（特种经济动物饲养专业论文）家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析.pdf

家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析中文摘要 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 中文摘要 溶茧酶是蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种蛋白水解酶，用于水解、软化茧的 先端，以便于珊化后的蚕蛾脱茧而出。研究家蚕蛾溶茧酶，不仅对蚕蛾脱茧而出 这一生理过程的认识具有重要的理论意义，而且对蚕丝蛋白的进一步开发利用也 将产生积极的影响。 本研究以公布的溶茧酶基因部分序列为基础( g e n b a i l l ( 登录号：a b 2 5 7 5 6 5 ) ， 从刚羽化的家蚕蛾的头部提取总r n a ，利用c d n a 末端快速扩增技术( r a p i d 黝p l i f l c a t i o no f c d n ae n d s ，r a c e ) 克隆了家蚕溶茧酶5 端和3 端序列，获得了家 蚕蛾溶茧酶基因全长c d n a 序列( g e i l b 锄k 登录号：e f 4 2 8 9 8 0 ) ，该序列全长c d n a 有l0 4 7b p ，包括5 4b p 的5 端非编码区( 5 u t r ) 、7 8 0b p 的蛋白质编码区、终止 密码子t a a 和2 1 0b p 的3 端非编码区( 3 u t r ) 。该序列可编码2 6 0 个氨基酸的蛋白 质，预测蛋白质分子量为2 7 6k d ，等电点( p i ) 为8 8 8 6 。与家蚕基因组比对后发 现该基因包含4 个内含子和5 个外显子，外显子内含子边界符合经典的g t a g 规则。 用s i 鄹出p3 0s e n ，e r 程序分析家蚕蛾溶茧酶基因，预测其从第1 2 2 位为信号肽序 列。s m a r t 分析结果预测其第3 4 2 5 4 位氨基酸序列具有类胰蛋白的丝氨酸蛋白酶 活性，并且利用生物软件d n a s 吖岖分析了家蚕蛾溶茧酶基因c d l n a 序列的调控元 件，这些可为今后对溶茧酶基因的进一步研究提供参考。 构建的重组质粒p e t 3 2 a - c o c o o n a s e 转化e c d 厅b l 2 1 进行原核表达， s d s p a g e 分析结果表明，家蚕溶茧酶基因以融合蛋白形式表达，相对分子量为 4 8k d 。本研究还进一步构建了该基因的真核表达载体，在b a c t o b a c 系统中进行 表达，表达的2 7 6k d 蛋白，与推导的融合蛋白大小相符。该表达产物与茧丝反应 后，在电镜下观察茧丝的形态，结果表明，表达产物对茧丝的丝胶层有一定的水 解作用。 为了利用家蚕溶茧酶基因的启动子构建能够表达外源基因的生物工厂，通过 l 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 中文摘要 p c r 扩增获得该基因的启动子序列并进行克隆和序列分析。进一步构建了由 c o c o o l 搬e 启动子驱动报告基因g f p 的重组病毒载体b a c c n g f p p o l y a ，并在草地 贪夜蛾s f 9 细胞中进行了表达。结果显示：c o c o o n a s e 基因的启动子序列符合真核生 物启动子的特点，并具有复杂的茎环结构，这可能与蛋白表达的时空特异性有关。 病毒转染试验表明：c o c 0 0 n a s e 基因启动子可以驱动绿色荧光蛋白基因g f p 在培养 的s f 9 细胞中表达。 关键词：家蚕；溶茧酶基因；c d n a 片段末端扩增；序列分析；原核表达；真 核表达；杆状病毒系统；b a c - t o b a c 系统；启动子 作者：吴玉丹 指导教师：沈卫德 c l o n i n ga n de x p r e s s i o no ft h ec o c o o n a s eg e n e 矗o mc l o m n ga n c l 上，x p r e s s l o no tt n e 乙o c o o n a s eu e n et r o m 召d 聊协聊d 力a n da c t i v i t ya n a l y s i so f i t sp r o m o t e r a b s t r a c t c o c o o n 硒ei sap r o t e 嬲es e c r e t e db ys i l k m o md u r i n g “se c l o s i o n ，a i l du s e df o r h y d r o l y z i l l g 锄ds o r e i l i n gm ec o c o o ne n di nc o n v e i l i e n tf o rt l l ee s c a p eo fs i l k m o t l l 丘o m t l l ec o c o o na r e re c l o s i o n s t u d i e so nt l l es i l k m o t l lc o c o o n a s e 甜es i g n a l 时n o to i l l yi n n l eu i l d e r s t a l l d i n go fm ep h y s i o l o g i c a lp r o c e s so f 圮s i l k m o m se s c a p ef r o mc o c o o n ， b u ta l s oi nt h ee x p l o i t a t i o no fs i l kp r o t e i l l b 弱e do n 廿1 ep a n i a ls e q u e n c cr e l e 觞e di i l 此n a t i o m lc e n t e rf o rb i o t e c l l i l o l o g y i n f o m a t i o n ( g e l l e a i l l 【a c c e s s i o nn o a b 2 5 7 5 6 5 ) ，w e u s e dn l cr a p i d 锄p l i f i c a t i o no f c d na l d sm e dt 0c l o n et 1 1 e5 - a n d3 - dr e g i o n so f 1 ec o c 0 0 n 腮eg e n e 、) l ，i t ht l l e t o t a lr n a 丘o mm es i l k m o 也h e a d d 聊匆垮聊d ，fl ) t h e 伽l - l e n g t hc d n ao ft 1 1 e c o c 0 0 n 舔eg e 劬m 肋所鱼垮朋d 厂fi sl0 4 7b p 谢m 觚o r fo f7 8 0b p ，5 4b p 肌c l e o t i d es e q u e n c ei i l5 u t r ( 硼n 彻s l a t e dr e g i o n ) ，2 1ob pn u c l e o t i d es e q u c n c ei i l 3 u t r ( 1 1 1 1 t r a n s l a t e dr e 西0 n ) a n dt c r i l l i n a t i o nc o d o nt a a ( g e n b a i l l 【a c c e s s i o nn o e f 4 2 8 9 8 0 ) ，n l ep r o t e i nw l l i c hw 豁e n c o d e db y l ec o c 0 0 n a s eg e n ec o n t a i n s2 6 0 a m i r l 0a c i d s ，n 坨p r o t e i nm o l e c u l a rw e i g h ti sa b o u t2 7 6k da n di t si s o e l e c t r i cp o 硫i s 8 8 9 a na l i 罂瑚e n to f 1 ec d n as e q u e n c e 砌ln 坞s i l l ( 、o 衄g e n o m es e q u e n c e s r e v e a l e d 廿l a tt 1 1 e r ew e r e4i 1 1 _ 臼o n s 锄d5e x o n s 、) l ，i t l l i n 也eo p e i lr e a d i n gf 锄i i lt 1 1 e c o c o o 姗eg e n e 舶mb d 所妣聊d 厂f ，a 1 1 da l lo f 妇mc o n f b n l l e d 也cc 觚o i l i c a lg t - a g n 1 1 e s a i i l i n oa c i ds e q u e n c e 觚a l y s i n gb ys i g i l a lp3 os e r v e rs h o w e dt l 斌m e r ei sa s i 盟a lp 印t i d eo f2 2 锄i n 0 i d sa tt 1 1 en - t e m 血“p r e d i c t i o no fp r o t e i i lf o u i l c t i o n a l d o m a i n 砌i c a t e dt l l a tt l l e 仃y p s i n - l i l 【es e r i n ep r o t e a s ed o m a i l lo ft l l ec o c o o r l a s ei sf - r o m 3 4t 02 5 4 锄i n oa c i d t 融1w e9 0 tt h ef i l l l 1 e n g t l lc d n ao f 也ec o c o o n a s eg e n ea i l d 觚a l y s e di t sc o n t r o le 1 咖e n tb yn l eb i o l o g ys o f i w a r ed n a s t a r n l er e c o m b i n a n tp e t 一3 2 a c o c o o i l a s ew a sc 0 n s t r u c t e da n di n t l r o d u c e di nec d ，f b l 21t 0e x p r e s sa1 一h i s l i i l l 【e dp r o t e i nb yi p t g1 kr e s u l to fs d s - p a g e i c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f t l l ec o c o o n a g e n ef m mb d 研以州d r f 锄da c t i v i t y 锄a l y s i so f i t sp r o m o t e r a b s n a c t d e m o n s 仃a t e dt h a tm ee x p r e s s i o np r o d u c t sm i 鲥t e da tas i z eo f4 8k d f u n h e 肌o r e ，t h e c o c 0 0 n a s eg e n ew 缱e x p r e s s e du s i i l gb a c t 0 一b a cb a c u l o v i m se x p r e s s i o ns y s t e m s d s p a g er e s u l t ss h o w e dm a tas p e c i f i cb a l l dc o n s i s t e n t 、杭t hm ee x p e c t e ds i z eo f 如s i o np r o t e i i lw a sd e t e c t e da r o u l l d2 7 6m s e mm i c r 0 酽a p h sw e r et a l 【e nm e r t r e a t i n gs i l k w o m ls i l k 诚t h 廿l ee x p r e s s e dp r o t e i n ，锄dt 1 1 er e s u l t ss h o 、v e dm a tt l l e e x p r e s s e dp r o t e i l lc a nh y d r o l y z et h cs e r i c i r l et 0s o m e e x t e n t t oe s t a b l i s hab i o - f a c t 0 巧t 0p r o d u c ef o r e i g ng e n e ，t l l ec o c o o n a s e 舀m ep r o m o t e r 、v 弱c l o n e da n ds e q u e n c e d ar e c o m b i n 锄tv i l l j sn a m e db a c - c n g f p - p o l y aw 弱 c o n s 仇l c t e d ，i nw m c hm e 陀p o r t e rg e r 圮g f pw 嬲d d v e nb yc o c o o n a s ep r o m o t e r t h e p r o m o t e r s t i v 毋w 嬲也e nc h a m c t 耐z e db yr e c o n l b i i l a n tv i r u se x p r e s s i o na s s a y si l l s f 9c e l l so f 印d 咖p 招朋少咖，如r h er e s u l t so fas e q u c n c e 龃a l y s i ss h o w e dt l l a tn l e c o c o o m i s ep r o m o t e rp o s s e s s e s 也ec h a r a c t e r i s t i c so fae u k a 巧o t i cp r o m o t e r s e c o n d a r y s t r u c t u r e 盟a l y s i si 1 1 d i c a t e d t 1 1 a tt 1 1 e s e q u e n c eo ft l l ep r o m o t e rr e 西o nf 0 肌sa c o n l p l i c a t e ds t e m - l o o ps t r u c t u r e t 挝sm a yr e l a t et o 恤t i s s u es p e c i a l 时o rt l l et i r i l i i l g a n da c t i v i t ) ，o ft ：h ep r o t e i ne x p r e s s i o n 1 1 l er c s u no fv i m se x p e r i m e n t a t i o ns h o 、e d 也a t 廿l ec o c o o n 嬲eg e n ep r o m o t 盱c o u l dd r i v e 也er 印o r tg e 舱e x p r e s s i n gi nm es f 9c e l l s k e yw o r d s ：勘朋匆眵m d 一；c o c o o i l a s e ；r l m - 蛇e ；s e q u e n c e 趾a l y s i s ； p r o k a 巧0 t i ce x p r e s s i o n ； e l l l c 砒y o t i ce x p r e s s i o n ； b a c u l o v i m ss y s t e m ；b a c 如- b a c s y s t e m ；p r o m o t e r i v 晰t t e n b y ：w u y u d a n d 硫c t e d b y ：s h e nw b i d e 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作 所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表 或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的 材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人 承担本声明的法律责任。 研究生签名：塞墨殳 同期：型兰：! ：砷 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中 国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以 采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相 一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公仰( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：叁叁堡 日 导师签名： 砌孑蔓加 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析前言 玉上- j 一 刖昌 2 0 0 3 年1 1 月1 5 日，经过4 0 0 多名科研人员5 个多月的努力，中国已率先完成家 蚕基因组“框架图”绘制工作。根据计算机组装和数据分析结果表明，基因组测序完 成了6 倍的覆盖深度，所获序列覆盖了家蚕基因组的9 5 5 4 ，精确度达到了9 9 9 5 。 家蚕基因组是人类基因组的1 7 ，比水稻基因组大i 5 左右。中国家蚕基因组框架图 的完成，共获得1 69 4 8 个完整基因，其中有约5 0 0 0 个基因为新发现基因。 由上述背景可知，随着人类基因组计划的全面推进与十余种模式生物基因组 全序列测定的完成，基因组计划的重心己逐渐由结构基因组研究转移到功能基因 组研究，生命科学随之开始了一个新的纪元后基因组时代。家蚕是鳞翅目昆 虫的典型代表，家蚕基因组物理图谱的完成，为鳞翅目昆虫功能基因的研究提供 了良好的平台。 家蚕是完全变态昆虫，其世代的完成要经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。 而溶茧酶是蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种蛋白水解酶，用于水解软化茧的先端 以便于羽化后的蚕蛾脱茧而出，而且溶茧酶基因的表达具有独特的时空性，即只 在成虫初期的特定组织中表达。同时作为溶茧酶天然底物的蚕丝蛋白及其降解产 物有着广泛的用途，可以预见溶茧酶的研究对蚕丝蛋白的迸一步开发利用也将产 生积极的影响。 综上所述，我们可以确定对溶茧酶基因的研究具有生理和经济上的双重意义。 而本论文的主要目的是获得溶茧酶基因全长序列，进行原核和真核表达，并对表 达产物做酶活测定，同时对溶茧酶基因的启动子活性进行分析。 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 第一章 第一章蚕丝降解技术的研究进展 摘要：本章简要介绍了蚕丝蛋白的组成和结构，概述了蚕丝降解产物的应用 价值和降解技术的研究进展，并对溶茧酶蛋白的相关研究进展进行了总结。 关键词：蚕丝降解；蚕丝蛋白结构；溶茧酶蛋白 我国具有55 0 0 多年的栽桑养蚕历史，家蚕的主要产物蚕丝，也是人类最早 利用的天然蛋白质纤维之一。它由1 8 种氨基酸组成，其自古以来是作为衣服装饰 用品而加以利用的。而人们所熟知的手术用缝线，则反映了蚕丝用于非服饰类领 域的可能性，显示了蚕丝蛋白对人体的安全性、亲和性、无过敏反应等优点。目 前，蚕丝蛋白的应用范围已经涵盖了人们生产生活的各种领域，与人们的日常生 活息息相关。 虽然蚕丝蛋白的降解产物有着广泛的用途，但由于丝素蛋白是一种典型的卜 角蛋白，很难被普通的蛋白酶降解，其应用受到生产技术条件的制约。目前降解 丝素生产丝肽主要采用盐解法【1 1 、酸解法【2 】和碱解法【3 1 、酶解法等。本文综述了有 关的研究成果，对蚕丝降解技术的发展情况进行了总结。 l 蚕丝蛋白的组成和结构 1 1 蚕丝蛋白的组成 茧丝是由丝素蛋白( f i b r o i l l ) 和丝胶( s 耐c i n ) 两部分组成，丝胶包在丝素蛋白 的外部，约占重量的2 5 ，蚕丝中还有5 左右的杂质，丝素蛋白是蚕丝中主要的 组成部分，约占重量的7 0 。 丝素蛋白分子取反平狮叠片以平行的方式堆积成多层结构。链问主要以氢 键相连，层间则主要靠范德华力维系。该蛋白的一级结构显示，所有的甘氨酸位 于折叠片平面的一侧，丙氨酸和丝氨酸等都在平面的另一侧。这些具有小侧链的 甘氨酸( g 1 y ) 、丙氨酸a ) 和丝氨酸( s e d 约占总组成的8 5 ，三者的摩尔比为 4 ：3 ：1 ，这些链段大多位于丝素蛋白的结晶区域；而带有较大侧基的苯丙氨酸 ( p h e ) 、酪氨酸( t 蚋、色氨酸( t r y ) 等主要存在于非结晶区域【4 1 。 丝素蛋白和其他蛋白一样，除了包含c 、h 、o 、n 四种元素以外，还含有多种 其他元素，诸如k 、c a 、s i 、s r 、p 、f e 、c u 等元素。 2 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 第一章 1 2 丝素蛋白的结构 丝素蛋白的聚集态结构被认为由结晶态和无定形态两大部分组成，结晶度在 5 0 6 0 左右。丝素蛋白分子的构象可分为二类，即s i l ki 和s i l k i i 结构。区别 丝索的结晶形态，是把液状丝在室温条件下干燥固形化作用所产生的结晶结构， 称为s i l ki 型，而把丝纤维中的结晶结构，称为s i l k i i 型。s i l ki 结构包括无规线 团( r a n d o mc o i l ) 和a 螺旋( o 【- h e l i x ) ，s i l ki i 结构呈反平行伊折叠浯s h e e t ) 。 2 蚕丝降解产物的应用价值 蚕丝蛋白的不同分子量的降解产物对人体有不同的利用价值，如分子量6 万以 下的多肽与小分子量的低聚肽，包括一些氨基酸的混合物，可以制成如整肠剂等 功能性食品、饮料等；而分子量20 0 0 40 0 0 的多肽又是化妆品生产的基材；低分 子量的二肽、三肽及氨基酸则可以被直接吸收利用【5 】o 由此可见，蚕丝蛋白降解产 物的开发利用价值到目前为止还无可估量。 2 1 抗氧化肽 我国是蚕业大国，每年大量生产蚕丝的同时也产生了大量的废丝废茧等。如 果能降解废丝废茧来制备抗氧化肽，对减轻环境的污染，增加其附加值，促进我 国蚕业的可持续性发展，有一定的积极意义。这里所说的抗氧化剂不仅用于含脂 肪食品的抗氧化，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品的开发【6 】。 2 2 丝素食品 动物试验表明：丝素粉末的消化率为2 7 ，溶液达到4 7 ，如果将丝素降解到 氨基酸水平，那么可达到9 0 以上的消化率水平。丝素的营养价值主要在于氨基酸 的组成和低聚糖类型。例如占丝素氨基酸总量4 5 的甘氨酸和1 2 的丝氨酸有降低 血液中的胆固醇和血糖值，防治高血压、糖尿病及呼吸道疾病的作用；又如占3 0 的丙氨酸具有促进血液中酒精的分解，增强肝功能，有保肝护肝作用。此外，丝 素食品还具有防治帕金森氏症及抗菌的作用。 2 3 丝素肽 由丝素溶液制各的低聚肽，主要用于化妆品的生产。一般可以控制水解条件 而获得平均分子量较大的水溶性多肽，尤其是1 0 0 0 2 0 0 0 范围的多肽，不仅能长 期保持溶液状态的稳定性，而且还保留着某些程度的丝素特征。 丝素肽也可用于洗发护发剂的开发制备，由于头发的吸着性强，可以在头发 的表面形成一层结晶性膜，而起到护发的作用。 3 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 第一章 2 4 吸水性高分子材料 蚕丝多孔性、吸附性强的特点决定了丝素的持水能力较高。在丝素溶液中添 加丙烯酸进行聚合反应，可形成高吸水性的分子材料。这种性质可应用于经皮吸 收的缓释性药剂的开发，或者抑制一些挥发性物质的蒸发，还可以制备医用糊剂 材料等。 2 5 丝素膜 将丝素溶液注于聚乙烯薄膜上，适当控制溶液量，可制成无色透明的丝素膜， 再添加一些其他基材，可制成以丝素为主体的复合材料。例如，加入一定量的具 有抗血凝作用的肝素钠，制成人造血管。又如丝素蛋白对人体无排斥反应，对水 分的通透性好，可用于人造皮肤的研制。 2 6 酶和抗体的固定材料( 载体) 丝素膜经过不溶性处理后，可作为固定酶和抗体的载体。这种类型的载体无 化学反应，固定作用强，热安全性好，对酶的处理和电的渗析作用等的抵抗性也 高于非固定酶。 3 蚕丝蛋白的降解 3 1 蚕丝蛋白的盐解 刘京奇的研究结果表明，在相同的水解浓度、温度下，碱性条件下水解的分 子量最小；酸性条件下水解最慢，分子量较大；中性条件水解最快，一般5 5 1 h 就可水解完全。丝素的中性条件下的水解主要是指以中性盐c a c l 2 h 2 0 c 2 h 5 0 ( 1 ：8 ：2 摩尔比) 体系在不同温度下的水解情况【刀。 研究人员进一步探索，发现其它许多中性盐类也可以溶解丝素，如：锶、钡、 镁、锌、锂的卤素盐和硝酸盐以及钾、钠、铵、锌的硫氰酸盐等，其中以硫氰酸 锂的溶解性最好，水溶液呈中性，在室温下即可溶解大量丝素而不会引起丝素蛋 白质的肽链和氨基酸的降解，并可经过中空纤维透析除盐，得到再生丝素水溶液。 3 2 有机溶剂对蚕丝蛋白的降解 n 甲基吗啉- n 氧化物( n m m o ) 属非衍生化溶剂体系，1 9 3 9 年由研n a c h e r 等 首次报道他们发现三甲基氧化胺、三乙基氧化胺和二甲基环己基氧化胺等叔胺 氧化物可以溶解纤维素后来，j o l l i l s o n 进一步发现n m m o 更适合用作纤维素溶剂。 n m m o 是一种脂肪族环状叔胺氧化物，它由二甘醇与氨反应生成吗啉，再经甲基 化和h 2 0 2 氧化得到由于n o 键的强极性，n m m o 和沁屋o h 2 0 表现出对纤维 4 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析第一章 素很强的溶解能力【8 j 。 这种溶剂无毒且易于回收的特点也吸引了丝素肽研究者的目光。1 9 9 9 年 f r e d d i 【9 】首次以n m m o h 2 0 为溶剂，发现在一定的温度下丝纤维可以溶解在 n m m 0 h 2 0 溶液中。 3 3 碱溶液对蚕丝蛋白的降解 刘京奇研究了不同浓度的n a 0 h 溶液8 0 条件下对丝素蛋白的溶解效果，结果 显示水解液的浓度对丝素水解分子量的分布具有较大的影响，浓度越高，在相同 时间、相同温度下，被水解成的物质分子量越小。 3 4 酸溶液对蚕丝蛋白的降解 酸溶液对蚕丝蛋白的降解包括盐酸水解、磷酸水解、硫酸水解三种。李岩亮 等以废柞丝为原料，通过水解一中和一脱色一过滤一脱盐一干燥工艺流程制备柞 蚕丝素肽，并确定了柞蚕丝水解最佳工艺条件，即硫酸浓度为5 0 ，料酸比1 ：3 5 ， 水解温度1 0 0 水解时间1 0h 【1 0 1 。 3 5 蛋白酶对蚕丝蛋白的水解 自然界中存在着许多可以水解蛋白质的酶类，而采用不同的蛋白酶水解同一 种蛋白质，由于酶本身的特性不同，酶水解的位点不同，水解效果也不一样。黄 雷选取了六种蛋白酶为供选酶，在各自适宜的作用条件( 依据常规的应用范围决定) 下，水解浓度7 的丝素蛋白溶液，做对比实验，结果显示在相同的酶活用量下， 六种蛋白酶水解丝素蛋白的能力次序为：碱性蛋白酶( 触c a l 邪e2 4 l ) 复合风味蛋 白酶( f l a v o 啪e ) 复合蛋白酶( p r o t e n 瑚【) 木瓜蛋白酶 胰酶 5 3 7 酸性蛋白酶【l l 】。 3 5 1 碱性蛋白酶( 灿c a l 硒e ) 倪莉等以可溶性丝素粉末为原料，直接采用碱性蛋白酶舢c a l a s e 进行水解，制 备血管紧张素转化酶( a c e ) 活性抑制剂一丝素肽。结果显示水解度为2 0 的酶解产 物对a c e 具有最强的抑制作用【1 2 1 。 3 5 2 弹性蛋白酶( e l a s t 硒e ) 程万里等比较了不同蛋白酶对丝素水解作用的大小，结果表明弹性蛋白酶对 丝素的水解能力较强。这与蛋白酶的催化专一性是分不开的。根据资料报道，弹 性蛋白酶优先水解羧基端结合着中性非芳香基团的氨基酸残基，如丙氨酸( a l a ) 、 甘氨酸( g l y ) 、丝氨酸( s e r ) 、缬氨酸( v a l ) ，而这些氨基酸在丝蛋白分子中占有很大 的比例，因而弹性蛋白酶在水解丝素时，它的水解位点较多，相对水解能力较大【1 3 1 。 5 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析第一章 3 5 3 双酶联用水解蚕丝蛋白 游斌先后利用碱性蛋白酶a l c a i a s e 和f l a v o u 亿y m e r5 0 0 m g 对丝蛋白进行水解， 其中a l c a l 嬲e 酶是内切蛋白酶，f l a v o u r z ) ，m e r5 0 0 m g 酶是兼有内切和外切双重作用 的复合蛋白酶。实验研究表明在底物丝蛋白浓度7 条件下酶解的最适工艺为：用 a l c a l a s e 酶于p h 7 5 ，温度5 5 条件下水解、1 2 0 m i n ( 加酶量o 0 3 5 10 0 m 1 ) ，然 后用f l a v o u 亿y m e r5 0 0 m g 酶于p h 6 5 ，温度5 0 条件下水解、2 4 0 m i n ( 加酶量 0 0 2 0 9 ，10 0 m 1 ) 。 另外，陈华利用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶联合水解柞蚕丝也取得了较好的效果， 其确定的混合酶水解的最佳条件是，酶量比为l ：1 时，t 6 0 ，p h = 7 5 ，水解时间 为6 h ，此时混合酶的水解度为3 8 1 。 3 5 4 丝素酶( f e m o n a s e ) 1 9 9 8 年，意大利学者a n n a m 撕as 【1 4 】分离到一种可以以丝素蛋白为唯一碳源和 氮源的微生物v a r i o v o r 觚p a r a d o x u s 。2 0 0 0 年，g i u s 印p ef 等【1 5 】进一步从该微生物的 培养液中获到一种蛋白酶。这种丝素酶可以水解多种蛋白质，当以丝素为底物时， 其最适p h = 5 7 5 。c a 2 + 、m n 2 + 、m 矿+ 对它有激活作用，酶活性为1 0 u m g 。 还有一种丝素酶就是通常所说的溶茧酶( c o c o o n 雒e ) ，该酶有两种来源，一 种是k 粕o s 等人【1 6 】发现于家蚕成虫的消化系统，可以水解丝素和丝胶的蛋白质： 另一种是s u r n i d a 等人f 1 刁从预蛹将要解体的丝腺中提取的酶，其对丝素有降解活性。 4 溶茧酶的相关研究 溶茧酶是蚕蛾在羽化的过程中分泌的一种蛋白水解酶，用于水解软化茧的先 端以便于羽化后的蚕蛾脱茧而出，故蚕丝为其作用的天然底物。因此，对溶茧酶 的研究，有利于推动蚕丝降解技术的发展和对蚕丝蛋白的利用。 4 1 溶茧酶的分泌器官 家蚕溶茧酶的分泌器官究竟在什么部位，历来说法不一。k a f a t o s ( 1 9 6 7 ) 【1 研认为 该酶是由下鄂自身合成并分泌的。相关研究表明，吐出液中的酶物质是在蛹到成 虫的转化期间由下颚中简单的表皮细胞分化而成的巨大多倍体细胞分泌合成。而 日本学者江口正治( 1 9 7 3 ) 【1 9 】在家蚕蛾的中肠和嗦囊液中检测到具有水解丝胶和丝 素活性的酶，认为除下颚外，溶茧酶还起源于中肠和嗦囊。 国内学者对此也做了相关研究，例如，张翠红【2 0 1 观察了家蚕变态期间下鄂、 涎腺、中肠和嗉囊的组织形态结构，结果表明除嗉囊外，均具有明显的、常态的 6 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析第一章 细胞结构和分泌器官的一般特征。另外，张翠红还对家蚕变态期间消化器官的酶 活力进行了测定，结果显示除嗉囊外，在家蚕下颚、中肠和涎腺中均检测到了蛋 白酶、酯酶和纤溶酶的活力( 表1 1 ) 。由此判断除嗦囊外，下颚、中肠和涎腺都有可 能是溶茧酶的分泌器官。 表1 1 家蚕潜成虫的消化器官三种酶活力的测定结果 t a b l e s1 1d e t e m “n a t i o no fe n z v m a t i ca c t i v i t yo ft h em i ( 1 9 u ta n ds a l i v a 珂i ns i l k w o 衄 器官t i s s u e 蛋白酶活力( u 加g ) 酯酶活力( u 抽g )纤溶酶活力( 驯m g ) 堕丝箜呈箜垡塑垒曼曼堡墅曼堑堑! ! 丝至i 垒塑里璺! 丝堕里笪! i 壁 中肠m i d 觚 7 2 67 5 l2 6 3 下颚m a ) 【i l l a 5 2 34 1 92 1 4 涎腺s a l i v a 珂 6 0 35 2 31 4 7 嗉囊c r a w o00 注：表中数据为多次测定结果的平均值。( 引自张翠红，2 0 0 7 ) 4 2 溶茧酶的生化特性 国内学者应用改进的亲和层析方法从下颚组织蛋白中分离纯化出溶茧酶蛋 白，并对其酶学性质进行了较为细致的研究【2 1 1 ，相关结果证明： ( 1 ) 下颚溶茧酶在低p h 环境下水解n 一苯甲酰一l 一精氨酸乙酯盐酸盐 ( b a e e ) 的酯酶与纤溶酶活性很低，其对b 趟强与纤维蛋白水解活性的最适p h 值 均为8 o 。 ( 2 ) 下颚溶茧酶表现出对蛋白抑制剂二异丙基氟磷酸( d f p ) 的强敏感 性，0 3 锄n 0 比d f p 即对溶茧酶产生了1 0 0 的抑制作用，可见溶茧酶属于d f p 敏 感性蛋白水解酶。 ( 3 ) 下颚溶茧酶对再生丝胶蛋白液有强烈的水解作用，反应1 2 h 后的水解度 达到4 2 2 左右。 ( 4 ) 用纯化的溶茧酶制备的抗体与蛾吐出液产生了与阳性对照相似的阳性免 疫条带，这说明在家蚕蛾的吐出液中包含下颚溶茧酶蛋白组份。 4 3 溶茧酶的合成 王厚伟对家蚕变态期间溶茧酶原细胞群的变化进行了汇总( 表1 2 ) 。相关研究 结果表明，溶茧酶酶原的合成是成虫在茧内发育的第9 至1 4 天之间以一种加速度进 行的，最高合成速率达到每天每个酶原细胞产生1 5 1 0 1 0 分子，占该时期外颚叶细 胞合成总蛋白质量的6 0 左右。 7 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 第一章 表1 2 溶茧酶原细胞群的发育 天数( d )条件 表皮逐渐消退，d n a 大量合成( k a f a t o s ，1 9 7 2 ) 。 细胞开始分化( k a f a t o sa l l df e d e r1 9 6 8 ) 。 专门细胞开始联合，z 2 细胞包覆z l 细胞。 细胞联合清晰可见：d 细胞( 导管细胞) 包覆z 2 ，在z l 细胞中出现假鞭毛化。 z 1 和z 2 细胞从表面消失，表皮物质开始分泌。 表皮物质与导管内里产物合成完毕。由z i 和z 2 分泌的表皮物质逐渐沉积。在z 细 胞中。高尔基体和粗面内质网大量扩增。 表皮物质转化成主要导管和末端装置的基底，顶端z 2 和z i 细胞的细胞质从末端装 置中消退，形成细胞外贮存泡。期间，开始快速合成溶茧酶酶原。 酶原在空泡中出现。 酶原合成，并逐渐积累，导管延长，端部装置外围物质逐渐添加。 酶原合成达最大速率a f a t o s ，1 9 7 2 ) ，在z i 和z 2 细胞中高尔基体和粗面内质 网达最大程度的发育。 酶原合成下降伥a f ；n o s ，1 9 7 2 ) 酶原开始分泌并激活。 蛾羽化脱茧而出。细胞群逐渐衰退，并最终消失。 ( 引自王厚伟，2 0 0 5 ) 5 本研究的目的及意义 家蚕和果蝇都是昆虫研究的模式生物。这两种生物基因组序列的解析为功能 基因的研究提供了强有力的支持。与果蝇相比，家蚕具有一些独特的生理现象。 家蚕是完全变态昆虫，其世代的完成要经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。而溶 茧酶基因的表达具有独特的时空性，即只在成虫初期的特定组织中表达。蚕蛾要 想从“作茧自缚”的状态中解脱出来，就需要该蛋白的帮助，因此，该基因可以作为 成虫期的典型表达基因。其表达的蛋白质参与的生理过程大致如下：羽化时先由 口腔吐出含溶茧酶的弱碱性液体，使蚕茧先端茧层湿润而松解，继而用胸足拨开 已松解的茧丝，得以脱茧而出，这是绢丝类昆虫具有代表性的生理过程。 以上是研究溶茧酶的生物学价值，除此之外，对溶茧酶进行研究还具有较高 的经济价值。例如，在上文中总结的生产丝素肽的方法主要有盐解法、酸解法和 8 眦 5 6 蝴 椭 9 州 “ 塔 鲫 眦 5 6 啦 珊 9 m “ 塔 m 6 卜 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析第一章 碱解法等化学方法，但这些方法不是效果有限，就是会造成对氨基酸的破坏。如 用c a c l 2 水溶液降解可得到分子量在数万的丝蛋白，由于仍属于大分子蛋白而影响 其吸收和营养价值；酸水解使色氨酸全部破坏，丝氨酸、酪氨酸和苏氨酸部分破 坏；碱水解引起消旋作用而降低营养价值；酶水解反应条件温和对氨基酸破坏小 而成为降解丝蛋白的最有前途的方法，但目前报道的酶解所采用的植物蛋白酶、 动物蛋白酶和微生物酶的水解效率都不高，而蚕丝是溶茧酶的天然底物，因此， 利用溶茧酶生产丝素肽不失为一种比较理想的选择【2 2 j 。 然而利用天然溶茧酶蛋白来制备小分子生物活性肽的方法也存在缺陷。首先， 天然溶茧酶的来源有限，受到时间的限制，必须等到蛹羽化成蛾后才能收集其由 口腔吐出的液体( 其中含有溶茧酶) ，其次是不容易纯化，稳定性差，该蛋白离 开母体后，活性丧失地较快，不利于保存。 本实验室拟采用分子生物学的方法来解决溶茧酶来源有限的难题。虽然日本 学者h i d e t 0 s l l it s u d a ( g e l 迅a n k 登录号：a b 2 5 7 5 6 5 ) 和国内学者王厚伟均克隆到 了溶茧酶c d n a 片段，但这些片段都是不完整的。本研究的目的就在于希望能够克 隆到溶茧酶的全cd _ n a 片段，对该序列进行分析，并进一步对其进行原核和真核表 达。我们期望能够证实，溶茧酶基因的表达产物具有水解丝蛋白的能力，为今后 丝肽生产技术的发展提供技术储备。 9 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析第一章 参考文献 c h e nx ，蹦咖d p s h a 0z z ，v o l l r a t hf 2 0 0 1 r c g e n e r a t e d 曰d 聊咖s i l k s o l u t i o n ss t u d i e d 、杭t hr h e o l e t 巧锄df t i r p d 朋p ，4 2 ：99 6 9 99 7 4 冀瑞琴，王学英，石生林，夏润玺，王爱荣，陈俊文2 0 0 2 磷酸催化水解 柞蚕丝制取复合氨基酸的研究沈阳农业大学学报i3 3 ( 3 ) ：2 0 0 一2 0 1 陈芳艳，纪平雄，王林川，彭文芳2 0 0 2 不同水解程度丝素肽对黑色素生 成抑制能力的研究华南农业大学学报，2 3 ( 4 ) ：8 1 0 刘永成，邵正中，孙玉宇，于同隐1 9 9 8 蚕丝蛋白的结构和功能高分子 通报，3 ：1 7 2 2 朱良均，姚菊明，李幼禄1 9 9 7 蚕丝蛋白的氨基酸组成及其对人体的生理 功能中国蚕业，1 ：4 2 4 4 陈力宏，董荚，孙艳辉2 0 0 6 酶法制备蚕茧层抗氧化多肽水解液的研究蚕 业科学，3 2 ( 3 ) ：4 4 2 4 4 3 刘京奇2 0 0 4 水解丝素分子量分布及在染整中应用硕士论文，浙江理工 大学，4 2 4 8 吕昂，张俐娜2 0 0 7 纤维素溶剂研究进展高分子学报，1 0 ：9 3 7 9 4 3 f r e d d igp e s s i mgt s l l l 【a d am 19 9 9 s 、e 1 1 i n ga i l dd i s s o l u t i o no fs i u 【f i b r i o n 陴d 掰匆垮掰d r 习i i ln 哪e t l l y lm o 啦o l i n cn o x i d e i n t e m a t i o n a lj o u m a lo f b i o l o g i c a lm a c r o m a l e c u l e s ，2 4 ：2 5l 一2 6 3 李岩亮，刘颖，贾延华2 0 0 4 硫酸水解制备柞蚕丝素肽的研究辽宁丝绸， 4 ：8 9 黄雷2 0 0 6 酶法水解丝素蛋白工艺的优化及丝素肽抗氧化活性功能的研究 硕士论文，沈阳农业大学，1 9 3 2 倪莉1 9 9 9 食品蛋白质新资源废蚕丝蛋白的研究与开发博士论文， 无锡轻工大学，4 4 - 4 6 程万里，陈杰2 0 0 3 不同蛋白酶对丝素水解作用的比较丝绸，1 ：3 0 3 2 1 0 ， ， 】 ， ， ， ， 】 町 u 刁 习 n 口 p h 眵 口 隅p n n 家蚕溶茧酶基因的克隆、表达及其启动子的活性分析 第一章 1 4 】 【1 5 】 1 6 】 【1 7 】 1 8 】 【1 9 】 【2 0 】 犯l 】 【2 2 】 m 锄撕as e v e s ，m 撕ar 0 m a i l o ，0 r i oc i 诧r r i ，e ta 1 19 9 8 t h em i c r o b i a l d e g r a d a t i o no fs i l k ：a1 a b o r a t o r yi n v e s t i g a t i o n i n t e m a t i o n a lb i o d e t 嘶o r a t i o n & b i o d e 伊a d a t i o n ，4 2 ：2 0 3 2 1 1 g i