（生物化学与分子生物学专业论文）中缅树鼩ucps组织分布及系统学研究.pdf

独创性声明 y7 7 5 5 2 7 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进 行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标 明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发 表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：般冶 浒石月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文 的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权云 南师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保 存和汇编本学位论文。 学位论文作者签名：愧讼 0 彬年f 月- 日 指导教师签名：融艮 咖侔g 月7 日 中缅树嗣u c p s 组织分布及系统学研究 摘要 本论文从分子水平探讨冷驯化对解偶联蛋白表达的影响，同时探讨u c p l 、 u c p 2 、u c p 3 在b a t 、肝脏、骨骼肌和脑中的组织分布情况。以及对中缅树询解 偶联蛋白基因的系统进化分析。 本论文主要分三个部分： 1 冷驯化对中缅树晌肝脏、b a t 和骨骼肌的总r n a 和总蛋白含量的影响。 2 中缅树嗣u c p l ，u c p 2 和u c p 3 在肝脏、b a t 、骨骼肌和脑四种组织中的 分布。 3 依据u c p i 对中缅树嗣进行系统发育研究及解偶联蛋白族的系统进化研究。 主要结果： 1 中缅树鞠经冷驯化2 8 后，体重、肝脏和骨骼肌相对重量均显著增加。同时 三种组织中总r n a 和总蛋白相对含量也达到显著增加的水平。 2 在b a t 、肝脏、骨骼肌和脑四种组织中，检测到u c p l 只在b a t 中表达； u c p 2 在除了脑以外的其它三种组织均检测到：u c p 3 只在骨骼肌和b a t 中 检测到。 3 u c p l r t - p c r 后测序得到一段4 6 5 b p 的序列，将该序列与g e n e b a n k 中可利 用的其它物种排序，构建了系统发生树。由系统树可见，中缅树晌的进化 地位与灵长类较接近。同一类型基因中进化关系较近的物种首先聚在一起。 u c p 2 和u c p 3 的进化关系比较近，然后和u c p l 聚在一起。 结论： 综上所述，经冷驯化后，中缅树询的b a t 、肝脏和骨骼肌的总r n a 和总蛋 白含量都明显增加，这说明除了b a t 和肝脏外，骨骼肌对于中缅树晌的适应性 产热也具有定的作用。同时我们测定在骨骼肌中有u c p 2 和u c p 3 的基因表 达，这可能与骨骼肌参与调节适应性产热相关。结合实验室以前冷驯化后骨骼肌 产热增强的研究结果，显示中缅树酾骨髓肌在适应性产热方面起到一定的补充作 用。 我们以中缅树询u c p i 部分e d n a 序列与其它物种u c p 基因构建的系统发 生树显示中缅树嗣在系统进化中与灵长类的进化距离最近其次与啮齿类关系较 近。这提供了一个中缅树晌在系统进化关系与灵长目关系更接近的辅证。 t h es t u d yo nd i s t r i b u t i o no f u c p sa n dp h y l o g e n e s i s0 ft r e e s h r e w a b s t r a c t t h ea r t i c l eb e g a nf r o mt h ee f f e c t so fc o l de x p o s u r eo ng e n ee x p r e s s i o no fu c p s i nb a t , l i v e r , a n ds k e l e t a lm u s c l eo f t r e es h r e w , t h e n t h ed i s t r i b u t i o no f u c p l ，u c p 2 a n du c p 3i nb a t l i v e r , s m ，a n db r a i nw e r ei d e n t i f i e dt os e a r c hf o ru c p so ft r e e s h r e w si nd i f f e r e n tt i s s u e s r r r p c rm e t h o dw a su s e di nb a to ft r e es h r e w sa n d s e q u e n c e dt h ep c rp r o d u c t i b nf o rr e s e a r c h i n gt h ep h y l o g e n e s i so ft r e et h r e w s t h e p h y l o g e n e t i ct r e ew a sb u i l tw i t hm e g a 3 0s o f t w a r eb ym a t r i x - l i k e l i h o o dm e t h o d t h et h e s i si sc o n s i s t so f t h r e ep a r t s 1 t h ee f f e c t s o f c o l de x p o s u r e o n g e n ee x p r e s s i o n o f u c p s i n b a t , l i v e r , a n ds k e l e t a l m u s c l ew e r es t u d i e d 2 t h ed i s t r i b u t i o no fu c p i ，u c p 2a n du c p 3w e r ei d e n t i f i e di nb a t , l i v e r , a n d s k e l e t a lm u s c l eo f t r e es h r e w s 3 t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo fu c p sw a sc o n s t r u c t e df o rr e s e a r c h i n gt h ep h y l o g e n e s i so f t r e es h r e w s t h er e s u l t sa n dc o n c l u s i o n s 1 a f t e r2 8 dc o l da c c l i m a t i n g ，t h ew e i g h to fb o d y , t h er e l a t i v ew e i g h t so fb a t , l i v e r a n ds k e l e t a lm u s c l e ，a n dt h et o t a lr n aa n dp r o t e i n si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yc o m p a r e d w i t ht h ec o n t r o lg r o u p ( 0 d a y ) t h i sr e s u l t ss u g g e s t e dt h a tu c p sc o u l dp l a yar o l ei n a d a p t i v et h e r r n o g e n e s i si nt r e es h r e w s 2 t h eg e n eo fu c p lw a si d e n t i f i e di nb a te x c l u s i v e l y , a n dt h eg e n eo fu c p 2i n b a t , l i v e ra n ds k e l e t a lm u s c l e ，a n dt h eg c n eo fu c p 3i nb a ta n ds k e l e t a l m u s c l e t h es t u d yo ft h ed i s t r i b u t i o no fu c p si nd i f f e r e n tt i s s u e sc o u l dc o n t r i b u t et os t u d y i n g t h ef u n c t i o n so fu c p s 3 t h ep a r t i a le d n as e q u e n c eo fu c p1i nt r e es h r e w sw a ss e q u e n c e d a n dc o m p a r e d w i t ho t h e ra n i m a l sa n dp l a n t s u c p ss e q u e n c e s ，t h ep h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e d t oa n a l y s et h ep h y l o g e n e s i so ft r e es h r e w s t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h er e l a t i o n s h i p b e t w e e nt r e es h r e w sa n dp r i m a t e sa l ec l o s e ，m e a n w h i l e ，t h ec l o s er e l a t i o n s h i p b e t w e e nu c p 2a n du c p 3w a ss h o w n c o n c l u s i o n ： i naw o r d ，t h et o t a lr n aa n dp r o t e i n so fb a t , l i v e ra n ds k e l e t a lm d s c l ei nt r e e s h r e w si n c r e a s e dm a r k e d l ya f t e rc o l da c c l i m a t e d ，w h i c hs u g g e s t e dt h a ts k e l e t a l m u s c l ec a np l a yac o m p l e m e n t a r yr o l ei na d a p t i v et h e r m o g e n e s i si nm i n i t y p e m a m m a l s m o r e o v e r , t h em r n ao fu c p 2a n du c p 3w e r ei d e n t i f i e di ns k e l e t a l m u s c l e ，w h i c hh a v ei m p l i c a t e dt h a ts k e l e t a lm u s c l ec o u l db ec o r r e l a t et oa d j u s t i n g a d a p t i v et h e r m o g e n e s i s c o m b i n e dw i t h t h ep r e v i o u sr e s u l t st h a ti n c r e a s i n go f m i t o c h o n d r i a lr e s p i r a t i o ni ns k e l e t a lm u s c l ea f t e rc o l da c c l i m a t e df r o mo u rt e a m ，w e c o n c l u d e dt h a ts k e l e t a lm u s c l ep l a yac o m p l e m e n t a r yr o l eo na d a p t i v et h e r m o g e n e s i s t h ep h y l o g e n e t i ct r e eo fu c p ss u g g e s t e dt h a tt h ep l a y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p b e t w e e nt r e es h r e w sa n dp r i m a t e sa r ec l o s e ，a n ds i s t e rg r o u p a n dt h e n ，t h ec l a d eo f s c a n d e n t i a p r i m a t e sj o i n e dw i t hr o d e n t s t h i sr e s u l t si sa c c o r dw i t hm o s tr e p o r t s t h e p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i pb e t w e e nu c p 2a n du c p 3 a r em o s tc l o s e s ta m o n gu c p s 4 第一章前苦 第一章前言 解偶联蛋i 圭1 ( u n c o u p l i n gp r o t e i n s ，u c p s ) 是位于线粒体内膜上的一种膜蛋 白，其主要功能是导致氧化磷酸化作用解偶联( 图1 ) 。u c p s 被激活时，形成质 子通道，可引起线粒体内膜上的质子转运速度加快，使a t p 合成依赖的线粒体 内膜上的电化学梯度改变，氧化磷酸化解偶联，不能合成a t p ，使产能转化为产 热。因此u c p s 是参与能量代谢的重要蛋白质。该蛋白在哺乳动物冷适应和调节 机体能量平衡过程中起着重要的作用( n e d e r g a a r do ta , 2 0 0 1 ) 。1 9 9 7 年叉发现 了两种与u c p 相近的同族蛋白( f l e u r ye t a l , 1 9 9 7 ；0 1 i v i e re l a l ，1 9 9 8 ) 。因此将 在b a t 细胞中表达的解偶联蛋白称为u c p l ，而将后来发现的称为u c p 2 和 u c p 3 ：因此，将所有的u c p 蛋白称之为u c p s ( r i c q u i e re t a l , 2 0 0 0 ：b o u i l l a u d o fa l ，2 0 0 1 ) 。u c p l 是最早发现的解偶联蛋白，它只在褐色脂肪组织( b a t ) 中 表达，是啮齿类动物非颤抖性产熟的重要解偶联蛋白质( n i s o l ie ta l ，1 9 9 8 ) 。现 在已经证明，u c p l 具有导致b a t 细胞线粒体解偶联的分子机制，但是对新发现 的解偶联蛋白，如在许多组织中广泛表达的u c p 2 和在骨骼肌中大量表达的 u c p 3 是否具有与u c p i 相似的解偶联功能，现在仍然不十分清楚。但是它们的 发现为人类和大型动物同样存在的产热现象找到理论依据。目前大量的有关u c p 基因的文献报道，除了认为u c p s 具有产热调节作用外，还报道了u c p s 可能具 有其他重要的生理和药理功能，如抗肥胖、抗糖尿病、调节脂肪酸代谢、抑制氧 游离基的形成，以及抗衰老等功能。尤其在人类非胰岛素依赖性糖尿病和肥胖症 方面更是研究的热点( k r o o k “a l ，1 9 9 8 ；b o u i l l a u de la l ，2 0 0 1 ；r i c q u i e re ta l ， 2 0 0 0 ) 。 第一常前高 图l 线粒体的代谢途径示意图。降低代谢效率主要出现在线粒体呼吸链本身的变化( 1 ) 降低代谢效率可以通过降低线粒体内膜的电化学梯度；( 2 ) 消耗a t p 并不需要做功；( 3 ) 即 使a t p 做功，也是没有目的的，如骨骼肌的颤抖；( 4 j 更多的质子通过质子通道返回线粒体； ( 5 ) 质子返阿线粒体可能使锥调节性的，是一种能量的“浪费”；( 6 ) b a t 线粒体中u c p i 导致 质子返回是可以调节的。 关于哺乳动物在低温环境下的适应性产热及其调节机理研究是当前生理生 态学研究领域中的热点问题之一，其机理已深入到分子水平，包括产热蛋白的分 子结构( k l i n g e n b e r g 等，1 9 9 9 ，2 0 0 1 ) 、线粒体内膜旷泄露的分子机制( p o r t o re t a l ，2 0 0 1 ) 、产热蛋白基因的结构及其表达调控( b o u i l l a u de la l ，2 0 0 1 ；r i c q u i e r e ，甜，2 0 0 0 ) 。 中缅树嗣( t u p a i ab e l a n g e r i ) 属树铜( s c a n d e n t i a ) ，树韵科( t u p a i i d a e ) 树铸属 ( t u p a i a ) 动物。树趵科动物现有二十种，而分布于我国仅中缅树晌。中缅树鞠分 布区主要为热带、亚热带地区，如印度、锡金、尼泊尔、缅甸，苏门答腊、爪哇、 婆罗洲、贝林、菲律宾及其附近岛屿，在我国为西南三省( 云南、四川西南部、 贵州西南) 、广西南部及海南岛有分布( 彭燕章等，1 9 9 1 ) ，其分布的地理位置处于 大多数动物学家所称的东洋区或东洋界，所以又称为东洋界典型代表动物( 彭燕 章等，1 9 9 1 ) 。我国的云贵高原可能是其分布的北限( 彭燕章等，1 9 9 1 ) 。分布于该 过渡地带的中缅树鼬，其生理适应特征可能也显示出某些过渡特征，同时又表现 出某些差异( 王政昆等，1 9 9 5 a ，1 9 9 6 ，1 9 9 9 ) 。树嗣体型小。易饲养，繁殖快。所以 6 鹕一章前言 树铜已用作研究近视、应激、甲肝病毒、乙肝病毒和丙肝病毒等的动物模型。由 此可见，由于树嗣特殊的生理特征和特殊的进化分类地位( 彭章燕，1 9 9 1 ) 已经 引起众多学者的注意。目前已成为生物医学研究中重要的实验动物。树莉曾被归 类为食虫目和灵长目，但多趋向将其列为一个树嗣目或称为攀兽目。目前为止， 对树虢的系统分类地位还存在很多争议( r o b e r ta n dm i y a m o t o ，1 9 9 9 ：a d k i a sa n d h o n e y c u t t ，1 9 9 1 ：p u p k oe la l ，2 0 0 2 ：s p r i n g e re t a l ，1 9 9 7 ) 。 目前关于中缅树钠适应性产热研究已经有王政昆( 1 9 9 4 ，1 9 9 5 a ；b ，1 9 9 6 ，1 9 9 9 ， 2 0 0 0 ) ，张武先等( 2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) ，王颖等( 2 0 0 4 ，2 0 0 5 ) 的研究报道，而且主要集 中在个体水平和组织细胞产热机理的研究。因此，从分子水平上进一步探讨中缅 树晌在低温胁迫条件下的冷适应产热及基因表达情况具有重要意义。通过对冷驯 化条件下肝脏、b a t 、骨骼肌和脑的总r n a 和总蛋白含量变化情况的研究，说 明解偶联蛋白表达水平在冷适应过程中的变化及作用；通过利用中缅树晌u c p l 基因序列对其进行系统进化的研究；对u c p 2 和u c p 3 组织分布的初步探讨， 为更深入的从分子水平对解偶联蛋自家族的功能和机制进行研究莫定基础。总 之，我们的研究是从分子水平对中缅树嗣冷适应产热机理进行研究以及对解偶联 蛋白家族功能和作用机制作更多的研究。? 同时，对中缅树嗣系统分类地位的探索 研究，为确定树朗的系统分类地位提供证据。希望我们的研究能够为人们尽快攻 克人类肥胖症和非胰岛素依赖性糖尿病等多种疾病提供理论依据。 絷一带材章= 1 ，方泣 第二章材料与方法 2 。l 动物处理 实验动物捕自云南省昆明市禄劝县屏山镇( 北纬2 5 。2 5 2 6 。2 2 ，东经 1 0 2 。1 3 1 0 2 。5 7 ) 附近灌丛中( 海拔1 6 7 9 m ) ，动物捕回后于实验室单笼饲养 ( 饲养笼规格为：1 2 c m 2 0 c m 3 0 c m ) ，无巢材，自然光照，室温，适应3 天。喂 以标准雏鸡饲料( 昆明生产蛋小鸡饲料：含粗蛋白1 8 ，粗纤维5 5 ) ( 6 9 1 ) ， 全脂奶粉( 2 7 ) 、白糖( 6 ，9 ) 以及精面粉( 2 1 3 ) ，熟喂动物，每隔l 天，加喂 少许水果( 苹果，梨等) 。随机分为对照组和冷驯化组，对照组和冷驯化组中尽量 雌雄各半。对照组在室温条件下饲养，光照1 2 l ：1 2 d 。冷驯化组为环境温度4 l c 到t l 化2 8 天，光照1 2 l ：1 2 d 。实验动物为非繁殖期成年个体。饲养地点为云南 师范大学生命科学学院动物学实验室。 2 2 总r n a 抽提及含量测定 动物断颈处死后。迅速分离所需组织适量，称重，进行总r n a 的抽提，参照 ( c h o m c z y n s k ie ta 1 ，1 9 8 7 ) 异硫氰酸弧一苯酚一氯仿一步法( a g p c 法) ：按照w ： v = i ：i 0 加入a 液，冰浴匀浆。将匀浆液转到离心管中，按顺序加入4 m 乙酸钠 ( w ：v = i ：1 ) ；水饱和酚( w ：v = i ：i 0 ) ；4 9 ：1 的氯仿一异戊醇( w ：v = i ：2 ) ， 上下颠倒，充分混匀。冰浴放置1 5 分钟。1 2 0 0 0 r p m ，4 0 离心2 0 分钟。取上清 液加入等体积的异丙醇。- 2 0 ( 7 静至4 5 分钟。1 2 0 0 0 r p m ，4 离心2 0 分钟。取沉 淀加入7 5 9 6 乙醇，一8 0 低温保存。用时离心取沉淀加无r n a 酶水溶解。所提总 r n a 通过l t j 6 的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色进行鉴定。总r n a 含量于2 6 0 n m 处比色，根据光吸收值计算其浓度及r n a 含量。计算公式如下： r n a 样品浓度= 4 0 x a 。稀释倍数 r n a 相对含量= r n a 样品浓度体积所取组织质量 2 3 总蛋白的抽提及含量测定 第一常材料j 方法 将实验动物断颈处死，迅速分离所需组织适量，用提取液a ( 提取液a ： l o m m t r i s e b a s e ，2 5 0 r a m 蔗糖，2 m m e d t a ) 清洗组织，去掉血液及动物毛，在冰 上剪碎组织，以组织：提取液a = i g ：5 m l ( w v ) 加入提取液a ，匀浆：在1 5 0 0 9 ， 4 c 条件下离心l o m i n ，去掉上层脂肪 再次在5 0 0 9 ，4 c 条件下离心5 m i n ， 去掉沉淀；进一步在i 0 ，0 0 0 9 ，c c 条件下离心l o m i n ，去掉上清液，所得的沉 淀用提取液b 悬浮( w v = l ：5 ) ( 提取液b ：2 0 m m m o p s ；2 0 r a m n a ：s o ，2 洲e d t a ) 。 用超声波仪在2 0 k h z 条件下超声两次，每次2 5 s 。超声后的溶液在l o ，0 0 0 9 ， 4 条件下离心2 0 分钟，去掉上清液，用相同体积的溶液悬浮，同时加入等体 积的5 的t r i t o n x - - 1 0 0 ，2 0 k h z 条件下超声两次，每次2 0 秒。将超声后的溶 液于1 0 ，0 0 0 9 ，4 条件下离心3 0 r a i n 。保留上清液。可用l o w r y 法测线粒体 总蛋白质的浓度。 l o w r y 法测蛋白含量 2 4p c r 引物设计及合成 u c p l 引物根据g e n b a n k 中的大鼠u c p ir n a 全基因( r n u c p rx 0 3 8 9 4 ， m 1 5 5 0 0 ) 设计。u c p 2 引物根据h i d a k a ( 1 9 9 8 ) 报道的大鼠u c p 2 基因序列设计。 u c p 3 引物根据金军华( 2 0 0 0 ) 等报道的大鼠u c p 3 基因序列设计。 表2 1u c p l ，u c p z 甄引物序列 t a b l e2 i d n as e q u e n c e so fu c p l u c p 2 僻ed r i m e r s o l i g o ( d t ) y a lp c r 引物均由大连宝生物公司合成。 2 5u c p i 的r t p c r 总r n a ( i - 5 g ) 及o l i g o ( d t ) ( 5 - - g g cc a cg c gt c g a c ta g ta c t1 1 t mr r r r r rm t 一3 ) 用来进行反转录( r t ) ，合成第一条链的e d n a 。2 0 9 l 反 9 第一幸材料5 i 方法 转录反应液中包含必下成分：2 0 0u n i t e s 的r e v e r s et r a n s c r i p t a s em m l v ( r n a s e h 。) ( t a k a r a 公司) ，1 0 r a m d t t ，5 0 0 n m o l i g o ( d t ) ，5 0 0 9 m 的各种d n t p ，5 f i r s ts t r a n db u f f e r ( m g c l 2p l u s ) ，r n a s ef r e ew a t e r 。单链e d n a 用于p c r 以克隆 树鼢e d n a 。 p c r 反应液中包含以下成分：2 5u n i t e st a qd n ap o l y m e r a s e ( t a k a r a 公 司) ，2 0 0 9 m 的d n t p ，p l 及p 2 各2 0 0 n m 。p c r 反应程序如下：9 4 3r a i n 加热变性，然后是3 0 个循环( 9 4 c3 0 s 变性，5 5 1m i n 退火，7 2 - c i 0r a i n 延 伸) ，最后7 2 1 0r a i n 终止反应。 2 6u c p 2 的r t p c r 总r n a ( 1 5 峙) 及o l i g o ( d t ) ( 5 一g g cc a cg c g t c g a c t a g t a c tt t t t 1 t t l v r 丁丌t 1 下t - - 3 ) 用来进行反转录( r d ，合成第一条链的e d n a 。2 0 i t l 反 转录反应液中包含以下成分：2 0 0u n i t e s 的r e v e r s et r a n s e r i p t a s em m l v ( r n a s e h 3 ( t a k a r a 公司) ， 1 0 m md t t ，5 0 0 r i mo l i g o ( d t ) ，5 0 0 p m 的各种d n t p ，5 f i r s ts t r a n db u f f e r ( m g c l 2p l u s ) ，r n a s ef r e ew a t e r 。单链e d n a 用于p c r 以克隆 树鼢e d n a 。 p c r 反应液中包含以下成分：2 5u n i t e st a qd n a p o l y m e r a s e ( t a k a r a 公 司) ，2 0 0 p m 的d n t p ，p 3 及p 4 各2 0 0 n m 。p c r 反应程序如下：9 4 c3m i n 加热变性，然后是3 5 个循环( 9 4 c3 0 s 变性，5 5 clr a i n 退火，7 2 c1 0m i n 延 伸) ，最后7 2 ( 21 0r a i n 终止反应。 2 7u c p 3 的r t - p c r 总r n a ( 1 - 5 9 9 ) 及o l i g o ( d t ) ( 5 - - g g cc a cg c ot c g a c ta g t a c tt t t t t t t t t t t t t t t t 一3 ) 用来进行反转录( r d ，合成第一条链的c d n a 。2 0 9 l 反 转录反应液中包含以下成分：2 0 0u n i t e s 的r e v e r s et r a n s e r i p t a s em m l v ( r n a s e h ) ( t a k a r a 公司) ，1 0 m md t t ，5 0 0 n mo l i g o ( d t ) ，5 0 0 p m 的各种d n t p ，5 f i r s ts t r a n db u f f e r ( m g c l 2p l u s ) ，r n a s ef r e ew a t e r 。单链c d n a 用于p c r 以克隆 树驹e d n a 。 p c r 反应液中包含以下成分：2 5u n i t e st a qd n a p o l y m e r a s e ( t a k a r a 公 司) ， 2 0 0 9 m 的d n t p ，p 3 及p 4 各2 0 0 n m 。p c r 反应程序如下：9 4 2 5m i n 0 第一二乖材料o 方法 加热变性，然后是3 0 个循环( 9 4 c3 0 s 变性，5 0 clm i n 退火，7 2 ( 21 5m i n 延 伸) ，最后7 2 ct 0r a i n 终止反应。 2 8p c r 产物的纯化及光密度扫描 用苯酚、氯仿各抽提一次，去除蛋白杂质再用凝胶回收法纯化p c r 产物。 1 琼脂糖凝胶电泳初步鉴定浓度。并于2 6 0 n m 处比色，根据光吸收值计算其浓 度。采用h y p e r s n a p d x5 软件分析p c r 产物的琼脂糖凝胶。 2 9 测序 送到t a k a r a 公司进行目的基因的测序。 2 1 0 数据分析及系统进化分析 2 1 0 1 数据统计 采用s p s s1 1 0 软件对所得数据进行统计学分析。所有数据以m e a n + s e 表示。差异显著性均以料p o 0 1 ，差异极显著； p ( o 0 5 ，差异显著表示。 2 1 0 2 系统进化分析 测序结果与g e n b a n k 数据库中已有的可用的序列比较，并从数据库获得相 关其它物种的解偶联蛋白基因的序列，构建系统发育树。序列对排用c l u s t a l x p r o g r a m ，进化树的构建采用m e g a 互0 软件分析及最大似然法构建系统进化树。 本研究所用的物种名称及其解偶联蛋白基因的g e n b a n k 登陆号列于表1 。 表1 构建进化树所用的物种名称和解偶联蛋白基因的g e n b a n k 登陆号 t a b l e1t h es p e e m s sn a m ea n dg e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r sf o ru c p ss e q u e n c e su s e di n p h y l o g e n e f i ct r e e s p e c i e s sn a m e g e n b a n kn o r a tu c p 2 m o u s cu c p 2 h a m s t e ru c p 2 h u m a n u c p 2 m o n k e y u c p 2 d o g u c p 2 p i g u c p 2 p i gu c p 3 c o wu c p 3 a b 0 0 5 1 4 3 b c 0 1 2 9 6 7 a f 2 7 1 2 6 4 u 7 6 3 6 7 a f 2 0 2 1 3 0 a b 0 2 0 8 8 7 a f 0 3 6 7 5 7 a f 0 9 5 7 4 4 a f 0 9 2 4 0 8 第- 二牵村科f 方法 d o g u c p 3 h a m s t e ru c p 3 r a tu c p 3 m o t l s eu c p 3 f r o g u c p 2 c a r p u c p 2 c h i c k e nu c p t u r k e y u c p b i r du c p z e b r a f i s hu c p d 0 9 u c p i r a b b i tu c p l h u m a n u c p l h a m s t e ru c p l r a tu c p l m o u s eu c p i w h e a tu c p r a tu c p 4 h l l r f l a nu c p 4 p o t a t ou c p a b 0 2 2 0 2 0 a f 2 7 1 2 6 5 a b 0 0 6 6 1 4 a f 0 5 3 3 5 2 b c 0 4 4 6 8 2 a j 2 4 3 4 8 6 a f 4 3 3 1 7 0 a f 4 3 6 8 1 1 a f 2 5 5 7 2 9 b c 0 7 5 9 0 6 a b 0 4 6 1 0 6 x 1 4 6 9 6 b c 0 6 9 5 5 6 a f 2 7 1 2 6 3 m l l8 1 4 b c o l 2 7 0 l a b 0 4 2 4 2 8 a j 3 0 0 1 6 2 a y 3 5 8 7 1 1 a j 0 0 2 5 8 6 2 第三章中缅树鼢u c p i ，u c p 2 发u c p 3 以：且r 脏、b a t 。骨骼脚l 和齄中的鲤i 织分布 第三章中缅树晌u c p i ，u c p 2 及u c p 3 在 肝脏、b a t 、骨骼肌和脑中的组织分布 迄今为止，已报道解偶联蛋白质共五种：u c p i 、u c p 2 、u c p 3 、u c p 4 和 u c p 5 ( s k u l a c h e v ，1 9 9 8 ) 。在哺乳动物中，u c p i 仅分布于b a t 中( v l a d i m i r ，1 9 9 8 ) u c p 2 广泛存在于组织和细胞中( f l e u r ye ta l 。，1 9 9 7 ) ，u c p 3 主要存在于骨骼 肌和b a t 中( r i c q u i e r ，1 9 9 9 ) ，u c p 4 和u c 陌主要存在于神经和脑组织，在植 物中也发现解偶联蛋白的存在，如蕃茄( f l e u r ye t a ，1 9 9 7 ) 其中u c p i 、u c p 2 、 u c p 3 是决定哺乳动物线粒体解偶联过程的主要蛋白质( j e z e ke ta 1 1 9 9 8 ； p a l o u ，1 9 9 8 ) ，在哺乳动物产热和能量代谢调节中具有重要的作用。近来的生化 和生理研究表明u c p 2 在静止代谢率和脂肪氧化方面起到一定作用( r i c q u i e r ， 1 9 9 9 ) ，但其具体作用机理还不甚清楚( m a s a k i ，1 9 9 9 ) 。越来越多的研究结果表 明，u c p s 与人类肥胖症和i i 型糖尿病有着密切的关系，该领域的研究引起了世 界各国学者的广泛重视( j e z e ke ta l1 9 9 8 ；c h a no ta 1 ，1 9 9 9 ；h o s o d ae ta 1 1 9 9 9 ；r i c q u i e r ，1 9 9 9 ；s c h r a u w e no ta 1 ，1 9 9 9 ) 。目前，u c p s 已被列为肥胖 和2 型糖尿病的候选基因。 u c p s 的研究，已经成为今后有效抗肥胖药物研究的新方向。本章采用 r t p c r 方法对u c p i 、u c p 2 、u c p 3 基因在中缅树嗣肝脏、b a t 、骨骼肌和脑中的 组织分布做了初步的鉴定分析，为以后进一步研究u c p s 基因表达情况及生理功 能打下基础。 3 1 材料与方法 见第二章。 3 2 结果 3 2 1 r n a 完整性的检验 从总r n a l 琼脂糖凝胶电泳图中可见，总r n a 的5 s ，1 8 s ，2 8 s 三条带完整可 第三章中孀扫f 翰【j c p t 。t ：c p 2 鼓u c f 3 以肝脏，f i a t 、骨靛j 忱郅脑中豹组织分布 进行r t p c r ( 图3 1 ) 。 舀3 i 总r n a l 璩黯糖毫泳圈 f i g3 1e l e c t r o p h o r c s i so f1 a g a r o s es h o w i n gt h ot o t a lr n ai nt i s s u e o f t r e es h r e w sb e f o r ea n da l 【e rc o l de x p o s u r e 3 2 2u c p l 的组织分布 以u c p l 引物p 1 和p z 分别做中缅树晌肝脏、b a t 、骨骼肌和脑总r n a 的r t p c r 得到的扩增产物电泳，以下是其1 琼脂糖电泳图。紫外灯下只有模板为b a t 总 r n a 的扩增产物电泳道上出现特异扩增带，与标准d n a 分子量对照，大小与理 论预期( u c p l ：4 8 3 b p ) 相符。其他扩增产物均无特异扩增条带。并且驯化2 8 天 的k n a 模板扩增的条带明显较亮( 图3 2 ) 。 第二章中缅辫聃u c p i 。u c p 2 鼓u c p 3 舀：肝脏、b a t 、骨骼肌和脑中的组织分布 图3 2 中缅树翻总r n ar t - - p c r 结果1 琼脂糖电泳 f i g 3 2e l e c t r o p h o r e s i so f1 a g a r o s es h o w i n gt h ep c rp r o d u c to f u c p io f t h el i v e ri nt r e e 。 s h r e w s 3 2 3u c p 2 的组织分布 以u c p 2 引物p 3 和p 4 分别做中缅树铜肝脏、b a t 、骨骼肌和脑总r n a 的 r t p c r 得到的扩增产物电泳。以下是其1 琼脂糖电泳图。紫外灯下可见除脑组 织外，肝脏、b a t 和骨骼肌三种组织的p c r 产物电泳卮均可见一清晰的特异扩 增带，与标准d n a 分子量对照，大小与理论预期( u c p 2 ：1 0 1 5 b p ) 相符( 图3 3 ) 。 第二章中缅树鼢u c p i ，u c p 2 技u c p 3n ：肝脏、b a t 、骨骼肌和脑中的氢王织分布 图3 3 中缅树驹u c p 2 在四种组织总r n ar t - - - - i r 结果l 琼脂糖电泳 f i g 3 3e l e c t r o p h o r e s i so f1 a g a r o s es h o w i n gt h ep c rp r o d u c to f u c p io f t h el i v e ri nt r e e s h r e w s 3 2 4i j c p 3 的组织分布 以u c p 3 引物p 5 和p 6 分别做中缅树晌肝脏、b a t 、骨骼肌和脑总r n a 的 r t p c r 得到的扩增产物电泳，以下是其1 琼脂糖电泳图。紫外灯下在b a t 和 骨骼肌两种组织的p c r 产物电泳后均可见一清晰的特异扩增带，与标准d n a 分 子量对照，大小与理论预期( u c p 3 ：4 7 5 b p ) 相符( 图3 3 ) 。 嚣三辛中缅树驹u c p i 。u c p 2 授u c p 3 硷；肝脏、b a t 、骨骼娜l 和脑中的纽织分布 图3 4 中缅树韵u c p 3 四种组织总r n ar t - - p c r 结果l 琼脂糖电泳 f i g 3 4e l e c t r o p h o r c s i so fl a g a r o s es h o w i n gt h ep c rp r o d u c to f u c p io f t h el i v e ri nt r e e s h r e w 表3 1 t a b l e3 1 中缅树昀u c p l 、u c p 2 和u c p 3 在四种组织中的基因表达 t h ee x p r e s s i o no fu c p l ，u c p 2 ，a n du c p 3i nf o u rt i s s u e si nt r e e s h r e w s u c p lu c p 2u c p 3 b tl i v e rs mb a t s m 相对光密度 7 ，0 46 5 26 7 66 6 26 r 3 06 3 2 3 3 讨论 解偶联蛋白( u n c o u p l i n gp r o t e i n ，u c p s ) 是位于线粒体内膜上的一类产热 蛋白( h i m m s h a g e n ，1 9 9 0 ) 。它可以驱散质子电化学梯度，使呼吸链和a t p 的合 成解偶联。使产能转化为产热，并提高静止代谢率。这意味着u c p s 在适应性产 热、体重调节和新陈代谢中发挥重要作用。u c p l