（分析化学专业论文）光谱法研究稀土元素与蛋白质的相互作用.pdf

原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进行 研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成 果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：! 墨茎j日期：垫堕妄! 壶 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属 兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同 意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许 论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学 位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论 文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：型赴导师签名：敞鼠期：翌型 张莉硕士学位论文 兰卅大学化学化工学院2 0 0 5 年 摘要 本论文有以下四部分组成： 一主要综述了蛋白质与金属离子相互作用的研究概况及稀土离子的生物效应， 介绍了蛋白质结构测定技术的发展，展望了在分子水平上对稀土元素的生物 效应的研究进展，探讨了稀土离子对生物体的调控功能及对人体的长远效 应。 二用共振散射光谱( r r s ) 和紫外一可见光谱( u v v i s ) 对镝( ) 、铽( 1 1 1 ) 与人血丙种球蛋白( g a m m as e r o g l o b u l i n h u m a n ，i g g ) 相互作用的机理进 行了探讨。研究表明：金属离子与丙种球蛋白肽键的c = o 基团和亲水外壳 的氨基酸残基中的羧基通过静电作用形成了缔合物。 三用共振散射光谱( r r s ) 、荧光光谱、紫外可见光谱( u v v i s ) 和红外光谱 ( f t i r ) 研究了稀土离子镝( i i i ) 、铕( i i i ) 与牛血红蛋白( h b ) 的相互作 用。研究表明：金属离子与血红蛋白肽键的c = o 基团和亲水外壳的氨基酸 残基中的羧基通过静电作用形成了缔合物。 四共振散射光谱( r r s ) 、荧光光谱、紫外可见光谱( u v ，v i s ) 和红外光谱( f t i r ) 研究了l o 种稀土离子与牛血红蛋白( h b ) 、人血丙种球蛋白的相互作用。 研究表明：金属离子与蛋白质肽键的c = o 基团和亲水外壳的氨基酸残基中 的羧基通过静电作用形成了缔合物，并且对1 0 种稀土离子与蛋白质作用的 强弱进行了分类。 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 a b s t r a c t t h ed i s s e r t a t i o ni sc o m p o s e do ff o u r p a r t s ： c h a p t e r o n e ： i tm o s t l ys u m m a r i z e dr e s e a r c hs u r v e yo ft h ei n t e r a c t i o no f p r o t e i n sw i t hm e t a l l i c i o n sa n db i o l o g i c a le f f e c to fr a r ee a r t hi o n s ，i n t r o d u c e dd e v e l o p m e n to fd e t e r m i n a t i o n t e c h n i q u e so fp r o t e i ns t r u c t u r e w ew e r eg o i n g t oc a 3 t yt h r o u g hd i s c u s s i o ni na s p e c t s o fl o n g - t e r me f f e c to nf l e s ha n dr e g u l a t i o na n dc o n t r o lf u n c t i o no no r g a n i s mo fr a r e e a r t hi o n s c h a p t e r t w o ： t h ei n t e r a c t i o nf o rd y ( i i i ) a n dt b ( i i i ) i o n sw i t hh u m a n ￥- g l o b u l i nh a sb e e n i n v e s t i g a t e db ys c a t t e r i n gs p e c t r u ma n du vs p e c t r a i ti ss h o w n t h a ta tp h7 4 0 t h e w e a kr r so f y g l o b u l i nc a l lb ee n h a n c e dg r e a t l yb yt h ei n t e r a c t i o no fy - g l o b u l i n w i t hd y ( i i i ) a n dt b ( 1 1 1 ) t h e i rs c a t t e r i n gw a v e l e n g t h sa p p e a ra t4 7 01 1 1 1 3 t h er r s i n t e n s i t yc a r lb ei n c r e a s e di nl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h ei n c r e a s i n go fd y ( i i i ) a n d t b ( r i ) c o n c e n t r a t i o n ，a n d t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r sa n dt h e o p t i m u m r e a c t i o n c o n d i t i o n sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d a n dt h eu v s p e c t r ar e s u l t ss h o w s t h a tb i n d i n go f d y ( i i i ) a n dt b ( i i i ) t o y - g l o b u l i nh a ds t r o n gi m p a c t o n p r o t e i nc o n f o r m a t i o n d y ( i i i ) a n d t b ( i i i ) w i t hc a r b o n y lo f t h ep e p t i d eb o n da n d c a r b o x y lo f a m i n oa c i d sr e s i d u e si n y g l o b u l i nc a l lf o r m a s s o c i a t i o nc o m p l e x e st h r o u g he l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n c h a p t e r t h r e e ： a tp h = 7 4 0 t h ew e a kr r so fh e m o g l l o b i nc a nb ee n h a n c eg r e a t l y b yt h e i n t e r a c t i o no f h e m o g l o b i n w i t hd y ( i i i ) a n d e u ( i i i ) r e s u l t i n gi nt w oc h a r a c t e r i s t i c p e a k s t h e i rs c a t t e r i n gw a v e l e n g t h sa p p e a ra t3 8 0 u ma n d4 7 0 u m t h ei n f l u e n c i n g f a c t o r sa n dt h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i f i o i i sh a v eb e e ni n v e s t i g a t e d i ti sd i s c o v e r e d t h ei n t e n s i t yo fr r si s d i r e c t l yp r o p o r t i o n a lt o t h ec o n c e n t r a t i o no fd y ( i i i ) a n d e i i i ) a n db yu v i s ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p i e sa n df t i rd e t e r m i n a t i o n ，i ti s c o n c l u d e dt h a td y ( i i i ) a n dt b ( i i i ) w i t hc a r b o n y lo ft h ep e p t i d eb o n da n dc a r b o x y lo f a m i n oa c i d sr e s i d u e si n h e m o g l o b i n c a l lf o r ma s s o c i a t i o n c o m p l e x e st h r o u g h e l e c 仃o s t a t i ci n t e r a c t i o n c h a p t e r f o u r ： t h ei n t e r a c t i o nf o rr a r ei o n sw i t hp r o t e i nh a sb e e ni n v e s t i g a t e db ys c a t t e r i n g s p e c t r u m ，u v i s ，f l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p i e sa n df t i r i ti ss h o w n t h a ta tp h 7 4 0 。t h ew e a kr r so fp r o t e i nc a nb ee n h a n c e dg r e a n vb vt h ei n t e r a c t i o no fp r o t e i n w i t hr a r ei o n s 耽ei n f l u e n c i n gf a c t o r sa n dt h eo p t i m u mr e a c t i o nc o n d i t i o n sh a v eb e e n i n v e s t i g a t e d t h er r s a n du v v i sa n a l y z i n gr e s u l t ss h o wt h a tt h ei n t e r a c t i o nf o r d i f f e r e n tr a r ei o n sw i t hp r o t e i n a r ed i f f e r e n t a n d 。t h e u v v i s ，f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p i e sa n d f t i rr e s u l t ss h o w st h a tb i n d i n go fr a r ei o n st op r o t e i nh a ds t r o n g i m p a c to np r o t e i nc o n f o r m a t i o n r a r ei o n sw i t hc a r b o n y lo f t h ep e p t i d eb o n da n d c a r b o x y lo f a m i n oa c i d sr e s i d u e si np r o t e i nc a l lf 0 1 t aa s s o c i a t i o nc o m p l e x e st h r o u g h e l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n 2 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 年 第一章综述 刚茜 蛋白质是构成生命体最重要的有机物质之一。它们能起多种作用，包括物 质的输运( 如血红蛋白的载氧) 、生化反应的催化( 酶) 、生物材料( 肌肉、骨骼、 毛发等) 的形成、免疫的作用或通过与其它蛋白质相结合的调节作用( 如钙调蛋 白) 等。蛋白质在几乎所有的生物学过程中都起着极其重要的作用。目前已经 发现的蛋白质数量已达几百万种，但是各种蛋白质均是含有多个配位原子( 如： n 、0 、s ，有些蛋白质还含有p 等) 的大分子多齿配体，因此能够很容易地与 金属离子或其它小分子配合物相互作用。 在生物体内，同其它物质一样，金属离子( 具有一定生物学功能的金属离 子) 的浓度也必须维持在适当的范围。假如某种必需金属离子的浓度过低，就会 对需要这种离子的生物学过程产生不利影响，从而导致生物体产生金属离子缺乏 症。一旦某种金属离子的浓度高过某一下限值，该金属离子的量对于完成其生 物功能就是充足的；另一方面，金属离子的浓度不能无限制的增加而不出现负面 效应，高过某一上限值，就会出现金属离子的毒性效应。假如某种金属离子结 合在不恰当的位点上，它就会与其它有益金属离子竞争此位点；或者说，当某种 金属离子结合位点受到干扰和破坏，就会出现不需要的反应活性。有些金属离子 如p b 、h g 等，对人体而言就是有毒金属，但其毒性的大小与存在形式有关；另 外，有些金属离子的生物学功能尚不清楚，可能无毒，也可能毒性相当大，这还 需要科学工作者的继续研究。目前发现金属离子与许多疾病的发病机理密切相关， 如早老性痴呆症、肌萎性脊髓侧索硬化症、疯牛病或克雅氏症【i i 、高血压、糖 尿病以及癌症2 】等，因此金属离子对重大疾病的致病机理的研究越来越引起人 们的关注。 蛋白质与金属离子相互作用的研究是一个经典的课题，早在5 0 年代就已开 始进行。自6 0 年代以来，采用晶体结构分析和配位化学方法研究了一些金属蛋 白和金属酶的结构，配合生物活性研究推测了它们的作用机理，这些研究构成了 生物无机化学的主要研究方向。8 0 年代以来，各种检测技术及计算机技术的发 展为人们研究蛋白质与金属离子的相互作用打开了一个新的局面。这方面我国的 生物无机化学家王夔、倪嘉缵1 4 】等已作了大量的职究工作，并有多部相关专著。 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 目前国内外的重要研究方向是金属结合后引起的构象变化，缔合及装配所引起的 后续生物效应。 本章主要对过渡元素、稀土离子、贵金属、p b 和h g 与一些常 见蛋白质相互作用的研究进展情况进行了综述和总结，以及介绍了蛋白质结构测 定技术的发展。 第一节金属离子与蛋白质相互作用的研究进展 蛋白质自身结构及配位环境的复杂性决定了蛋白质同金属离子相互作用的 复杂性。蛋白质可以与金属离子直接作用形成配合物，也可以与小分子配合物发 生配体交换反应或加合反应；含金属元素的蛋白质，还可发生金属离子之间的置 换反应，这在重金属中毒方面尤为常见。金属离子常充当蛋白质构象变化的诱发 因子，而且同种金属离子或不同金属离子之间也常存在不同程度的竞争结合作 用，且对不同的蛋白质、这种作用的方式和程度是不同的。对同种金属离子来说， 一个离子的结合可能引起蛋白质构象发生部分变化，使蛋白质的紧密结构趋于松 散状态，而裸露出更多的结合部位引发更多金属离子的结合，从而引起整个蛋白 质分子构象的变化。蛋白质的功能来自其特定的构象，构象改变了，其生物功能 或活性就会减弱或消失。因此研究金属离子同蛋白质的相互作用，特别是作用前 后蛋白质的构象变化，并阐明某种金属离子的作用机理，这对于从分子水平上研 究微量金属离子对药理的作用、抗凝血、抗癌的作用及其对人体健康的影响、预 防中毒和环境污染治理等具有重要意义。 1 1 过渡元素与蛋白质的作用及影响 在过渡元素中，m n 、f e 、c o 、c u 、z n 、m o 等都是人体必需元素，v 、c r 、 n i 、w 等是有益元素。但是体内金属离子过多或过少都将导致人体正常生理功 能的紊乱，从而引起各种各样的疾病。因此，研究过渡金属和蛋白质相互作用的 机理及作用后影响其正常生理功能而造成的可能疾病是很有意义的。 1 1 1 过渡元素与蛋白质的相互作用 梁宏等研究t m n ( i i ) 与血清白蛋白的相互作用【5 】。发现在紫外区l m c t 谱带 ( 配体到金属离子的电子跃迁) 处，1 ：l 的m n ( i i ) 一h s a ( 人血清白蛋白) 斧f i m n ( i i ) - - b s a ( 牛血清白蛋白) 在生理p h 下金属中心的配位结构随浓度的变化而不同。浓 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 度较低时，金属中心具有五配位的四方锥构型：浓度较高时则转变为四配位的四 方平面构型。张风云等【6 】利用甲醇沉淀法和渗析法研究了金属离子与人血清蛋白 的作用，发现在离子浓度为1 0 3 0m g l 、温度4 5 c 和p n7 0 时，金属离子 与人血清蛋白作用的强弱顺序为z n c u c d c o f e c r m n n i 。有人利 用微透析取样法研究了两种金属离子与血清白蛋白的竞争结合作用【7 1 ，结果表 明，铜( i i ) 和镍( i i ) 、镉( i i ) 和锌( i i ) 在h s a 上都有共同的第一结合位点，从而建 立了一种研究金属离子与蛋白质竞争结合作用的方法。荧光猝灭法 8 】研究表明， 在生理p h 值7 4 3 o 0 2 和温度2 8 下，以铜( i i ) 一牛血清白蛋白和锌( i i ) 一牛 血清白蛋白单金属体系作参考，研究了双金属体系中铜( 1 i ) 、锌( i i ) 与b s a 的相 互作用；并在s t e r n v o l m e r 猝灭公式的基础上近似推导了此双金属体系中荧光猝 灭的缔合公式，由此获得铜( i i ) - b s a 单金属体系的s t e r n v o l m e r 猝灭常数飓v 、 解离常数硒和双金属体系中铜( i i ) 与b s a 的s t e r n v o l m e r 猝灭常数k 1 s v 和解离 常数k d ，并通过比较与分析推测锌( i i ) 能够竞争铜( i i ) 与b s a 的结合，并且铜 ( i i ) 与b s a 结合的稳定性大于锌( i i ) 与b s a 结合的稳定性。另外还有利用微透析与 高效液相色谱联用技术【9 】研究t n i ( i i ) 与人血清白蛋白( h s a ) 的相互作用，计 算出第一结合位点数和结合常数分别为1 1 6 和8 6 1 0 5 l m o l 。冯玉英等1 0 1 用荧光光谱法并结合紫外光谱法研究了肌红蛋白( f e p p m b ) 的活性中心铁卟啉 与铜离予的相互作用，结果表明在水溶液中肌红蛋白中的铁可被铜离子取代，形 成铜卟啉化合物( c u p p m b ) ，并且随着体系中铜离子量的增加，其相互作用增 强。 不同的蛋白质结合相同的金属或不同的金属配位到相同的蛋白质中均引起 肽链不同程度的变构，这主要表现在：改变蛋白质二级结构、影响蛋白质三级结 构和四级结构或基本不影响蛋白质结构1 。如乳铁蛋白( 1 a c t o f e r r i n ) 是哺乳动物 体内的铁传递蛋白，f e 3 + 的插入不会引起蛋白质两端离铁结合部位较远的结构域 显著变构，处于两结构域之间的二级结构单元也没有显著变化【l “，只是它们的 相对定位、距离和取向有所改变。但是，铁离子的引入能显著影响乳铁蛋白的三 级结构。：n 3 n z n 2 + 不但改变胰岛素的二级结构，而且影响其四级结构【1 3 , 1 4 1 。 此外，过渡元素和蛋白质相互作用的研究还是很广泛的，见表1 1 。 张莉硕士学位论文兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 1 1 2 过渡元素与蛋白质作用后的影响 大量实验资料表明，铁、铜、锰、锌等过渡金属离子是重要的神经化学因子 它们不正常的代谢与神经系统的疾病紧密相关，如早期老年痴呆症( a l z h e i m e r d i s e a s e ，a d ) ”j ，家族肌萎性脊髓侧索硬化症( f a i l i a la m y o t r o p h i cl a t e r a ls c l e r o s i s ，f a ls ) p 4 j 和疯牛病或克雅氏症( 州o nd i s e a s e ，p d ) ( 见表1 2 ) 。所以要结合分 子生物学和蛋白质化学的知识去研究那些不正常的金属与蛋白质的相互作用， 最终找到神经性疾病的起源【“。一些与金属离子有关的疾病如表1 2 。 表1 2 与金属离子有关的疾病 近几年来风靡英国的疯牛病( p r i o nd i s e a s e ，p d ) 则是由于铜离子导致的神经 毒性而引起的。疯牛病蛋白( p r p ) 1 1 与c u 2 + ( 也可能为f e 3 + ) 结合后，二级结构发 生根本改变，其中a 。螺旋转变为伊折叠”1 ，因而聚集成p r p ”。p r p 5 。蛋白聚集引起 病变并带有传染性。铜离子在疯牛病的发病机理中扮演着至关重要的角色【”。 6 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 流行病学研究表明，从事的职业如经常与锰、铜、铅、铁、汞、铝和锌接触则患 p d 病的风险因素更大，在p d 病人的黑质中，这些金属的水平大大提高。早老 性痴呆症( a d ) 与z n ”的结合有关。声淀粉样蛋f t ( a ? ) 是早老性痴呆症( a d ) 病脑中 淀粉样斑的主要成分，可能含有两个z n 2 + 的结合部位，即使是生理浓度的z n 2 + 也 可使邸二级结构发生变化，聚集并产生沉淀【3 6 ，3 7 】。 在细胞癌变中，金属致癌物与蛋白质作用，一般说来主要是与酶中固有的 金属离子发生了置换，引起酶的空间构型的改变，使其活动部分受到抑制或全部 消失。如n i ( i i ) 置换了含铜酶中的c u ( i i ) ，或置换了酶中的辅因子m g ( i i ) ，c d ( i i ) 可置换含锌酶中的z n ( i i ) ，当酶的活性降低后，产生代谢障碍而诱发癌症 2 1 。 由此可见，金属离子是否对生物体有影响主要取决于金属离子与蛋白质作用 后是否改变蛋白质的构象，从而影响蛋白质正常的功能。 1 2 稀土离子与蛋白质的作用 随着稀土元素在工业、农业、养殖业及日常生活中的应用，稀土已经进入了 我们的生态环境，它们会通过各种途径进入动植物体，并且最终经由食物链进入 人体。稀土进入人、动物、植物体内是一件令人担忧的事，因为人们对它们在生 物体系内的效应知道得还不多，若贸然大量使用则有可能产生严重的后果，这种 后果或许要经过几代人以后才表现出来。因此研究稀土离子与蛋白质的相互作用 已经是紧迫而重大的问题。 稀土离子的生物化学研究是从稀土离子的毒害和防止开始的。早在1 9 1 3 年人 们就发现稀土离子就有抗血液凝固的作用。一般认为是由于稀土离子与钙离子的 拮抗作用所致。稀土离子属于硬酸，性质与c a 2 + 相似，但具有更高的正电荷，因 此稀土可以竞争性的取代钙。稀土离子取代c a ”而与羧基结合，改变了凝血酶原 蛋白的结构，从而破坏了整个凝血过程1 3 8 1 。近年来发现稀土化合物有抗动脉硬 化的作用，此作用也同稀土离子与钙的拈抗作用有关；n j a n c s o 等在1 9 6 0 年即发 现稀土具有抗炎作用 3 8 】；此外发现稀土与肿瘤组织有较高的亲和性，可以用于 肿瘤的诊治和治疗。 一般认为稀土离子具有“低促一高抑”的h o r m e s i s 效应【3 9 】，也就是说稀土的 益害程度与它的吸收多少、在体内的数量和分布状态口8 1 有关。经研究发现口服、 肌肉或皮下注射吸收的少而慢，而腹腔或静脉注射、呼吸道摄入则吸收的多而快； 张莉颂士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 另外有研究表明1 4 0 ，按工龄分级比较，稀土作业工人的细胞免疫功能明显低于 非稀土作业者，这说明稀土作业环境对工人的细胞免疫功能有一定影响。尽管人 们已经做了许多有意义的工作，但由于稀土在动、植物体内的作用和机理研究涉 及到小剂量和长时间的问题，研究方法上有许多困难，问题比较复杂。因此研究 稀土离子与蛋白质的相互作用机理、作用后蛋白质构象的改变及其带来的生物效 应的变化都有着重要的意义。 1 2 1 稀土与血清白蛋白的作用 牛血清白蛋白( s e r u m a l b u m i n ，b s a ) 与稀土离子的相互作用研究是最早的。 b i m b a u m 等【4 1 1 由钕( i i i ) 在可见区的吸收差光谱得出b s a 以羧基与钕( i i i ) 结合。 r e u b e n 【4 2 1 使用质子驰豫法给出b s a 有4 个钆( i i i ) 结合部位，k d = 0 1 3 m m 0 1 l 。 而人血清蛋( h s a ) 与稀土离子结合的硒值为9 4 1 0 。4m o l l - i 【4 3 l ，钙( i i ) 与钆 ( i i i ) 的结合部位是不同的。1 3 9 l a n m r 研究表明，镧( i i i ) 与b s a 弱相互作用的肠 值为4 6 0m m o l - l 。【4 4 1 。张保林等用离心超过滤法测定了1 1 种稀土离子( i i i ) 与 牛血清白蛋白的结合常数，并通过多种光谱技术对结合机理进行了研究，获得了 专一性结合常数和非专一性结合常数以及专一性结合部位数目( n 。) ；用t a i r a 方 程求得的轻、重稀土与b s a 的专一性结合部位数目略有差异，从l a g d ，n ；= 4 0 ； t b l u ，n 。= 3 o 【45 1 。 稀土离子可使b s a 2 8 0 n m 的特征紫外吸收峰增加，诱导b s a 发生构象变 化，这种构象变化类似于降低p h 值出现的蛋白质肽键伸展，且引起构象变化的 顺序是：镨( i i i ) 铽( i i i ) 钕( i i i ) 镧( i i i ) ，同样条件下钙( i i ) 、铝( i i i ) 以 及一些过渡金属离子却无此作用。s h a h i d 等【4 6 1 由静电相互作用解释了这种构象 变化。对2 3 n a n m r 研究发现：稀土离子与h b a 结合后使蛋白质分子体积膨胀， 链段活动性增3 n t 4 7 1 。u v 讲s 光谱和表面增强拉曼光谱研究表明c e 4 + 离子很可能 和肽键上的c = o 基及边链羧基上的c = o 基发生配位作用，并引起b s a 肽链伸 展4 8 瑚】。范小娜等实验了牛血清白蛋白同钐( i i i ) 、铕( i i i ) 离子形成配合物的 合成方法及红外光谱特征，结果表明稀土离子钐( i i i ) 、铕( i i i ) 同牛血清白蛋 白中羧基的氧和氨基或酰胺基的氮形成灵敏度很高的配合物。通过园二色谱， 紫外吸收光谱及红外光谱的研究表明稀土离子与b s a 作用配位的基团为谷氨酸、 天冬氨酸残基侧链中的卢、a c o o 。和肽键中的c = o 基团【4 ”。 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化丁l 学院2 0 0 5 年 在h s a 含有的5 8 5 个氨基酸残基的单默链中仅在2 1 4 位含有一个色氨酸 ( t r p ) ，这是研究无辐射能量转移的极好模型。的确，h s a 可使铽( i ) 荧光加强【5 ”， 其他稀土离子可同铽( 1 i b 竞争结合，而钙( i i ) 却不能。对铽( i i i ) 与血清白蛋白作用 后进行荧光测定所给出的解离常数是2 0 1 0 4 m o l l ，其中一个铽( i i i ) 结合部位 与t r p 2 1 4 间距为1 3 8 n m t5 2 1 。稀土离子与白蛋白的相互作用已被扩展到三元体系 中【53 1 。 1 2 2 稀土与免疫球蛋白的作用 d o w e r 等 5 4 1 使用质子驰豫加强及e p r ( 电子顺磁共振) 技术研究了钆( i i i ) 与 非免疫兔中的免疫球蛋白g ( i g g ) 的结合作用。当p h 为5 5 时，i g g 有六个钆( h i ) 结合部位，位于f c 结构域( 是有两条重链各自的一半即含碳端的一半所组成， 不能与抗原结合) 的两个高亲合部位的k d ( 金属配合物的解离常数) 值为 5 9 m o t l 1 ，在( f a b h 结构域( 有一条轻链同重链含氮端的一半所组成，可与抗原 结合) 中的四个弱结合部位的局值为1 4 0 9 m o l l 。钆( i ) 加入到f c 和f a b 片 断中使蛋白质的荧光增加近1 0 。铽( i ) 与蛋白质的结合导致近1 0 0 倍的荧光增 强。若用抗肺炎球菌多糖免疫的蛋白质进行实验，由于抗原的分子量不同导致翻 转时间的改变，钆( i i i ) 与免疫球蛋白结合的凰值有所不同1 5 s 】。人血免疫球蛋白 在p h6 2 时与钆( i i i ) 结合的髓值为i a x 1 0 4m o l - l - 1 【5 酊。 自旋标记半抗原的e p r 研究证实稀土离子结合部位与半抗原相距1 2n f r 【， 稀土离予的结合使i g g 仅产生小的局部构象变化 5 7 1 。 1 2 3 稀土与血红蛋白的作用 荧光光谱和园二色谱研究表明稀土离子可导致血红蛋白中的珠蛋白和血红 素辅基的荧光发射增强，使血红蛋白的“一螺旋含量减少并引起二级结构和构象的 改变，稀土离子还可能干扰部分珠蛋白和血红素辅基正常的相互作用”。 稀土离子与血红蛋白( h b ) 作用后将会一定程度地抑制血红蛋白在低氧分压 时释放氧的功能。当有稀土存在时h b 不容易放出氧，这时h b 的二级结构发生改 变。对影响h b 载氧能力的机制研究指出，当血液中的铈离子进入红细胞后，使二 磷酸甘油酸部分水解而增加氧的亲和力，但铈与珠蛋白结合后可改变血红蛋白 的高级结构，既可增加又可降低氧的亲和力，铈离子也能通过推动羟自由基生成 使f e2 + 氧化成f e ”，而降低氧的亲和力5 9 6 0 1 。 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 1 2 4 稀土与其它蛋白质的作用 用紫外差光谱法研究人血清脱铁转铁蛋白与e u 3 + 的作用 6 ”。发现e u 3 + 可占 据脱铁转铁蛋白的两个金属结合部位，e u 3 + 优先占据脱铁转铁蛋白的c 端结合 部位，条件平衡常数是l o g k c = 8 4 2 o 1 2 和l o g k n = 6 0 3 0 4 2 ，稀土离子 占据脱铁转铁蛋白的c 端结合部位时受离子大小的影响。 脱铁乳铁蛋白与t b 3 + 及e u 3 + 作用后f6 2 1 ，结合紫外示差光谱、荧光光谱及圆二 色谱等方法发现t b 3 + 与e u 3 + 可特异性地结合在脱铁乳铁蛋白的两个f e 2 + 结合部位， 但不能从已经结合铁的乳铁蛋白中把铁置换出来。t b ”与这两个部位结合的条件 平衡常数为l g k1 = 8 ，4 8 o 2 4 和l g k 2 = 6 7 2 o 1 8 ( 2 5 。c ，0 1 0m o l l n a c i ， o 1 0m o l l - i h e p e s ，p h7 4 ) 。t b 针在这两个位点结合时，蛋白质的构象发生变化。 在t b 3 + 与蛋白质的浓度比低时，构象趋于紧缩，色氨酸残基进入疏水的环境；当 t b ”结合得较多时，构象转为开放，色氨酸残基转向亲水性环境。但无论哪种情 况，t b ”与脱铁乳铁蛋白的结合都不影响蛋白的二级结构。 用荧光光谱和园二色谱( c d ) 研究了人红细胞收缩蛋白( s p ) 与稀土离子的作 用63 1 。s c a t c h a r d 法解析表明，每个收缩蛋白四聚体分子有8 7 0 个e u3 十离子的结合 部位，其中2 9 0 个为强结合部位，其k 1 = 5 8 1 0 5l m o l 一；其余5 8 0 个为弱结 合部位，其k 2 = 3 3 1 04 l m o l 一。稀土离子与s p 的结合导致s p 的构象改变，一 螺旋含量下降，即使结构变得松散，这种改变既与稀土离子和s p 的浓度比有关， 也与稀土的性质有关。在低浓度下，轻稀土l a 与c e ”使s p 的a 一螺旋含量增 加，镧系中部的稀+ s m3 + 与e u3 + 使a 螺旋含量降低，g d3 + 的含量影响变化 不大，重稀土离子d y3 + 、h o 与t m3 十使s p 的a 一螺旋含量降低，但y b 3 + 却 使其增加；在高浓度下，除l a3 + 的影响变化不大及y b3 + 使a 螺旋含量反常的低 外，其它离子的影响变化趋势与低浓度相同；而y b3 + 具有反常的表现，其原因可 能与y b3 + 离子及其配合物易得到一个电子以形成f 1 4 电子构型有关【3 9 。 稀士离子与蛋白质的相互作用是广泛的，如与干扰素、骨糖蛋白、金属硫蛋 白、钙调蛋白、牙齿磷蛋白、血兰蛋白和半刀豆球蛋白a 等作用。不同浓度的稀 土离子和蛋白质的结合，通过改变蛋白质微构象或干扰蛋白质和其它离子结合的 两种程度不同而发挥着剂量作用，并影响蛋白质的功能。稀土离子( c e3 + ) 在高 低两种浓度条件下与g 一肌动蛋白 “1 结合，其结合位点及对肌动蛋白上c r y s 3 7 4 的 张莉硕士学位论文兰卅i 大学化学化工学院2 0 0 5 年 微构象影响不同。t b 3 + 可抑制脱铁蛋白对f e 2 + 的吸收i6 5 1 ，该抑制作用随浓度的增 加而增强。稀土的致毒作用机n _ t 6 6 】研究表明，稀土在高浓度时，会呈现重金属 离子的特性。除此之外，稀土离子还可以与运铁蛋白【6 7 】外源凝集素、小白蛋白 等许多蛋白质结合而影响其生理功能。有关稀土进入生物体，特别是进入人和动 物体内，其剂量效应对体内酶系统的影响的研究还需继续深入。 1 3 贵金属与蛋白质的作用 利用共振散射技术研究了金( 1 1 1 ) 与血清白蛋白的作用【6 ”，金( i i i ) 与血清白蛋 白的结合会破坏血清白蛋白分子的聚集，而且使血清白蛋白分子中的二硫桥键 断裂，导致白蛋白分子趋于松散，散射截面积减小，表现为共振散射强度降低。 张宝林等人6 9 1 通过监测顺、反铂与c d 7 m t 2 反应过程中释放出的c d 2 + 的浓 度，以及铂( i i ) 化硫蛋自在不同p h 下吸收光谱的变化，测定了铂( i i ) 化硫蛋白 的平均表观稳定常数，测得其值为2 3 1 0 ”。 张朝平等人【7 0 】用振动光谱研究了r 一球蛋白与银( i ) 离子的相互作用，结 果表明，y 一球蛋白表面的氨基酸残基同银( i ) 离子反应生成2 或4 配位的物种， 其i r 光谱在酰胺带区域呈现明显差异；同时，在恒定加热温度下，r a m a n 光谱 强度在反应开始后1 5 m i n 左右达到最大值，超过1 5 m i n 后银( i ) 离子被还原为 银。有关贵金属离子与蛋白质的作用研究见表1 3 。 表1 3 贵金属与蛋白质的相互作用 1 4 p b 、h g 与蛋白质的作用 p b 、h g 是对人体有害的金属。p b 中毒难于诊断，常常吸入几个月或更长 时间没有什么症状。慢慢感到有些不适，如食欲减退、易激怒、头痛、腹痛和呕 吐等，进一步恶化可能昏迷甚至死亡。h g 中毒有三种：汞蒸气、无机汞和烷基 汞。吸入汞蒸气是有害的，急性中毒表现为支气管发炎和肺组织损坏，慢性中 张莉硕士学位论文兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 毒表现为动作震颤和牙床发炎。可溶性无机汞有剧毒，过量的氯化高汞使肠道腐 蚀，。肾功能丧失，最后导致死亡。烷基汞危险性最大，它对脑细胞的损伤是持久 性的，另外还会扰乱线粒体的功能和使染色体产生畸形。因此，研究p b 、h g 与蛋白质的作用机理对于解析中毒机理是很有价值的。 季清洲、王立波等口8 1 对兔肝金属硫蛋白结合铅离子的圆二色谱进行了研究。 从锌诱导的家兔肝脏中分离纯化得到金属硫蛋白的两种亚型：z n m t i 和 z n m t i i ，在酸性条件下经柱层析得到脱金属硫蛋白( a p o j a t s ) ；用圆二色性( c d ) 光谱法研究，发现两种亚型a p o m t s 与铅离子的结合依赖于铅离子的加入比例及 p h 值。a p o m t s i 在p h3 - - 5 之间和a p o m t s - i i 在p f t 4 - - 6 之间与铅离子结合形 成特征簇合物p b 7 m t s ，其c d 谱图特征峰位于3 1 6 衄( - ) 、2 7 0n m ( + ) 、2 4 5n i i l ( + ) 及2 2 5n m ( - ) ，这表明解铅中毒的最佳条件应控制在弱酸性环境。 不同亚型的 a p o m t s 与铅离子的结合方式不同：p b 2 + 与a p o m t - i 的结合采取平均分配的方式， 而与a p o m t - l i 则采取选择性的结合方式，表明这两种亚型在解铅毒功能上存在 差异。 用双向电泳技术对比测定了正常的兔脑组织蛋白质和重金属铅中毒的脑组 织蛋白质之间的明显差异，从中鉴定了三个代表性的蛋白质斑点的分子质量分 别为6 6 5 0 1 、2 0 1 3 0 和1 9 5 4 8 ，并利用肽质量指纹图谱检索数据库初步确定三种蛋 白质的归属，发现重金属中毒的脑组织蛋白质中有不同表达的蛋白质存在 7 9 1 。 s t e i n b e r g 和s p e r l i n g p i 】还指出汞可能插入胱氨酸的二硫键 h 9 2 2 + + r s s r = 2 ( r s h g ) + = r s h g s r + h g ”，通过破坏二硫键来改变蛋白质的结构。 n a h a rs f 8 0 】等人研究了c d 2 + 、h 9 2 + 、p b 2 + 与p s i i 富集膜蛋白的相互作用，用去卷 积二阶导数f t i r 差异光谱研究了金属与蛋白质相互作用的本质及形成金属络合 物后蛋白质的构型转变和结构变化。结果表明，低离子浓度时未发现金属离子与 蛋白质相互作用；高浓度时，观察到金属离子结合在蛋白质中酪氨酸残基的c = o 和c n 基团上，同时还可观察到汞与硫的结合，主要的构象变化是从未配位蛋 白质的6 4 的螺旋和1 0 的口折叠转变到络合物的5 5 4 0 的螺旋和1 0 。2 0 的伊折叠。 第二节蛋白质的结构研究 蛋白质结构的研究很早就受到许多科学家的关注，并提出了许多假说，但是 一直没有一个令人满意的理论。直到1 9 5 2 年丹麦生物学家l i n d e r s t r o m - l a n g 第 一次提出蛋白质三级结构的概念，刁使蛋白质结构研究走上了正确的道路。1 9 5 8 1 2 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 年，英国晶体学家b e r n a l 提出了蛋白质的四级结构。近年来，随着蛋白质结构 研究技术的发展，蛋白质化学家又在四级结构的基础上增加了两种新的结构层 次，即超二级结构和结构域。超二级结构是1 9 7 3 年r o s s m a n 提出的，是指两个 或几个二级结构单元被多肽链连接起来组合成的有特殊的几何排列的局域空间 结构；结构域的概念是由免疫化学家p o r t e r 提出的，是指蛋白质分子中那些明显 分开的球状部分，如动物的免疫球蛋白( i g g ) 含有1 2 个结构域。如图2 1 为蛋 白质各级结构的示意图。 n 螺自 三缳结构 衄红帑白声韭毽) p 忻建 耋击跨城 = 圾臻蝴 四域结构 ( 血虹鬣白) 图2 1 蛋白质各级结构示意图 对于蛋白质的结构研究来说，从5 0 年代起，许多新的物理方法开始广泛应 用于配合物的电子结构和空间结构的研究，如x 射线晶体结构测定法、电子光谱、 红外光谱、电子顺磁共振等。对于金属蛋白和金属酶来说，最直接也最可靠的方 法是x 射线晶体结构测定法，目前还没有其它方法代替。但x 射线衍射法只能测 定合格的晶体，对于无法结晶或结晶后生物活性与非晶体不同的生物分子，x 射 张莉硕士学位论文 兰州大学化学化工学院2 0 0 5 年 线衍射技术就显得无能为力，只能提供有限的结构信息，因此其应用就受到一定 限制。新近发展起来的新的测定技术外延x 射线吸收精细结构( e x t e n d e d x - r a ya b s o r p t i o nf i n es t r u c t u r e ，e x a f s ) 分析【s ”成为测定特定的吸收原子 一金属蛋白和金属酶中金属原子近邻环境结构的有效而发展迅速的实验技术。它 是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种研究物质局部结构的方法，可以测定吸收原子 周围的配位结构，也就是测定配位原子的种类、数量、距离等结构信息，其优点 是它不仅可用于研究晶体物质，也可用于研究无定形物质、溶液和非单原子气体 等，因而成为x 射线等其它结构测定方法的补充。一些具有放射性同位素和具有 磁性核的生物配合物可以用n m r 法进行研究；那些含有不具有光、磁特性的金属 的金属蛋白或