（急诊医学专业论文）血必净注射液对脓毒症大鼠急性肺损伤保护作用的研究.pdf

目录 中文摘要o ooooo ooo ooooo ooo oooo ooo ooo oooooo oooeoo ooo oo0 l 英文摘要o ooo ooooo ooo ooo oooooo oqo ooooooooo oo0 0 00 000000 000000 3 研究论文血必净注射液对脓毒症大鼠肺损伤保护作用的研究 前言”一”一”“”o oooo o ”一“oo oooo ”ooo ooo ”6 月o 舌”“”一”“” ”一“”“ ”。 材料与方法o oooo0 6 结果”“”“一”一“”一”“”o oooo oooo1 2 附图o o o ooooo0 1 5 附表”一”2 l 讨论”一”一”一”一”一”“”“”o oo ooo ”2 3 结论”一”“”一”“一”“”一”o oo oooooo o oo ”“”一”一“2 6 参考文献2 6 综述血栓调节蛋白及核因子k a p p ab 与脓毒症关系的研究进展2 9 致谢o ooooo oo o ooooooooo oooooo o oo qooo oooooo ooooooo o 3 8 个人简历3 9 中文摘要 血必净注射液对脓毒症大鼠急性肺损伤 保护作用的实验研究 摘要 目的：观察脓毒症大鼠急性肺损伤模型肺脏形态学、病理学改变及核 因子k a p p ab ( n f 1 出) 的表达、血浆血栓调节蛋白( t m ) 浓度和血清肿 瘤坏死因子a ( t n f a ) 浓度，并观察应用血必净注射液后上述指标的变 化，从蛋白c ( p c ) 途径、内皮细胞损伤、炎症因子的角度探讨脓毒症 的发生机制及血必净注射液对脓毒症肺损伤的保护作用。 方法：采用盲肠结扎穿孔术( c l p ) ，制备大鼠脓毒症模型。选用健 康s p r a g n e d a w l e y ( s d ) 大鼠1 4 4 只，体重在2 0 0 - - - 2 3 0 9 之间，随机分为4 组：空白对照组( a 组) 2 4 只、假手术组( b 组) 2 4 只、脓毒症组( c 组) 4 8 只、血必净治疗组( d 组) 4 8 只。各组动物按术后处死时间点6 、 2 4 、4 8 、7 2 小时各分为4 个亚组，a 组和b 组的每个亚组6 只大鼠，c 组和d 组的每个亚组1 2 只。d 组分别按c l p 后0 、12 、2 4 、3 6 、4 8 、6 0 小时经尾静脉注射血必净注射液4 m l k g 。c 组和b 组于相应时间点经尾 静脉注射相应量生理盐水。各组大鼠自c l p 术毕开始计时，于相应时间 点将动物麻醉后，经腹主动脉采血测定血浆t m 浓度、血清t n f q 浓度， 取右肺下叶行苏木精伊红( h e ) 染色观察形态学改变，免疫组化检测 n f k b 的表达。 结果：大鼠一般情况的观察：b 组大鼠均存活，苏醒早，一般状况 逐渐好转，进食水及大便正常；剖腹未见恶臭、肠管坏死、腹腔水肿等表 现。c 组大鼠均有严重的脓毒症表现：苏醒延迟、逐渐出现精神萎靡、竖 毛、活动减少、不再扎堆取暖，进食量减少、腹泻及呼吸频率加快等表现， 2 4 小时后出现死亡；剖腹有恶臭，可见血性惨液、肠管水肿粘连、盲肠 肿胀坏死。d 组大鼠与c 组相比临床表现有所减轻，死亡数有所减少。 病理观察：a 组大鼠肺呈均匀粉红色；光镜下组织结构完整清晰，肺泡 壁完整，肺泡腔无炎细胞浸润，偶有少许红细胞。b 组大鼠与a 组无明 显差异。c 组大鼠双肺肿胀，呈暗红色，肺表面可见散在出血点及出血斑， 切面含血量多，可有实变区或萎陷区；光镜下早期肺泡壁毛细血管扩张、 中文摘要 瘀血、炎性细胞浸润，肺水肿、弥漫肺出血及肺泡腔塌陷，部分透明膜形 成，后期可见肺泡塌陷明显，肺大疱形成，病变2 4 小时达顶峰，其后无 减轻趋势。d 组大鼠较c 病理损伤轻且有减轻趋势。血浆t m 浓度：a 组与b 组血浆t m 浓度较稳定，两者差异无统计学意义，p 0 0 5 。c 组大 鼠c l p 后6 小时血浆t m 浓度开始升高，并逐渐上升，至7 2 小时仍无下 降趋势，与a 、b 组比较差异有统计学意义，p 0 0 1 。d 组大鼠c l p 后6 小时血浆t m 浓度开始升高，但比同时间点c 组浓度低，以后逐渐降低， 仍比同时间点b 组浓度高，d 组与c 组及a 组、b 组差别均有统计学意 义，p 0 0 1 。血清t n f q 浓度：a 组与b 组血清t n f a 浓度较稳定， 两者差异无统计学意义。c 组血清t n f 仅浓度于c l p 后6 小时开始逐渐 升高，至7 2 小时无下降趋势，与a 组及b 组相比，差异均有统计学意义， p 0 0 5 。d 组血清t n f 0 【浓度在各时间点较c 组均显著降低，差异有统 计学意义，p 0 0 5 。d 组血清各时间点t n f 0 c 浓度均较a 组及b 组升高， 差异有统计学意义，p 0 0 5 。肺组织n f r b 表达：a 、b 组均可见散在 的n f k ：b 阳性细胞；c 组于c l p 后6 、2 4 、4 8 、7 2 小时均显著增强，在 支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞及血管内皮细胞的胞质内有表达，与a 、 b 组比较有显著差异，p 0 0 5 1d 组c l p 后6 小时亦出现表达，2 4 、4 8 、 7 2 小时表达显著低于c 组，但仍明显高于a 、b 组，差异均有统计学意 义，p 0 0 5 。 结论： c l p 法能够成功复制大鼠脓毒症肺损伤模型。血必净注射 液可以明显降低t n f q 和t m 水平，减少肺组织n f r b 表达，对脓毒症 大鼠急性肺损伤有保护作用。 关键词：血必净注射液；脓毒症；肺损伤；血栓调节蛋白；肿瘤坏 死因子- q ；核因子k a p p ab 研究论文 t h es t u d yo nt h ep r o t e c t i v ee f f e c to fx u e b i j i n gi n je c t i o n a g a i n s ta c u t el u n gi n j u r ya f t e rs e p s i si nr a t s a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t oe s t a b l i s has c i e n t i f i ca n dr e p r o d u c i b l ea n i m a lm o d e lo f s e p s i s i n d u c e dl u n gi n j u r y t o o b s e r v et h ep a t h o l o g i c a lc h a r a c t e r sa n dt h e l e v e l so fp l a s m at h r o m b o m o d u l i n ( t m ) ，s e r u mt u m o rn e c r o s i sf a c t o r - a ( t n f - a ) a n dt h ee x p r e s s i o no fn u c l e a rf a c t o r - k ：bf n f k b ) i nl u n gt i s s u e so f s e p s i sr a t s t oi n v e s t i g a t et h ep r o t e c t i v ee f f e c to fx u b i j i n gi n j e c t i o n m e t h o d s ：i nt h i ss t u d y , s dr a t sw e r es u b j e c t e dt os e p s i si n d u c e db yc e c a l l i g a t i o na n dp u n c t u r e ( c l p ) s u r g e r y o n eh u n d r e da n df o r t y - f o u rn o r m a l s p t a g u e d a w l e y ( s d ) ，w e i g h t e d2 0 0 - - 2 3 0 9w e r er a n d o m l yd i v i d e di n t of o u r g r o u p s ：c o n t r o lg r o u p ( g r o u pa ，n = 2 4 ) ，s h a mo p e r a t i o ng r o u p ( g r o u pb ，n = 2 4 ) ， c l pg r o u p ( g r o u pc ，n 2 4 8 ) a n dx u e b i j i n g - t r e a t e dg r o u p ( g r o u pd ，n = 4 8 ) e a c hg r o u pw a sd i v i d e di n t of o u rs u b g r o u p s a n i m a l si nt h es u b g r o u p sw e r e o r d e r l ys a c r i f i c e di n6 ，2 4 ，4 8 ，7 2h o u r sa f t e rt h eo p e r a t i o n s a n i m a l si ng r o u p cw e r eg i v e nr e s p e c t i v e l yi n t r a v e n o u si n j e c t i o nw i t hx u e b i j i n ga tt h ed o s eo f 4 m l k ga tp o s t - c l ea n i m a l si ng r o u pba n dg r o u pd w e r er e c e i v e dt h es a m e d o s eo fs a l i n e a f t e rc l p , r a t si ne a c hg r o u pw e r ea n e s t h e t i z e dw i t h10 c h l o r a lh y d r a t e ( 3 m l k g ) a tt h er e q u i r e dt i m e b l o o ds a m p l e sf r o ma b d o m i n a l a r t e r yw e r ec o l l e c t e dt om e a s u r et h el e v e l so ft ma n dt n f 一0 【p a r to ft h er i g h t l u n g w a sh a r v e s t e d t oo b s e r v et h e p a t h o l o g i c a l c h a r a c t e r s b y h e m a t o x y l i n - e o s i n( h e ) a n dt h e e x p r e s s i o n o fn f k b b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y r e s u l t s ：q t h eg e n e r a ls i t u a t i o no fr a t s ：t h er a t si ng r o u pbw e r ea l l s u r v i v e da n dc a m ea r o u n de a r l i e rt h a nt h o s ei ng r o u pca n dg r o u pd n o a b d o m i n a ld r o p s ya n de v i ls m e l l i n ga n db o w e l sn e c r o s e sw e r ef o u n dw h e n t h e i ra b d o m e n sw e r eo p e n e d t h er a t si ng r o u pcc a m ea r o u n dl a t e rt h a nt h o s e i ng r o u pba n dw e r eo b s e r v e da p p a r e n ti n a c t i o n ，p i l o e r e c t i o n ，a n dt a c h y p n e a b l o o d ya s c i t e sa n de v i ls m e l l i n gw e r ef o u n dw h e nm o r b i da n a t o m yw a s 研究论文 p e r f o r m e d e n t e r i ce d e m aa n dt h ec e c a ln e c r o s i sw e r ea l s o o b s e r v e d c o m p a r e dw i t ht h eg r o u pc ，t h ec l i n i c a la p p e a r a n c e so ft h er a t si ng r o u pd w e r eb e t t e r ( 爹h es t a i n i n g ：t h el u n g sp r e s e n t e dp i n ki nb o t hg r o u pa a n d g r o u pb t h en o r m a la l v e o l a r w a l lw a sc o m p l e t ea n dc l e a r , w i t h o u ts o a k a g eo f i n f l a m m a t o r yc e l l si nt h el u m e no fa l v e o l u s e s ，o ro c c a s i o n a l l yaf e wo f e r y t h r o c y t e s t h el u n g sw e r ed e e pr e da n do b v i o u s l ys w o l l e ni ng r o u pc t h e r ew e r es o m ee c c h y m o s i s e si nt h es u r f a c eo ft h el u n g a tt h ee a r l i e rs t a g e ， p u l m o n a r ye d e m a ，d i f f u s ep u l m o n a r yh e m o r r h a g e ，t h ei n f i l t r a t i o no f i n f l a m m a t o r yc e l l sa n dh y a l i n em e m b r a n ew e r eo b s e r v e d ；a tt h el a t e rs t a g e ， p a r ta l v e o l a rh a sc o l l a p s e da n dw ea l s oo b s e r v e db u l l a e t h ep a t h o l o g i c a l c h a n g e sw e r eo b v i o u s2 4 h o u r sa f t e rt h eo p e r a t i o na n dn oi m t r p v e m e n tc o u l d b eo b s e r v e d c o m p a r e dw i t hg r o u pc ，r a t si n g r o u pdp r e s e n t e db e t t e ri n p a t h o l o g i c a lc h a n g e s ，b u ts t i l lw o r s et h a ng r o u pb t m ：t h el e v e l so ft m i ng r o u pc g r a d u a l l yi n c r e a s e df r o m6 ht oha f t e rc l ps u r g e r y t h el e v e l so f t mi ng r o u pcw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a nt h o s ei ng r o u pbo nt h ef o u rt i m e p o i n t s ，t h e r ew a sas t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e m ( p 0 01 ) t h el e v e l s o ft mi ng r o u pda l s og r a d u a l l yi n c r e a s e df r o m6 ht o7 2 ha f t e rc l p s u r g e r y , b u tt h el e v e l so ft mi ng r o u pdw e r eo b v i o u s l yl o w e rt h a nt h o s ei ng r o u pc ， t h e r ew a sas t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e m ( p o 0 1 ) t h el e v e l so ft m i n g r a u pdw e r eh i g h e rt h a nt h o s ei ng r o u pb ，t h e r ew a sas t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c eb e t w e e ng r o u pba n dg r o u pd ( p o 01 ) ( d t n f 一0 【：t h el e v e l so f t n f qi ng r o u pcg r a d u a l l yi n c r e a s e df r o m6 ht o7 2 ha f t e rc l p s u r g e r ya n d t h el e v e l sw e r eo b v i o u s l y h i g h e rt h a nt h o s ei ng r o u pba n dg r o u pd ，t h e r ew a s as t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e m ( p o 0 1 ) t h el e v e l so ft n f 一0 【i ng r o u p da l s og r a d u a l l yi n c r e a s e df r o m6 ht o7 2 h ，b u tt h el e v e l so ft n f 仅i ng r o u pd w e r eo b v i o u s l yl o w e rt h a nt h o s ei n g r o u pc ，t h e r ew a sa s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c eb e t w e e nt h e m ( p 0 o1 ) t h el e v e l so ft n f ai ng r o u pdw e r e h i g h e rt h a nt h o s ei ng r o u pb ，t h e r ew a sas t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c eb e t w e e n g r o u pd a n dg r o u pb ( p o 0 1 ) n f r , be x p r e s s i o ni nl u n gt i s s u e ：t h e r ew a s o n l yav e r yw e a ke x p r e s s i o no fn f r , bi ng r o u paa n dg r o u pb t h e e x p r e s s i o n o fn f r , bi n g r o u pcw a s o b s e r v e df r o m 6 ht o7 2 hi n 4 研究论文 c y t o p l a s m a ，o fb r o n c h i a le p i t h e l i a lc e l l s ，a l v e o l a re p i t h e l i a lc e l l sa n dv a s c u l a r e n d o t h e l i a lc e l l s t h ee x p r e s s i o no fn f r bi ng r o u pdw a so b s e r v e di n6 hi n s u c hc e l l sa n dt h ee x p r e s s i o nd e c r e a s e di n4 8 ha n d7 2 h ，t h e r ew a sas t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c eb e t w e e ng r o u pc a n dg r o u pd ( p o 0 5 ) c o n e l u s i o n ： 1as c i e n t i f i ca n dr e p r o d u c i b l ea n i m a lm o d e lo fs e p s i s - i n d u c e dl u n g i n j u r yc a nb ee s t a b li s h e db yc l e 2x u e b i ji n gp e r f o r m sp r o t e c t i v ee f f e c to na n i m a l sw i t ha c u t el u n gi n j u r y a f t e rs e p s i sb yd e c r e a s i n gt h el e v e l so ft n f - aa n dt m ，d e p r e s s i n gt h e e x p r e s s i o no f n f 一1 c b k e yw o r d s ：t r e a t m e n tw i t hx u e b i ji n g ；s e p s i s ；a c u t el u n gi n j u r y ；t m ； t n f - a ；n f - i ：b 5 研究论文 血必净注射液对脓毒症大鼠肺损伤保护作用的研究 上-j 刖 菁 脓毒症( s e p s i s ) 是由感染因素介导的全身炎症反应综合症( s i r s ) 。 自抗生素应用以来，因脓毒症导致的病死率由5 5 下降至3 5 左右【l 】， 但近年来的研究表明，脓毒症患者的死亡率呈逐年上升趋势【l 】。在全世界 范围内，脓毒症仍是i c u 中死亡的主要原因之一。 近期研究表明，脓毒症的病理生理基础是炎症因子、凝血及内皮细胞 损伤等因素间的相互促进、相互影响【2 】。近年来，p c 系统成为脓毒症研 究的热点，t m 作为p c 通路的重要组成部分，在抗凝血及减弱炎症反应 方面都有着重要作用，而且是血管内皮损伤的重要标志物。c o n w a ye m 等【3 】的研究认为t m 的c 型凝集素相似区域( d 1 区域) 可以维持细胞功 能和细胞连接的完整性，直接抑制炎性细胞黏附，阻止炎性细胞迁移，抑 制n f 1 c b 信号通路的激活。此外h a s e g a w a 等【4 】使用重组人t m 治疗内毒 素诱导的脓毒症大鼠，结果发现重组人t m 虽然不能改善动物整体存活 率，但能在短期内改善这些动物的生存状态并能降低这些大鼠多器官功能 衰竭( m o f ) 的发生率。 本研究通过观察经血必净治疗后的脓毒症大鼠血浆t m 浓度、血清 t n f 0 【浓度及肺脏n f k b 的表达，旨在阐明脓毒症大鼠急性肺损伤的发 生机制及血必净注射液对脓毒症的治疗作用，希望探索到一种治疗脓毒症 的新方法。 l 材料 1 1 实验动物 健康s d 大鼠1 4 4 只， 动物中心提供。 1 2 主要仪器 台式低速离心机( 0 4 1 2 1 ) 材料与方法 均为雄性，体重2 0 0 - 、- 2 3 0 9 ，由河北医科大学 上海手术器械厂 研究论文 电热三用水箱( q i y s 0 0 2 ) 北京市医疗设备厂 超低温冰箱日本s a n y o 公司 d s h z 3 0 0 型恒温水浴箱江苏太仓医用仪器厂 a p 2 5 0 d 1 0 0 电子天平瑞典o h a u s 公司 o l y m p u sb x 4 1 系统显微镜日本o l y m p u s 公司 s w - c j i f d 净化工作台苏州安泰空气技术公司 r s 2 8 高速低温离心机德国贺利氏公司 微量移液器德国g i l s o n y b l 2 生物组织包埋机孝感亚光医用电子技术研究所 y t - 6 生物组织摊烤机孝感亚光医用电子技术研究所 h m p 1 1 0 组织脱水机德国w a l l d o r f 公司 h m 3 1 5 组织切片机德国w a l l d o r f 公司 全自动酶标仪奥地利c l i n i b i 0 1 2 8 c 1 3 主要药品和试剂 血必净注射液天津红日药业股份公司 t n f - a 试剂盒北京中山生物科技公司 t m 试剂盒北京中山生物技术公司 n f k b 免疫组化试剂盒北京中山生物技术公司 n f k b 特异性抗体( 一抗)北京中山生物技术公司 多聚甲醛( 分析纯)天津市化学试剂研究所 磷酸二氢钠( 分析纯)天津市化学试剂六厂 磷酸氢二钠( 分析纯)天津市化学试剂六厂 无水乙醇( 分析纯)天津市泰兴试剂厂 9 5 乙醇( 分析纯)天津市泰兴试剂厂 二甲苯( 分析纯)北京益利精细化学品公司 冰乙酸( 分析纯)天津市百世化工化学试剂厂 生理盐水石家庄第四制药厂 苏木精天津市化学试剂六厂 伊红天津市化学试剂六厂 1 4 主要试剂的配制 、 ( 1 ) l o 水合氯醛：称取1 0 9 水合氯醛，用蒸馏水溶解后，稀释至 研究论文 1 0 0 m l 。 ( 2 ) 0 2 m 磷酸缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e d ，p b ，p h 7 4 ) - 取磷酸 二氢钠( n a i l 2 p 0 4 2 h 2 0 ) 31 2 9 加蒸馏水至1 0 0 0 m l 溶解，此为0 2 m a 液。取磷酸氢二钠( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ) 7 1 6 9 加蒸馏水至1 0 0 0 m l 溶解， 此为0 2 m b 液。将1 9 0 m l 的0 2 m 的a 液和810 m l 的0 2 m 的b 液充分 混合，即为0 2 m 的p b ( p h 7 4 ) 。若p h 值偏高或偏低，可通过适当改变 a 液和b 液的比例加以调整。 ( 3 ) 0 0 1 m 磷酸缓冲生理盐水( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ， p h 7 4 ) ：将9 9 n a c l 和5 0 m 1 0 2 m 的p b ，加入到1 0 0 0 m l 的容量瓶中，最 后加蒸馏水至1 0 0 0 m l ，充分摇匀，若p h 值偏高或偏低，可用1 nh c i 或 n a o h 加以调整。 ( 4 ) 4 多聚甲醛固定液：称取4 0 9 多聚甲醛干粉加入5 0 0 m l0 2 m p b 液的玻璃烧瓶中，加蒸馏水至1 0 0 0 m l ，持续加热磁力搅拌至6 0 一6 5 ，使 成乳白色悬液。用1 0 m m o l l 的n a o h 调整p h 值至7 o ，使呈清亮状， 过滤后保存备用。 2 实验方法 2 1 动物分组及给药 健康s d 大鼠，随机分为空白对照组( a 组) 2 4 只、假手术组( b 组) 2 4 只、脓毒症组( c 组) 4 8 只和治疗组( d 组) 4 8 只。各组再按照随机 原则按时间点6 、2 4 、4 8 、7 2 小时，分为四个亚组。采用标准颗粒饲料及 饮用水按常规饲养一周，待大鼠适应实验室环境后开始实验。d 组大鼠分 别按c l p 后o 、1 2 、2 4 、3 6 、4 8 、6 0 小时按4 m l k g 经尾静脉注射血必净 注射液( 处死时间点与给药时间点重合的动物不再给药，直接处死) 。b 组与c 组于相应时间点经尾静脉注射相应量生理盐水。 2 2 大鼠c l p 模型制备 大鼠术前称重、编号，并禁食6 小时，可以自由饮水。用l o 水合 氯醛( 按3 m l k g ) ，腹腔注射进行麻醉。将大鼠仰卧位固定于手术台上， 剪去腹部体毛，常规消毒、铺孔巾，无菌条件下进行手术，取下腹正中切 口，切口长度2 c m ，逐层切开，找到盲肠并小心游离其盲端尽量避免损伤 血管，用生理盐水润湿盲肠表面，将盲肠取出，于距盲端l c m 处进行结 扎，用1 2 号针头贯穿3 次，并留置一条宽2 m m 的橡皮条贯通盲肠，以防 研究论文 止针孔闭合，然后将盲肠按原位置还纳腹腔。逐层缝合腹壁切口并用无菌 纱布覆盖切口。术毕颈部皮下注射5 m l 生理盐水抗休克。 2 3 假期手术组模型制备 假手术组大鼠按c l p 组方法麻醉、固定、备皮、消毒、逐层切开腹 壁，找到盲肠翻动几下后即缝合腹壁切口。 2 4 标本采集 剔除死亡大鼠，于6 、2 4 、4 8 、7 2h 取相应亚组大鼠6 只，用1o 水 合氯醛( 按3 m l k g ) ，腹腔注射麻醉，开腹经腹主动脉取血，分别置于抗 凝与非抗凝试管中，以3 0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，分别取血浆及血清，并置于 7 2 冰箱保存。取右肺下叶，约2 c mx2 c mx0 3 c m ，浸泡于4 多聚甲 醛中固定，以备进行光镜检查及免疫组化检测。 2 5h e 染色 2 5 1 玻片处理 玻片用热肥皂水刷洗，自来水冲洗干净后，置于清洁液中浸泡2 4h ， 清水洗净烘干，9 5 酒精浸泡2 4h ，再用蒸馏水冲洗，烘干后备用。 2 5 2 光镜切片制作 ( 1 ) 将所取肺组织，大小约2 c mx2 c m 0 3 c m ，浸泡于4 多聚甲醛中 固定4 8h ； ( 2 ) 7 0 1 0 0 的酒精逐级脱水共2 4 h ，在h m p 1 l o 组织脱水机中进 行； ( 3 ) 二甲苯固定透明3 0 m i n ； ( 4 ) 5 2 低溶点石蜡包埋，在y b l 2 生物组织包埋机中进行； ( 5 ) 在r m 2 0 15 组织切片机中4um 连续切片； 2 5 3h e 染色 ( 1 ) 切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水：二甲苯( 1 ) 1 5 m i n - - - z 甲苯( i i ) l o m i n 一1 0 0 乙醇2 m i n 一9 5 乙醇l m i n 一8 0 乙醇 1 m i n 一7 5 乙醇l m i n 一自来水沈片刻； ( 2 ) 蒸馏水洗2 m i r a ( 3 ) 苏木精染色1 0 m i n ，自来水冲洗片刻； ( 4 ) 1 盐酸乙醇分化3 0 s ； ( 5 ) 温水( 约5 0 ) 5 m i n ； 研究论文 ( 6 ) 置伊红液2 m i n ； ( 7 ) 常规脱水，透明，封片：9 5 乙醇( 1 ) l m i n 一9 5 乙醇( i i ) l m i n 一1 0 0 乙醇( 1 ) l m i n 一1 0 0 乙醇( i i ) l m i n - - - - - 甲苯石碳酸( 3 ： 1 ) l m i n c 甲苯( 1 ) l m i n - - - - 甲苯( i i ) l m i n ； ( 8 ) 中性树脂封片。 2 6 免疫组织化学 2 6 1 免疫组化步骤 采用免疫组织化学链霉素亲和素一生物素标记( s a b c ) 法进行染色， 观察n f k b 在大鼠肺组织中的表达和分布情况 ( 1 ) 载玻片泡酸清洁，多聚赖氨酸防脱片处理，蜡块4 9 m 厚度连续切片， 捞片置于6 0 烤箱干燥4 0 分钟； ( 2 ) 石蜡切片脱蜡：二甲苯( 1 ) 5 m i n - * - - 甲苯( i i ) 5 m i n 一1o o 乙醇 ( 1 ) 5 m i n 一1 0 0 乙醇( i i ) 5 m i n - 9 5 乙醇( 1 ) 5 m i n 一9 5 乙 醇( i i ) 5 m i n 一9 0 乙醇( 1 ) 5 m i n 一9 0 乙醇( i i ) 5 m i n - 8 5 乙醇( 1 ) 5 m i n 一8 5 乙醇( i i ) 5 m i n 一7 5 乙醇( 1 ) 5 m i n 一7 5 乙醇( i i ) 5 m i n 一自来水冲沈一p b s 冲洗两次； ( 3 ) 新鲜配制的3 双氧水溶液室温孵育3 0 m i n ，以消除内源性过氧化 物酶的活性。蒸馏水冲洗2 m i n x 3 次，p b s ( p h 值7 4 ) 浸泡5 m i n 3 次； ( 4 ) 抗原修复：微波炉中火1 5 m i n ( 9 2 9 8 ) ，室温冷却1 0 2 0 分钟， 0 0 1 mp b s 冲洗5 分钟3 次； ( 5 ) 1 0 正常山羊血清( p b s 稀释) 封闭游离的结合位点，常温下放置 2 0 m i n ，以减少非特异性染色，甩去多余液体，不洗； ( 6 ) 在湿化盒内，滴加一抗( n f 1 c b ) ，4 。c 过夜，0 0 1 mp b s 冲洗5 分 钟3 次； ( 7 ) 在湿化盒内，滴加生物素标记的二抗，室温孵育3 0 分钟，0 0 1 mp b s 冲洗5 分钟3 次； ( 8 ) 在湿化盒内，滴加生物素标记的二抗，室温孵育3 0 分钟，0 0 1 mp b s 冲洗5 分钟3 次； ( 9 ) d a b 显色：使用d a b 显色试剂盒。取l m l 蒸馏水，分别加入试剂 盒中a 、b 、c 试剂各l 滴，混匀后加至切片。室温显色，镜下控 研究论文 制反应时间，5 分钟。蒸馏水充分洗涤。苏木素轻度复染细胞核1 分钟、1 盐酸乙醇分化、1 氨水反蓝、充分水洗； ( 10 ) 经8 0 乙醇和7 0 乙醇各3 0 秒、9 5 乙醇1 分钟、1 0 0 乙醇2 分 钟两次脱水。二甲苯透明5 分钟、中性树脂封片。 2 6 2 免疫组织化学结果判定 每个标本选取5 张切片，每张切片于镜下随机选取5 个完整且不重叠 的高倍视野，采用美国m e d i ac y b e r n e t i c s 公司生产i m a g e p r op l u s 多功 能真彩色细胞图像分析管理系统分析，并予以人工再次复核。 判断结果采用半定量积分法，分别按阳性细胞百分数及染色强度计分。 免疫组织化学( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys c o r e ，h i s ) 标准：a 为阳性细胞 数分级0 1 ：= 0 、l 1 0 = 1 、1 0 5 0 = 2 、5 0 8 0 = 3 、8 0 - 1 0 0 = 4 ；b 为阳性 细胞显色强度分级0 ( 阴性) 、l ( 浅黄色为弱阳性) 、2 ( 浅棕黄色为阳性) 、 3 ( 棕黄色为强阳性) ；h i s = a x b 。 n f r b 定位于胞浆，如细胞浆不着色为阴性，凡细胞浆内有棕黄色颗 粒或棕黄色均匀染色为阳性染色细胞。阳性细胞必须结构清晰，定位准确。 2 7e l i s a 法操作步骤 试剂盒组成：酶标板( c o m e dw e l l s ) ：9 6w e l l s 、浓缩洗涤液：1 5 m l 、 显色液( t m bs u b s t r a t e ) ：1 2 m l 、终止液：1 0 m l 、样品稀释液：l o o m l 、 a n t i r a tt mb i o t i n ：1 2 m l 、标准品：1 s e t 、浓缩酶联物( h r p ) ：6 0 、酶 联物稀释液：1 5 m l 。 准备工作：浓缩洗涤液( 5 0 x ) 用双蒸馏水稀释成1 ( 至7 5 0 m 1 ) 。 配制lxh r p ：h r p 用酶联物稀释液稀释6 0 倍，即1 份浓缩h r p 加入 5 9 份h r p 稀释液。即5 0ulh r p 加入2 9 5 0 1 tlh r p 稀释液。标本应预 实验以确定稀释倍数，建议稀释2 0 0 0 倍，即l oul 标本加入2 m l 生理盐 水中，混匀( 1 ：2 0 0 ) ；然后将混匀液l oul 加入l m l 样品稀释液中( 1 ：1 0 0 ) ， 混匀；这样总共2 稀释2 0 0 0 倍。标准品已经稀释，不用再稀释。 操作步骤：加入1 0 0ul 标准品、1 0 0ul 已稀释标本于反应板孔中。 轻轻混匀3 0 秒，2 0 2 5 温育2 0 分钟。洗板：甩尽板内液体，用洗 涤液洗涤反应板，并去除水滴，反复洗涤3 次。每孔加入1 0 0l ila n t i - r a t t m 。轻轻混匀3 0 秒，2 0 2 5 温育2 0 分钟。洗板：甩尽板内液体，用 洗涤液洗涤反应板，并去除水滴，反复洗涤3 次。每孔加入1 0 0u1 1x 研究论文 h r p ，轻轻混匀3 0 秒，2 0 2 5 温育2 0 分钟。洗板：甩尽板内液体， 用洗涤液洗涤反应板，并去除水滴，反复洗涤3 次。每孔加入1 0 0i llt m b 显色液，轻轻混匀3 0 秒，2 0 2 5 温育2 0 分钟。每孔加入1 0 0pl 终止 液，轻轻混匀3 0 秒，1 5 分钟内在4 5 0 n m 处读o d 值。 同理测定血清t n f a 浓度。 3 统计学分析 数据统计分析采用s p s s l l 5 版软件包( s p s sc o m p a n y ，s h i c a g o ， i l l i n o i s ，u s a ) 进行，比较血浆t m 浓度、血清t n f 仅浓度和肺组织n f k b 表达的变化，采用完全单因素的方差分析，方差不齐时采用非参数的秩和 检验。p o 0 5 。与a 组、b 组相比，c 组在各个时间点( 6 、2 4 、4 8 、7 2 小时) 血浆t m 浓度均升高， 差别有统计学意义，p 0 0 1 。与c 组相比，d 组在各个时间点血浆t m 浓 度均降低，差别有统计学意义，p 0 0 1 ，但较同时间点a 组及b 组仍升 高，差别均有统计学意义，p 0 0 5 。与a 组及 b 组相比，c 组在各个时间点( 6 、2 4 、4 8 、7 2 小时) 血清t n f q 浓度均 升高，差别有统计学意义，p 0 0 5 。与c 组相比，d 组在各时间点血清 耵师a 浓度均降低，两者差别有统计学意义，p 0 0 5 。d 组血清t n f a 浓度较同时间点a 组及b 组仍高，差别均有统计学意义，p 0 0 5 ( 见f i g 5 a 、f i g 6 a 、f i g 7 a 、f i g 8 a ) ；c 组n f k b 阳性细胞于 术后6 小时开始增多( 见f i g 5 c ) ，术后4 8 小时达高峰( 见f i g 6 c ) ，并 持续到7 2 小时，明显高于a 组与b 组，p 0 0 5 ( 见f i g 8 c ) ：d 组表达 量在相同时间点均显著低于c 组，p 0 0 5 ( 见f i g 5 d 、f i g 6 d 、f i g 7 d 、 f i g