（水生生物学专业论文）启动子对蓝藻中外源egfp基因表达的影响.pdf

论文题目：启动子对蓝藻中外源馅勿基因表达的影响 学科专业：水生生物学 学位申请人：郭正红 指导教师：王全喜教授魏兰珍副研究员 摘要 蓝藻是一类能进行光合放氧的原核生物，具有结构简单、适应性强、分布 广泛、便于外源基因转化和营养丰富等特点。随着基因工程的发展和蓝藻分子 生物学研究的深入，人们通过重组d n a 分子技术在蓝藻中构建了一系列新的 表达载体，并成功表达了蓝藻基因工程下游产物。相对于其它基因工程受体系 统，蓝藻细胞不仅无毒且有些种类还具有很高的营养价值，使得蓝藻成为一种 独特的基因工程受体系统。自1 9 8 4 年适用于接合转移的可在大肠杆菌蓝藻间 穿梭表达的p r l 载体构建完成至今，杀蚊幼虫毒素蛋白、人体超氧化歧化酶等 一大批外源基因已在蓝藻中成功表达。然而，利用蓝藻基因工程制备重组药物 的产业化进程并不顺利，究其原因，外源重组蛋白表达效率低下可能是关键因 素之一。 集胞藻6 8 0 3 ( s y n e c h o c y s t i ss p p c c6 8 0 3 ) 为单细胞原核藻类，培养条件简单， 可光合自养，在特殊培养条件下也能进行异养生长，其基因组结构简单，序列 也已于1 9 9 6 年测定完成，是蓝藻分子生物学研究的模式生物之一，具有天然的 外源d n a 转化系统；其细胞体积较大，对外源蛋白的容受力较高；有些藻类 含有丰富的营养成分，为将来基因工程产物的直接食用提供了可能。 本研究首先利用本实验室已经构建好的转基因藻株p g 和p g s ，运用蛋白免 疫印迹检测转基因藻中外源基因的表达水平。明确异源g r o e s l 启动子的最佳诱 导条件。实验结果表明：当藻细胞生长在衰退期时，经过4 2 c 诱导0 5 h ，外源 e g f p 的表达量达到最高；通过转基因飚和p g s 藻株中外源基因表达水平的比 较，发现s d 序列能显著提高外源基因的表达量。 其次，本研究依据基因芯片数据，以高光诱导条件下转录水平上调的n d h k 基因为目的基因，对其启动子序列进行预测。并把该启动子序列插入到同源重 组载体p 0 上，转化集胞藻6 8 0 3 ，得到含n d h k 基因启动子片段的转基因藻株 p 3 3 0 藻株。通过蛋白免疫印迹，研究不同生长时期、不同高光诱导时间以及二 氧化碳浓度下转基因株系中外源基因的表达情况。结果表明，该未知启动子在 高光诱导4 小时，低二氧化碳培养条件下，使外源e g f p 基因的表达水平达到最 高。比较p g s 和p 3 3 0 两种不同诱导因子对e g f p 的表达水平，经过w e s t e m b l o t 分析表明，p 3 3 0 修饰后的外源基因表达量比p g r o e s l 加s d 序列修饰的外源基 因表达量的作用更加明显。 本研究分析了集胞藻6 8 0 3 中g r o e s l 启动子和s d 序列以及新的调控元件 p 3 3 0 对外源基因表达作用的特性。结果表明，经过这些调控元件都很大程度的 提高了外源基因的表达。这为以后利用蓝藻制备药用基因带来了很大的市场应 用的理论基础。 关键词：集胞藻6 8 0 3 、转基因藻株、g r o e s l 启动子、p 3 3 0 、自然转化 论文类型：应用基础 t h e s i s t o p i c ：e f f e c t s o nt h e f o r e i g ne g f pg e n er e g u l a t e db yp r o m o t e ri n c y a n o b a c t e r i a p r o f e s s i o n a ld i s c i p l i n e ：h y d r o b i o l o g y d e g r e ea p p l i c a t i o n ：g u oz h e n g h o n g i n s t r u c t o r ：p r o f w a n gq u a n - - x i w e il a n z h e n a b s t r a c t c y a n o b a c t e r i aa r ea u t o t r o p h i cp r o k a r y o t e sp e r f o r m i n go x y g e n i cp h o t o s y n t h e s i s ， w h i c hp o s s e s s e sm a n yc h a r a c t e r i s t i c s ，t h en a t u r a ld n at r a n s f o r m a t i o n s y s t e m ， s i m p l ec e l ls t r u c t u r e ，f a s tg r o w t h ，s t r o n ga d a p t a b i l i t y , a n do b t a i n i n gt h eu s e f u l o r g a n i cp r o d u c t sw i t hl i t t l ee x p e n d i t u r eo fe n e r g ya n dr e s o u r c e s t h o u g ht h e d e v e l o p m e n to fg e n ep r o j e c ta n dt h ed e e p l yr e s e a r c ho fc y a n o b a c t e r i am o l e c u l a r b i o l o g y , t h ee x p r e s s e dv e c t o rw e r ec o n s t r u c t e di nc y a n o b a c t e r i ab yr e c o m b i n a n t d n am o l e c u l a rt e c h n i q u e c y a n o b a c t e r i aa r en o tv i r u l e n ta n dh a v eh i g hn u t r i t i o n v a l u ec o m p a r e dw i t ho t h e r sr e c e p t o rs y s t e m t h e r e f o r e ，c y a n o b a c t e r i aa r ef o u n dt o b et h ep e r f e c tm o d e la l g a ef o rs t u d i n gt h eg e n e t i ce n g i n e e r i n g s i n c e19 8 4 ，t h ep r l s h u t t l ev e c t o rw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f e r e df r o me c o l it o n i t r o g e n f i x i n g f i l a m e n t o u sc y a n o b a c t e r i a m a n ye x p r e s s i o np l a s m i d so fc y a n o b a c t e r i a lc e l l sh a v e b e e ne x t e n s i v e l yr e p o a e d ，t h ee x p r e s s i o nl e v e l so ff o r e i g ng e n e sh a v en o tb e e n o p t i m i z e d t h e r e f o r e ，h o wt oe n h a n c ee x o g e n o u sg e n ee x p r e s s i o n l e v e l si n c y a n o b a c t e r i a lc e l l sr e m a i n su n c l e a r s y n e c h o c y s t i ss p s t r a i np c c 6 8 0 3 ( h e r e a f t e rs y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 ) i sa u n i c e l l u l a ra u t o t r o p h i cp h o t o s y n t h e s i sc y a n o b a c t e r i u ma n di t sc o m p l e t eg e n o m i c s e q u e n c e sh a v eb e e no b t a i n e d i ti sau s e f u lt o o lt os t u d yt h eg e n e t i c se n g i n e e r i n go f c y a n o b a c t e r i u m f i r s t l y , t w oh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o nv e c t o r s ，p ga n dp g sw e r ec o n s t r u c t e d b yi n s e r t i n gt h eg r o e s lp r o m o t e rg e n e ，a n ds ds e q u e n c ei nt h eu p s t r e a mo fe g f p ， r e s p e c t i v e l y s u b s e q u e n t l y , t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n e ，劝，i np ga n d p g sw e r ei n v e s t i g a t e du n d e rd i f f e r e n tg r o w t hp h a s e s ，t e m p e r a t u r e s ，a n dt i m ep o i n t s b yu s i n gi m m u o b l o t t i n g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt h e e x p r e s s i o no fe g f pi ns y n e c h o c y s t i s6 8 0 3w e r ea t4 2 0 cf o r3 0m i n t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a tt h eg r o e s l s dt a n d e mw a sm o r ee f f i c i e n tf o rt h ee x p r e s s i o no fe 蜘 i ns y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 s e c o n d l y ，t h ep r o m o t e rr e g i o n ( 3 3 0 一b p ) i nt h e n d h c - k j o p e r o n w a s d e t e r m i n e dp r e l i m i n a r i l ya n di n s e r t e di nt h eu p s t r e a mo fe g f pg e n e ，a n dt h e nt h i s v e c t o rw a st r a n s f e r r e di n t os y n c h o c y s l i s6 8 0 3c e l l st og e n e r a t et r a n s g e n i ca l g a ，p 3 3 0 t h el e v e lo ff o r e i g ng e n ei np 3 3 0w a sa n a l y z e di nd i f f e r e n tg r o w t hs t a g e s ，d i f f e r e n t h i 曲一l i g h ti n d u c e dt i m ea n dc a r b o rd i o x i d ec o n c e n t r a t i o n t h er e s u l t si n d i c a t et h a t e g f ph a st h eh i g h e s ta m o u n t si nh i g h - l i g h tw i t h4 ha tl o wc 0 2c o n d i t i o nb yt h i s u n k n o w np r o m o t e r a n dw a sa s s o c i a t e dw i t hi n c r e a s e de x p r e s s i o nl e v e li np 3 3 0 舔 i nt h i ss t u d y ，t h ee f f e c t so fm a n yr e g u l a t o r ye l e m e n t s ，i n c l u d i n gg r o e s l p r o m o t e ro r i g i n a t e df r o ms y n e c h o c o c c u s7 9 4 2 ，s ds e q u e n c e ，a n dn o v e lp o t e n t i a l p r o m o t e r ，p 3 3 0 ，c o n t a i n e di n t h en d h c k - jo p e r o n ，o nt h ee x p r e s s i o nl e v e l so f e x o g e n o u sg e n e ，e g f p ，w e r ea n a l y z e d w ef o u n dt h a ta l lt h e s er e g u l a t o r ye l e m e n t s c a ne n h a n c et h ee x p r e s s i o nl e v e l so fe x o g e n o u sg e n ei ns y n e c h o c y s t i s6 8 0 3w i t h d i f f e r e n td e g r e e s t h e s er e s u l t sw i l lf u t h r e rh e l pi ns o l v i n gt h el o we x p r e s s i o nl e v e l s o fe x o g e n o u sg e n ei nc y a n o b a c t e r i a lh o s t k e yw o r d s ：s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 ，t r a n s g e n i cs t r a i n ，g r o e s lp r o m o t e r ，p 3 3 0 ，n a t u r a l t r a n s f o r m a t i o n t h e s i st y p e ：a p p l i c a t i o nb a s e 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名q 厄胭期沙叶f 咖 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名莉t 五脶师签名：们中日期：测时2 尹 7 上海师范大学硕士论文第一章 第一章文献综述 1 1 蓝藻基因工程 蓝藻( c y a n o b a c t e r i a ) 是一种能进行光合放氧作用的原核生物，兼有植物和微 生物的特性，通常称之为蓝细菌。大约3 0 多亿年前的元古代，地球上最古老 的生命体蓝藻出现，并成为当时地球上仅有的光合放氧原核生物，它是当 时地球上主要的生产者之一，对地球表面从无氧到有氧大气环境的转变起到巨 大的作用。蓝藻种类繁多，约1 5 0 属，2 0 0 0 余种，在自然界中分布较为广泛， 遍布于淡水和海水中，潮湿和干旱的土壤或岩石上、树干和树叶上，温泉中、 冰雪上，甚至在盐卤池、岩石缝中都有它们的踪迹；有些还可穿入钙质岩石或 介壳中( 如穿钙藻类) 或土壤深层中( 如土壤蓝藻) 。 蓝藻中，有些种类具有很高的经济和应用价值，因而使其成为目前蓝藻生 物学研究的热点之一。在目前已被报道的2 0 0 0 种蓝藻中约有1 6 0 多种( 大多数 为念珠藻目) 可以固定大气中的分子念氮并使之转变为结合态氮，进而合成蛋白 质。在湖北省数万亩的大面积晚稻田中，通过放养筛选出的固氮蓝藻藻种，使 水稻的产量提高1 0 1 5 。有些蓝藻蛋白质含量较高，可达2 0 2 5 ，氨基酸 和多种维生素，因而可作为食品。例如螺旋藻和节旋藻等，因其具有很高的营 养价值和医疗功能，现己作为食品被投入市场。另如中国传统食品发菜( 产中国 北部和西北部半干旱地区) 、地木耳( 普生) 、葛仙米( 产华中华南山区稻田湿地) 等也是人们当前具有较高经济和营养价值的食品。有些蓝藻还可以作为鱼种的 饵料，例如罗非鱼以蓝藻为食料。在水环境保护中，人们也经常利用蓝藻吸收 工业废水中有害元素氮、磷和其他化合物，起到降低有毒物质含量，从而达到 净化水体的作用。 蓝藻的细胞结构和遗传体系与大肠杆菌相似，有利于移植大肠杆菌的基因 工程技术，因此适用于大肠杆菌的分子生物学实验操作也同样适用于蓝藻1 2 j ， 蓝藻中的某些种类具有天然的外源基因转化系统和基因重组系统，因此可以作 为外源基因的表达宿主。有些蓝藻具有的异型胞，还可以进行固氮作用的研究。 蓝藻所具有类似于高等植物的光合系统，被人们作为模式植物用于光合作用的 研究。依据密码子所具有的偏好性，蓝藻又可能成为植物体内重要基因产物的 表达宿主。在进化中蓝藻处于细菌和高等植物的过渡时期，蓝藻所特有的生物 学特性和独特的进化地位，从分子水平上了解蓝藻的生理特性和生物学机制一 直是蓝藻遗传学研究的重点。鉴于其诸多特性，许多科学家将蓝藻作为一种极 好的模式生物应用于生物学各领域的研究。 第一章上海师范人学硕士论文 二十世纪六十年代s h e s t a k o v 和k h y e n 第一次报道1 3 j 通过自然转化的方法外 源d n a 可以转入蓝藻中，从此揭丌了研究蓝藻基因工程的篇章。蓝藻基因工 程的研究分为：藻类质粒和限制性内切酶的研究、藻类内源基因的研究、藻类 外源基因的表达、藻类毒素检测和藻类检测等方面，发展至今已有近四十多年 的研究进程，一批可用于产生优质、高产、抗逆基因产物的表达系统也已构建 完成，现在，利用这一表达宿主，生产出大量廉价的蛋白质和药物已成为蓝藻 分子遗传学和基因工程的研究目标。 另外，随着集胞藻6 8 0 3 等蓝藻基因图谱的完成，功能基因组研究的进一步 深入，对光合作用、固氮作用、信号传导等将得到更好的诠释。蓝藻基因组相 对于高等植物较小，相对简单便利的多。蓝藻中的藻胆蛋白、r u b i s c o 等与光合 作用、固氮作用、氨基酸合成有关的基因已经在细菌、真菌中都已经得到表达， 蓝藻来源的限制性内切酶也实现了在大肠杆菌中的基因工程的生产。蓝藻中不 少天然产物己被证明具有降低血脂、抑制肿瘤等生物活性，因而，试图利用蓝 藻快速大量生产有关基因工程药品已成为基因工程研究的热点之一。 i i 1 蓝藻基因组研究进展 蓝藻中各基冈的网络调控以及复杂的代谢途径，都依赖于蓝藻基因组的研 究。1 9 9 4 年k a z u s ad n a 研究所公布集胞藻6 8 0 3 的基因组图谱1 4 j 。1 9 9 6 年该 研究所完成了集胞藻s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 全基因组的测序工作1 5 j 。这是第一个被 测序的光合生物，该物种的测序完成为开展研究光合生物的生理生化、代谢调 控、信号传导等方面提供了有利的依据。随后，2 0 0 1 年该研究所又完成了鱼腥 藻a n a b a e n a7 1 2 0 的全基因组序列。随羞蓝藻基因工程的发展，大规模基因组 测序工作展丌进行，越来越多生物的全基因组序列被公布。迄今为止，数据库 中的报道，已有1 3 0 7 种生物在进行基因组的测序工作( h t t p ：w w w n c b i n l m n i h g o v g e n o m e s s t a t i c g p s t a t h t m l ) ，其中原核生物有114 0 种，真核生物 有1 6 7 种；已经完成全基因组测序的生物有1 0 0 1 种，其中原核生物有9 7 9 种， 真核生物有2 2 种。而蓝藻中有3 5 种全基因组的测序工作完成或即将完成。 ( h t t p ：g e n o m e k a z u s a o r j p c y a n o b a s e ) ( 见表1 - 1 ) 2 上海师范人学硕士论文第一章 表1 - 1 蓝藻数据库基因组信息 t a b l e1 - 1c y a n o b a c t e r i ag e n o m ei n f o r m a t i o ni nc y a n o b a s e ( h t t p ：b a c t e r i a k a z u s a o r j p c y a n o ) 3 第一章上海师范大学硕士论文 1 2 蓝藻中外源基因的转化方式 1 9 7 0 年s h e s t a k o v 和他的同事首次报道了外源d n a 可以转化进入 s y n e c h o c o c c u sp c c7 9 4 3 中i 6 。19 8 2 年，他们又发现了s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 能够 自然吸收外源d n a 。随后，一批外源基因也在蓝藻中取得了成功表达，由于外 源基因进入蓝藻的方式不同，转化的效率也存在一定的差异。一般来说，外源 基因进入蓝藻细胞主要通过以下三种方式( 7 l ：遗传转化( g e n e t i ct r a n s f o r m a t i o n ) 系统，接合转移( c o n j u g a t i o n ) 系统和噬藻体( c y a n o p h a g e ) 侵染系统。 1 2 1 蓝藻的遗传转化系统 蓝藻的种类虽然很多，但是可以真正用于外源基因表达的受体种类并不多。 目前认为无异形胞分化的单细胞藻株较容易作为宿主细胞。如s y n e c h o c o c c u s 6 3 0 1 ，7 9 4 3 ，7 0 0 2 ，7 9 4 2 ，7 3 6 0 9 和s y n e c h o c y s t i s6 8 0 3 ，6 7 1 4 ，6 9 0 6 等，都可在指数生长 期有效地吸纳外源d n a 。但有些种类需要添加外界辅助物- d 可进行转化，如 s y n e c h o c y s t i s6 3 0 8 需要利用c a 2 + 诱导人工感受态，才能有效的导入外源基因。 但少数丝状蓝藻也可以用作转基因的受体系统，如a n a b a e n a7 1 2 0 等。 蓝藻的遗传转化方式包括自然转化、诱导转化和电击转化。 自然转化是指宿主细胞在对数生长期时与外源d n a 接触，可以有效地吸 纳外源d n a 进入宿主细胞体内的一种转移方式。可用于自然转化的篮藻都是 无异型胞分化的单细胞藻株，如聚球藻6 3 0 1 ，7 0 0 2 ，7 9 4 3 ，7 9 4 2 ，7 3 6 0 9 和集 胞藻6 8 0 3 ，6 7 1 4 ，6 9 0 6 等1 8 j 。自然转化的具体机制还不是很清楚，可能是由于 丝状体蓝藻细胞外的核酸酶的作用。至今，自然转化仍是单细胞蓝藻转化中最 主要的转化方式，而丝状或片状的蓝藻中尚未发现有关自然转化的报道。 诱导转化是指通过添加某些诱导剂促使感受态细胞吸收外源d n a 的转移方 式。在对数生长期的藻细胞，采用钙离子1 9 1 、溶菌酶【l o 】等处理后可转变成感受态 细胞。这种转化方式对于缺乏天然感受态品系的基因转化具有非常重要的作用。 电击转化是指宿主细胞在高压脉冲的作用下，通过短暂的电击，促使细胞 壁瞬间产生通道从而使得外源d n a 进入宿主细胞内的转移方式【l 。电击转化 主要用于转化多细胞蓝藻，如：鱼腥藻、念珠藻等12 1 。t h i e l 等【l l 】利用电击法成 功转化了鱼腥藻m 1 3 1 ，并寻找到了电击转化效率的最佳条件。但是电击法也 可能会使宿主染色体突变频率上升【l3 1 ，对宿主产生机体的损伤，一般情况下不 利用该方法进行转化。 4 上海师范人学硕士论文第一章 1 2 2 接合转移系统 接合转移又名三亲接合转移，主要是通过细胞f a j 的接触介导的，并且需要 借助接合质粒，使d n a 从一种细菌转移到另一种细菌中的d n a 转移方法。到 目前为止，接合转移仍是将外源基因转入蓝藻最有效的方法，它几乎适用于各 种蓝藻的外源基囚导入。但是这种方法的使用往往受到载体的限制，需要的条 件比较苛刻：接合转移的实现必须是通过运载质粒在辅助质粒和结合质粒三者 的作用下进行结合转移到宿主细胞体内。如果辅助质粒和结合质粒中没有蓝藻 复制起始位点，将无法在宿主细胞内进行复制而自动丢失。但是，运载质粒可 以在蓝藻中自主复制或与在宿主染色体上发生同源重组而使外源基因稳定存在 f 1 4 1 。现主要应用于丝状蓝藻的转化方法，较为成熟。1 9 8 4 年，w 6 l k 等【1 5 】建立 了在大肠杆菌和丝状蓝藻中的转化系统，其结合转移系统是由结合质粒r p 4 、 辅助质粒及p r l 穿梭质粒所组成。1 9 9 2 年s o d e 掣1 6 j 在集胞藻、聚球藻、假鱼 腥藻三个属中的7 种海洋蓝藻中成功地进行结合转移。2 0 0 3 年至2 0 0 6 年期间， 本实验室通过采用该方法在鱼腥藻7 1 2 0 中进行外源基因的转化，并成功的获得 了许多转基因藻株可用于外源基冈表达。 1 2 3 噬藻体侵染系统 噬藻体是一类侵染蓝藻的病毒，它具有很强的侵染性，s u t t l e 和c h a n 1 7 j 等 报道每升海水中有1 0 8 个嗜藻体存在，在水体的表面将有5 1 0 的藻细胞被嗜 藻体破坏。但它在生物界中却占有着特殊的位置【1 8 】【19 1 。1 9 7 3 年p a d a n 等首次 在淡水蓝藻中发现了嗜藻体，随后b e r g h 等1 2 l j 又在海水蓝藻中发现了嗜藻体， 至今已经有许多种蓝藻噬藻体从蓝藻中分离出来。目前研究最多的是单细胞蓝 藻聚球藻s y n e c h o c o c c u s 的噬藻体。其中，h a m b l y 等 2 2 1 发现，对聚球藻 s y n e c h o c o c c u s 中分离出的噬藻体s p m 2 中1 0 k b 的片段进行分析发现，它与大 肠杆菌噬菌体t 4 很相似，有相同的保守序列，这为扩大基因库中建立基因问的 交流提供了平台，为构建监藻基因工程载体提供了新思路。 1 3 外源基因在蓝藻中的表达 在许多生物体中外源基因都已达到表达甚至高效表达的水平，包括细菌【2 3 1 、 真菌2 4 1 、酵母【2 5 1 、昆虫细胞【2 6 1 、哺乳动物细胞【”1 、人的肝细胞【2 8 】、高等植物1 2 9 】 和藻类等等。虽然利用蓝藻作为外源基因的表达宿主起步较晚，但是由于其 自身所具有的独有的特点和优势，已成为近年来生物技术中发展较快的领域之 5 第一章 上海师范大学硕士论文 蓝藻宿主作为外源基冈的表达宿主，也是根据蓝藻自身的特点和表达基因 的特点考虑的。因为宿主的选择与外源基因能否有效导入、稳定正确的表达产 物、简便培养和蛋白产物的纯化都具有直接的关系【3 1 1 。蓝藻分子生物学近几年 己跃至生物学的自订沿之一，主要标志有两点：其一，1 9 9 6 年对单细胞蓝藻基因 组图谱的测序完成，为研究蓝藻基因工程丌辟了先河。其二，自1 9 8 7 年以来， 尤其是9 0 年代中期以来，一批具有应用前景的外源基因在许多蓝藻中的成功表 达。让世人看到了蓝藻的经济应用前景，这也必将得到社会上更多的理解和支 持，从而加速蓝藻分子生物学研究的发展。 其中选择蓝藻作为基因表达宿主具有如下几点原副3 2 】： 遗传背景简单。除了裸露的染色体d n a 以外，不含有其它d n a ，便于实验 操作和外源d n a 的检测。基因组序列简单、具有良好的遗传和生理特性基础 用于高等植物和动物的表达可以作为研究各类生化特性的理想模式生物。 细胞被属于革兰氏阴性菌，主要由肽聚糖组成，便于外源d n a 的转化。 培养条件简单。生长条件为光合自养型，只需要光照、二氧化碳及无机盐用 于生长。培养方便廉价，蓝藻只进行分裂繁殖，并且生长速度比真核藻类要快。 多数蓝藻含有内源质粒，为监藻质粒载体的构建提供了有利的条件。 由于蓝藻的生长条件只借助于光照、二氧化碳和少量的无机盐，所以其自身 体内一般不产生内毒素蛋白，并且蓝藻体内富含蛋白质，可以用作食物及保健 品，在此基础上，如果采用转基因技术，把一些有用的药物基因转入无毒的蓝 藻中，就可以达到两全其美的效果了。 在蓝藻细胞中表达的外源基因产物不形成包涵体、藻细胞中不含有内毒素的 特点，使得通过转基因蓝藻制备药物的下游加工过程大大简化，具有潜在的经 济价值和社会效益1 3 3 j 。 鉴于其诸多优点，许多人试图将蓝藻作为外源基冈的表达宿主。目前利用 蓝藻作为表达宿主，已有多种外源基凶进行过表达。如芽孢杆菌杀幼蚊毒素基 因【3 4 】、人碳酸苷酶基因f 3 5 1 、人超氧化物岐化酶h s o d 基因【3 6 】、r u b 括c o 基因【3 7 】【3 8 l 等。蓝藻虽然作为外源基因的表达宿主具有许多天然的优点，但至今在蓝藻细 胞体内外源基因的最高表达量也只占可溶性蛋白总量的3 左右1 3 l 。远不如在蓝 藻中自身的表达量，因此提高外源基因在蓝藻中的表达效率成为开发蓝藻基因 工程产品的关键所在。 6 上海师范大学硕士论文第一章 1 4 启动子 基因的表达调控在分子生物学研究领域中占据着极其重要的地位，主要包 括转录水平的调控和翻译水平的调控。而转录水平的调控是研究原核生物中表 达调控最重要的环节，它决定着细胞内m r n a 的丰度【3 9 1 。其主要与m r n a 聚 合酶、顺式作用元件、反式作用因子以及它们之间的相互作用有关。只有它们 正常地发挥作用，生物体才会在细胞分裂、组织分化、器官分化、世代发育以 及对环境因子的反应中正确地进行基因转录调控。启动子是重要的顺式作用元 件，应用较为普遍。关于启动子的研究是转基因产品研究、基因表达调控机制 研究等领域的核心内容。 1 4 1 启动子的结构特点 启动子是法国分子生物学家j a c o b 和m o n o d 4 0 j 等人开创性的工作。早在 1 9 6 1 年，他们通过对大肠杆菌的乳糖代谢系统突变体的研究，发现了乳糖操纵 子并深入研究其结构与功能，为基因表达调控的研究打下了基础。1 9 6 4 年，人 们发现了启动子，从此启动子结构与功能的研究成为分子生物学的研究热点之 一。没有启动子，基因就不能进行转录。启动子是基因工程表达载体的重要元 件，是基因结构的一个组成部分，控制基因表达( 转录) 的起始时问和表达程度。 它就像一个“开关”，决定着基因的活动。启动子通过与r n a 聚合酶结合作用并 启动基因转录的d n a 序列，影响着基因的转录效率【4 1 】【4 2 l 。其核心区域存在保 守序列是启动子最显著的特征。经生化和遗传学的方法证吲4 3 】1 4 4 1 原核生物启动 子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，位于转录起始位点上游 1 0 区和3 5 区具有很高的同源性，对启动子具有很重要的功能，对m r n a 的合 成极为重要【45 。启动子富含a t 碱基对，它的强弱就取决于3 5 区和1 0 区的碱 基组成及其间隔序列。在原核生物中1 0 区同3 5 区之间核：纾酸数目的变动会影 响基因转录活性的高低。一般而言，蓝藻与大肠杆菌的启动子的结构具有很高 的相似性，它们具有相似的r n a 聚合酶和启动子，但是蓝藻启动子序列中1 0 区保守性很强，高于7 0 t 4 6 1 。而3 5 区的保守性较差或者不存在【4 7 儿4 8 1 。 在蓝藻启动子的结构中，转录起始位点的确定也占据着一定的作用。但是， 很少有人知道蓝藻中的转录起始位点与其它的原核生物存在很大的差异1 4 引。通 过生物信息学和实验的手段对2 1 个基因的2 5 个转录起始位点( t t s ) 进行分析， 发现有些基因的t t s 多于一个，而有些基因却很难寻找到，并且1 0 区序列具 有t a t a g t 的特征，但3 5 区却没有共同的序列特性。这为研究蓝藻启动子序 7 第一章上海师范大学硕十论文 列的功能方面提供了宝贵的依据。 1 4 2 启动子的类型 蓝藻是进行光合自养的原核生物，对于蓝藻基因启动子的研究是从2 0 世纪 7 0 年代开始研究的。与高等植物基因的启动予研究相比，蓝藻基因的启动子研 究甚少，主要集中在光合作用相关基因的启动子，且国外报道较多，国内这方 面的研究报道较少，并且局限于固氮类蓝藻的研究似n a b a e n a ) 。启动子的选择 是决定外源基因在转基因宿主体内表达强弱和控制表达量的关键因素。启动子 控制着转录的起始时间和转录程度。选择合适的启动子对于增强外源基因的表 达量至关重要。生物体内基因的表达表现为程序性地开放和程序性地关闭，而 这里起关键作用的就是启动子。 启动子可调控细胞内某些基因的表达。在原核生物表达系统中，大肠杆菌的 许多启动子被用来作为蛋白表达的工具，通常使用的可调控的强启动子有p l ( 乳 糖启动子) 、p t w ( 色氨酸启动子) 、p i 。矛i p r ( x 噬菌体的左向和右向启动子) 以及p ( 乳 糖和色氨酸的杂合启动子) 等。其中p l a e 和p 。嵋的表达量可以占细胞中可溶性蛋白的 1 5 3 0 ，但是它们中很少可以被广泛使用，因为这些高效表达的启动子都是采 用i p t g 进行诱导，不适用于蓝藻中，因为i p t g 会对藻细胞自身代谢产生毒害作 用，并且价格昂贵，不便于广泛使用。与高等植物相比，藻类基因表达调控的研 究相对较少，且多数集中于国外学者，主要是关于光合作用与固氮作用相关基因 的启动子研究。 启动子决定着外源基因的转录效率，外源基因在宿主体内表达与否及表达 量都直接与启动子有关。至今，已有许多启动子被克隆用于研究。根据其来源 不同，可以分为来源于宿主之外的外源性启动子和来源于宿主之内的内源性启 动子。而启动子按照对基冈表达的调控方式主要分为组成型启动子( 即基因的表 达不受时空和某种物质的诱导限制而在生物体内的表达) 、诱导型启动子( 基因 的表达受到某种物质的诱导，如果没有诱导物存在，基因表达水平很低甚至没 有) 和组织特异性启动子( 植物体内某个组织或器官基因的表达) 1 5 引。其中使用诱 导型启动子是提高表达效率的一种有效手段。然而，如何使用合适的可诱导型 启动子，其诱导条件的选择，对宿主自身的正常生长有无毒害作用，也是在选 择启动子时所需要考虑的。 1 4 3 蓝藻中组成型启动子和诱导型启动子对基因表达的作用 按照对基因表达的调控方式主要分为组成型启动子、诱导型启动子和组织 8 上海师范大学硕士论文 第一章 特异性启动子。 1 4 3 1 组成型启动子 组成型启动子在转基因植物中使用的较多，它们是植物基因工程中应用最 早、最广泛的一类启动子。具有持续性，表达量基本恒定。、而最常用的是将植 物中花椰菜花叶病毒3 5 s 启动子作为一种组成型的强启动子被应用【5 。 1 4 3 2 诱导型启动子 诱导型启动子( i n d u c i b l ep r o m o t e r ) 可以大幅度地提高基因的转录水平，其目 的基因的表达量受某种物质的诱导而增加。目前已经分离了光诱导表达基因启动 子、热诱导表达基因启动子、离子诱导表达基因启动子等等。诱导型启动子可以 受化学物质、离子、温度、光照等条件诱导。例如：聚球藻中几种基因启动子与 l a c z 进行融合表达，通过检测d 半乳糖苷酶的活性，发现了几个受c 0 2 调节的启 动子【5 2 1 。详见表1 4 2 。 1 4 3 3 组织特异型启动子 组织特异型启动子( t i s s u e s p e c i f i cp r o m o t e r ) 3 l 称器官特异性启动子。在这类 启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育 调节的特性。 1 4 4 蓝藻中内源型启动子和外源型启动子对基因表达的作用 1 4 4 1 内源启动子在蓝藻中的表达 最早的外源基因在蓝藻中的表达都是通过其内源启动子作为调控元件【5 3 巧5 j 或者通过高等植物叶绿体作用的【5 6 】。启动子聚球藻7 9 4 2 中，编码光系统i i 反 应中心d 1 蛋白的p s b a i 启动子的活性【y 7 1 ，分别通过l a c z 和l u x a b 构建的载体 检测启动子元件的突变引起表达量的变化，结果表明在强光下启动子的活性下 降，表达量减少，并且p s b a i 的3 5 区时表达所必需的，1 0 区可以增加表达量， 在高光条件下，不会引起表达量的减少。 1 4 4 2 外源启动子在蓝藻中的表达 大肠杆菌l a c z 基因第一次在蓝藻聚球藻7 0 0 2 中的表达。在聚球藻7 0 0 2 中， 通过p c r 的方法扩增出印印作为启动子，g l n a 基因片段作为整合平台，表达 外源小鼠金属硫蛋白m m t - i 。大肠杆菌中的，口记基因在聚球藻7 9 4 2 中进行表 达，聚球藻7 9 4 2 的启动子与l a c z 基因融合表达，然后去识别受c 0 2 调控的启 动子。在高低c 0 2 条件下，通过测定p 半乳糖苷酶的活性。详见列表1 4 2 。 9 第一章 上海师范人学硕士论文 表1 - 4 1 组成型启动子在蓝藻中的表达 t a b l e1 - 4 1c o n s t r u c t i v ep r o m o t e r sf o rg e n e se x p r e s s i o ni nc y a n o b a c t e r i a 内源启动子 启动的外源基因表达宿主 文献 h e p a l u x a ba n a b a e n as p p c c7 1 2 0 w a l kc p ( 1 9 9 3 ) c p c bc r y l v ds y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 r a n d y ( 19 9 2 ) 班lacz s y n e c h o c o c c u ss p p c c7 0 0 2 b u z b y ( 19 8 5 ) 成 型 p s b a 启 动 子p e t f h u p s l 小肠三叶因子( i t f ) 基因 尿激酶原( p r o - u k ) 箍冈 g m c s f 细胞生长因子 表皮生长因子f e g f ) 基凶 水稻胞质f b a 与菠菜叶 绿体t p i 串联基因 蚊毒基凼c r y l v d l u x a b a n a b a e n as p p c c7 1 2 0 s y n e c h o c o c c u ss p 。p c c7 0 0 2 n o s t o c p u n c t i f o r m e 2 9 1 3 3 宁叶( 2 0 0 2 ) 罗娜( 2 0 0 0 ) 马为民( 2 0 0 3 ) 魏兰珍( 2 0 0 5 ) t a n d e a u d e ( 19 8 7 ) m a r i e ( 2 0 0 3 ) 外源启动子 启动的外源基因表达宿主 文献 t a c 人碳酸酐酶基冈( h c a )s y n e c h o c o c c u ss p ，p c c7 9 4 2 p r i c eg d ( 1 9 8 9 ) c d c b h g m c s fa n a b a e n as p p c c7 1 2 0 魏兰珍( 2 0 0 8 ) 表1 4 2 诱导型启动子在蓝藻中的表达 t a b l e1 - 4 2i n d u c i b l ep r o m o t e r sf o rg e n e se x p r e s s i o ni nc y a n o b a c t e r i a 内源启动子特征启动的外源基因 表达宿主 文献 r b e l 光调节 h s o d 基i 天l s y n e c h o c o c c u ss p p c c6 3 0 1 1 1 a k i s h i m a ( 1 9 9 4 ) g r o e s l温度胸腺索a is y n e c h o c o c c u ss p p c c7 9 4 2 章军( 2 0 0 1 ) c p c p 诱。 c p c p 2 a