（营养与食品卫生学专业论文）酶联免疫法检测双酚a的研究.pdf

摘要 摘要 双酚a ( b i s p h e n o la ，b p a ) ，是近几年从食品塑料包装材料中新发现的一种“内分泌 干扰物( e n d o c r i n ed i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，e c d ) ”，具有某些雌激素特性。无论在食品包 装材料，还是在环境中，其含量都很低，用常规h p l c 方法无法快速分析。本论文旨在 研究快速检测双酚a 的酶联免疫法( e l i s a ) ，这对食品安全监督以及技术储备有着重 要的意义。 本文首先采用重氮化法在b p a 分子上引入羧基，接着将其与牛血清白蛋白( b o v i n e s e r u ma l b u m i n ，b s a ) 和卵清白蛋白( o v a l b u m i n ，o v a ) 偶联，制备免疫抗原b p a h b s a 和包被抗原b p a h o v a 。其紫外扫描光谱和红外光谱表明偶联成功。通过紫外分光光度 法估算b p a h b s a 和b p a h o v a 的偶联比分别为1 2 2 和1 3 2 。用免疫抗原b p a h b s a 免疫新西兰白兔制备抗血清，产生的抗血清效价最高达到5 1 2 0 0 。然后以此抗体为基础 设计了间接竞争e l i s a 法，检测限达到0 0 0 1i t g m l ，5 0 抑制率( 5 0 i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n , i c 5 0 ) 为1 0 g m l 。用双酚酸、双酚b 、双酚e 、4 枯基苯酚试验了此方 法的特异性，交叉反应率分别为2 0 0 、1 0 0 、3 3 和2 0 。重现性实验的变异系 数范围为4 0 7 9 9 5 ，c v 值均小于1 0 ，重复性良好。对聚碳酸酯( p c ) 材料的 桶装纯净水作了1l a g m l - 1 、3 “g m l 1 、1 0l a g m e - 1 、2 5p g m l d 和5 0p g m l 1 水平的添 加回收实验，五个水平的回收率范围为9 2 5 - - 一1 0 7 7 。综合各因素，本论文研究的e l i s a 法各项参数都达到了检测的需要，具有实际应用价值。 关键词：双酚a 完全按抗原多克隆抗体竞争e l i s a 聚碳酸酯 a b s t a c t a b s t r a c t b i s p h e n o la ( b p a ) ，g e n e r a l l yk n o w n a se n d o c r i n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s ( e c d ) ，h a d a p o t e n t i a le s t r o g e n i cc h a r a c t e r i s t i c i nr e c e n ty e a r s ，b i s p h e n o la h a sb e e nf o u n di nf o o d p l a s t i cp a c k a g i n g m a t e r i a l s t h ec o n t e n to fb p ai sm u c hl o w e re i t h e ri nt h ee n v i r o n m e n to r i nt h ef o o dp a c k a g i n gm a t e r i a l s ，i tc a n n o tb ea n a l y z e dr a p i d l yb yg e n e r a lh p l c t h er a p i d m e t h o df o rd e t e r m i n a t i o nb i s p h e n o la ( b p a ) w a sc a r r i e do u tb ye l i s ai nt h i sp a p e r , w h i c h w i l lb eb e n e f i c i a lt of o o ds a f e t ys u p e r v i s i o na n dt e c h n i q u es t o r a g e b i s p h e n o lah a p t e n ( b p a h ) w a sp r e p a r e db yt h em e t h o do fd i a z o t i z a t i o n ，a n dt h e ni t w a sc o u p l e dt oc a r r i e rp r o t e i nb o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) a n do v a l b u m i n ( o v a ) t o p r e p a r ei m m u n o g e nb p a h - b s a a n dc o a t i n ga n t i g e nb p a h - o v a u vs c a n n i n gs p e c t r u m a n di rs p e c t r u mb o t hi n d i c a t e dt h a tt h ei m m u n o g e nb p a h - b s aa n dc o a t i n ga n t i g e n b p a h - o v aw e r es u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d t h ec o u p l i n gr a t e sw e r e12 2a n d13 2 r e s p e c t i v e l yb y u l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t r ya n a l y s i s n e w z e a l a n dr a b b i t sw e r e i m m u n i z e d 谢t l lb p a h - b s aa n dt h eh i g h e s tt i t e ro fs e r u m w a sa sh i 啦a s512 0 0 t h e n ，a n i n d i r e c tc o m p e t i t i v ee n z y m e - l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( e l i s a ) w a sd e v e l o p e d t h e d e t e c t i o nl i m i tw a s0 0 01l x g 。m l ，a n di c 5 0v a l u e ( 5 0 i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ) w a s10 l x g m l 一t h er e p r o d u c i b i l i t yw a se s t i m a t e db yc o e f f i c i e n to fv a r i a t i o n ( c v ) t h e c o e f f i c i e n to fv a r i a t i o nw e r e4 0 7 - - 9 9 5 ，a l lb e l o w1 0 t h es p e c i f i c i t yw a ss t u d i e d 谢t h c r o s sr e a c t i v i t i e s u s i n g f o u rs i m i l a rc h e m i c a ls t r u c t u r e c o m p o u n d s ( 4 ，4 一b i s ( 4 一h y d r o x y p h e n y l ) v a l e r i ca c i d 、b i s p h e n o lb 、b i s p h e n o le a n d4 c u m y p h e n 0 1 ) t h e c r o s sr e a c t i v i t i e sw e r e2 0 0 ，10 0 ，3 3 ，2 0 ，r e s p e c t i v e l y b p aw a sa d d e dt o d r i n k i n gw a t e ra n d t h er e c o v e r i e sw e r e9 2 5 - 10 7 7 i ng e n e r a l ，a l li n d e x e so ft h ea s s a y h a v er e a c h e dt h er e q u i r e m e n t so fd e t e c t i o n ，a n di ts h o w e dt h a t t h i sa s s a yh a dp o t e n t i a l a p p l i c a t i o ni np r a c t i c e k e y w o r d s ：b i s p h e n o la ，c o m p l e t ea n t i g e n ，p o l y c l o n a la n t i b o d y ，c o m p e t i t i v ee l i s a ， p o l y c a r b o n a t e 1 i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注乖致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 丕盔纽 日 期： 迎墨。盘：! 窆 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 歪盔选 导师签名： 塑竖至鏊 日 期：刎：厶! l q 第一章绪论 第一章绪论 食品安全是一个非常引人注目的问题，因为它关系到人类的身体健康，家庭幸福， 社会发展。在经济迅猛发展的时代，各式各样的绿色食品、健康食品层出不穷，随之食 品包装行业也飞速发展。在现代生活中，塑料包装的地位越来越重要。随处可见各式塑 料制品、食具、容器，塑料包装材料被广泛应用于包装食品。随着形形色色塑料制品的 广泛应用，双酚a 造成了严重的环境污染。双酚a 能从塑料制品中扩散出来引起环境 和食物污染。1 9 9 3 年，k r i s h n a n 等首次发现高压灭菌时双酚a 从聚碳酸酯塑料瓶中扩 散出来【1 1 。后来，又有人发现食品包装容器或塑料薄膜中的双酚a 渗入食品或饮料中 2 1 。 塑料包装中迁移出的小分子物质双酚a 对人体健康构成了极大的威胁。 双酚a 是近几年从食品包装材料中新发现的一种“内分泌干扰物( e n d o c r i n e d i s r u p t i n gc h e m i c a l s ，e c d ) ”，具有某些雌激素特性 3 , 4 1 。双酚a 的发现引起了各国对食 品及包装材料的广泛关注，已相继有从蔬菜罐头、婴儿用调制液、食品罐等检出双酚a 的报道。双酚a 主要用于生产聚碳酸酯、环氧树脂、聚砜树脂等高分子材料，又用作酚 醛树脂、可塑性聚酯的抗氧化剂及聚氯乙烯的稳定剂。制成的塑料产品用于食品和饮料 的包装，树脂产品广泛用于金属的涂层包括食用油、食品罐头、瓶盖和供水管等。人们 日常生活中所使用的诸如纸杯、塑料杯、金属罐等或多或少地存在有可能导致人体内分 泌紊乱的有害化学物质双酚a 。 我国是一个食品包装材料生产和使用大国，许多塑料制品、食具、容器已成为人们 生活的必用品，但我国对这些包装材料中双酚a 的调查研究报道极少，主要是缺乏便捷、 快速、灵敏的检测方法。 1 1 双酚i a 理化性质及危害研究 1 1 1 双酚a 理化性质 双酚a ( b i s p h e n o l a ，b p a ) 是由苯酚、丙酮在酸性介质中合成的，是环氧树j j 旨( e p o x y r e s i n ，e p ) 、聚碳酸酯( p o l y c a r b o n a t e ，p c ) 、聚砜( p o l y s a l f o n e ，p s f ) 、聚芳酯( p o l y a r y l a t e ， p a t ) 、酚醛树脂( p h e n 0 1 f o r m a l d e h y d er e s i n ，p f ) 、不饱和聚酯树脂( u n s a t u r a t dp o l y e s t e r r e s i n ，u p r ) 、阻燃剂等产品的重要原料。分子式c 1 5 h 1 6 0 2 ，摩尔质量为2 2 8 3 ，其化学 结构如图1 1 。 图1 - 1 双酚a 化学结构式 f i g 1 1t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f b i s p h e n o l a 双酚a ，化学名称为2 ，2 一双( 4 一羟基苯基) 丙烷，又名4 ，4 一二羟基二苯基丙烷，简称双 酚基丙烷。为白色至淡褐色片状或粉末，可燃，有酚气味和苦味，沸点2 5 0 - 一2 5 2 ( 1 7 7 3 k p a ) 。纯品熔点1 5 5 - - 一1 5 6 ，工业品熔点1 5 0 一 1 5 2 。相对密度1 1 9 5 ( 2 5 ) ，闪点 江南大学硕士学位论文 7 9 4 。溶于乙醇、丙酮、乙醚、苯及稀碱液等，微溶于四氯化碳，不溶于水( 溶解度 9 8 1 乙基- 3 一( 3 一二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐( e d c ) 牛血清蛋白( b s a ) b r 卵清白蛋白( o v a ) b r 盐酸 a r 对氨基苯甲酸 a r 亚硝酸钠 a r 氢氧化钠 a r 尿素 a r 二甲基亚砜( d m s o ) a r 碳酸氢钠 a r 甲醇 a r 磷酸二氢钾 a r 磷酸氢二钠 a r 氯化钠 a r 氯化钾 a r 乙醇ar 磷酸 a r 1 2 n e w j e r s e y ，u s a n e w j e r s e y ，u s a 9 8 n e wj e r s e y ，u s a 上海华美生物工程公司 s i g m a 公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 第二章双酚a 完全抗原的制备与鉴定 溴化钾 考马斯亮蓝g 2 5 0 透析袋( m w c o ：7 0 0 0 ) 2 1 2 主要溶液 s p国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 上海绿鸟科技发展有限公司( 进口分装) 1 ) p b s ( o 0 1m ，p h7 4 的磷酸盐缓冲液) ：8 0 9n a c l ，0 2 9k c l ，o 2 9k h 2 p 0 4 ， 2 9 9n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 ，溶于8 0 0 m l 蒸馏水中，加热搅拌，待全部溶解后，加蒸 馏水至1 0 0 0 m l 。 2 ) 牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取1 0 0m g 牛血清白蛋白，用蒸馏水溶解， 尽量不要起泡，定容至1 0 0m l ，即为1 0 0 “g m l d 的原液。 3 ) 蛋白试剂考马斯亮蓝g 2 5 0 的配制：称取1 0 0m g 考马斯亮蓝g 2 5 0 ，溶于5 0m l 9 0 乙醇中，加入8 5 ( w ) 的磷酸1 0 0m l ，最后用蒸馏水定容至1 0 0 0m l 。 此溶液在常温下可放置一个月。 2 1 3 主要仪器设备 d e l t a 3 2 0 型酸度计 p l 2 0 0 2 型电子天平 p b 3 0 3 e 型电子分析天平 p b 4 0 0 1 e 型精密电子天平 w h 2 微型旋涡混合仪 s c 2 型磁力搅拌器 9 9 1 a 型大功率数显恒温磁力搅拌器 h h 4 型数显恒温水浴锅 1 0 1 2 型电热鼓风干燥箱 f t se 1 5 8 5 q 冷冻干燥仪 t u 19 0 0 双光束紫外可见分光光度计 w f j 2 0 0 0 型7 2 2 紫外光分光光度计 n i c o l e tn e x u s 傅立叶变换红外光谱仪 x b 7 0 型雪花制冰机 其他为实验室常用仪器设备。 2 2 实验方法 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 梅特勒托利多仪器( 上海) 有限公司 上海沪西仪器分析厂 上海曹县行无线电元件厂 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 上海实验仪器制造厂 美国f t s 公司 北京普析通用仪器有限责任公司 上海市三分析仪器厂 t h e r m oe l e c t r o nc o r p o r a t i o n 宁波格兰特制冷设备制造有限公司 2 2 1 双酚a 半抗原的制备 装有搅拌器与温度计的1 0 0m l 烧杯置于冰浴中，在烧杯中加入1 ：2 5 的盐酸5m l ， 0 6 8 5 7g ( 5m m 0 1 ) 对氨基苯甲酸，搅拌并保持混合物的温度在4 以下，从伸入到液 面下的滴液漏斗中缓慢滴加2 0m l 质量分数2 5 的n a n 0 2 溶液，并随时补充冰块以保 持溶液温度为4 。反应1h 后用淀粉k i 试纸检验，呈蓝色表示已到终点，加入少量 尿素除去过量n a n 0 2 ，继续搅拌1 0m i n 。用适量1 0 n a o h 溶解1 1 4 1 5g ( 5m m 0 1 ) 双 江南大学硕士学位论文 酚a ，缓慢滴加到上述反应中，继续反应1h ，其间不断用n a o h 调节溶液p h 为中性。 反应结束后，静置。用真空抽滤器抽滤，得到的固体产物用干燥箱烘干。重结晶后得到 褐色固体即为双酚a 半抗原( b p a h a p t e n ，b p a h ) 。制备路线见图2 1 。 c l l 图2 - 1 双酚a 半抗原的制备路线 f i g 2 - 1t h ep r e p a r a t i o no f b i s p h e n o lah a p t e n o l 2 2 2 双酚a 完全抗原的制备 b p a h 、n h s 和e d c 的摩尔比率为l ：1 ：1 。称取0 1 1 2 8g ( o 3m m 0 1 ) b p a h ， 0 0 3 4 5g n h s 和0 0 5 7 5ge d c ，将它们用3m ld m s o 溶解在1 0m l 烧杯中，磁力搅拌 过夜，所得溶液为a 液。称取o 1 2gb s a ，溶解在5m lo 1 m o l l dn a h c 0 3 ( 用h c l 调 p h 至7 o ) ，得到b s a 溶液。在搅拌下，a 液缓慢滴加到b s a 溶液中，反应过夜，所 得溶液用蒸馏水于4 透析5d ，前两天每隔8h 换一次透析液，后三天每隔1 2h 换一 次透析液。最后，将溶液冷冻干燥，所得固体- - 2 0 条件下储存6 引。 2 2 3 双酚a 包被抗原的制备 将上述合成双酚a 完全抗原过程中的b s a 换成卵清白蛋白( o v a l b u m i n ，o v a ) ，其 余步骤同2 2 2 。 2 2 4 完全抗原与包被抗原的鉴定 紫外分光光度计法( u l t r a v i o l e ts p e c t r o p h o t o m e t r y ) ：采用分光光度法进行偶联比的 估测，紫外光谱来鉴定b p a h b s a 的合成。 红外吸收光谱法( i n f r a r e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y ) - 又称为分子振动一转动光谱。将 合成的双酚a 完全抗原经过冷冻干燥以后，采用k b r 压片，进行红外吸收光谱的扫描。 双酚a 包被抗原的鉴定与双酚a 完全抗原的鉴定方法相同。 1 4 节僦 盟她 一n 犬y 第二章双酚a 完全抗原的制备与鉴定 2 2 5 完全抗原与包被抗原偶联比的估测 2 2 5 1 摩尔吸光系数8 的测定 配制b p a 质量浓度为0 、1 0 、2 0 、3 0l x g m l 。1 的甲醇溶液，通过紫外扫描可知b p a 的最大吸收波长为2 7 9n i n ，在2 7 9n n l 处测吸光值，每个浓度做平行样。摩尔吸光系数： 占：黑 ( 2 1 ) 。摩尔浓度 p 叫 2 2 5 2 偶联物蛋白质量浓度测定 根据在一定质量浓度范围内吸光值与质量浓度成正比的原理，配制b s a 质量浓度 为0 、2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0p g m l 。1 的磷酸盐缓冲溶液，各取1 0m l ，加入5m l 考马 斯染色液，立即混匀，3 0 水浴温热5m i n ，每个浓度做平行样。在5 9 5 衄处测吸光 值，做标准曲线。以上述方法处理偶联物，对照标准曲线即可得到偶联物的蛋白质量浓 度。 2 2 5 3 偶联比测定 配制2 0 0 腭m l 1b s a 的p b s 溶液，在2 7 9n l t l 处测吸光值，以p b s 为空白，吸光 值为a l ；将已测知蛋白质量的偶联产物用p b s 稀释到蛋白质量浓度为2 0 0p , g m l ，在 2 7 9n n l 处测吸光值，以p b s 为空白，吸光值为a 2 。双酚a 偶联物的偶联比为： a 2 一a l ，= - ( 2 2 ) 2 0 0 1 0 - 3 、7 6 5 0 0 0 其中为双酚a 的摩尔吸光系数( l m o l 。1 ) ，6 5 0 0 0 为b s a 的摩尔质量，2 0 0 x 1 0 3 为b s a 质量浓度( g l 1 ) 。 2 3 结果与分析 2 3 1 完全抗原的紫外扫描 b p a 完全抗原的紫外扫描图见图2 2 。对比三条曲线可以看出，b s a 在2 0 4n i n 和 2 7 8n l n 处有特征吸收，双酚a 半抗原在3 6 2n n l 处有特征吸收峰，而两者的偶联物在2 0 4 n l t l 和3 5 3i l i a 处有特征吸收峰，这是由于两者吸收峰的迭加效应，使出现的2 个特征吸 收峰与b p a 半抗原和b s a 的吸收峰相比，有一定的位移。由此初步判断，b p a 半抗原 已与蛋白发生偶联成为完全抗原。 江南大学硕士学位论文 2 5 2 1 5 d l o 5 0 3 0 0 波长( n m ) 图2 - 2 完全抗原的紫外扫描图 f i g 2 - 2t h eu vs c a n n i n gs p e c t r u mo fc o m p l e t ea n t i g e n 2 3 2 半抗原以及完全抗原的红外光谱 双酚a 半抗原红外光谱图见图2 3 。从对氨基苯甲酸的图谱上可以看出，在3 5 0 0 - 3 3 0 0c m 1 区域有中等强度吸收峰，伯胺基( - n h 2 ) 因振动偶合呈现双峰。从双酚a 半 抗原图谱上，看不到胺基的振动，这是因为经重氮化后胺基消失；但是，在3 5 0 0 , - - - 3 2 0 0 c m 。1 区域相对于双酚a 图谱来说，双酚a 半抗原在3 3 0 5c m d 处有明显的羧基吸收峰。 说明双酚a 上已引入了羧基，它可以与蛋白质大分子偶联。 w m , m u m b m ( c m - 1 ) 图2 - 3 双酚a 半抗原红外光谱图 f i g 2 3i rs p e c t r u mo fb i s p h e n o lah a p t e n 双酚a 完全抗原的红外光谱图见图2 4 。将完全抗原的红外光谱与b s a 的红外光谱 相比较，它们在3 5 0 0 3 2 0 0c m 以区域，以及1 6 6 0 - - 一1 5 0 0c m 。1 区域具有相似的吸收。这 是蛋白质中氨基酸产生的特征峰，说明制备的完全抗原中含有b s a 。再将完全抗原的红 1 6 第二章双酚a 完全抗原的制备与鉴定 外光谱与双酚a 半抗原的红外光谱相比较，它们在1 7 0 0 、11 4 0 、1 0 0 0c m 1 附近处具有 相似的吸收，而b s a 在此处无吸收。说明制备的完全抗原中含有双酚a 半抗原。由此 判断，双酚a 半抗原与b s a 偶联成功。 i 3 5 0 03 0 0 0 2 5 2 0 0 0 1 5 0 01 0 0 0 w 岫_ 每n 图2 - 4 完全抗原的红外光谱图 f i g 2 - 4i rs p e c t r u mo fc o m p l e t ea n t i g e n 2 3 4 完全抗原偶联比的估测 以吸光度( y ) 对相应的质量浓度( x ) 作标准曲线，回归方程为y = 0 0 0 4 7 x + 0 0 9 8 3 ， r = 0 9 9 8 8 。参照标准曲线制作步骤，取待测样品o 2m l ，最后测得o d 5 9 5 咖值为0 2 8 7 ， 对照标准曲线方程，计算得蛋白含量为4 0 1i x g m e - 1 。由此可知，样品的实际蛋白含量 为2 0 0 5p g m l 一。在2 7 9n n l 处其平均吸光值为0 5 2 4 ，相同质量浓度的b s a 的平均吸 光值为o 1 5 6 。根据计算公式( 2 2 ) ，则b p a h b s a 的偶联比为： 0 5 2 4 0 1 5 6 ，：业黑= 广：1 2 2 ( 2 3 ) 2 0 0 1 0 。 、7 6 5 0 0 0 同法，计算b p a h o v a 的偶联比为1 3 2 。 0 7 6 0 0 1 8 6 ，：盟绰：1 3 2( 2 4 ) 2 0 0 1 0 。 4 5 0 0 0 其中6 5 0 0 0 为b s a 的摩尔质量，4 5 0 0 0 为o v a 的摩尔质量，2 0 0 x 1 0 。3 为白蛋白质 量浓度( g l 以) ，9 7 9 2 4 为双酚a 平均摩尔吸光系数( l m o l 一，见表2 。1 ) 。白蛋白及偶 联物质量浓度为2 0 0 9 9 m l 。1 时的吸光值数据见表2 - 2 1 7 江南大学硕士学位论文 表2 - 1b p a 摩尔吸光系数测定数据 t a b l e2 - 1t h ed a t ao fb p am o l a r a b s o r p t i v i t y 表2 - 2 白蛋白与偶联物( 2 0 0 烬m e 1 ) 吸光值测定 t a b l e2 - 2t h ea b s o r b e n e yo fa l b u m i n & c o m p l e t ea n t i g e n 2 4 讨论 影响免疫分析质量的主要因素是抗体选择性和亲和性，这些性质又决定于免疫半抗 原的结构，因此免疫半抗原的设计与制备是建立小分子免疫分析的关键步骤。本论文从 以下几个方面来考虑免疫半抗原的设计。 2 4 1 间隔臂的选择 一般情况下，待测物可作为半抗原直接与载体连接，但是双酚a 结构中不具备可直 接与载体共价连接的基团，需要在与载体连接之前先连接上一个间隔臂。免疫半抗原设 计的基本原则是免疫半抗原与载体连接后结合抗原中能最大程度保持和突出待测物的 特征结构，特别是立体结构。机体的免疫系统对载体远端的半抗原结构识别最强，所以 在免疫半抗原的的设计中间隔臂的长短选择非常重要。间隔臂的长度以5 7 碳为宜，太 短则载体的空间位阻将影响免疫系统对半抗原的识别，并可能由于载体局部的微化学环 境使半抗原结构发生形变，过长则可能因为氢键或疏水作用使免疫半抗原发生折叠。由 于实验中选择蛋白质作为载体，所以间隔臂末端连接氨基或羧基，这样可以简单地借用 合成肽的方法通过较稳定的酰胺键将半抗原与载体相连【7 0 1 。本实验选用了7 碳的对氨基 苯甲酸作为反应物，经重氮化后与b s a 偶联，生成b p a h b s a 。 2 4 2 载体的选择 常用来作为合成人工抗原的载体蛋白质有牛血清蛋白( b o v i n e $ e i u ma l b u m i n ， b s a ) 、卵清蛋白( o v a l b u m i n ，o v a ) 、钥孔血蓝蛋白( k e y h o l el i m p e t h e m o c y a n i n ，k l h ) 、 人血清蛋白( h u m a ns e r u ma l b u m i n ，h s a ) 及人工合成的多聚赖氨酸( p o l y l 1 y s i n e ， p l l ) ，但最常用的是b s a ，因为它的物理化学性质稳定，不易变性，价廉且易得；另 外，它的赖氨酸含量高，分子内有许多自由基，并且在不同的p h 和不同的离子强度下 1 8 第二苹双酚a 完全抗原的制备与鉴定 都能保持较大的溶解度，在含有机溶剂( 比如二甲基亚砜和二甲基甲酰胺) 状态下都能 和半抗原进行偶联，并且在偶联后仍保持可溶状态r 7 1 】。 2 4 3 偶联方法的选择 半抗原与载体蛋白偶联方法的选择，主要考虑半抗原的结构与特性【7 2 】。对于具有羧 基的半抗原，其羧基首先被活化，生成不稳定的亲电性中间体，再与蛋白质游离氨基发 生缩合反应，将半抗原连接到蛋白质载体上。常用的方法有混合酸酐法、n 羟基琥珀酰 亚胺活性酯法和碳二亚胺法。本实验选择用反应条件和操作比较简单的碳二亚胺法合成 免疫抗原和包被抗原。通过紫外扫描和红外光谱的方式鉴定了b p a h b s a 和b p a h o v a 偶联成功。 2 4 4 最佳偶联比 结合抗原鉴定的一个基本方面就是确认半抗原与载体的交联比，即每分子载体上结 合的半抗原的分子数。连接到蛋白质分子上的半抗原数目并非越多越好，太多或太少均 能导致弱的免疫应答，影响抗体的生成。制备免疫原时，载体蛋白分子中连接的半抗原 分子过多，不仅增加偶联物制备过程中的麻烦( 如出现沉淀，要求分离纯化等) ，还有 可能不利于载体与淋巴细胞表面结合，不能使载体引起免疫反应。每个载体蛋白分子上 结合多少个小分子为最佳，不同的实验有不同的答案。一般认为，每个蛋白质分子上结 合1 0 - 2 5 个半抗原分子比较合适。李俊锁等【7 3 】实验结果进一步认为以血清蛋白为载体， 偶联比一般应以1 0 左右为宜，而且低偶联比有助于提高抗体的选择性和亲和力。偶联 比的测定方法有很多，本实验选用了比较简便和常用紫外分光光度法，测定本实验制备 的免疫抗原( b p a h b s a ) 偶联比的估测值为1 2 2 ，因此可以认为获得了具有较好偶联 比的完全抗原。此外，还有同位素示踪法，元素分析法，红外光谱法，凝胶电泳法等。 同位素示踪法需要同位素标记抗原，存在放射性同位素污染的潜在危险，且操作复杂。 其他的方法主要用于确认是否连接，计算交联比时误差较大。由于目前对半抗原与载体 蛋白结合比的测定还没有一个标准的方法，不同的学者采用的方法也不尽相同，因此结 合比报道只是提供比较粗略的分析，而非绝对意义上的结合比。 2 5 本章小结 双酚a 分子经衍生化后，紫外扫描及红外光谱法分析确认衍生化成功。采用碳化二 亚胺法将衍生化产物分别与b s a 、o v a 偶联，制备免疫抗原b p a h b s a 和包被抗原 b p a h o v a 。经紫外扫描及红外光谱法分析鉴定，表明双酚a 分子与b s a 偶联成功。 由紫外分光光度估算b p a h b s a 和b p a h o v a 的偶联比分别为1 2 2 和1 3 2 。这为进一 步制备抗b p a 抗体提供了良好的免疫抗原，为建立e l i s a 法快速检测双酚a 奠定了研 究基础。 但b p a h b s a 及b h p v a b s a 能否刺激动物机体产生针对b p a 的抗体，还要通过 下一步的动物免疫实验来证实。 1 9 江南大学硕士学位论文 第三章抗双酚a 抗体的制备与鉴定 酶联免疫检测方法中抗体是不可或缺的基本试剂，获得高亲和力的抗双酚a 抗体是 酶联免疫检测的关键。抗体的优劣直接影响e l i s a 方法的灵敏度，特异性等。 用于e l i s a 方法检测的抗体一般采用多克隆抗体或者单克隆抗体。单克隆抗体具 有识别单一抗原决定簇，特异性高，实验重复性好的优点，但是制备复杂，成本高，并 且有些单克隆抗体会发生交叉反应；而多克隆抗体则具有制备比较简单、选择性好等优 点，是酶联免疫检测中最常用的抗体来源。 本章拟制备多克隆抗体，进行食品及包装材料中b p a 迁移分析研究。首先用免疫 抗原b p a h b s a 免疫新西兰白兔，通过白兔的机体反应产生对应的抗体，通过间接 e l i s a 方法对获得的血清进行检验，并测定其效价。收获的抗血清用饱和硫酸铵法纯化。 3 1 实验材料 3 1 1 材料和试剂 免疫抗原( b p a h b s a ) 包被抗原( b p a h o v a ) 新西兰长耳白兔( 雄性，1 5 2 k g 只) 弗氏完全佐剂 弗氏不完全佐剂 牛血清蛋i 刍( b s a ) b r 辣根酶标记羊抗兔i g g ( c o a ta n t i r bi g g h r p ) 四甲基联苯胺( t m b ) 9 9 n ，n - 二甲基甲酰胺( d m f ) a r 盐酸a r 氢氧化钠a r 碳酸钠a r 碳酸氢钠a r 氯化钠a r 氯化钾 a r 磷酸二氢钾a r 磷酸氢二钠a r t w e e n 2 0a r 柠檬酸 a r 双氧水a r 硫酸铵a r 浓氨水a r 本实验室制备 本实验室制备 上海陈行实验用兔有限公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 上海华美生物工程公司 北京博奥森生物技术有限公司 上海生工生物工程技术有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 第三章抗双酚a 抗体的制备与鉴定 考马斯亮蓝g 2 5 0 超纯水 透析袋( m w c o ：7 0 0 0 ) 3 1 2 主要溶液 国药集团化学试剂有限公司 分析测试中心液相实验室 上海绿鸟科技发展有限公司( 进口分装) 1 ) 包被缓冲液( 0 0 5m o l l ，p h9 6 的碳酸盐缓冲液) ：1 5 9gn a 2 c 0 3 ，2 9 3g n a h c 0 3 ，加超纯水至10 0 0m l 。 2 ) p b s ( 0 0 1m o l l ，p h7 4 的磷酸盐缓冲液) ：8 0gn a c i ，0 2gk c i ，0 2gk h 2 p 0 4 ， 2 9 9n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ，溶于8 0 0m l 超纯水中，加热搅拌，待全部溶解后，加超 纯水至1 0 0 0 m l 。 3 ) 封闭缓冲液：含1 0 m g m l 4b s a 的p b s 溶液。 4 ) 洗涤缓冲液( p b s t ) 含0 0 5 t w e e n - 2 0 的p b s 溶液。 5 ) a b 稀释液：含lm g m l 1b s a 的p b s 溶液。 6 ) 底物缓冲液：( o 1m o l l ，p h5 0 的磷酸盐一柠檬酸缓冲液) ：o 5 2g 柠檬酸，1 8 gn a 2 h p o a 1 2 h 2 0 ，超纯水定容至1 0 0 0m l ，调p h 至5 0 。4 存放，用前加 h 2 0 2 。 7 ) 底物溶液：2 0 0m g t m b 溶于2 0m ld m f ，分装- - 2 0 保存。用前取t m b 贮液 ( 3 7 助溶) o 1m l 加入p h5 0 磷酸盐柠檬酸缓冲液7m l ，3 h 2 0 29 0 此。 8 ) 终止液：2m o l l 1 的h 2 s 0 4 溶液。 9 ) 饱和硫酸铵：称取硫酸铵( a r ) 4 0 0 - - 4 2 5g ，以5 0 - - - 8 0 的超纯水5 0 0m l 溶解， 搅拌2 0m i n ，趁热过滤，冷却后以1 5m o l l 。1 浓氨水调p h 至7 o 。配置好的饱 和硫酸铵，瓶底应有结晶析出，4 保存备用。