（运动人体科学专业论文）不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及bcl2蛋白表达的影响.pdf

摘要研究目的：本研究从运动健身的理念出发，利用8 周不同强度的有氧训练运动模型对大鼠比目鱼肌、腓肠肌、肱二头肌进行研究，测定不同强度运动组中不同骨骼肌细胞凋亡率，b c l 2 、b a x 蛋白表达情况及细胞内c e + 含量。探讨适宜的运动强度及运动量对骨骼肌细胞凋亡的影响，为科学合理的体育健身提供研究资料。研究方法：4 0 只三月龄雄性s d 大鼠随机分为安静对照组( c 组) 、小强度运动组、中等强度运动组和大强度运动组，各组训练8 周后取比目鱼肌、腓肠肌和肱二头肌，用于t u n e l ，b e l 2 、b a x 和c a 2 + 的检测。用美国c o m p i xs i m p l ep c i 生物显微分析图像系统进行分析，用s i m p l e p c i6 0 图像分析系统分析阳性产物。研究结果：( 1 ) t u n e l ：8 周不同强度训练后，大鼠比目鱼肌细胞凋亡指数小强度组比其他3 组低( p o 0 5 ) ，随着运动强度的加大，中等强度组细胞凋亡指数与安静组比较变化不明显，大强度组凋亡指数较其他组都高( p o 0 1 ) ；腓肠肌细胞凋亡指数大强度组凋亡指数较其他组都高( p o 0 1 ) ，其他组之间变化不明显；肱二头肌细胞凋亡指数小强度组较其他组最低，随运动强度加大，中等强度组和大强度组细胞凋亡指数都升高。( 2 ) b a x ：8 周的不同强度的训练，大鼠比目鱼肌b a x 表达中等强度组最高，小强度最低；腓肠肌b a x 表达各运动组均高于安静组，其中大强度组最高；肱二头肌b a x 表达大强度组最高，中等强度最低。( 3 ) b c l 2 ：经过8 周的不同强度的训练，大鼠比目鱼肌b c l 2 表达各运动组均高于安静组，其中大强度最高；腓肠肌b c l 2 表达小强度最高，大强度组最低；肱二头肌b c l 2 表达安静组比其它各组高，而大强度组中最低( 4 ) b c l 2 b a x ：经过8 周的不同强度的训练，大鼠比目鱼肌、腓肠肌b c l 2 b a x 比值小强度最高，与各组均有非常显著性差异；肱二头肌b c l 2 b a x 比值小强度最高，与中等强度组、大强度组均有非常显著性差异。( 5 ) c a 2 + ：经过8 周的不同强度的训练，大鼠骨骼肌钙离子含量各运动组均高于安静组，且均具有非常显著性差异。结论：( 1 ) 小强度的运动训练能抑制骨骼肌细胞的凋亡，能够有效的保护机体。( 2 ) 大强度的运动训练能诱导骨骼肌细胞的凋亡。( 3 ) 比目鱼肌( 慢肌) 细胞凋亡率比腓肠肌( 快肌) 细胞凋亡率要高，可能是大强度运动过程中的运动单位募集顺序的不同造成的。( 4 ) 在中等强度组训练中，肱二头肌细胞凋亡指数较安静组明显上升，而对比目鱼肌、腓肠肌细胞凋亡指数较安静组变化不明显。( 5 ) 比目鱼肌和腓肠肌经过小强度的运动训练，使b c l 2 b a x 的比值增高，有效的抑制细胞的凋亡，延缓衰老，增进健康，但肱二头肌经过中等强度的训练，b c l 2 b a x 的比值减小，可能诱发细胞凋亡的发生。( 6 ) 骨骼肌细胞内c a 2 + 的变化与细胞凋亡指数具有相关性。关键词：骨骼肌；细胞凋亡；b c l 2 基因；c a 2 +i la b s t r a c tr e s e a r c ho b j e c t i v e ：t h i sr e s e a r c he m b a r k sf r o mt h em o v e m e n tf i t n e s s si d e a ，u s i n g8 - w e e kt r a i n i n go fd i f f e r e n ti n t e n s i t ya e r o b i ce x e r c i s em o d e lt os t u d yr a t s o l e u sm u s c l e ，g a s t r o c n e m i u s ，b i c e p ss t u d y ，w ed e t e r m i n e dt h ed i f f e r e n ti n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u p so fd i f f e r e n ts k e l e t a lm u s c l ec e l la p o p t o s i s ，b c l 一2 ，b a xp r o t e i ne x p r e s s i o na n di n t r a c e l l u l a rc a 2 +c o n c e n t r a t i o n ，e x p l o r i n gt h ea p p r o p r i a t ee x e r c i s ei n t e n s i t ya n da m o u n to fe x e r c i s eo ns k e l e t a lm u s c l ec e l la p o p t o s i s ，f o rs c i e n t i f i ca n dr e a s o n a b l ep h y s i c a lf i t n e s st op r o v i d er e s e a r c hd a t a m e t h o d s ：4 0m a l et h r e e - m o n t hs dr a t sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of o u rg r o u p s ：q u i e tc o n t r o lg r o u p ( cg r o u p ) ，l o wi n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u p ( l eg r o u p ) ，m o d e r a t e i n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u p ( m eg r o u p ) a n dh i g h - i n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u p ( h eg r o u p ) ，e a c hg r o u pm a i n t a i n i n gt h ea b o v e - m e n t i o n e dl o a dt r a i n i n gt o8w e e k s t a k es o l e u s ，g a s t r o c n e m i u sa n db i c e p s ，t h es k e l e t a lm u s c l eo fl e f tl e gu s e df o r t u n e l ，c a 2 + ，a n db c l 2 、b a xd e t e c t i o n w i t ht h eu n i t e ds t a t e sc o m p i xs i m p l ep c ia n a l y s i so fb i o l o g i c a lm i c r o - i m a g i n gs y s t e mf o ra n a l y s i s ，u s i n gs i m p l e p c i6 0i m a g ea n a l y s i sp o s i t i v ep r o d u c t s r e s u l t s ：( 1 ) t u n e l ：a f t e r8 - w e e kd i f f e r e n ti n t e n s i t yt r a i n i n g ，r a ts o l e u sm u s c l ec e l la p o p t o s i si n d e xi nl o wi n t e n s i t yg r o u pt h a ni nt h eo t h e rt h r e eg r o u p st h el o w e s t ( p o 0 5 ) ，a l o n gw i t ht h ei n c r e a s i n ge x e r c i s ei n t e n s i t y ，m e d i u mi n t e n s i t yg r o u pc e l la p o p t o s i sd i dn o tc h a n g es i g n if i c a n t l y ，h i g h i n t e n s i t yg r o u pa p o p t o t i ci n d e xa r eh i g h e rt h a nt h o s eo fo t h e rg r o u p s ( p o o1 ) ，i i ig a s t r o c n e m i u sm u s c l ea p o p t o s i si n d e xo fh i g h i n t e n s i t yg r o u pa r eh i g h e rt h a nt h o s eo fo t h e rg r o u p s ( p o o1 ) ，w h i l et h eo t h e rg r o u p sd i dn o tc h a n g es i g n i f i c a n t l y ，b i c e p sc e l l sw i t ha p o p t o s i si n d e xo fs m a l l i n t e n s i t yg r o u pa r et h el o w e s t ，w i t ht h ee x e r c i s ei n t e n s i t yi n c r e a s e d ，a p o p t o s i si n d e xo fm o d e r a t e i n t e n s i t yg r o u pa n dt h eh i g h i n t e n s i t yg r o u ph a v ei n c r e a s e d ( 2 ) b a x ：m e d i u mi n t e n s i t yg r o u p sb a xc o n t e n ti sh i g h e s t ，a n dt h el o w - i n t e n s i t yi sl o w e s t ；g a s t r o c n e m i u sb a xc o n t e n ti nt h ee x e r c i s eg r o u pw e r eh i g h e rt h a naq u i e tg r o u p ，i nw h i c hh i g h i n t e n s i t yg r o u pi st h eh i g h e s t ；b i c e p sb a xc o n t e n ti st h eh i g h e s ti nh i g h - i n t e n s i t yg r o u p ，m e d i u mi n t e n s i t ya tl e a s t ( 3 ) b c l - 2 ：s o l e u sm u s c l e sb c l - 2c o n t e n ti nt h ee x e r c i s eg r o u pw e r eh i g h e rt h a nc o n t r o lg r o u p ，i nw h i c ht h eh i g h - i n t e n s i t yi st h el o w e s t ；g a s t r o c n e m i u sb c l - 2c o n t e n ti st h eh i g h e s ti nl o w - i n t e n s i t yi st h eh i g h e s t ，a n dh i g h - i n t e n s i t yi st h el o w e s t ；b i c e p sb c l - 2c o n t e n ti nc o n t r o lg r o u po ft h eh i g h e s ta n dl o w - i n t e n s i t yo ft h el o w e s t ( 4 ) b c l - 2 b a x ：s o l e u s 、g a s t r o c n e m i u s sb c l 一2 b a xr a t i oo fl o w i n t e n s i t ya r et h eh i g h e s t c o m p a r e dw i t ho t h e rg r o u p s t h e yh a v ev e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s ；b i c e p sb c l 一2 b a xr a t i oo ft h es m a l li n t e n s i t yi st h eh i g h e s t ，c o m p a r e dw i t hw i t hm o d e r a t e - i n t e n s i t yg r o u p ，h i g h - i n t e n s i t yg r o u pw e r ev e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( 5 ) c a 2 + ：r a ts k e l e t a lm u s c l e sc a 2 + c o n t e n ti ne x e r c i s eg r o u pw e r eh i g h e rt h a nt h eq u i e tg r o u p ，a n da l lh a v ev e r ys i g n i f i c a n td i f f e r e n c e c o n c l u s i o n ：( 1 ) s m a l l i n t e n s i t ye x e r c i s et r a i n i n gc a ni n h i b i ts k e l e t a lm u s c l ec e l l s1 va p o p t o s i s ，c a ne f f e c t i v e l yp r o t e c tt h eo r g a n i s m ( 2 ) h i g h - i n t e n s i t ye x e r c i s et r a i n i n gc a ni n d u c ea p o p t o s i si ns k e l e t a lm u s c l ec e l l s ( 3 ) t h es o l e u sm u s c l e ( s l o wm u s c l e ) c e l la p o p t o s i sr a t ei sh i g h e rt h a nt h eg a s t r o c n e m i u s ( f a s t - t w i t c h ) c e l l s ，t h i sm i g h tb eh i g h i n t e n s i t ye x e r c i s er a i s et h em o t o ru n i ti nad if f e r e n to r d e r ( 4 ) c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，b i c e p s a p o p t o s i si n d e xw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d ，w h i l et h es o l e u s ，g a s t r o c n e m i u sa p o p t o s i si n d e xd i dn o tc h a n g es i g n i f i c a n t l y ( 5 ) s o l e u sa n dg a s t r o c n e m i u sm u s c l e sa f t e rl o wi n t e n s i t ye x e r c i s et r a i n i n g ，b c l - 2 b a xr a t i oi n c r e a s e d ，t h i sr e s u l ts u g g e s t i n gt h a tl o wi n t e n s i t ye x e r c i s ec a ne f f e c t i v e l yi n h i b i tc e l la p o p t o s i s ，d e l a yc o n s e n e s c e n c ea n dp r o m o t eh e a l t h b u tt h eb i c e p sa f t e rm o d e r a t e i n t e n s i t yt r a i n i n g ，b c l 一2 b a xr a t i od e c r e a s e s ，i n t i m a t i n gt h a tm o d e r a t e i n t e n s i t yt r a i n i n gm a yt r i g g e rc e l la p o p t o s i s ( 6 ) s k e l e t a lm u s c l ec e l l sc a 2 + c o n t e n tc h a n g e si sr e l a t e dt oa p o p t o s i si n d e x k e y w o r d s ：s k e l e t a lm u s c l e ；c e l la p o p t o s i s ；b c l 2g e n e ：c a 2 +v缩略词表缩略词英文全名中文全名b c l 2c a s p a s en 小正ls o dm d ab c e l ll y m p h o m a l e u k e m i a - - 2b 细胞淋巴瘤白血病癌基因半胱天冬酶t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e m e d i a t e dd t u pn i c ke n dl a b e l i n g末端脱氧核糖核酸转移酶接到d t u p 缺口末端标记m i t o c h o n d r i ap e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e线粒体膜上通透性转换超氧化物歧化酶丙二醇不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b c l 2 蛋白表达的影响湖南师范大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立。进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：仅p4 耙秽砷j 。年2 - 月砰日湖南师范大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大学。同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于1 、保密口，在年解密后适用本授权书。2 、不保密曰。( 请在以上相应方框内打“4 )作者签名：孓f 7导师签名：湘日期：芦f 口年岁月z t - 日日期：洲。年ry j 珥日“6 7不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b c l 2 蛋白表达的影响1 前言骨骼肌作为人体运动的动力装备，完成人体的各项运动，而机体通过运动训练的刺激，能明显地改变骨骼肌的结构和功能。机体对运动地反应和适应有着高度的专一性、特异性，与运动的类型、强度有关。一方面通过适宜地运动训练使肌纤维增粗，改善骨骼肌的结构并提高自身功能，但另一方面过度地运动训练可导致骨骼肌结构损伤破坏，代谢紊乱，机能下降甚至机能障碍，特别在过度训练情况下。现代病理学研究证实，大强度的运动训练很容易导致细胞损伤甚至死亡，从而引起骨骼肌的损伤和凋亡。细胞凋亡发生于发育、成熟、衰老过程中，为维持内环境稳定而对不同有害刺激应答或在疾病中所产生的一种特殊的受d n a 基因控制的细胞自杀行为。它是细胞死亡的一种重要方式，细胞不是因受到伤害导致其死亡，而是维持生命新陈代谢的需要，遵循细胞自主有序性的结束其生命过程，及时清除多余的、受损的或衰老的细胞。国内外专家通过免疫组化、t u n e l 、凝胶电泳d n a 片段检测等方法对其检测，并通过其影响因子如：b c l 2 蛋白、p 5 3 蛋白、c a s p a s e 基因、自由基、n o 、c a 2 +等发现细胞凋亡【1 1 。细胞凋亡与运动类型、运动量有关，过度的运动能引起心、脑、肝、肾、肌肉以及神经系统、内分泌系统的损伤，这些损伤的发生过程细胞凋亡都有参与。近年来国内外对骨骼肌凋亡的研究越来越多，但通过运动对不同类型骨骼肌影响因子的研究却不多。s o n gw t 2 1 等对老龄大鼠进行了1 2 周的跑台耐力训练后发现，比目鱼肌中b c l 2 表达，运动组与对照组相比显著增加；而b a x 表达及b a x b c l 2 值均降低。有研究发现3 1 ，通过8周中等强度的运动训练后，成年大鼠的比目鱼肌b c l 2 表达比对照组高，b a x 表达比对照组低，但无显著性差异。李惠翔4 1 等对大鼠腓肠肌研究发现，中等强度运动组b c l 2 基因蛋白强阳性表达明显高于对照组，说明大鼠腓肠肌b c l 2 基因蛋白随一定强度的运动训练增加。本课题组成员周婕嘲，李江华 6 1 等对后肢肌慢肌比目鱼肌和快肌胫骨前肌、腓肠肌的比较，均已证实中等强度的运动比大强度运动更易诱导比目鱼肌细胞凋亡。c a 2 + 作为细胞内第二信使，在细胞凋亡信息传递中起着关键作用。据研究报道，c a 2 + 在细胞凋亡中的作用是两方面的，即可诱发，也可抑制。当胞c a 2 + 浓度升高可抑制凋亡，而c a 2 + 耗竭可导致细胞凋亡。b c l 2蛋白能控制细胞内钙离子的重新分隔，阻断某些因素的促凋亡过程。在凋亡过程的起始中，线粒体起着主要的作用1 7 。线粒体损伤对诱导细胞凋亡具有核心作用。研究还发现，b c l 2 基因对细胞内钙离子平衡的维持具有重要作用，而钙离子水平的变化与活性氧的产生密切相关【8 】。同时钙离子是活性氧介导细胞凋亡的重要物质。现已证实b c l 2 家族是长时间的力竭、低氧运动中诱导骨骼肌细胞凋亡的机制，并且本课题组的前期研究发现随运动强度的不同对慢肌和快肌的影响有一定的差异。但是在较长时间，经过系统的不同强度的常氧训练对慢、快肌细胞凋亡的影响及前后肢快肌细胞凋亡的影响并没有研究，本研究从运动健身的理念出发，利用8 周不同强度的有氧训练运| = ：间强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b c l 2 蛋白表达的影响动模型对大鼠比目鱼肌、腓肠肌、肱二头肌进行研究，测定不同强度运动组中不同骨骼肌细胞凋亡率，b c l 2 、b a x 蛋白表达情况及细胞内c a 2 +含量。探讨适宜的运动强度及运动量对骨骼肌细胞凋亡的影响，提供科学合理的体育健身研究资料。硕上学位论文2 材料与方法2 1 实验对象与动物模型2 1 1 实验研究对象与分组健康s d 大鼠4 0 只( 分4 组，每组1 0 只；3 月龄) ，以国家标准啮齿类动物饲养，实验期间室温保持2 0 2 5 。c ，相对湿度为5 0 5 ，每天光照1 2 h ，自由饮水，分笼饲养，坚持1 2 d 换一次垫料。大鼠适应性饲养1 周，每天以15 r n m i n 的速度进行1 0 m i n 适应性跑台练习。l周后将大鼠按体重分层，随机分为安静对照组( q u i e tc o n t r o lg r o u pc组) 、小强度运动组( l o wi n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u pl e 组) 、中等强度运动组( m o d e r a t e - i n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u pm e 组) 和大强度运动组( h i g h i n t e n s i t ye x e r c i s eg r o u ph e 组) ，对它们进行训练与观察，通过实验结果的统计分析。参照孙晓娟| 9 , 1 0 1 及b e d f o r d t l l l 的运动负荷标准。采用杭州立泰科技有限公司p t 动物实验跑台，具体训练方案为：训练开始时，l e 组、m e组、h e 组均以1 5 m m i n x1 5 m i n 的运动负荷训练，以后速度隔日增加2 m m i n ，时间增加5 m i n ，至l e 组达1 9 r n m i n x6 0 m i n ，m e 组达2 6 m m i nx 4 4 m i n ，h e 组达3 4 m m i n x 3 4 m i n 时( 如表1 1 ) ，各组维持上述负荷训练至8 周结束。每天观察大鼠的一般状况，测量饮食量和体重以监不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b c l 2 蛋白表达的影响控建模过程。表2 - 1 大鼠各组运动强度安排t a b l e 2 1e x e r c i s ei m e n s i t ya r r a n g e m e n to fr a t si ne a c hg r o u p组别运动强度对照组(c组)0小强度运动组( l e 组)中等强度运动组( m e 组)大强度运动组( ti e 组)1 9 m m i n 6 0 m i n2 6 m m i n 4 4 m i n3 4 m m i n 3 4 m i n2 1 2 实验试剂试剂名称生产厂家b a x 、b c l 2 鼠单抗i g g ( i 抗)武汉博士德生物工程有限公司考马斯亮兰蛋白测定试剂盒南京建成生物工程有限公司c a 2 + 测定试剂盒南京建成生物工程有限公司磷酸盐缓冲液p b s ( o 0 1 mp h 7 2 7 4 ) 福州迈新生物技术开发有限公司t b s 液、枸橼酸盐组织抗原修复液北京中杉金桥生物工程有限公司生理盐水湖南科伦制药有限公司其他的常用试剂如：甲醇、无水乙醇、9 5 乙醇、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、3 0 h 2 0 2 、二甲苯、多聚甲醛、甲醇、冰醋酸和浓硫酸等购置与国药集团化学试剂有限公司和天津市大茂化学试剂厂2 2 实验仪器p t 动物电动跑台浙江杭州立泰科技有限公司s h h w 2 1 6 0 0 型三用恒温水箱天津市莱斯特仪器有限公司硕士学位论文s 2 9 3 自动双重纯水蒸馏器上海亚荣生化仪器厂全自动数显立式高压蒸汽灭菌器上海博迅医疗器械公司a e 2 6 0 s 电子分析天平梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司包埋机江苏金坛医疗器械厂光学显微镜德国l e i c a 公司i p i i i 摊片机广东肇庆市凌峰电子器械厂8 2 0 轮转组织切片机美国a o 公司7 2 0 0 可见分光光度计北京瑞利分析仪器公司b c 3 0 0 0 全自动血细胞分析仪深圳迈瑞生物医疗股份有限公司t g l 16 c 台式高速离心机湖南星科科学仪器设备有限公司o l y m p u sb x 5 2 显微图像采集系统日本奥林巴斯株式会社2 3 骨骼肌组织标本的制作最后一次运动实验结束2 4 小时后，用1 0 水合漉醛2 m l 每只腹腔注射，麻醉大鼠后，断头处死。取比目鱼肌、腓肠肌和肱二头肌，用冰生理盐水洗去残留的血迹，尽可能去掉脂肪组织和结缔组织。其中，左腿的比目鱼肌、腓肠肌和肱二头肌立即放入液氮中冷冻，用于制作1 0 的组织匀浆；右腿的比目鱼肌、腓肠肌和肱二头肌立即放入4 的多聚甲醛中固2 4 小时后进行常规石蜡包埋，用于制作免疫组织化学的标本。2 4 实验指标和测试方法2 4 1 切片的制作将固定于4 中性多聚甲醛液的肌组织块放入( 7 5 一8 5 一9 0 一9 5 一1 0 0 一1 0 0 ) 梯度酒精脱水中，两次二甲苯透明后进行常规石不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b d 一2 蟹白表达的影响蜡包埋。使用石蜡切片机，将蜡块切成5 u m 的切片。2 4 2 样本制作任取部分腓肠肌、比目鱼肌、肱二头肌用生理盐水漂洗后，滤纸吸干，准确称取其重量，按重量体积比1 ：9 加生理盐水，手工匀浆后制成1 0 组织匀浆待测。取部分1 0 的组织匀浆，以3 0 0 0 转r a i n 离心1 0 m i n ，然后取其上清再用生理盐水按1 ：9 稀释成1 的组织匀浆，用于考马斯亮兰蛋白测定；取部分1 0 组织匀浆液，用于线粒体c a 2 + 含量的制备。2 5 实验方法2 5 1 细胞凋亡t u n e l 标记法凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活，细胞自身的染色质或d n a 被切割，出现单链或双链缺口，并产生d n a 断点数目相同的3 o h 末端。末端脱氧核糖核酸转移酶( t e r m i n a ld e o x y n u c l e o t i d y lt r a n s f e r a s e ) 可以将地高辛标记的d u t p ( d i g d u t p ) 标记至3 o h 末端，d i g d u t p 结合在d n a 断点部位，可以通过生物标记的抗地高辛抗体( a n t i d i o t i n ) 反应后，再结合链酶亲和素过氧化物酶( s a b c ) ，然后加入显色底物d a b 予以显示。凋亡的细胞核呈黄色，从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡的细胞。操作步骤：1 、新鲜配制3 h 2 0 2 ，室温处理l o 分钟。蒸馏水洗涤2 分钟3 次。2 、标本片加0 0 1 mt 1 3 s 1 ：2 0 0 新鲜稀释p r o t e i n a s ek3 7 。c 消化1 0 1 5 分7硕上学位论文钟，0 0 1 mt b s 洗2 分钟3 次。3 、标本片加标记缓冲液( l a b e l i n gb u f f e r ) 2 0 u l 片，以保持切片湿润。按每张切片取t d t 和d i g u t p 各1 u l ，加入1 8u l 标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，2 0 u l 片。置样品于湿盒中，3 7 。c 标记2 小时。4 、0 0 1 mt b s 洗2 分钟3 次。5 、加封闭液5 0 u l 片，室温3 0 分钟，甩掉封闭液，不洗。6 、用抗体稀释液1 ：1 0 0 稀释生物素化抗地高辛抗体：( 取l m l 抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体1 0 u 1 ) ，混匀后5 0 u l 片加至标本上。置样品于湿盒中，3 7 反应3 0 分钟。0 0 1 mt b s 洗2 分钟3 次。7 、用抗体稀释液1 ：1 0 0 稀释s a b c ：取l m l 抗体稀释洲加s a b c1 0 u l ，混匀后5 0 u l 片加至切片。3 7 反应3 0 分钟，o 0 1 mt b s 洗5 分钟4次。8 、d a b 显色：取l m l 蒸馏水，分别加入d a b 试剂盒中a ，b ，c 试剂各一滴，混匀后加至标本片上，显色l o 3 0 分钟左右。水洗。9 、苏木素轻度复染。0 0 1 mt b s 洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片。显微镜观察。2 5 2b a x 和b c l 2 的免疫组织化学的测定免疫组织化学技术是利用特异性一级抗体与肌组织中b a x 、b c l 2抗原结合，通过化学反应后，显色剂使生成的抗原抗体复合物染成棕褐色或棕黄色。对肌组织中b a x 、b c l 2 进行定位、定性及定量的研究。具体步骤如下：蜡切片于二甲苯脱蜡后，于剃度乙醇脱水；经自来水冲不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b c l 2 蛋白表达的影响洗后用3 的h 2 0 2 室温孵育1 0 m i n ，切片浸入p h 6 0 的柠檬酸，通过微波修复抗原，常温冷却后p b s 冲洗5 m i n x 3 次，1 0 t h 羊血清室温孵育1 0 m i n ，减少或消除非特异性染色；滴加b a x 、b c l 2 一抗( 1 ：5 0 ) 5 0 9 l ，置4 。c 冰箱过夜；次日取出切片后恢复常温后p b s 冲洗5 m i n x 3 次，滴加二抗，3 7 。c 孵育3 0 m i n ( 烤片) ，p b s 冲洗5 m i n x 3 次，d a b 显色4 5m i n ，蒸馏水充分冲洗，苏木素染色5 m i n ，1 的盐酸酒精分色数秒；烘干后，中性树胶封片。在光学显微镜下，每张切片镜下( x 4 0 0 ) 随机取5 - 6 个视野进行分析，用美国c o m p i xs i m p l ep c i 生物显微分析图像系统进行分析，用s i m p l e p c i6 0 图像分析系统分析阳性产物。2 5 3 肌组织蛋白含量的测定通过考马斯亮兰法测定肌组织蛋白含量。蛋白质分子具有n h 3 + 基团，当棕红色的考马斯亮兰显色剂加入蛋白质标准液或样品中时，考马斯亮兰染料上的阴离子与蛋白质n h 3 + 结合，使溶液变为蓝色，通过以5 9 5 n m ，l c m 光径的分管光度计测定各管吸光度( o d ) 值可计算出蛋白含量。具体操作按照试剂盒说明书进行，计算公式为：蛋白含量( g i n )= ( 测定管o d 值一空白管o d 值) ( 标准管o d 值一空白管o d 值)标准管浓度( g l )2 5 4 肌组织c a 2 + 的测定通过c a 2 + 在碱性溶液中与甲基香酚蓝( m t b ) 相结合，生成蓝色络合物，通过比色与同样处理的钙标准进行比较，计算出钙的含量，在9硕士学位论文5 5 0 n m ，0 5 c m 光径的分管光度计测定各管吸光度( o d ) 值。具体操作按试剂盒说明书进行，计算公式：钙( m m o l g p r o t ) = ( 测定管o d 值一空白管o d 值) ( 标准管o d 值一空白管o d 值) 标准品浓度( 2 5 n m o l 1 ) 蛋白含量( g p r o t 1 )2 6 质量监控在实验中，先将所用玻璃仪器全部洗涤刷洗，再用重铬酸钾洗液浸泡至少2 4 小时，多次清水冲洗，再用蒸馏水润洗3 5 次。在主要实验过程中，其步骤应注意：( 1 ) 将石蜡切片进行脱蜡时，观察二甲苯1 0 m i n 、二甲苯1 0 m i n 与二甲苯2 m i n 、二甲苯2 m i n 、二甲苯2 m i n 之间的效果；( 2 ) 同一组肌组织切片分别以一抗p b s 比为1 ：2 0 0 ，1 ：1 0 0 ，1 ：5 0 ，l ：2 0由高到低不同浓度工作液的孵育，并找出在不同孵育时间下，4 。c 冰箱过夜与室温静置l h ，观察染色结果，并找出最佳效果；( 3 ) 在同一组肌组织切片中找出二抗孵育的最佳时问；( 4 ) 在微波高压修复抗原过程中，找出最佳高压修复时间，发现微火力为8 0 力h 热7 m i n ，然后8m i n ，停2m i n ，再加1 0m i n 为最好；( 5 ) 在显微镜下观察d a b 染色时染色情况，严格控制染色时间，以避免着色太浅或背景着色。如进行当次免疫组化实验过程中，在其它操作步骤均不改变的情况下，仅改变一种实验步骤，以便找出最佳实验条件与方法。( 6 ) 实验所需试剂必须配制新鲜。特别在检测t u n e l 实验时，测试试剂必须配制新鲜，在进行微波高压修复时，需用温度计测量枸橼酸缓冲不同强度运动对骨骼肌细胞凋产及b a x 、b c l - 2 蛋白表达的影响液达到9 5 ，并保持5 m i n 。2 7 统计学分析所有的数据用“平均值士标准差”( = 士s ) 表示；各组间显著性差异采用方差分析、组内显著性差异用双侧t 检验，显著水平取a = 0 0 5 ；所有数据均用s p s s16 0 统计学软件进行处理。3实验结果3 1 实验前后体重变化情况如表3 1 所示，经过两个月的训练，各组老鼠的体重明显增加，但安静组与各运动组相比，体重明显增加，安静组与小强度组( p o 0 5 ) 、中等强度组相比( p o 0 5 ) 及大强度组相比( p o 0 1 ) ，均具有显著性意义。说明强度适宜的有氧运动能控制体重，有效的达到减肥的目地。表3 - 1 实验前后大鼠体重变化表t a b l e3 - 1t h ec h a n g eo fr a t s w e i g h tb e f o r ea n da f t e re x p e r i m e n t a l组别实验前体重( g )实验后体重( g )注：。与c 相比，p 0 0 5 ；一与c 相比，p 0 0 1 。3 2 不同运动强度对不同类型骨骼肌凋亡细胞核t u n e l 结果的影响凋亡细胞核通过t u n e l 法进行标记，在形态变化上，凋亡细胞呈圆形或椭圆形，凋亡细胞核呈棕褐色或棕色着染，形态不规整，呈碎点状，大小不一致。经苏木素复染非凋亡正常细胞的细胞核呈蓝色，核相对比较大，形态大小差异不大。3 2 1 不同运动强度对比目鱼肌凋亡细胞核t u n e l 结果的影响通过t u n e l 法标记结果发现，不管在什么状态下，比目鱼肌都能检测到t u n e l 阳染细胞核，安静组和中等强度组中，都能看到少量阳性的细胞核，小强度运动偶尔能发现少量阳性的细胞核，而大强度运动1 不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b e ! 2 蛋白表达的影响中能明显的看到深棕褐色阳性细胞核( 见附图1 ) 。与安静组相比，小强度组凋亡指数明显减少，具有显著性差异( p o 0 5 ) ，大强度凋亡指数明显升高，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) ；小强度与中等强度相比，具有显著性差异( p o 0 5 ) ，小强度与大强度相比，具有非常显著性差异( p 0 0 1 ) ，中等强度与大强度相比，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) 。( 如表3 2 ，图3 1 )表3 2 不同运动强度对比目鱼肌凋亡指数的影响t a b l e3 - 2e f f e c t so fd i f f e r e n te x e r c i s ei n t e n s i t i e so na p o p t o t i ci n d e x o fs o l e u sm u s c l e注：# 与c 相比，p o 0 5 ；# # 与c 相比，p 0 0 1 ；与l e 相比，p 0 0 5 ：与l e 相比，p 0 0 1 ；与m e 相比，p o 0 1 。1 21 08642 |0lcl em eh el 叫! - 蝈鱼则图3 一l 不同运动强度对比目鱼肌凋亡指数的影响f i 9 3 - 1e f f e c t so f d i f f e r e n te x e r c i s ei n t e n s i t i e so na p o p t o t i ci n d e xo fs o l e u sm u s c l e硕上学位论文3 2 2 不同运动强度对腓肠肌凋亡细胞核t u n e l 结果的影响通过t u n e l 法标记结果发现，不管在什么状态下，腓肠肌都能检测到n 肥l 阳染细胞核，安静组和中等强度组中，都能看到少量阳性的细胞核，小强度运动偶尔能发现少量阳性的细胞核，而大强度运动中能明显的看到深棕褐色阳性细胞核( 见附图2 ) 。与安静组相比，大强度凋亡指数明显升高，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) ；小强度与大强度相比，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) ，中等强度与大强度相比，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) 。( 如表3 3 ，图3 2 )表3 3 不同运动强度对腓肠肌凋亡指数的变化t a b l e3 - 3d i f f e r e n te x e r c i s ei n t e n s i t i e so nt h ec h a n g e si na p o p t o t i ci n d e xg a s t r o c n e m i u s注：# # 与c 相比，p 0 0 1 ；与l e 相比，p 0 0 1 ； 与m e 相比，p 0 0 1 。r 一一1l 壁题则图3 - 2 不同运动强度对腓肠肌凋亡指数的变化f i 驴- 2d i f f e r e n te x e r c i s ei n t e n s i t i e so nt h ec h a n g e si na p o p t o t i ci n d e xg a s t r o c n e m i u s不同强度运动对骨骼肌细胞凋亡及b a x 、b c l 2 蛋白表达的影响3 2 3 不同运动强度对肱二头肌凋亡细胞核t u n e l 结果的影响通过t u n e l 法标记结果发现，不管在什么状态下，肱二头肌都能检测到n 眦l 阳染细胞核，安静组和中等强度组中，都能看到少量阳性的细胞核，小强度运动偶尔能发现少量阳性的细胞核，而中等强度运动中能明显的看到深棕褐色阳性细胞核( 见附图3 ) 。与安静组相比，中等强度、大强度凋亡指数明显升高，具有非常显著性差异( p 0 0 1 ) ；小强度与中等强度、大强度相比，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) ，中等强度与大强度相比，具有非常显著性差异( p o 0 1 ) 。( 如表3 4 ，图3 - 3 )表3 - 4 不同运动强度对肱二头肌凋亡指数的变化t a b l e3 - 4d i f f e r e n te x e r c i s ei n t e n s i t i e so nc h a n g e si na p o p t o t i ci n d e xb i c e p sb r a c h i i注：# # 与c 相比，p o 0 1 ；与l e 相比，p o 0 1