（海洋生物学专业论文）小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化.pdf

小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 摘要 本论文采用分子生物学方法对一株从形态学上被认为小球藻属的藻株进行 鉴定，确定它是蛋白核小球藻( c h l o r e l l ap y r e n o i d o s a ) 。之后通过单细胞分离法 和紫外诱变两种方法来筛选具有优良性状的小球藻。以期能获得生长速度快，蛋 白含量高的小球藻株系。并对高产诱变株进行了光照、温度和氮源等培养条件的 优化。 通过克隆c h l o r e l l as p 的核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶伽氧酶( r u b i s c o ) 大亚基基 因，利用分子生物学方法进行进行种质鉴定，对单克隆测序结果作b l a s t n 序列 比对及分子系统学分析，并构建了系统树，结果都显示该未定种与蛋白核小球藻 亲缘关系最近，分子系统学分析中两者的靴带支持率高达1 0 0 ，可以初步判断 该未定种为蛋白核小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 。 利用单细胞分离法从1 2 0 ：昧- j 球藻单克隆株系中筛选得到一个株系，其生长 速度、蛋白含量和其他生理特征均优于其他株系，初步命名为cp y r e n o i d o s aq 7 。 为进一步提高其生长速度和蛋白含量，以其作为出发株进行紫外诱变。诱变剂量 为3 0 w 紫外灯、照射距离1 5 e r a ，辐射时间2 0 m i n 。经粗筛选、两轮比较筛选和重 复验证，我们从1 2 0 株诱变单克隆中筛选得到三株生长速度、蛋白含量高于其他 株的诱变株：cp y r e n o i d o s am 5 1 、cp y r e n o i d o s am 5 9 、cp y r e n o i d o s am 7 3 。与 出发株q 7 相比，诱变株m 5 l 、m 5 9 、m 7 3 的生长速率分别提高了6 2 3 、3 ，8 、 5 9 2 。蛋白含量分别提高了2 5 、3 1 、1 9 。同时，分析了诱变株的稳定性， 将诱变株第五代与第一代的生长曲线相比较，结果表明，诱变株有良好的稳定性。 我们对m 5 1 、m 5 9 、m 7 3 进行光照和湿度试验，以探讨他们生长的最适光 照和温度条件，结果表明，在1 4 0 p a n o l m o s 1 、2 5 c 时，诱变株的生长速度最快， 而且m 5 1 的生长速度大于m 5 9 、m 7 3 ，这与前面筛选时结果一致，它最具备工 业化养殖的潜力，因此，以m 5 1 为对象，研究了单一氮源及不同氮源组合对其 生长速度和蛋白含量的影响。当仅以尿素【c o ( n h 2 ) 2 】或硝酸钠( n 削0 3 ) 为氮源时， 小球藻生长较缓慢，生物量低，当仅以碳酸氢铵( n h c h c 0 3 ) 为氮源时，小球藻生 长较快，细胞密度可达3 2 1 5 x 1 0 5 r n l ，是适于小球藻生长的氮源。根据单因子试 验结果设计正交实验，正交分析结果表明：最适于藻生长的氮源组合为：尿素 7 0 0m g l ，碳酸氢铵1 2 5m g l ，硝酸钠0m g l 。最适于藻积累蛋白的组合为：尿 素7 0 0m g l 、n h 4 h c 0 35 0 0m g l 、n a n 0 3 1 5 0m g l 。 关键词：小球藻；蛋白含量；核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶，力口氧酶； 紫外诱变； 正交设计；氮源；生长速度 6 n ei d e n t i f i c a t i o no fc h l o r e h a s p ，s e l e c t i o no fp r o u c t i v e s t r a i n sa n do p t i m i z a t i o no fc u l t u r ec o n d i t i o n s a b s t r a c t i nt h i sp a p e r , t h ea l g ew a s p r e l i m i n a r yi d e n t i f i e a t e da sc h l o r e l l as p b a s e do ni t s m o r p h o l o g i c a lf e a t u r e s t h e nt h ec h l o r e l l as p w a si d e n t i f i e a t e da sc h l o r e l l a p y r e n o i d o s au s i n gm o l e c u l a rm e t h o d s t h em o n o c l o n yi s o l a t i o na n du l t r a v i o l e t r a d i a t i o nm u t a g e n e s i sa r eu s e dt os e l e c tp r o d u c t i v es t r a i n sw h i c hg r o wf a s t e ra n d c o n t a i nm o r ep r o t e i n t h ec u l t u r ec o n d i t i o n ss u c ha sl i g h t , t e m p r e m r ea n dn i 虹o g e n s m 】职o f p r o d u c t i v em u t a n t sw a so p t i m i z e d t h er i b u l o s e 一1 ，5 - b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s el a r g es u b u n i t ( r b e l ) g e n e w a sc l o n e dt oi d e n f i f i e a t e dc h l o r e l l as p w ea n a l y s i s e dt h es e q u e n c eu s i n gb l a s t n a n dm o l e c u l a rs y s t e r n a f i c sm e t h o d s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec h l o r e l l as p a n d c h l o r e l l a p y r e n o i d o s ah a v et h ec l o s e s tr e l a t i o n s h i pw i t hh i 曲b o o t s t r pv a l u e s ( 1 0 0 ) i tc a nb ec o n c l u d e dt h a tt h ec h l o r e l l as p i sc h l o r e l l a p y r e n o i d o s a w ef i l t r a t e das t r a i n ，n a m e dc h l o r e l t a p y r e n o i d o s aq t , b ys i n g l ec l o n em e t h o d t h e nt h ec h l o r e l l ap y r e n o i d o s aq 7w a sr a d i a t e di n3 0 wu l t r a v i o l e tl i g h t t h e i r r a d i a t i o nd i s t a n c ew a s1 5c ma n dt i m ew a s2 0m i n w eg o t3s t r a i n so fm u t a n t s ， n a m e dc h l o r e l l at r y r e n o i d o s am 5 1 ，c h t o r e l l ap y r e n o i d o s am 5 9a n dc h l o r e l l a p y r e n o i d o s am 7 3 ，f r o m1 2 0c l o n e s t h e yg r o wf a s t e ra n dc o n t a i nm o r ep r o t e i nt h a n o t h e rs t r a i n s c o m p a r e dw i t hp a r e n ts t r a i nq 7 ，t h eg r o w t hr a t eo fm u t a n t sm 5 1 ，m 5 9 a n dm 7 3w a si n c r e a s e db y6 2 3 3 8 a n d5 9 2 r e s p e c t i v e l ya n dt h e i rp r o t e i n c o n t e n tw a si n c r e a s e db y2 5 3 1 a n d1 9 r e s p e c t i v e l y 1 1 1 e i rg e n e t i cs t a b i l i t y w a sa n a l y s e da l s o g o o dg e n e t i cs t a b i l i t yw a sc o n c l u d e d t h em o s ts u i t a b l ef o s t e rs i t u a t i o no fp r o d u c t i v em u t a n ts t r a i n sw a ss t u d i e d i t s h o w e dt h a tt h ep r o d u c t i v es t r a i n sh a v eb i g g e s tg r o w t hr a t ea n db i o - m a s sa t 1 4 0 “m o l m 2 s 一，2 5 c t h eg r o w t hr a t eo fm 5 1i sf a s t e rt h a nm 5 9a n dm 7 3 s ow e t h i n km 5 1h a st h ep o t e n c yo fl a r g e s c a l ec u l t i v a t i o n t h e nt h ee f f e c to fd i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o na n dd i f f e r e n tn i t r o g e ns o l l t c c s ( u r e a , n h 4 h c 0 3 ，n a n 0 3 ) o nt h eg r o w t h 7 a n dp r o t e i nc o n t e n to fc h l o r e l l ap y r e n o i d o s am 5 1m 髑i n v e s t i g a t e d w h e nn i t r o g e n s o r r c e si su r e ao rn a n 0 3 ，t h ea l g a eo a nn o tg r o wf a s to rg e th i g hb i o - m a s s w h e nt h e n - h h c o ji sr t i t r o g e ns o i l l c 聍$ ，t h ea l g a ec a l lg r o wr a p i d l ya n di t sc e l la e n s i 锣c a l l a r r i v e d3 2 1 5 x 1 0 6c e l l m 1 t h eo r t h o g o n a ld e s i g ni sb a s e do nt h er e s u l t so fs i n g l e n i t r o g e n8 0 u r e ee x p e r i m e n t t h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n tr e s u l tr e v e a l e dt h a tt h e o p t i m u mn i t r o g e ng r o u pf o rg r o w t hi su r e a7 0 0m e c l ，n h 4 h c 0 31 2 5m g l ，n a n o ，0 m g 几a n dt h eo p t i m u mn i t r o g e ng r o u pf o rp r o t e i nc o n t e n ti su r e a 7 0 0m g l n h 4 h c c h 5 0 0m g l ，n a n 0 3 1 5 0m g l k e y w o r d s ： c h l o r e l l a ；p r o t e i n c o n t e n t ； r i b n l o s e - l ，g - b i s p h o s p h a t e e a r b o x y l a s e o x y g e n a s e ；u l t r a v i o l e tr a d i a t i o nm u t a g e n e s i s ；o r t h o g o n a ld e s i g n ； n i t r o g e ns 0 1 1 1 c e ；g r o w t hr a t e 8 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得l 壅! 堑遨查墓丝 置要缱型壹明笪：奎拦互窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 谢意。 学位论文作者签名：时撒签字日期：知噼石月君日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后 适用本授权书) 学位论文作者签名：蜀抱侠 导师签字： 签字日期：及珥年6 月孑日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 签字日期：矽衫年钿云日 电话：通讯地址： 小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 刖声 第一节小球藻的概述 1 小球藻的发现 1 8 9 0 年，荷兰生物学家b e i j e r i n e k 首先在琼脂平板上成功分离到种叫做小 球藻( c h l o r e l l a ) 的纯培养物。另一科学家o t t ow a r b u r g 于1 9 1 9 年将这一纯培养物 在实验室里作为研究植物生理学的工具。 人类对小球藻的研究开发已有半个世纪的历史。二战期间，由于粮食的缺乏， 如何利用水生藻类生物作为人类的食物资源开始成为研究课题，单细胞藻类的培 养逐渐被重视起来，许多国家先后进行了培养和营养价值的研究。小球藻是最早 被开发研究的对象之一。该属种类较多，其中蛋白核小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 因蛋白质含量高而受到重视。日本、美国、前苏联等国家白5 0 年代率先开发小球 藻作为单细胞蛋白，7 0 年代日本首先开发小球藻作为人类的健康食品，s o f t - 代又 开发出健康和美容系列产品，包括小球藻食品、小球藻饮料、小球藻绿酒、小球 藻化妆品等。我国在6 0 年代初开始开展小球藻的培养与生产试验研究【“。 2 小球藻的生物学特性 小球藻是单细胞植物，单生或多个细胞聚集成群，浮游。种类较多，多数生 活在肥沃淡水中，少数生活在海洋里，有时生长在潮湿土壤、岩石、树干上，有 的可与原生动物共生。按植物学分类，小球藻属于绿藻门绿球藻且、小球藻科【2 】。 常见的有蛋白核小球藻( c h l o r e l l a p y r e n o i d o s a ) 、普生小球藻( c h l o r e l l av u l g a r i s ) 、 椭圆小球藻( c h l o r e l l ae l l i p s o i d e a ) 、埃氏小球藻( c h l o r e l l ae m e r s o n i i ) 、凯氏小 球藻( c h l o r e l l a k e s s l e r i ) 等。它们是良好的实验材料，并可进行大规模的培养。 小球藻呈球形或广椭圆形。细胞内具有杯状( 核蛋白小球藻) 或呈边缘生板 状( 卵形小球藻) 的色素体，蛋白核小球藻的色素体中有一个球形的蛋白核，细 胞中央有一个细胞核。细胞大小依种类有所不同，蛋白核小球藻的细胞直径3 5 微米，在人工培养的情况下，生长良好时，细胞会交小。 小球藻以拟亲孢子的方式行无性繁殖。首先在细胞内部进行原生质体分裂， 成为多个孢子，然后这些孢子破母细胞而出，每个孢子长成一个新个体。 小球藻的生态条件依种类而不同。 小球藻蘸种鉴定、株系筛选和培养条件优化 2 1 、盐度海水小球藻对盐度的适应性很强，可以在河1 2 1 、港湾、半咸水中生 长繁殖。 2 2 、温度一般的小球藻在1 0 3 6 c 的温度范围内都能比较迅速地繁殖，最适 范围在2 4 - - 2 8 c 1 3 1 。 2 3 、光照最适光照强度约在15 0 m l m 。s 。左右。 2 4 、酸碱度最适范围约在p h 乱8 之间。小球藻在有机质丰富( 特别是氮肥) 的水中生长特别繁茂。 3 小球藻的功用 小球藻作为一类体积小，结构简单，生长迅速的单细胞藻，是一种有效的生 物系统。又因其营养价值高且兼具保健功能，作为一种优良的单细胞蛋白( s i n g l e c e l lp r o t e i n ) 源，被广泛用作食品和水产养殖业的饲料。在许多农作物低产区， 它是确保基本蛋白质供给的主要来源。它还含有大量的活性物质，有较大的药用 价值。目前，小球藻已被深入研究，在一些国家和地区已有很大程度的开发和利 用，先后开发成蛋白源饲料食品、饮料、医药制品等1 4 , 5 。表1 为干藻粉的主要 化学成分。 表l 小球藻的主要化学成分( 1 0 0 0 9 ：f 藻粉) t a b l e1t h em a i nc h e m _ i c a lc o m p o n e n t so f c h l o r e l l a ( 1 0 0 0 9d r ya l g a ep o w d e r ) 2 小球萋蘸种鉴定、株系筛选和培养条件优化 3 1 用作营养保健品 小球藻粉蛋白质含量颇高，可达5 0 以上，是优质的单细胞蛋白源；所含 氨基酸种类齐全，含量丰富，必需氨基酸总量接近鱼粉、啤酒酵母，高于一般植 物性蛋白( 表2 、表4 ) ，在必需氨基酸( a a ) 中，赖氨酸、精氨酸、亮氨酸、缬 氨酸的含量很高，苯丙氨酸、异亮氨酸、苏氨酸的含量较高，组氨酸含量略低， 蛋氨酸和色氨酸含量较低，为限制性氨基酸。根据饲养标准，小球藻的限制性 a a 含量有所欠缺，但作为非动物性资源，小球藻的必需a a 组成是基本平衡的， 基本上达到联合国粮农组织( f a o ) 对健康食品八种必需a a 的标准；e t 、e n 达 到f a o w h o 的标准蛋白模式”，完全能够满足人、动物生长所需( 表2 ) ；其氨 基酸组成均衡，氨基酸分达到6 4 3 ，蛋氨酸+ 胱氨酸为第一限制性氨基酸，苏氨 酸为第二限制性氨基酸，其余氨基酸含量高于f a o i w h o 评分模式( 表3 ) 。如 此丰富的蛋白质和质量良好的氨基酸组成，无疑是一种很好的营养源 表2 小球藻粉的蛋白质和必须氨基酸含量与常见饲料含量比较( ) t a b l e 2t h ec o m p a r i s o no f p r o t e i na n gn e c e s s a r ya m i n oa c i db l t w e f f l lc h i o e l l a p o w d e ra n df a m i l i a rf e e d i n g s t u f f ( ) 饲料中国饲料编号c p l y sm e tc y s t h r l i el e uv a l t y r p h et r p 3 ! ：壁墨塑些星：堡墨壁垄塑些鲞墨! 咝丝 鱼粉5 - 1 3 - 0 0 4 46 4 ，55 2 2 i 7 lo ，5 82 8 72 6 84 9 93 2 52 1 32 1 0 7 8 啤酒酵母 7 - 1 5 - 0 0 0 1 5 2 43 3 8o 8 3o 8 32 , 3 32 8 54 7 03 , 4 0 0 1 2 4 0 7 2 0 8 表3 小球藻必需从含量与f a 0 必需a a 标准比较【5 】 t a b l e3t h ec o m p a r i s o no f n e c e s s a r ya m i n oa c i db e t w e e nc h l o r e l l aa n df a o s t a n d a r d 氨基酸小球藻f a o 标准 亮氨酸 5 0 44 8 赖氨酸 3 0 8 4 2 苯丙氨酸 3 0 9 2 8 。075 2 2 蛋氨酸 2 9 3 2 8 二7 j二6 苏氨酸 1 4 2 1 4 色氨酸4,144 2 缬氨酸 表4 小球藻粉必需氨基酸的构成比例与f a o ，、h 0 的建议模式比较( 埘曲【6 】 t a b l e4t h ec o m p a r i s o no f r a t i oo f n e c e s s a r ya 1 1 _ i i l l oa c i db e t w e e nc h l o r e l l ap o w d e r a n df a o w h oa d v i c e dn l o d e 第一第二 貅mml y lm r k 一 r r r f h r t r p v a l 从s 嚣翟 基酸基酸 f a o w h o 4 0 。07 0 05 5 0 3 5 06 0 04 0 01 0 05 0 01 0 0 蛋白核小mch 4 1 38 6 45 9 32 3 3 8 3 24 1 52 4 9 5 7 , 9 6 6 6 球藻糟 c y s 小麦麸 2 9 35 1 6 3 6 92 4 85 7 82 7 4 1 7 74 0 16 7 1 l y s t h r 大豆柏4 2 77 8 26 002 4b 8 7 84 0 ，41 3 74 4 9 7 0 9v a l c y s 玉米蛋4 4 91 8 251 53 3 7 51 1 4 83 2 85 7 4 6 92 7 8 l y st r p 4 小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 啤酒酵母 5 4 49 0 86 4 5 2 5 48 0 04 4 53 9 76 4 97 2 6 花生仁袖2 6 25 2 32 9 31 6 ，96 9 22 3 29 42 8 ，54 8 3 m e t + c y s m c t + l y s 娜 另外，小球藻还含有丰富的维生素、多不饱和脂肪酸( p o l yu s a t u r a t e df a t a c i d ) 、多糖、叶绿素、胡萝h 素等营养物质，是一种高蛋白、低糖、低脂肪、 低热值、维生素和微量元素全面的绿色营养源食品，且具有许多医疗保健功效， 被f a 0 列为2 1 世纪人类的绿色营养源健康食品。 3 2 小球藻的药用价值 小球藻蛋白质含量高且含有较多的生理活性成分如微藻多糖、高不饱和脂肪 酸、牛磺酸、含卤多萜类化合物、甾醇类化合物、肛胡萝b 素等，从而使其制品 可能具有降血糖、降血脂、降血压、抗癌、抗血栓等多种生理功效。因而对微藻 功能成分的研究和保健食品的开发成了当前国内外食品研究的一个新的热点。 自1 9 6 2 年日本学者y a m a g i s h i 报道小球藻对胃溃疡有治疗作用以来，人们对小 球藻的药理作用进行了广泛的研究。发现小球藻在增强免疫、防止消化性溃疡、 抗肿瘤、抗辐射、抗氧化、抗病原微生物、防治贫血、降血脂和抗动脉粥样硬化 等方面都有重要的药理作用1 7 。如g u z m a n 等人就对小球藻多糖或糖蛋白等成分 的抗炎症、增强免疫及调节细胞激素及免疫方面进行了研究报道嘲，而小球藻提 取物改善体内氧化状况及对消化性溃疡的作用也已在l e e 和t a n a k a 等人的动物实 验中得到证实【9 1 0 1 ；国外目前在小球藻糖蛋白抗肿瘤功效及作用方式等方面的研 究较多，如有科学家曾报道小球藻糖蛋白对抑制肿瘤转移具有显著的作用，而这 种作用在肿瘤内给药再加皮下注射可得到加强f l 卜1 3 1 ；另外，国外对其在抗高血压、 降低血脂和血胆固醇及防止动脉粥样硬化等方面也进行了广泛的试验和研究 1 1 4 - 1 # j 。国内，旌瑛等研究发现蛋白核小球藻多糖对小鼠的免疫功能有显著的调节 作用。汪炬、蒲含林等证明小球藻提取物对移植性肉瘤小鼠和肝癌h c a 腹水瘤 小鼠具有抗肿瘤作用及化疗增效作用，并对免疫功能有调节作用f 】9 1 。 小球藻生长因子( c n o r e l l ag r o w t hf a c t o r ，c g f ) ，也叫小球藻精，是小球藻 的细胞活性物质，包括氨基酸、核酸、多糖、多肽、蛋白质、酶、维生素、矿物 小球藻藻神鉴定、株系筛选和培养条件优化 质等“神秘成分”，被称为“类荷尔蒙”。近年来。小球藻生长因子提取技术及其生 理活性研究成为荚、美、等国家和我国台湾地区的研究热点 2 0 - 2 2 1 。 国外对其生理功能也有较多的研究，世界上没有其它动植物像小球藻那样能 够每2 0h 增长4 倍，这主要是由小球藻的生长因子决定的瞄- 2 4 1 。韩士群等的免疫 调节试验表明，1 5 0 、4 5 0 m g ( k g ，d - 1 ) 剂量的c g f 可以明显增强二硝基氟苯引起的 小鼠迟发性超敏反应，对造血功能受损的小鼠有恢复作用，并增强小鼠单核巨噬 细胞吞噬功能的作用【2 5 】，胡开辉等将小球藻生长因子加入啤酒酵母菌液，发现 其具有促进啤酒酵母的发酵、提高啤酒酵母产气量的作用阅。 小球藻生长因子的生理功能有：激活淋巴细胞，增强机体免疫能力；活化人 体细胞；使儿童生长发育加快，抵抗外来疾病的入侵；促进人体受伤组织修复， 有机物、重金属等中毒的人服用后能迅速康复；对胃溃疡、高血压和心血管等疾 病也有一定作用。可预见c g f 在食品、饮料、保健品、医药等领域有广阔的应 用前景f 2 5 】。 表5 中列出了酶解法提取的c g f 主要成分。蛋白质主要以短链蛋白质、多肽 存在；氨基酸有1 9 种，其中7 种为人体必需氨基酸。精氨酸、脯氨酸、赖氨酸、 谷氨酰胺等含量较高，分另d 达到2 1 、2 2 、1 5 、1 5 。核苷酸包括腺嘌呤 核瞀酸、次黄嘌岭核苷酸、胞嘧啶核苷酸、脱氧腺嘌呤核苷酸等。c g f 中的多糖 含量为4 8 ，并含有多种维生素，其中包括维生素a 、b 以及生物素等【2 卯。 表5 小球藻细胞中c g f 的主要成分与含量( ) t a b l e5t h em a i nc o m p o n e n t sa n dt h e i re o n t e mo fc g fi nc h l o r e l l ac e l l ( ) 主要成分i 蛋白质氨基酸总和核苷酸总和多糖维生素总和 含量 5 6 64 2 5 96 84 81 7 3 3 良好的饲料添加剂 前面已经介绍了小球藻蛋白含量高、氨基酸含量丰富且组成合理。另外蛋白 核小球藻粉中必需氨基酸含量远高于猪、鸡、鸭动物饲养标准中的营养需求量， 见表6 ，因此完全能够满足动物生长之所需，是优良的蛋白饲料。 表6 小球藻粉中必需氨基酸含量与动物营养需求量比较( ) 小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 t a b l e6t h ec o m p a r i s o no f n e c e s s a r ya m i n oa c i db e t w e e nc h l o r e l l ap o w d e r a n dt h ed e m a n do f a n i m a l ( ) 注：1 蛋白和小球藻粉；2 中国瘦肉型生长肥育猪饲料标准；3 肉用仔鸡营养需求量周 龄；4 但鸡营养需求1 ：0 - 6 , 厨龄：5 台湾省建议仔猪营养需要l 5 k g 。 小球藻粉粗纤维含量较低，矿物质含量和维生素含量较高，同时，还含有丰 富的类胡萝卜素和叶绿素等，在畜禽饲料中添加后会改善蛋鸡蛋黄和肉鸡皮肤颜 色。小球藻粉还含有较高的不饱和脂肪酸，对改善猪肉品质有重要意义。另外， 小球藻粉中铅、砷、汞和大肠杆菌、沙门氏菌的分析结果符合g b l 3 0 7 8 - - 2 0 0 1 ( ( 镐j 料卫生标准，说明小球藻粉作为饲料添加剂符合饲料卫生指标。 王冉等从小球藻粉作为饲料添加剂应用于动物考虑，用小白鼠做了毒理安全 性评价。结果表明：小球藻粉的l d 5 0 1 0 0g k g 体重，是安全无毒级物质。对 体细胞无诱变作用，对生殖细胞无诱变畸形作用，是一种高蛋白、低糖、低脂、 营养全面均衡的绿色营养源，是非常具有开发前景的优良饲料蛋白源 2 2 1 。 3 4 治理污染 小球藻是氧化塘中的主要藻类之一，在氧化塘处理废水的过程中起着重要的 作用，并且还可异养培养，将富含养分的无毒废水进行资源化处理。近几年来， 国内外研究利用小球藻处理废水主要表现在以下几个方面： 3 4 1 小球藻吸收和利用废水中的氮、磷等营养成分 很多废水中含丰富的蛋白、其他形式的氮、磷、钾、铁和微量元素，适合小 球藻的生长，如食品发酵工厂废水、啤酒厂废水等，大量排放会造成水体污染和 资源浪费，如果用小球藻处理这些废水，就可以将废水处理与资源充分利用结合 起来。蒋培森等 2 刀选用蛋白核小球藻处理啤酒厂废水污泥。将废水污泥的抽提 液以不同比例与培养基混合，以不加抽提液的培养基为对照，然后分别接种等量 的蛋白核小球藻。1 0 d 后发现在废水污泥抽提液与培养基之比为8 0 ：2 d 时，无论 是藻生物量还是粗蛋白含量都在几组处理中是最高的，与对照相近。日本的山崎 7 小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 繁久等【2 8 1 在海生小球藻的培养液中添加白酒酿造的蒸馏废液，然后在恒温箱内， 充气，光照等条件下培养7 d 。结果表明，蒸馏废液能促进海生小球藻增殖。胡月 薇等【2 9 】研究发现小球藻在无光异养条件下能利用啤酒厂废水中多种营养成分。 小球藻去除废水中的铵态氮并将它们转化为细胞中的蛋白质、叶绿素等含氮物 质，并显著地降低废水中的c o d 、b o d 。 3 4 2 小球藻对重金属的吸收和富集 p a s c u c c i 等p o 】将铜、铁、镍、铝、锌等金属化合物与蛋白核小球藻的混合物 分别接种于蒸馏水、海水、废水中。经过培养后发现铜、镁能够被最有效去除。 m o h a p a t r a 等 3 1 研究了小球藻解除水银毒害作用的能力。l i a n g 等t 3 2 】发现小球藻能 够在含有重金属及过量铵的废水中生长，处理废水的同时实现了废水中资源的利 用。c h o n g - 等f 3 3 研究了普通小球( 溉妇咖妇) 和四尾橱藻等1 1 种藻类处理综 合废水中的镍和锌的规律性。比较单位生物量处理金属的能力，小球藻具有最强 的吸收镍和锌的能力。 李坤等用接种密度为4 9 8 1 0 4n m l - i 的淡水小球藻对含c l 尹、c d 2 + 、勐2 + 的 水体分别处理，观察了藻细胞对上述3 种离子的清除能力，并用金鱼存活检测了 结果。结果表明淡水小球藻对不同密度的c u 2 + 、c d 2 + 、动2 + 都有清除能力其中， z n 2 + 的清除能达到国家污染物排放的二级标准鲫。 3 4 3 小球藻降解有机化合物 王翠红等3 毋采用海藻酸钠作为包埋剂，制成具有一定强度直径为4m i l l 的海 藻酸钠小珠，每个小珠含1 8 x 1 0 5 个小球藻。用固定化小球藻处理酚浓度为2 2 0 5 m g l 的废水，经7 2 h 处理后，出水酚浓度可降至0 3 0 6m g l ，达到国家地面水一 级排放标准。结果表明，采用固定化小球藻处理含酚废水，出水透明度高、稳定、 物理性好、成本低。孙红文等【3 6 】利用普通小球藻、蛋白核小球藻和斜生栅藻处 理偶氮染料废水。实验中，在这3 种藻培养液中分别加入l o 种不同结构的单偶氮 染料，结果表明，蛋白核小球藻生长最好，脱色率最高；在l o 种单偶氮染料中对 酸性红b 的脱色率最高可达8 9 8 。陶永华等筛选具优势的藻类用于净化含油污 废水，结果表明，普通小球藻最具优势，对于1 8 4m w l 的含油废水，降解去除 率可高达9 4 9 5 f 翊。 利用小球藻处理废水，可有效地去除废水中的有机物质、磷、氮和重金属等， 小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 处理水可用于农田灌溉和工业生产。另一方面由此获得的藻体若不含有毒有害物 或经处理后有毒有害物不超标则可作为动物饲料、饵料、人类的潜在食品或精细 化工品原料。利用小球藻处理废水既可以净化环境，又可降低生产小球藻的成本。 这为废水的资源化处理提供了一条新的高效而经济的途径。 第二节叶绿体r b c l 基因序列在微藻系统学研究中的应用 lr b c l 基因的结构 核酮糖1 ，5 二磷酸羧化酶加氧酶( r u b i s c o ) 是叶绿体基质中的主要可溶性蛋 白，此酶在光合作用的c a l v i n - b e n s o n 循环中固定c 0 2 ，使核酮糖1 ，5 二磷酸 ( r u b p ) 与c t h 缩合成6 碳化合物，然后迅速裂解形成两分子的3 磷酸苷油酸， 同时也催化光吸收作用的第一步，使r u b p 与0 2 反应生成一分子磷酸甘油和一分 子磷酸乙醇酸。在真细菌和和甲藻中，r u b i s c o 呈两个大亚基组成的二聚体形式， 在所有绿色植物以及其他一些细菌和非绿色藻类中，r u b i s c o 全酶为十六聚体， 它由8 个相同的大亚基( 5 5k d a ) 和8 个相同的小亚基( 1 5k d a ) 组成。其中大亚 基排列成八聚体核心，一个大亚基的c 端与邻近大亚基的n 端形成一个类似于磷 酸丙糖异构酶的“b 桶状活性中心，在光合作用的c 0 2 固定中起作用。大亚基由叶 绿体d n a 编码并且由叶绿体的核糖体合成，小亚基由核基因编码，首先由细胞 质内的核糖体合成前体蛋白，穿越叶绿体膜后再加工为成熟形式1 3 8 1 。编码大亚基 的基因简称为r b c l 基因，编码小亚基的基因简称为r b e s 基因。 r b e l 基因存在于大单拷贝区( l a r g es i n g l ec o p y ) ，同a t p 酶的8 亚基和亚 基基因相邻近，长度约为1 4 0 0 b p ，由5 非编码区、编码区和3 q 编码区三部分组 成。5 q 编码区具有可以和叶缘体1 6 sr r n a3 端附近互补的s - d 序列，3 q # 编码 区具反向重复序列，能形成典型的茎环结构作为转录终止信号，多数r b e l 基因 还具有和原核生物基因启动予类似的共通序列【3 9 】。产物为4 7 6 个氨基酸。由于 r u b i s c o 在光合作用及光呼吸作用中所起的关键作用，r b c l 基因的进化明显受限 制，它的编码序列高度保守。目前已广泛用于植物的系统发育分析。在1 9 8 0 年 m c i n t o s hl 等首次测定了玉米r b c l 基因的序列，这也是第1 个被克隆和测序的 叶绿体蛋白质的基因【艚】。紧接着又测定了菠菜和烟草r b c l 基因的序列。迄今已 9 小球藻美种鉴定、株系筛选和培养条件优化 测得1 0 0 0 余种种子植物r b c l 基因的序列【4 1 1 。 2r b e k 基因在微藻系统分类研究中的应用 微藻的鉴定及分类是藻类研究的基础，也是其中较为困难的课题之。传统的 分类系统主要是根据藻类的形态构造和生理生化特点为基础的自然分类系统，即 根据藻类所具有的形态特征、生理特性等将藻类逐级分类，建立一系列分类阶元。 各级分类阶元的建立不仅构成了1 个完整的、相互联系的生物系统，同时也为藻 类的鉴定规定了一系列的标准和方法，即生物检索表。这些标准和方法已成为人 们认识藻类、研究其生长发育过程和生活史的有力工具。 但传统分类方法有其不足之处，传统分类方法所依据的形态、生理等指标易 受环境条件的影响，亲缘关系相近的物种之间在形态等指标上表现的差异很小， 如甲藻门的亚历山大藻属( a l e x a n d r i u m ) 的一些种类，仅细胞壁上个别甲片的结 构有细微差别，但它们形成赤潮或不形成赤潮所造成的危害性差异却很大。同时， 微藻是海洋初级生产力的主要贡献者，但它们的个体微小，一般光学显微镜难于 观察，有时需借助电子显微镜辨别鉴定，并且有些藻类的结构不利于电子显微镜 制片，还有些藻类种问界定的形态学标准并不清晰，因而很难完整而正确地揭示 一些物种之闻的亲缘关系，以致在某些微藻属、种的分类上造成混乱。另外，这 种以形态学为基础的分析方法，因其分析速度慢、耗时长，对操作人员的要求较 高，需要富有经验的专家等，这就更难以满足浮游植物种群动力学观测“量大、 连续”的要求。所以在传统分类的基础上寻找一些新方法弥补它的不足方面并解 决上述难题就成为近十几年来微藻分类与鉴定领域研究的新动向【4 2 】。 m a r kw c h a s e 等【4 3 】在“密苏里植物年刊”第8 0 卷第三期上发表的基于r b e l 基因序列对整个种子植物进行的系统发育重建是植物系统学研究的一个里程碑。 目前通过分析r b e l 序列数据来探讨的多是种子植物的系统学问题洲，但在微藻 系统分类中研究中的应用也取得了一定的成果。李海涛等对长菱形藻( n i t z s c h i a l o n g i s s i m a ) 和新月细柱藻( c y l i n d r o t h e c ac l o s t e r i u m ) 的l g sr d n a 和r b c l 基因 进行了测序并用邻接法构建了系统树。结果表明，两种藻在1 8 sr d n a 和而乩基 因序列上均存在较大的差异，证明了在依据形态指标难以确定藻类分类地位的情 况下，1 8 sr d n a 和r b c l 基因序列是有用的1 4 5 。刘金姐克隆了节旋藻( a r t h r o s p i r a p l a t e n s i sf a c h b 3 4 1 ，a p l a t e n s i sf a c h b 4 3 9 ，a m a x i m ao u q d s m ) 和螺旋藻 1 0 小球藻藻种鉴定、株系筛选和培养条件优化 ( s p i r u l i n af a c h b 4 4 0 ) r b e l 基因部分片断并进行了序列测定与分析。结果表明， 螺旋藻( s p i r u a n af a c h b 4 4 0 ) 的g c 含量比其他的节旋藻品系高；氨基酸序列分析 发现螺旋藻与其他节旋藻品系的差异较大：螺旋藻与节旋藻核苷酸序列相似性约 为7 8 1 - 7 8 5 ，而三个节旋藻品系之间的相似性介于9 6 5 9 9 6 。系统发生分析 结果显示，三个节旋藻品系形成一个小的分支，其自举值为1 0 0 0 ，而螺旋藻与鱼 腥藻聚合为一个类群，自举值为9 0 9 1 4 6 1 。盂振克隆了8 株盐生杜氏藻的r b c l 序列， 以小杜氏藻、莱茵衣藻和小球藻为外类群，使用邻位相接法和最大简约性法构建 分子系统树拓扑结构类似，盐生杜氏藻所有株系聚为一单系群，得到9 8 1 0 0 的 靴带支持率，而普林莫杜氏藻和d s p m i o 聚为一簇，靴带支持率高达9 8 1 0 0 。 与出发株b j 3 8 相比，3 株紫外诱变株系显示出不同的遗传性变异，但碱基替代多 发生在胞嘧碇和胸腺嘧啶之阆【4 7 】。w y m a n 等人还利用r b e l 基因的编码产物l ，5 二磷酸核酮糖羧化酶( r u b i s c o ) 的表达程度作为浮游植物增殖的指标，对赤潮的发 生进行早期预报嗍。刘永健利用聚合酶链式反应扩增胶州湾表层海水浮游植物 核酮糖1 ，5 - - - 磷酸羧化氧化酶大亚基基因( r b c l ) 片段，建立了该基因片段变异 类型文库。随机测定t 2 8 个r b e l 片段序列，依此初步分析了胶州湾表层海水浮 游植物而c 上基因分子遗传多样性。结果表明，春季胶州湾表层海水浮游植物优 势种群为d 类r b c l 代表的浮游植物，其中隐藻占2 8 6 、s t r a m e n o p i e s 占3 2 1 、 定鞭藻占2 8 6 、红藻占3 6 4 9 】。 第三节海洋微藻育种技术 海洋微藻含有独特的药理活性物质，因此它们具有多种药用价值和保健功 能。由于不同的藻种生长速度不同，组成成分也有一定的差异。而一般在微藻的 生产中，不仅要获得高产量，还要提高微藻的产品质量，也就是要提高有经济价 值的生物活性物质的含量，以此必须改进海洋微藻的育种技术。因而对微藻