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中山大学硕士学位论文2 3 个y - s n p s 遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究 2 3 个y - s n p s 遗传标记复合检测体系 的建立及法医学应用研究 专业:法医物证学 硕士生:张爱平 指导老师:刘超主任法医师 中文摘要 y 染色体的男性特异性,使其在法医d n a 检验和亲权鉴定方面有巨大应用潜 力。对轮奸案、强奸案等案件提取的混合检材进行鉴定时,y 染色体遗传标记扩 增分型技术更有其特殊的价值,获得的单倍型结果不受女性成分影响。当犯罪嫌 疑人样本无法获得时,还可通过取其父系的任何一个男性个体的生物检材作y 染 色体遗传标记进行排查分析,达到节约费用,缩小排查范围的目的。当孩子是男 孩,亲权鉴定出现疑问或者没有母亲参与时,比较y 染色体遗传标记是一个排除 被指控父亲的简便方法。中华民族的家系以父系姓氏为主,海外侨胞、知名人士 寻根问祖需鉴定是否为同一父系宗亲,财产继承需鉴定是否具有父系亲缘关系 等。检测y 染色体遗传标记显然有其他检验手段无法替代的作用。y 染色体特异 性遗传标记的研究,对于人类学家和考古学家是一个重要领域。 目前,s t r 技术被广泛应用于法医个体识别,但是在法医d n a 检验中会 遇到各种降解检材,潮湿炎热等环境会导致d n a 链断裂,d n a 片段的完整性 受到破坏,这种现象在陈旧的骨骼、腐败的尸体、发霉变质的斑迹检材中尤为 常见。荧光标记s t r 复合检测系统对上述检材往往无法正确分型。当d n a 片 段发生降解,大片段s t r 基因座不易检出,容易产生非特异性带,出现优势扩 增和基因漏扩等现象,一直是法医d n a 检验的主要难题之一。研究新的遗传 标记、检测方法十分迫切。 单核苷酸多态性( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o 印h i s m ,s n p s ) 是由基因水平上 中山大学硕士学位论文2 3 个y s n p s 遗传标记复合枪测体系的建立及法医学应用研究 的单个核苷酸变异所引起的d n a 序列多态性,其中最少的一种在群体中的频率 不少于l 。它包括了人类基因组已知多态性的8 0 ,是最常见的遗传变异类型。 从生物遗传和变异的本质分析,s n p s 将是一种最能反映群体遗传结构和个体间 的遗传差异的标记系统。由于具有可以用p c r 方法检测、分析片段更小 ( 4 5 1 5 0 b p ) 、突变率低、可实现高通量、自动化检测等特点,s n p s 迅速成为法 医学界解决严重降解d n a 标本分型的研究热点。 y s n p s 突变率低,相对稳定,通过对y 染色体s n p s 单倍型的分析,可进 行父子亲缘鉴定,还可以进行兄弟关系、叔侄关系、爷孙关系的父系亲属鉴定。 同时y 染色体s n p s 分布具有明显的地域性,可用于进行犯罪现场遗留的生物 学个体所属群体的推断。2 0 0 8 年,y 染色体协会( t h eyc h r o m o s o m ec o n s o n i 啪) 报道了5 9 9 个y 染色体上的单核苷酸多态性( s n p s ) 位点。 目前国内外对y s n p s 进行高通量检测的研究并不多见,同时还未见针对 中国人群的高效的复合检测体系。本课题探讨利用目前法医d n a 实验室常用 的复合p c r 扩增结合荧光标记单碱基延伸( s i n g l eb a s ee x t e n t i o n ,s b e ) 技术 和毛细管电泳检测的方法构建一个v s n p s 复合检测体系,实现对多个v s n p s 位点快速、简单、特异、灵敏、准确的检测,为降解d n a 检材的高通量分型 提供新的技术手段,通过群体遗传学研究获得广东地区人群的群体遗传学资料, 并探讨其在法医学案件检验中的应用。 首先根据y 染色体协会的文献筛选出主要分布于东亚人群的单体群及其 对应的6 5 个y - s n p 位点,根据文献给出的r s 编号在n c b i 的d b s n p s 数据库 ( 觚p :肌m 啊n c b i n l m n i h g o “s i t e s d b s n p ) 中查找位点的相关信息,结合国内外 文献选择3 0 个d b s n p 数据库报道在中国人群中多态性较好、侧翼序列稳定的 y - s n p s 位点,部分位点信息查看g e n b a n k 中的y 染色体序列 ( h _ t t p :肌m 啊n c b i n l m n i h g o w g e n b a n u i n d e x h t m l ) 。这些位点包括p 1 6 4 、m 1 2 2 、 p 2 0 3 、p 1 4 8 、p 1 4 5 、m 8 9 、p 1 5 1 、m 2 1 6 、p 1 2 8 、p 1 5 7 、p 1 4 9 、p 1 3 1 、p 1 9 9 、 p 1 2 3 、p 1 9 1 、p 2 0 1 、m 1 1 1 、m 1 9 9 、p 1 3 0 、m 9 、p 1 3 2 、p 2 0 0 、p 1 9 7 、m 1 1 9 、 p 1 3 6 、m 1 3 4 、m 1 7 5 、p 1 6 3 、m 3 2 4 、p 1 9 8 。 对3 0 个v s n p s 位点进行p c r 引物设计和单个y s n p s 位点的p c r 扩增, 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳( p a g e ) 和银染技术对单位点p c r 扩增产物进行检测。 中山大学硕士学位论文2 3 个y - 卵巾s 遗传标记复合榆测体系的建立及法医学应用研究 随后,通过“加尾”设计不同长度的单碱基延伸引物( 单碱基引物的长度2 0 8 5 个碱基) ,利用s n a p s h o t 刑试剂盒对每个位点进行单碱基延伸反应及毛细管电 泳检测,确定各个位点的迁移距离。去除单位点p c r 检测有非特异性扩增的位 点m 3 2 4 ,无法用单碱基延伸方法检测的位点m 1 7 5 ,正反向单碱基延伸引物3 端序列接近无法得出正确结果的位点p 1 9 8 ,通过正交法对复合p c r 体系中各组 分的含量及p c r 反应的参数进行调整,去除复合单碱基延伸反应有非特异性荧 光峰的位点p 1 6 3 ,正交法调整复合单碱基延伸体系各组分的含量和各引物的浓 度,综合考虑引物间的相互作用和扩增效率,选定了2 6 个y s n p s 位点建立复 合扩增体系。 使用建立的2 6 个y s n p s 复合p c r 扩增体系与荧光标记单碱基延伸技术 和毛细管电泳检测相结合的方法调查了2 9 0 名广东地区汉族无关男性个体,获 得了2 6 个y s n p s 位点的频率分布资料,除m 1 2 2 、m 1 9 9 、p 1 3 0 外,其余2 3 个遗传标记在广东人群中均具有遗传多态性。去除m 1 2 2 、m 1 9 9 、p 1 3 0 三个位 点,最终建立2 3 个y s n p s 复合检测体系,该体系各个y s n p s 位点的基因多 样性( g e n ed i v e r s i t ) ,) g d 范围为0 0 1 3 7 o 4 9 1 2 ,共检测到1 4 3 种单倍型 ( h 印1 0 t y p e ) ,单倍型多样性( h 印l o t y p ed i v e r s 埘) h d 为o 9 9 0 7 。根据y 染色 体协会命名原则,共有1 1 种单体群( h 印l o g r o u p ) 。 在2 5p lp c r 扩增体系中,最低检测量为5 0 p g ,当模板量在o 1 l o n g 时, 能得到较理想结果。检测1 0 种动物血样。猪、猴、鸡、黄牛、山羊、兔、鼠、 鹅、狗、猫的d n a 样本均无扩增产物。同一男性个体的肌肉、皮肤、肝脏、 指甲、软骨、血痕和骨骼等组织基因分型相同。在女性d n a 与男性d n a 比例 达1 0 0 0 :1 的混合检材中,扩增分型不受影响。 采用本体系检测3 0 对父子,4 5 对兄弟,5 个家系每个家系2 0 名个体,父 子与兄弟之间分型一致,每个姓氏家系的2 0 名个体分型结果相同。 对实际检案中收集的部分腐败检材进行检测分型,对于3 0 例s t r 仅检出 1 5 个基因座的模板,本体系能够完成1 8 2 1 个v s n p s 位点的分型。 结论:本研究建立了一个以单碱基延伸和毛细管电泳技术为基础的2 3 p l e x v s n p s 复合检测体系,包括p 1 6 4 、p 2 0 3 、p 1 4 8 、p 1 4 5 、m 8 9 、p 1 5 1 、m 2 1 6 、 p 】2 8 、p 】5 7 、p 14 9 、p 】3 1 、p 1 9 9 、p 】2 3 、p 19 1 、p 2 0 1 、m 1 】1 、m 9 、p 13 2 、p 2 0 0 、 中山大学硕士学位论文 2 3 个y - s n p s 遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究 p 1 9 7 、m 1 1 9 、p 1 3 6 、m 1 3 4 。该体系在中国汉族人群中多态性高,遗传稳定性 好、种属特异性强。所建立的2 3 个y - s n p s 复合检测体系通量大、重复性好、 灵敏度高、分型明确,对男女混合检材分型效果理想,可用于腐败检材和父系 亲缘关系等法医学鉴定。对案件中遇到的骨骼、毛发、肌肉等严重腐败检材分 型效果满意,可以在法医d n a 实验室推广使用。本体系研究平台基于法医d n a 实验室常规设备,具有良好的应用前景。 关键词:单核苷酸多态性( s n p s ) ,y 染色体,复合扩增,引物延伸法( 单碱 基延伸法) ( s b e ) ,降解d n a 片段,微测序法 i v 中山大学硕士学位论文2 3 个y - s n p s 遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究 e s t a b l i s h m e n to f2 3 - p l e xy _ s n p st y p i n gm e t h o db a s e do n s i n g l e b a s ee x t e n s i o na n dc a p i a i ye l e c t r o p h o r e s i st e c h n o l o g y a n di t sa p p l i c a t i o ni nf o r e n s i cs c i e n c e m a j o r :f o r e n s i cb i o l o g y n a m e :a i - p i n gz h a n g s u p e i 、r i s o r : p r o c h a ol i u a bs t r a c t t h em a l es p e c i f i c i t yo ft h eh 啪a l lyc h r o m o s o m em a k e si tp o t e n t i a l l yu s e 如l i n f o r e n s i cs t u d i e sa r l dp a t e m i 够t e s t i n g ,趾dm a r k e r sa r en o wa v a i l a b l ew h i c hw i l i a l l o wi t su s e 如l n e s st ob ea s s e s s e di np r a c t i c e c o m p a r e dw i t ho t h e r s ,t h et y p i n go fy c h r o m o s o m eg e n e t i cm a r k e r sh 嬲s o m eu n p a r a l l e l e d p r o p e r t i e s w h e r em a l e 硒s a i l 锄ta n df e m a l ev i c t i md n a sa r em i x e d ,邪i nr a p ec a s e s ,yc l l i o m o s o m e g e n e t i cm a r k e r sw i l lg i v es p e c i f i ci n f o m a t i o n o nt h ea s s a i l a n t a sm a n ym a l e r e l a t i v e so fam a nw i us h a r et l i syc h r o m o s o m e ,“i sp o s s i b l et 0g e t 也es u s p e c t s g e n o t y p e 仃o ma r l yo fh i sr e l a t i v e sw h e nh i ss 锄p l ei si m p o s s i b l eo b t a i n e d w h e r e m ep a t e n l i 哆o fa s o ni si nq u e s t i o n ,c o m p 撕s o no ft h eyc h r o m o s o m e sc a nb ea s i m p l ew a y o fe x c l u d i n ga i la l l e g e df a t h e r c h i n e s ec l a n s s u c c e s s i o ni sm a i n l yb 2 l s e d o nt h ec 锄眵i n go no fp a t r i l i n e a lf i a m i l y 瑚m e s o v e r s e a sc h i n e s e ,c e l e b r i t i e sw h o w a n tt 0l o o kf o rt h e i r 觚c e s t o r sn e e dt 1 1 ei d e n t i f i c a t i o no fp a t r i l i n e a lc l a n t h e i i m e r i t a r l c ea l s on e e d st h ei d e n t i f i c a t i o no fp a t e m a lr e l a t i v e s t h i ss p e c i a l i s e dr o l eo f t l l ec h r o m o s o m el e n d si ts o m eu n i q u ep r o p e r t i e s ,w h i c hh a v ea t t i a c t e dt h ea t t e n t i o n o fr c s e a r c h e r sw 1 0a r ei n t e r e s t e di nu i l d e r s t a n d i r 培h 1 加 1 a ng e n e t i ch i s t o r ) r c u r r e n t l y ,s h o r tt a l l d e mr 印e a t s ( s t r s ) c o n t r i b u t c t op e r s o n a l i d e n t i f i c a t i o ni n m 肌yf o r e n s i cc 鹊e sb e c a u s eo f t h e i rh i g hp o l y m o r p h i s m h o w e v e r ,d e g r a d e dd n a v 中山大学硕士学位论文2 3 个y 甜岬s 遗传标记复合枪测体系的建立及法医学应用研究 s 锄p l e so f k nn e e dt ob ei d e n t i f i e di nt h ef o r e n s i cd n a l a b n l ei n t e g r a t l i t ) ro fd n a c h a i n c o u l db ei n n u e n t e db yt l l ee n v i r o m e n t a lf a c t o r s ,s u c h 嬲m o i s t u r ea n dh i 曲 t e m p e r a t u r e i ti sv e r yc o m m o ni nt h eo b s o l e t es k e l e t o n ,d e c o m p o s e dc o 印s e ,m u s t ) r 肌dd e g e n e r a t i v cs p o t s p r e s e n t l y ,t h em u l t i p l e xp c r - s t 风s y s t e m su s e di nm 哪, f o r e n s i cd n al a bw e r en o ts a t i s f i e di n 帅i n gs u c hh i 曲l y - d e g r a d e dd n as a n l p l e s w ,l l e nt h cd n a 丘a g m e n t sa r ed e g r a d e d ,l a r g es t ra l l e l e st ) ,p i n gw o u l db er e d u c e d , a n da l l e l ed r o p - o u t ,“p e a ki m b a l a n c e w o u l do c c u r ,a n de v e nc o m p l e t e l yt 0d e l e t e 1 t i sas e r i o u sp r o b l e mi nf o r e n s i cd n a t y p i n g s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o 叩h i s m ( s n p ) a r ed n as e q u e n c ev 撕a t i o n st h a to c c l l r w h e nas i n g l e 肌c l e o t i d ei nt l l eg e n o m es e q u e n c ei sa l t e r e d f o rav 撕a t i o nt ob e c o n s i d e r e das n p ,i tm u s to c c u ri i la tl e a s t1 o ft h ep o p u l a t i o n s n p s 踟et h em o s t c o m 如o ng e n e t i cs e q u e n c ev a r i a t i o n sa n dm a k eu pa b o u t8 0 o fa l lh u m 觚g e n e t i c v a r i a t i o n f o rt h ea d v a l l t a g e so fs h o r t e rt a r g e t 仔a g m e n t s ( 4 5 一l5 0 b p ) ,l o w e rm u t a t i o n 阳t e ,c 印a b i l i t yo fh i g h t h r o u g h p u td e t e c t i o na n da l i t o m a t i o i l s n p sh a v er a p i d l y b e c o m eah o t s p o ti nf o r e n s i cm e d i c i n ea i m e da tt t l ed e 铲a d e ds 锄p l e s y s n p sh a v em ep r o p e n ) ,o fs 讪l e 锄dl o wm u t a t i o nr a t e s y - s n pg e n o t ) ,p i n g c a i lb e 邶e df o ri d e n t i f i n gt h ep a t e m i t yo ff a t h e r 锄ds o n ,觚e m i t y ,g 砌d f a t h e ra n d 伊锄d s o n t h eh i 曲d e g r e eo fp o p u l a t i o ns p e c i f i c 埘o fy - c h r o m o s o m 2 l lh 印l o t ) ,p e s m i g h tm a l ( ei tt e m p t i n gt oa s kw h e t h e rr e 2 u s o n a b l ec o n c l u s i o l l sc a nb ed r 踟l a b o u tt h e e t l u l i c o r i g i no fac m p r i tf b mad n as 锄p l e i i l t h ey e a ro f2 0 0 8 ,t h ey c l d m o s o m ec o l l s o l t i 啪r e p o n e d5 9 9y s n p sl o c iw h i c hc a nb eg e n o t y p e d b yp c r b u tl l i g h - n l r o u g h p u ty s n p s 勺憎i n gm e t h o dw a ss e l d o m l yr 印o r t e d ,a n da l s o t h e r ew 嬲n ta n yr e p o r ta b o u ta1 1 i 曲- t h r o u 曲p u ty s n p s 锣p i n gs y s t e mb 弱e do n c h i n e s ep o p u l a t i o n i nt h i ss t u d y ,、ed e v e l o p e dah i g h l ys e n s i t i v em u l t i p l e xy s n p s t y p i n gs y g t e mb a s e do ns i n 西e - b a s ee x t e n s i o n ( s b e ) a u l dc 印i 1 1 a 哆e l e c t r o p h o r e s i s t e c l l l l o l o g y ,a n de x p l o r e da n e wm e t h o di nd e 黟a d e d 【) n at y p i n g a c c o r d 洫g t om el i t e r a t u r eo ft 1 1 eyc h r o m o s o m ec o n s o i r t i u m ,w ep r i m a r i l y s e l e c t e d6 5c a i l d i d a t ey s n p sm 破e r sw h i c hw e r em a i n l yd i s t r i b u t e di ne 嬲ta s i a p o p u l a t i o n a c c o r d i n g t 0t :h er sm m l b e rw ec o u l d6 n dr e l a t e di o n a t i o n so f 也e l o c ii nd b s n p s 出也山a s e ( h t q p :1 州w n c b i i l l m i l i h 召o “s n p ,c o m b i n e d 、析m v t 中山大学硕士学位论文2 3 个y - s n p s 遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究 l i t e r a t w c sa b o u ty - s n p sw ep i c k e du p3 0y s n p sw h i c hw e 陀r e p o n e d h i 曲 p o l y m o 印k s mi i lc l l i n e s ch ld b s n p sd a t a b 嬲e 锄dd n ar e g i o ns l m o u n d i n gt h e s u b s t i t u t i o ns i t ei ss 诎l e ,n l e yw e r ep 1 6 4 ,m 1 2 2 ,p 2 0 3 ,p 1 4 8 ,p 1 4 5 ,m 8 9 ,p 1 5 1 , m 2 1 6 ,p 1 2 8 ,p 1 5 7 ,p 1 4 9 ,p 1 3 1 ,p 1 9 9 ,p 1 2 3 ,p 1 9 l ,p 2 0 1 ,m 1 l l ,m 1 9 9 ,p 1 3 0 ,m 9 , p 1 3 2 ,p 2 0 0 ,p 1 9 7 ,m 1 1 9 ,p 1 3 6 ,m 1 3 4 ,m 1 7 5 ,p 1 6 3 ,m 3 2 4 ,p 1 9 8 s o m el o c i i m b m l a t i o n 谢t h o u tr sm m l b e rc a nb eo b t a i n e df r o myc l l i d m o s o m es e q u e n c ei n g e n b a i l l 【( h t t p : 删w n c b i i l l m n i h g o v g e n b a n u i n d e x h t m l ) p c r p r i m e r so f t h e3 0y - s n p sl o c i 、e r ed e s i 朗e dt oa s s u r et h a t 1 e 锄1 p l i c o n l e n g t h s 、e r ei nt h er a n g ef 幻m5 4t ol4 6b p s e a c hl o c u s 、v a sa m p l i f i e da n dt h ep c r p r o d u c t sw e r e 融e c t e db yp a g ea l l ds i l v e rs 扭i n 1 1 l el e n g mo ft h et e m p l a t es p e c i f i c p a n so ft h es i n g l eb a s ee x t e n s i o np r i m e r sr a n g e df 如m16t 02 9n u c l e o t i d e s i l l e d e s i r e dl e n 舀ho f p r i m e rw 嬲删u s t e da tt h e5 e n db ya d d i t i o no f ap i e c eo f a n c u t r a l s e q u e n c ea l l 讹r ,i fn e c e s s a 巧,ap o l y c tt a i l m 3 2 4a n dp 16 3 、v e r er e i n o v e db e c a u s e : o f n o n - 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s n p s 遗传标记复合检测体系的建立及法医学应用研究 第1 章引言 在法医学领域,广泛使用的d n a 遗传标记分为两种:核基因组d n a 与线 粒体d n a ( m t d n a ) 。核基因组d n a 遗传标记中,y 染色体具有男性特异性, 为单倍型遗传,大部分在减数分裂中不发生重组,由父亲直接传给儿子,并且 这种单倍型是非随机地分布在人群中,具有种群特异性【1 3 1 。在个体识别方面, 虽然只可以排除,很难下认定结论,但是在特殊情况下,比如亲子鉴定证据不 足或者分析男女d n a 混合物时,有其他遗传标记无法比拟的优势,因此在法 医学上得到广泛应用【l 】。 目前法医d n a 实验室广泛应用的荧光标记一次扩增1 7 个y - s t r 基因座的 商品化试剂盒,多态信息含量、个体识别率和灵敏度均较高,检测特异性强, 适用于各种来源的生物学检材,因此成为法医物证学鉴定的主要手段【2 】。但其 检出成功率受限于d n a 片段的长度( 其检测长度范围为1 0 0 3 3 5 b p ) 。 法医实际检案中,经常会遇到高度腐败的水浸、土埋、焚烧、久置野外的 尸体检材,其d n a 常常被降解成小片段,现有的s t r 复合扩增体系对严重降 解d n a 片段( 2 0 0 b p ) 分型效力低,表现为复合扩增时扩增片段较大的基因 座无法正确分型,易产生非特异性带,出现优势扩增、等位基因丢失甚至无扩 增产物等现象【3 1 【4 1 。通过改进d n a 的提取方法,提高模板d n a 的浓度和纯度, 优化p c r 扩增条件等在一定程度上提高腐败检材的s t r 分型成功率【5 】,但仍不 能从根本上解决降解d n

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