c i t yg e n et oa c c e l e r a t et h ef o r mo ft h ev a s c u l a r , w h i c hc a ns t i m u l a t ee n d o t h e l i u mt oe x c r e t em u s t e re n z y m ea n da c t i v a t e dg e n e ， m a k i n gb o t t o mm e m b r a n c ed i s o r g a n i z e d ，s ot h e c e l lc a ni n v a d ei n t o s u r r o u n d i n gm a t r i x ，m i g r a t e ，p r o l i f e r a t ea n df o r man e wv a s c u l a ra tl a s t n e o v a s c u l a r i z a t i o ni sn o to n l yt h en e c e s s a r yc o n d i t i o n so ft h et u m o rg r o w t h ， b u ta l s oc a nc r e a t et h ec o n d i t i o n sf o rm e t a s t a s i so ft h et u m o rc e l l al a r g e n u m b e ro fr e s e a r c h e sh a v ei n d i c a t e dt h a tv e g fc o u l da c c e l e r a t et h ef o r mo f v a s c u l a ra n dt h em e t a s t a s i so ft h et u m o r 4 英文摘要 t h e r e f o r , t h eo b je c t i v eo ft h i ss t u d yi st od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fh i f - la ， p i n c ha n dv e g fi n l a r y n g e a ls q u a m o u s c e l lc a r c i n o m a b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ，a n dt oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e e x p r e s s i o no fh i f - la ，p i n c ha n dv e g fa n dt h eo c c u r r e n c e ，d e v e l o p m e n t a n dm e t a s t a s i so f l a r y n g e a lc a r c i n o m a ，w h i c hm i g h tp r o v i d ean e wi d e a sa n d m e t h o d sf o rl a r y n g e a lc a r c i n o m a t h e r a p y m e t h o d s ： s a m p l e so f 5 0c a s e so fl a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m aa n d10c a s e s o fa d ja c e n tn o r m a lt i s s u e sf r o mt h ef i r s to r4 t hh o s p i t a lo fh e b e im e d i c a l u n i v e r s i t y , j a n u a r y1 ，2 0 0 8t od e c e m b e r31 ，2 0 0 9w i t h o u tp r e o p e r a t i v e c h e m o t h e r a p y a n dr a d i o t h e r a p yi n g l o t t i c a n ds u p r a g l o t t i cc a n c e rh a v e c o m f i r m e db yt w op a t h o l o g i s t e x p r e s s i o no fh i f la ，p i n c ha n dv e g f p r o t e i ni nl a r y n g e a ls q u a m o u s c e l lc a r c i n o m aa n da d j a c e n tn o r m a lt i s s u ew e r e d e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n d a n a l y s er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e e x p r e s s i o n o fh i f la ，p i n c ha n dv e g fa n dc l i n i c a l p a t h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i ci nl a r y n g e a lc a r c i n o m a r e s u l t s ： lp o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t eo f h i f - l ai s7 2 ( 3 6 5 0 ) a n d1 0 ( 1 1 0 ) i nh u m a nl a r y n g e a ls q u a r n o u sc e l lc a r c i n o m aa n da d j a c e n tn o r m a lt i s s u e s r e s p e c t i v e l y ；a n dt h ee x p r e s s i o no fh i f - l ai nh u m a nl a r y n g e a ls q u a m o u s c e l lc a r c i n o m aw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h ea d j a c e n tn o r m a lt i s s u e ( p o 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fh i f lai n h i g hd i f f e r e n t i a t e dg r o u pw a s5 2 17 ( 1 2 2 3 ) ，s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nm o d e r a t e da n dp o o r l yd i f f e r e n t i a t e d g r o u p a n dt h eh i f l ae x p r e s s i o nw a s8 5 2 9 ( 2 9 3 4 ) a n d4 3 7 5 ( 7 1 6 ) i n l y m p hn o d em e t a s t a s i sg r o u pa n dn ol y m p hn o d em e t a s t a s i sg r o u p r e s p e c t i v e l y , w h i c h h a s s i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) ；t h ee x p r e s s i o no f h i f lai n c r e a s e dw i t ht h et u m o rp a t h o l o g i c a l g r a d e sa c c o r d i n gt o t h e d i f f e r e n t i a t i o no ft h et u m o rc e l la n dt h ed i f f e r e n c eh a ss t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p o 0 5 ) a n dw a s i r r e l e v a n tw i t h a g e ，g e n d e r , c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n ，c l i n i c a ls t a g i n ga n do t h e rc l i n i c o p a t h o l o g i c a l 5 英文摘要 2p i n c hp o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t ei nh u m a nl a r y n g e a ls q u a m o u sc e l l c a r c i n o m aa n da d j a c e n tn o r m a lt i s s u e sw a s8 4 ( 4 2 5 0 ) a n d2 0 ( 2 1 0 ) r e s p e c t i v e l y ； a n dp i n c he x p r e s s i o ni nh u m a nl a r y n g e a l s q u a m o u sc e l l c a r c i n o m aw a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h a ti nt h ea d j a c e n tn o r m a lt i s s u e ( p o 0 5 ) p i n c he x p r e s s i o ni nl y m p hn o d em e t a s t a s i sg r o u pa n dn o l y m p hn o d e m e t a s t a s i sg r o u pw a s9 4 1 2 ( 3 2 3 4 ) a n d 6 2 5 0 ( 1 0 1 6 ) r e s p e c t i v e l y , w h i c h h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p o 0 5 ) ；t h ee x p r e s s i o no fp i n c hi n c r e a s e dw i t h t h et u m o rp a t h o l o g i c a lg r a d e sa c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h et u m o rc e l l a n dt h ed i f f e r e n c eh a ds t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( p o 0 5 ) a n dw a si r r e l e v a n tw i t h a g e ，g e n d e r , c l i n i c a lc l a s s i f i c a t i o n , c l i n i c a ls t a g i n ga n do t h e rc l i n i c o p a t h o 1 0 9 i c a l 3v e g fp o s i t i v ee x p r e s s i o nr a t ei nh u m a nl a r y n g e a ls q u a m o u sc e l l c a r c i n o m aa n da d j a c e n tn o r m a lt i s s u e sw a s 6 6 ( 3 3 5 0 ) a n d 10 ( 1 10 ) r e s p e c t i v e l y a n dt h ed i f f e r e n c eh a ds t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c e ( p 0 0 5 ) v e g fe x p r e s s i o ni nl y m p hn o d em e t a s t a s i sg r o u pa n dn ol y m p hn o d e m e t a s t a s i sg r o u pw a s7 9 4 1 ( 2 7 3 4 ) a n d3 7 5 0 ( 6 1 6 ) r e s p e c t i v e l y , w h i c h h a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c eq o 0 5 ) ；t h ee x p r e s s i o no fh i f 1ai n c r e a s e dw i t h t h et u m o rp a t h o l o g i c a lg r a d e sa c c o r d i n gt ot h ed i f f e r e n t i a t i o no ft h et u m o r c e l l sa n dt h ed i f f e r e n c eh a ds t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p 0 0 5 ) a n dw a s i r r e l e v a n tw i t ha g e ，g e n d e r , c l i n i c a lc l a s s i f i c a t i o n ，c l i n i c a ls t a g i n ga n do t h e r c l i n i c o p a t h o l o g i c a l 4i nh u m a n l a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m a ，t h ee x p r e s s i o no fh i f 1a w a ss i g n i f i c a n t l yp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t h t h ee x p r e s s i o no fp i n c ha n d v e g f ( p o 0 5 ) t h e r ew a sn os t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h ee x p r e s s i o n o fp i n c h p r o t e i na n dv e g fp r o t e i n c o n c l u s i o n s ： 1t h ee x p r e s s i o no fh i f la ，p i n c ha n dv e g fp r o t e i n ，i nh u m a n l a r y n g e a ls q u a m o u sc e l lc a r c i n o m ah i g h l yi n c r e a s ew i t ht h ed i f f e r e n t i a t i o n o f t h ec e l l s 2t h e e x p r e s s i o n o fh i f - la ，p i n c ha n dv e g f p r o t e i n w a s 7 研究论文 h i f 1 a 与p i n c h 、v e g f 在人喉鳞癌中的表达及意义 -j- 刖吾 喉癌为头颈部常见恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的1 - - - 5 左右， 头颈部恶性肿瘤的3 3 - - - 8 1 。近年来临床观察显示，我国喉癌的发病 率有逐渐上升的趋势。因其具有早期症状隐匿、生长速度较快、对放化疗 的敏感度较低、抵抗力强的特点；同时具有侵袭力强，容易向邻近扩散， 淋巴结转移早的特性，6 0 8 0 患者一经发现就已属晚期，导致其治疗效 果较差，预后不理想，严重危害人体健康。因此，阐明其发生、发展、浸 润转移的机制对喉鳞癌的临床治疗具有重要的意义。 目前已广泛证实，恶性肿瘤微环境的一个重要特征是低氧。低氧在肿 瘤的发展、恶性侵袭、远处转移以及肿瘤对放疗、化疗的抵抗等方面都起 着极其重要的作用。在低氧过程中肿瘤细胞往往会通过特异性转录因子一 低氧诱导因子1 a ( h i f 1 a ) 过表达来维持氧和代谢的稳定，促进自身生长 和转移。作为肿瘤组织氧供与能供的中心调控环节，h i f 1 a 是血管内皮细 胞生长因子( v e g f ) 基因和糖酵解过程中多种关键酶基因的上游调控基 因，通过对一系列靶基因的调控，在肿瘤的发生发展及转移中起重要作用。 由于h i f l a 在肿瘤生物学行为中的重要作用，其与肿瘤的关系成为 近年来肿瘤学研究中的一个热点。目前研究显示h i f 1 a 与喉鳞癌发生发 展及转移密切相关，但其具体作用机制及调控因素尚不清楚。因此有必要 深入研究探讨h i f 1 a 与喉鳞癌生物学行为的关系，了解其在喉鳞癌发展 及治疗抵抗中的作用，为喉鳞癌的临床治疗开辟新的途径奠定研究基础。 肿瘤的侵袭转移是一个十分复杂的过程，涉及到许多黏附分子的异常 表达，如整合素家族、生长因子家族、血管生成因子家族等【。p i n c h 蛋白 是新近发现的l i m ( l i n 1 l ，l s l 1a n dm e c 3p r i t e i n s ) 家族的一个成员【2 4 1 ， 它与整合素一起参与了细胞的粘着、粘附作用，调节细胞的形态改变和迁 移。研究发现其还参与生长因子信号转导系统，在信号传导中可能起着一 种“分子开关的作用，如果p i n c h 过表达被阻断或它的蛋白功能被抑制， 那么整合素和生长因子信号通路功能可能就会同时下调【5 1 。 肿瘤持续性生长和转移需要有新生血管的形成，血管内皮生长因子 研究论文 ( v e g f ) 亦称血管通透因子( v p f ) ，是促进肿瘤血管生成的最主要的血管生 长因子之一【6 】，是一种选择性促内皮细胞有丝分裂原，能直接刺激血管生 长，在肿瘤浸润和转移过程中发挥着重要作用。 h i f 1 a 是调节肿瘤细胞适应缺氧的核心因子，参与多种基因的转录调 控和肿瘤细胞缺氧的适应过程，促进肿瘤的发生和进展 7 1 。h i f 1 a 是否 同样调节喉鳞癌组织中p i n c h 和v e g f 的表达；p i n c h 在喉鳞癌的发病过 程中是否通过调节v e g f 的表达介导肿瘤的进展? 目前尚不清楚。 因此，本研究采用免疫组化方法检测了h i f 1 e t 、p i n c h 和v e g f 在 人喉鳞癌的表达情况，并分析三者与喉癌临床病理参数之间的关系；探讨 了h i f 1 a 与p i n c h 和v e g f 的表达与喉鳞癌的发生、发展及转移是否发 生了同步改变：以及三者之间的相互作用关系，分析其在喉癌中的作用。 材料与方法 1 实验材料 1 1 组织标本 通过病案收集河北医科大学第一医院及第四医院2 0 0 8 年9 月1 日至 2 0 1 0 年8 月3 1 日术前未经放化疗的声门型及声门上型喉鳞癌病人标本5 0 例。切取标本切缘、经病理证实为正常喉粘膜组织1 0 例作为对照。喉鳞 癌病例中男性4 4 例，女性6 例；年龄3 4 - - 7 8 岁，平均年龄6 0 岁；其中 伴有淋巴结转移者3 4 例，无淋巴结转移者1 6 例。临床分型：声门上型为 2 8 例，声门型为2 2 例；临床分期：i 期5 例，i i 期7 例，i 期5 例，期 3 3 例。病理学分级：鳞癌高分化2 3 例，中分化1 l 例，低分化1 6 例( 见 f i g 1 2 3 4 ) 。所有标本均经两位副高以上职称的病理科医生复查确诊。 1 2 主要试剂及仪器 l 兔抗人h i f 1 a 和v e g f 蛋白多克隆抗体，武汉博士德生物公司，工作 浓度为l ：7 0 。 2 兔抗人p i n c h 蛋白多克隆抗体，购自美国s i g m a - a l d r i c h 公司。工作浓 度为l ：7 0 。 3 二步法抗兔i 鼠通用型免疫组化检测试剂盒北京中杉金桥生物公司 4 浓缩型d a b 试剂盒北京中杉金桥生物公司 研究论文 5 病理组织包埋机 6 病理组织切片机 7t p c 型摊片机 8h p x 9 0 8 2 数显电热培养箱 9 双目显微镜n i k o ne 2 0 0 德国l e i c a 德国l e i c ar m 2 0 1 6 天津久圣医疗电子有限公司 上海博迅实业实验有限公司 1 3 主要试剂配置 1 3 1o 0 1mp b s ： n a 2 h p 0 41 1 6 6g ，n a h 2 p 0 41 1 8g ，n a c l3 4g ，加蒸馏水4 0 0 0m l 混匀， 用o 1n 的h c l 或n a o h 调p h = 7 2 - 7 4 。 1 3 2o o lm 枸橼酸盐抗原修复液( p h 6 o ) ： 枸橼酸三钠3g ，枸橼酸0 4g ，加蒸馏水1 0 0 0m l 混匀。 1 3 33 h 2 0 2 溶液： 3 0 的h 2 0 21 0m l 加入9 0m l 蒸馏水，充分混匀。 2 方法 2 1 取材、固定、包埋、切片 2 1 1 术后立即取材，以1 0 中性福尔马林液固定。 2 1 2 将组织块修成l c m xlc m x 0 3c m 大小。 2 1 37 0 酒精脱水1h 。 2 1 48 0 酒精脱水1h 。 2 1 59 5 酒精脱水1h 。 2 1 6 无水乙醇i 、1 1 分别脱水1 5h 。 2 1 7 二甲苯i 透明3 0m i n 。 2 1 8 二甲苯i i 透明3 0m i n 。 2 1 9 浸蜡，将组织块浸入石蜡i 中，6 5 7 0 2h 。 2 1 1 0 将组织块浸入石蜡i i 中，6 5 - - - 7 0 1h 。 2 1 1 1 包埋：将熔化的石蜡倒入包埋框，将浸蜡的组织块放入，冷却后修 饰蜡块。 2 1 1 2 载玻片的处理t 将载玻片浸酸过夜后，用自来水冲洗l o 次，再置 于蒸馏水中浸泡2 次，每次o 5 小时，最后置于架上晾干。 2 1 1 3 蘸片：将晾干的载玻片在多聚赖氨酸( a p e s 粘片剂) 中浸泡l m i n ， 置于架上晾干，以防脱片。 研究论文 2 2h e 染色。 2 2 1 切片5g m 厚，捞片后使用电热箱6 0 过夜。 2 2 2 将切片在二甲苯i 、i i 、i i i 中静置各5m i n ，脱蜡。 2 2 3 将切片放入无水乙醇i 、i i 静置各5m i n 洗去二甲苯。 2 2 4 将切片于9 5 、8 0 和7 0 酒精中各静置5 r a i n 。 2 2 5 自来水浸泡5m i n 。 2 2 6 苏木素中根据以往染色经验染色5m i n 。 2 2 7 自来水冲洗后放入1 的盐酸酒精中分化后立即取出。 2 2 8 自来水冲洗去分化。 2 2 9l 的氨水中返蓝1 5 - - - 3 0s ，自来水冲洗。 2 2 1 0 伊红染色5s ，自来水冲洗。 2 2 1 17 0 酒精中轻轻涮洗1 0s 。 2 2 1 28 0 酒精中静置2m i n 。 2 2 1 39 5 酒精中静置5m i n 。 2 2 1 4 无水乙醇i 、i i 中各1 0m i n 。 2 2 1 5 二甲苯i 、i i 中各1 0m i n 。 2 2 1 6 中性树胶封片。 2 3 免疫组织化学检测( 两步法) 2 3 1 切片4i t m 厚，切片烤蜡3h 。 2 3 2 切片常规二甲苯、梯度酒精脱蜡至水( 二甲苯i5m i n - - - - 甲苯i i5 r a i n - - - , - 甲苯5m i n 一无水酒精5m i ”无水酒精i i5m i n - - - , 9 5 酒精5 m i n - - - , 8 0 酒精5m i n 一7 0 酒精5r a i n ) 。 2 3 33 过氧化氢甲醇浸泡1 5m i n ，以灭活内源性过氧化物酶。 2 3 4o 1mp b s 浸泡3 次，每次5m i n 。 2 3 5 抗原修复采用0 0 1 m 柠檬酸( p h 6 o ) 缓冲液高压热修复2 分钟。 待温度降至室温。 2 3 6p b s 浸泡3 次，每次5m i n 。 2 3 7 滴加兔抗人、p i n c h 、v e g f 蛋白多克隆抗体( 1 ：7 0 ) ，置湿盒中放入 4 冰箱过夜。 2 3 8p b s 冲洗3 次，每次5m i n 。 2 3 9 滴加二步法检测试剂( 具体操作按照说明书进行) 。 研究论文 2 3 1 0p b s 冲洗3 次，每次5m i n 。 2 3 1 ld a b 显色：根据组织切片大小，每张片子上滴加5 0 山新配置的 显色液，镜下观察显色结果，待显色合适时，自来水冲洗5 分钟，终止显 色。 2 3 1 2 苏木素衬染2 分钟，脱水、透明、封固。 2 3 1 3 同步设有阳性和阴性对照：用阳性片作为阳性对照； 阴性对照采用p b s 代替一抗，其他步骤不变。 3 免疫组化结果判定标准 h i f 1 a 蛋白表达产物主要定位于细胞浆及核，v e g f 蛋白表达产物主 要定位于细胞浆，以在癌细胞胞浆中出现淡黄色至棕黄色颗粒者为阳性细 胞，凡细胞胞浆显色强度与背景无明显差别者为阴性细胞；p i n c h 蛋白 表达产物主要定位于细胞外间质中，尤其在肿瘤侵袭边缘间质的部分纤维 母细胞样细胞中表达明显，以间质中纤维母细胞样细胞的胞浆、癌细胞胞 浆出现棕黄色颗粒为阳性细胞，凡细胞间质及细胞显色强度与背景无明显 差别者为阴性细胞。 结果判定标准：计分标准参照许良中等【8 】的方法，随机选取1 0 个高 倍视野约l0 0 0 个细胞，计算阳性细胞百分比，结合染色强度进行评分， 以两者乘积为最后得分：0 分为阴性，l 7 分为阳性。 4 统计学方法 统计学处理采用s p s s l 3 0 统计软件，计数资料采用卡方检验进行统 计学处理，p 0 0 5 定为有统计学意义。 结果 1h i f 1 a 蛋白在喉鳞癌中的表达及与临床病理参数的关系 1 1h i f 1 a 在人喉鳞癌组织和癌旁正常喉粘膜组织中的表达情况 h i f 1 a 在1 0 例癌旁正常喉黏膜组织中仅l 例出现轻度的阳性表达， 阳性信号定位于鳞状上皮细胞胞浆，阳性表达率为1 0 ( 1 1 0 ) ；而在喉 鳞癌组织癌细胞的胞浆中可见致密浓染的棕黄色颗粒，部分切片显示在癌 细胞胞浆及胞核中均表达，阳性表达率为7 2 ( 3 6 5 0 ) ，显著高于癌旁正 常组织，统计学差异具有显著性( p 0 0 5 ) 。( 见t a b l el ，f i g 5 ，6 ，7 ) 。 研究论文 1 2h i f 1 a 在人喉鳞癌组织中的表达与年龄、性别、临床分型的关系 5 0 例病例中，男性组与女性组h i f 1 a 的阳性表达率分别为7 5 ( 3 3 4 4 ) 、5 0 ( 3 6 ) ，相比无显著统计学差异( p - = 0 3 3 1 ) ；6 0 岁以上患 者与6 0 岁以下患者中阳性表达率分别为9 0 9 ( 1 0 1 1 ) 、6 6 6 7 ( 2 6 3 9 ) ， 相比无显著统计学差异( p = 0 1 4 8 ) 。声门上型组和声门型组中的阳性表达 率分别为7 8 5 7 ( 2 2 2 8 ) 、6 3 6 4 ( 1 4 2 2 ) ，相比无显著统计学差异 ( p = o 2 4 3 ) ( 见t a b l e2 ) 。 1 3h i f 1 a 在人喉鳞癌组织中的表达与病理分级、淋巴结转移及临床分 期的关系 h i f 1 a