（动物学专业论文）低剂量镉诱导酵母细胞氧化损伤的机理研究.pdf

原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导帅的指导下独立进行 研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均己明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成 果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：里主鱼生日期：三! 竖! 丝 关于学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属兰 州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定，同意学 校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被 查阅和借阅：本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学位论文。本 人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：受盥导师签名：蚴日期：垒望丘盘掣 致谢 谨此论文完成之际，首先向我的导师张迎梅教授表示衷心的感谢从我进入 研究生阶段的那一天起，三年的硕士学习期间，张老师始终给予了我极大的关心 与指导，不仅从学术上，还从生活和个人修养上全面塑造着我。 知识是重要的，但更重要的是她教会了我如何从纷繁芜杂的知识中找出自己 的方向来，从论文的选题，设计到撰写，导师严谨求实的治学态度，渊博的专业知 识，敏锐的学术洞察力和活跃的学术思想，都让我终生受益。 生活就是奋斗，张老师也许并未明说，但她的一言一行都向我传达着这一思 想是啊，像张老师这样已取得一定成就的人都还在不断进取，我又怎能任由时间 从我指缝间溜走呢? 张老师对我们生活的关心也是有目共睹的。在一些重大节日的时候，张老师 了解我们远离家乡的抑郁，总会组织一些活动，既融洽了实验室的气氛，也让我们 感到了家的温暖。 一个老师最大的心愿也许就是能让学生在自己的帮助下走上成材之路。对老 师最好的报答就是成为一个对国家，对人民有用的人。我将在自己的道路上坚定 的走下去，无论多大的挫折，也不放弃，因为我知道，张老师正在用温暖的目光看 着我。 当然，我还要感谢兰州大学生科院刘乃发老师，胡建成老师和兰州物化所蒋 生祥老师的支持，以及师妹王叶菁和侯雅妮的帮助，没有他们的帮助我将无法完 成我的实验同时我还要感谢实验室的其他同学，在生活和学习中都给予了我无 私的帮助。 最后，我要感谢我的父母我想对他们说，二十多年的求学路很辛苦，但你们 比我更辛苦! 罗松年 2 0 0 6 年4 月于兰州大学 中文摘要 低剂量镉诱导酵母细胞氧化损伤的机理研究 镉作为一种有毒重金属，自从上世纪6 0 年代日本发生群体性镉中毒事件后 关于其生物毒理的研究就一直受到各国科学家的重视。低剂量镉具有很强的生物 毒性。为了探讨镉损伤真核细胞的作用过程，以及在细胞中镉攻击的靶目标，我 们实验室设计了一系列实验来研究这一问题。 酿酒酵母作为一种单细胞真核生物，具有增殖快，培养方便，兼性厌氧等特点 对其进行研究可以为镉与其它真核生物的相互作用提供有益的信息。因此本实验 选用酿酒酵母作为实验材料。 线粒体是真核细胞的能量中心，能量供应的多少影响细胞的代谢以及d n a 复 制等各个方面。而且线粒体是氧自由基产生的主要场所，在氧化磷酸化的过程中， 有约2 的氧气转化为氧自由基，线粒体的状态决定了氧自由基产生的多少。已有 实验证明，镉能诱导酵母细胞的氧化损伤。因此，镉对细胞的作用与线粒体有密切 的关系。本实验通过控制酵母培养基中葡萄糖的供应来影响细胞线粒体的代谢状 态，并测定酿酒酵母线粒体d n a 在不同代谢条件下所受氧化损伤的程度，由此推 测镉与酵母细胞作用的方式。 实验在不同葡萄糖条件下，用浓度l o 汕n o l l 的氯化镉染毒l o h 后，统计酵 母细胞的存活率，并用h p l c e c 法测定酵母线粒体d n a 中8 一o h d g l o s d g 比值。 结果表明：无葡萄糖条件下，氯化镉处理后，酵母细胞对镉的耐受性明显高于有 葡萄糖条件下( 尸锄0 1 ) ，而且对线粒体d n a 的氧化损伤程度也明显低于有葡 萄糖条件下的情况( p o 0 1 ) 。 关键词镉：酿酒酵母；氧化损伤：线粒体d n a a b s t r a c t o x i d a t i v ed a m a g em e c h a n i s mo fl o wd o s eo fc a d m i u mt oy e a s tc e l l s c a d m i u mi sak i n do fp o i s o n o u sh e a v ym e t a l s w h i c hl e a dt oas e r i o u sp o i s o n e da c c i d e n t i nj a p a nl a s t6 0 s f r o mt h e no n ，m a n ys c i e n t i s t sw e r ea t t r a c t e dt oi n v e s t i g a t et h e c a d m i u m st o x i c o l o g y l o wd o s eo fc a d m i u mh a ss e r i o u st o x i c i t yt oo r g a n i s m b u ti t s a c c u r a t ea c t i o n m a pa n dw h i c hc e l l u l a ro r g a ni si t st a r g e ta r eu n s o l v e dy e t i no r d e it o r e s o l v et h ep r o b l e m w ed e s i g nas e d e se x p e r i m e n t s s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ei sag o o dm o d e lo r g a n i s m t h r o u g hi n v e s t i g a t i n gc a d m i u m e f f e s t so ns c e r e v i s i a e , w ec a ng e tk n o w nc a d m i u ma c t i o nm e c h a n i s mt oo t h e r e u k a r y o t e s m i t o c h o n d d aa r et h ep o w e rc e n t e ro fe u k a r y o t i cc e l l ，w h i c ha f f e c tm a n ya s p e c t so fc e l l u l a r a c t i o n s w h a tm o r e ，m i t o c h o n d r i aa r et h em a j o rl o c u so fg e n e r a t i n gf r e er a d i c a lo x y g e n 2 o fo x y g e ni st r a n s f o r m e di n t of r e er a d i c a lo x y g e ni nc e l l u l a rm e t a b o l i s m s ot h es u mo f f r e er a d i c a lo x y g e ni nc e l li sc o n c e r n e dw i t hm i t o c h o n d d a sc o n d i 颤o n c a d m i u mh a sb e e n e x p e r i m e n t a lp r o v e da b l et oi n d u c eo x i d a t i v es t r e s si ny e a s t h o wi th a p p e n e di su n k n o w n i nm ye x p e r i m e n t s ，lc o n t r o lt h em e t a b o l i s ms t a t eo fm i t o c h o n d n at h r o u g hc h a n g i n gt h e v o l u m eo fg l u c o s ei nm e d i u m 。a n dt h e nd e t e c tt h el e v e lo fm i t o c h o n d r i ad n ab e i n g o x i d i z e di nd i f f e r e n tm e t a b o l i s ms t a t e s f i n a l l y c o n c l u s i o ni sm a d eb ya n a l y z i n gt h e e x p e d m e n t a ld a t a a f t e re x p o s e dt oc d c i zd o s e d10 m o l lf o r10h o u r s y e a s tc e l l sw e r ec o l l e c t e df o r s u r v i v a la s s a ya n do x i d a t i v ed a m a g eo fm i t o c h o n d d ad n aw a sa s s e s s e dt h r o u g h d e t e c t i n gt h el e v e l o f8 - o h - d g 10 5 d gb yh p l c - e c a l lt h er e s u l t sw e r ec o m p a r e d b e t w e e nt h es i t u a t i o n sw i t ho rw i t h o u tg l u c o s ei nm e d i u m i tw a sc o n c l u d e dt h a tc d 2 + t o l e r a n c eo ft h ey e a s lw a sh i g h e ri ng l u c o s e - f r e em e d i u mt h a nt h a ti ng l u c o s e s u f f i c i e n t m e d i u m ( p 0 0 1 ) a n dt h ey e a s ti ng l u c o s e - f r e em e d i u mh a dal o wl e v e lo fo ) ( i d a t i v e d a m a g ei nm i t o c h o n d n a ld n a ( p o 0 5 表明差异不显 著，p o 0 5 表明差异显著或影响显著， p 0 0 5 ) ，可能因为2 他 n o l l 氯化镉在第一个梯度区间内，细胞内的拮抗机制比 较强，镉离子并未对酿酒酵母细胞的生存产生太大的影响，所以无论是在有葡萄 糖条件下，还是在无葡萄糖条件下，酿酒酵母细胞的存活率都较高且差异不明显。 而当氯化镉染毒浓度为1 0 l - o l l 时，无葡萄糖条件下酿酒酵母细胞的存活 率显著高于有葡萄糖条件下，这说明该浓度条件下的氯化镉已对酿酒酵母细胞产 生了较大的损伤。由于在有葡萄糖条件下的酿酒酵母细胞代谢程度高，对线粒体 损伤的直接后果是导致代谢程度高的线粒体产生更多氧自由基，对酿酒酵母细胞 造成的损伤更大，在宏观上的反映就是无葡萄糖条件下染毒的酿酒酵母细胞存活 率显著高于有葡萄糖条件下的存活率。 3 葡萄糖水平对酵母细胞氧化损伤水平的影响 3 1 在h p l c e c 系统中样品浓度与峰面积的关系方程式 表3 不同浓度的核酸样品在h p l c - e c 系统中的峰面积 f a b l e3s a m p l ep e a ka r e ao fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fn u c l e o t i d e sd e t e c t e db y h p l c - e cs y s t e m 承应 5 x 1 0 4i x l 矿5 x l o 5l x l 0 55 x l 矿i x l o 5 x t o 7i x l o 。75 x l 矿i x l 矿 峰面积 m o l tm o | tm o l lm o l tm o l lm o lm o l lm o l lm o l lm o l l 2 d g 过量 1 0 0 3 5 6 44 9 6 5 5 31 0 2 5 6 36 0 6 1 31 1 4 7 54 6 6 40 6 0 70 3 9 1 0 2 6 3 浓度 5 1 0 4l x l 0 45 x l o 9i x l 0 5 x 1 0 。ol 1 0 1 05 x 1 0 1 l 1 0 1 15 x 1 0 1 2l x l 0 1 2 峰面积 m o l lm o l lm o l lm o l lm o l lm o l lm o l tm o l lm o l l m o l l 8 0 h d g9 5 3 22 0 l l1 0 2 82 0 2 61 0 0 l2 0 1 10 8 4 52 4 6 51 0 3 91 8 8 2 x 1 0 1 0 x l f f 21 0 。2 i o 。3 x l o 。3x 1 0 。4 在e x c e l 中输入以上数据后，由计算机得出其关系方程为：8 - o h d g ( 分子量 2 8 3 2 4 ) ：2 - d g ( 分子量2 6 7 2 4 ) 2 - d g ：y = 1 0 7 x + 1 5 6r 2 = o 9 9 9 9 ， 线性范围为1 0 n m o l 一0 i m m o l 8 一o h d g ：y = 2 0 2 x1 0 8 xr z _ o 9 9 9 9 ， 线性范围为i p m o l l o n m o l y 为峰面积，x 为样品含量，单位m o l l 。 3 2 h p l c e c 系统所测d n a 样品中8 - o h - d g 和2 d g 的峰面积 表4 不同c d c i z 浓度和培养条件下样品中8 - o h d g 和2 - d g 在h p l c e c 系统中的峰面积 t a b l e4t h e s a m p l ep e a k so f8 - o h d ga n d2 - d gi nh p l c - e cu n d e rd i f f e r e n tc d c l 2 c o n c e n t r a t i o n sa n dc u n u r ec o n d i t i o n s 、 实验组12 34 567 89 实验结果、 0 删 垂葡8 删一d g 0 0 2 0 0 0 1 30 0 1 80 0 3 0 0 0 2 20 0 1 6 0 , 0 2 00 0 1 8o 0 1 b 萄糖2 - d g1 9 7 8 8 1 3 0 7 31 7 2 9 52 52 2 1 2 1 7 7 61 8 0 5 2 1 6 2 1 31 8 9 0 11 3 7 5 7 培养比值5 , 5 4 85 3 7 15 7 5 7 5 2 1 35 2 6 9 4 8 8 76 6 8 450 6 5 7 1 2 7 有葡8 - 0 h d g0 0 2 1o0 2 1o0 2 9 0 0 2 50 0 1 70 0 2 6 0 , 0 2 3o 啪o 0 2 2 萄糖2 - d g2 6 6 2 61 0 7 3 4 2 8 9 1 52 1 9 2 1 1 0 8 1 92 4 5 1 32 6 9 4 22 5 8 5 5 ” 培养比值4 1 8 35 8 0 25 3 2 5 5 9 7 84 7 6 35 6 2 8 4 4 艇5 2 65 5 3 2 删 无葡8 - 0 h d g0 0 1 9 0 0 1 50 0 1 6 0 0 1 30 , 0 1 70 0 1 3 0 0 1 30 0 1 40 0 ” 萄糖2 - d g1 9 8 7 61 7 4 9 2 1 2 6 0 91 5 2 4 11 1 1 2 3 1 3 1 0 41 1 7 9 8 3 8 6 1 5 6 ” 培养比值5 , 0 6 14 5 0 86 9 5 6 4 7 6 30 9 5 65 5 3 3 6 3 7 552 5 2 58 4 9 有葡8 - 0 1 4 d g 0 0 1 6 0 0 1 70 0 1 50 0 1 6 0 0 1 80 0 1 1 0 0 1 30 0 1 4o 0 1 5 萄糖2 - d g1 3 6 8 52 2 4 7 6 仃1 1 4 1 6 5 9 91 9 8 2 3 1 7 5 1 71 47 8 8 1 0 7 3 41 4 1 培养比值6 4 0 540 2 14 3 7 65 3 8 1 4 7 6 6 3 3 3 74 7 9 47 啪5 5 7 3 1 0 埘 无葡8 - o h d g0 0 2 60 0 2 5 0 0 1 8 0 0 , 3 2 0 0 2 4 0 , 0 1 30 , 0 3 7 0 0 2 40 _ 0 1 0 萄糖2 一d g1 02 3 41 4 | 0 8 91 27 4 8 1 6 6 1 21 3 9 9 7 9 4 7 61 6 4 5 1 1 2 0 7 27 o 髓 培养比值1 4 5 8 59 8 2 38 1 0 81 0 3 6 4 9 6 6 58 3 4 6 1 22 5 71 1 2 7 6 92 有葡8 - 0 t d 6 0 0 3 50 0 3 1 0 0 5 60 0 2 7 o 坼0 0 3 0 o 0 4 4o 啪o0 8 4 萄糖2 - d g 4 0 31 6 1 4 5 1 9 7 1 81 23 1 41 4 1 8 7 9 8 2 11 7 5 3 4 1 4 嘟1 2 2 害养比值 1 7 5 3 7 1 0 6 2 31 51 3 61 2 2 9 3 1 4 ，5 1 21 8 6 8 1 1 3 7 5 51 & 瞄 2 0 2 8 4 3 3 线粒体所受氧化损伤的水平 为了表征线粒体所受氧化损伤的水平，需要把峰面积值转换为8 - o h d g 和 2 一d g 的量之比。 8 - o h d g l o s g = 1 0 4 y 州g 2 0 2 ( y 2 - d g - 1 5 6 ) 通过此计算公式对表4 中的数据进行转换并分析，即得到表5 的结果。 表5 有葡萄糖和无葡萄耱条件下，氯化镉染毒后酿酒酵母细胞线粒体d n a 中8 伽一d g 1 0 s d g 的比值( n = 9 ) t a b l e5l e v e l so f8 - o h - d g 1 1 0 s d go fm i t o c h o n d r i ad n ai nt h ey e a s te x p o s e dt o c d c l 2u n d e rt h ec o n d i t i o no fg l u c o s e - s u f f i c i e n to rg l u c o s e - f r e el n ：9 ) 染毒浓度 无葡萄糖培养组g l u c o s e f r e e 有葡萄檐培养组g l u c o s e - s u f f i c i e n t c o “。“。a t i o n s 显著性 o fc d c i ：8 - o h d g l o s g 8 - o h d g i o g s i g n i f i c a n c e 0i j m o l l 5 7 6 9 _ _ _ 0 ，7 5 9 5 3 3 3 _ + 0 7 5 7 n s 2r n o l l 5 9 1 7 _ + 1 3 7 7 5 1 1 7 - t - 1 2 3 9 n s 1 0p m o l l 1 0 4 0 7 _ _ _ 2 0 4 4 1 5 4 2 1 3 0 7 3 n s ：p o 0 5 ： ：p o o l 仅依据酵母细胞存活率实验不能确定镉作用的靶目标就是线粒体，因为酵母 细胞存活率实验无法证明酿酒酵母细胞是否死于镉离子所引起的氧化损伤。如果 无法证明这一点就不能把培养条件的差异与酿酒酵母细胞受到损伤的程度联系 起来。 所以通过在h p l c e c 系统中统计酿酒酵母线粒体d n a 受到的氧化损伤程度， 主要包括两个方面的内容，一是在镉染毒后酿酒酵母线粒体d n a 受到的氧化损伤 的程度有没有升高，由此证明镉离子确实诱导了酿酒酵母细胞的氧化损伤；二是 考察在有葡萄糖和无葡萄糖条件下酿酒酵母线粒体d n a 受到的氧化损伤的程度 是否有差异，且这种差异是否与宏观实验中所得到的结果相吻合。 根据本研究所取得的结果，验证了上述两方面的假设。镉确实诱导了酿酒酵 母线粒体d n a 的氧化损伤，且在不同染毒和培养条件f ，氧化损伤程度强，细胞 的存活率就低，两者有着因果的关系。 以上实验结果充分证明了，镉离子在进入细胞质中后，主要的作用目标和作 用方式是攻击线粒体，通过与线粒体上蛋白的结合或是影响线粒体膜内外的钙离 子平衡来损伤线粒体的正常功能。在这种状态下，由于电子传递受阻，电子漏给 氧分子的作用加强，从而产生更多的氧自由基。氧自由基的增多引起包括线粒体 d n a 、蛋白质、膜脂等在内的一系列细胞组成部分的氧化损伤，严重时导致了细 胞的死亡。 讨论 当氯化镉染毒浓度为l o t t m o l l 时，无葡萄糖条件下酿酒酵母线粒体d n a 的 氧化损伤程度显著低于有葡萄糖条件下( p o 0 1 ) 。这是因为无葡萄糖条件下线 粒体代谢水平低，氧气消耗量少，当线粒体受到损伤时产生的氧自由基也就少。 而细胞存活率和所受氧化损伤与代谢水平之间明显的相关性充分证明了线粒体 是镉损伤细胞的关键。根据这一结果，可以做出以下假设：低剂量的镉进入细胞 后首先与细胞质中一些含有巯基的蛋白和多肽发生结合，包括降低细胞抗氧化剂 的活性和置换出一些蛋白中的铁离子，铁离子由于有价态的变化可以把过氧化氢 转化为羟自由基，羟自由基又诱导了细胞脂质和蛋白的过氧化损伤，镉和羟自由 基共同作用使线粒体的正常功能受到损伤，产生大量的氧自由基，镉对细胞的损 伤也因为氧自由基的大量产生而进一步加大。而当氯化镉染毒浓度为2 - t m o l l 时，低浓度的c d 2 + 首先被细胞质中的含巯基蛋白结合了，无法到达线粒体，所以 有葡萄糖和无葡萄糖条件下酿酒酵母线粒体d n a 的氧化损伤程度差别不明显，与 没染毒时的情况也无明显差别。 而当线粒体受到损伤时，一方面会使线粒体产生大量的氧自由基，造成细胞 的氧化损伤：另一方面也可能诱导由线粒体启动的细胞程序性死亡。己知镉能诱 导酿酒酵母细胞的氧化损伤p 8 】，其如何与线粒体发生作用将在接下来讨论。 生物体内，9 0 以上的氧分子在线粒体中被消耗从生物氧化反应的分子过程 看，氧分子作为一种必需物质具有益害两重性。一方面，氧分子作为呼吸链的终端 电子受体参与产生a t p 的氧化磷酸化反应，是维持生命的重要能量代谢过程：另 一方面，氧分子可通过一系列化学反应生成有害的氧自由基，造成细胞损伤并导 致疾病和衰老。然而在呼吸链的底物端，有些物质，如黄素蛋白，非血红素铁蛋 白，醌尤其是半醌发生氧化反应的能障很低，常常直接启动0 2 的单电子还原产生 超氧阴离子自由基( 0 2 ) 。这种在电子传递给末端氧化酶之前漏出呼吸链与氧反 应生成超氧自由基的过程是线粒体生成有害活性氧的源头。因此，线粒体消耗氧 一方面用于制造a t p ，供机体的能量需求，另一方面也会生成活性氧自由基损伤 线粒体自身。实验证明线粒体是细胞中产生活性氧的一个重要部位。c h a n c e 等1 3 9 j 证明在正常生理情况下约有2 的氧消耗于线粒体活性氧的产生。 在线粒体的正常情况下也会有少量的氧分子转化为氧自由基，而这些自由基 会与氢或氮等结合形成一些高活性分子，对细胞器和生物大分子产生损伤。但是 生命的进化使细胞发展了有效的抗氧化防御机制。各种抗氧化酶是一个最重要的 防御体系，如广泛分布的超氧化物歧化酶和过氧化物酶在细胞质中和线粒体内基 质中起着重要的防御作用嘲，这中间存在着一个氧化与抗氧化的平衡。活性氧 的生成能刺激抗氧化防御机制增高活性以对抗活性氧的伤害，但是活性氧一旦生 成过量或是过快，细胞还是会受到损伤，过度损伤的细胞将通过凋亡机制被清除 以保证机体的正常生命活动。 m i nl i 发现镉可以直接损伤从细胞中分离出来的线粒体，阻断呼吸链，导 致线粒体膨胀，质子漏增加并失去线粒体内膜电势 2 7 1 。以上作用会导致氧化磷 酸化作用解偶联，解偶联作用会刺激氧的消耗，导致更多的氧自由基产生。 此外，镉可以通过细胞膜上的锌离子通道进入细胞，这样就减少了细胞中锌 的含量。此外镉还能替换s o d 上的锌离子，降低s o d 清除自由基的能力。这样就 使细胞中所形成的氧化一还原平衡态向氧化损伤的方向倾斜，导致细胞线粒体膜 和蛋白的氧化损伤。 镉能通过与细胞内质网上的钙离子通道结合，阻止钙离子的回收。细胞质中 钙离子增多，与钙调蛋白结合会启动蛋白酶活性，使关键的线粒体蛋白水解，影 响线粒体的正常功能。 线粒体还有另一个重要的功能就是启动细胞的程序性死亡，y u n g l u e ns h i h 通过实验证明镉能诱导细胞的程序性死亡【5 3 1 。下面讨论这一过程有是如何发生 的，镉与线粒体有什么样的作用方式。 线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞 表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。镉能诱导 质子漏的开启，使线粒体膜电位降低，然后是线粒体的解联，呼吸链产生大量活 性氧，氧化线粒体内膜上的心磷脂。实验证明，用解偶联剂m c i c c p 会导致淋巴细 胞凋亡，而如果能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。 3 1 镉通过线粒体膜上的钙离子通道进入线粒体。在线粒体膜上p t p 是动态的由 多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道，被认为是 细胞生死开关，是由电位依赖性阴离子通道( v d a c ) ，即孔蛋白( p o r i n ) 、腺苷酸移 位酶( a d e n i n en u c l e o t i d et r a n s l o c a s e ，a n t ) 以及亲环素d ( c y p d ) 复合物在内 外膜交接处构成的一种复合结构 4 3 1 。每个a n t 单体包括4 个半胱氨基，通过与 巯基和高结合性，进入线粒体的镉通过修饰a n t 上的巯基基团使p t p 打开并释放 细胞色素c 到细胞质。细胞色素c 通常位于线粒体内膜和外膜之问，其释放到细 胞质诱导了细胞程序性死亡【2 7 1 。此外p t p 通道的打开被认为是线粒体跨膜电位 的耗散的主要因素，凡是能够专一作用于线粒体诱导p t 孔道生成的物质，例如苯 并二嗪受体的配基原卟啉i x 等都能引起细胞凋亡j 。 v d a c 位于线粒体外膜中，为非专一性孔蛋白，其运输作用由专一性的反向转 运载体一a n t 来调节【】。a n t 是甲状腺素的专一受体，单独存在时其对c a 2 + 非常敏 感删。a n t 和b a x 能与人工脂双层相互作用共同形成复合通道，其电生理学特性 与a n t 或b a x 单独形成的通道大不相同。b c l 2 与a n t 相互作用而阻止其形成通 道b c l 2 也能阻止a n t 和b a x 问的协同作用。镉引起细胞质中c a 2 + 浓度上升，使 v d a c 通道打开，放出细胞色素c 。细胞色素c 具有双重功能，除参与电子传递外， 在细胞凋亡的启动中，很可能是作为一个凋亡起始因子，也起着重要作用。在线粒 体损伤后，细胞色素c 作为胁迫传感器被释放到胞质中，从而引发细胞执行凋亡 程序 4 7 l 。 线粒体上的肌酸激酶( c r e a t i n ek i n a s e ，c k ) 为立方形八聚体，呈平行于膜 的堆砌状，可通过不断的磷酸化与去磷酸化途径来行使其功能。中间有孔道与内、 外膜相结合，横连形成与孔蛋白相偶联的通道，可将磷酸化的肌酸激酶运到细胞 质中。线粒体上的孔蛋白通过肌酸激酶八聚体与a n t 发生相互作用来调控孔道的 开关。镉诱导产生的过氧化物自由基能通过破坏肌酸激酶而使孔道失控1 4 6 j 。 a i f 位于线粒体膜间间隙，在c a 2 + 、过氧化氢等的作用下，线粒体p t p 孔径 变大，释放出a i f ，也能诱导细胞色素c 和胱冬肽酶9 、胱冬肽酶2 的释放。但 a i f 一旦从线粒体中被释放出来，获能后可直接进入细胞核内，独立地将d n a 断 裂为6 0 k b 左右的片段，引起染色质凝缩和d n a 的大规模断片化。膜间隙中的a i f 还可通过自身放大回路来影响线粒体膜的通透性，使其释放出更多的a i f ，这些 a i f 再去作用于其他线粒体，进而破坏细胞内线粒体正常功能【4 2 l 。镉既可以提高 细胞质中c a 2 + 浓度，又可以诱导过氧化氢的生成，因此通过a i f 的作用也可以诱 导细胞程序性死亡。 镉作用后会降低肝脏线粒体中谷胱甘肽( g s h ) 的水平，其降低的水平大致 在1 9 和2 5 之间。相向水平下肾脏谷胱甘肽降低的水平在1 8 到2 3 之间。谷胱 甘肽的减少导致g s h g s s i i 比例的降低，自由基水平因此而升高【柏】。同时被镉离 子置换出来的铁离子催化过氧化氢转化为反应活性更高的羟自由基，羟自由基能 氧化线粒体膜蛋白和膜脂，损伤线粒体膜的透性，内膜钙离子的释放等。可以导 致线粒体膨大，线粒体内膜非特异性孔道产生，细胞色素c 从内膜脱落并流失到 胞质中，b a x 表达，c a s p a s e 活化等现象，这些都是启动细胞凋亡的因素具体过程 是当r o s 水平上升到一定高度后，膜电势降低，线粒体内膜将出现p t p ，使线粒体 跨膜电位降低。由于孑l 道对小于i 5 k d 的大分子均可通过，h 2 0 及小分子将到达 基质，导致基质膨胀而使线粒体内膜嵴被拉直，外膜破裂。如果这种线粒体数量 增加，在胞质中释放出的可溶性蛋白浓度达到一定阈值，就会启动核凋亡的产生 4 9 1 。有报道指出p t p 与电控离子通( v d a c ) 相关，其开放是凋亡的早期事件 s o 引】。 细胞在镉染毒后a t p 的量急剧减少，这会降低一些耗能的细胞损伤修复系统 的活性，细胞损伤积累到一定的程度就会诱导细胞的程序性死亡。 由于细胞接触镉时，镉先要与细胞膜和细胞质发生作用，而不是单独的与线 粒体作用，因此，虽然线粒体在镉的毒性作用中起着关键的作用，但具体的作用 方式可能是多途径的，前面所述的多种作用同时发生，呈现一种网状结构。如果 镉单独作用于线粒体，则可能是以下这种方式：首先，镉与线粒体上膜特异蛋白 的巯基结合，刺激线粒体对钙离子的吸收，接着p t p 通道打开，线粒体膜电势降 低，氧化一磷酸化解偶联，a t p 水平降低，呼吸链被抑制，氧自由基大量产生， 线粒体膜在氧化损伤下崩溃 s 4 l 。 结论 本实验通过控制细胞中线粒体的代谢状态把线粒体，氧自由基和镉的细胞毒 性联系了起来，研究后得到了以下结论。 一、镉对细胞的作用有一个阀值，细胞的拮抗机制能抵消一部分镉的毒性， 镉的剂量在阀值以下对细胞影响不大。当氯化镉染毒浓度为2 山n o l l 时，线粒体 d n a 尽管更容易受到氧自由基的损伤，但其受氧化损伤的程度与没有镉染毒时的 情况并无明显差异。 二、氯化镉染毒剂量较低但高于阀值时，受损的线粒体产生大量的氧自由基， 导致细胞器和生物大分子的氧化损伤以及整个细胞的死亡。因为在氯化镉染毒浓 度为l o o l l 时，酿酒酵母细胞的死亡率与其线粒体d n a 的氧化损伤程度直接 相关。 三、镉主要通过攻击细胞线粒体造成细胞的损伤，因为当线粒体代谢水平较 低时，酿酒酵母细胞的死亡率与线粒体d n a 的氧化损伤程度都明显降低，表明镉 在这种情况下对细胞的毒性的降低，充分反映了线粒体在镉毒性机理中的核心作 用。 有关低剂量镉与线粒体方面的研究已有不少报道，但镉与线粒体的相互作用 关系和途径还有待进一步探究。 参考文献 1 段昌群。环境生物学。科学出版社，2 0 0 4 2 惠秀鹃。环境毒理学。化学工业出版社，2 0 0 3 3o b a t ah u m e b a y a s h im e f f e c t so fc a d m i u mo nm i n e r a ln u t r i e n tc o n c e n t r a t i o n s i np l a n t sd i f f e r i n gi nt o l e r a n c ef o rc a d m i u m j o u r n a lo fp l a n tn u t r i t i o n ，1 9 9 7 ， 2 0 ：9 7 - - 1 0 5 4 赵中秋，朱永官，蔡运龙。镉在土壤一植物系统中的迁移转化及其影响因素。生态环境， 2 0 0 5 1 4 ( 2 ) ：2 8 2 - 2 8 6 5赖宝春。火余县污灌区镉污染对人体健康影响调查。环境与开发，1 9 9 5 。1 0 ( 4 ) ：8 - 9 6p r a s a dm n v c a d m i u mt o x i c i t ya n dt o l e r a n c ei nv a s c u l a rp l a n t s e n v i r e x p e r b o t a n y 1 9 9 5 3 5 ( 4 ) ：5 2 5 5 4 5 7黄会一蒋德明，张春兴等。木本植物对土壤中镉的吸收、积累和耐性。中国环境科 学，1 9 8 9 ，9 ( 5 ) ：3 2 3 3 3 0 8t r i v e d isa n de r d e il e f f e c t so fc a d m i u ma n d l e a do nt h ea c c u m u l a t i o no fc a 2 + a n dk + i nw h e a to fl o w a n dh i g hk + s t a t u s p h y s i 0 1 p l a n t 1 9 9 2 ，8 4 ：9 4 一1 0 0 9b a r c e l oja n dp o s c h e n r i e d e rc p l a n tw a t e rr e l a t i o n sa n da sa f f e c t e db yh e a v y m e t a ls t r e s s j p l a n tn u t r 1 9