（外科学专业论文）同种异体主动脉补片移植后干扰素γifnγ表达的变化.pdf

目录 一、摘要 中文论著摘要l 英文论著摘要3 二、英文缩略语5 三、论文 前言0 00 6 日u 舌6 材料与方法6 结果9 讨论1 6 结论1 9 四、本研究创新性的自我评价2 0 五、参考文献2 1 六、附录 综述2 5 致谢3 4 个人简介3 5 中文论著摘要 同种异体主动脉补片移植后干扰素丫 ( i f n 丫) 表达的变化 目的 因同种异体血管移植免疫排斥反应较异种血管弱，与人工材料相比更符合生理 特点，而且具有抗感染效果好、勿需抗凝等优点，在临床上有较高的实用价值。但 同种异体血管移植后会引起宿主机体的免疫排斥反应，造成内膜增生、动脉粥样 硬化、纤维化、钙化等，其最终结果造成移植物狭窄和闭塞，这是同种异体血管移 植成功的一大障碍。已知干扰素y 是体内重要的免疫调节因子，主要通过参与辅 助性t 淋巴细胞( t h 细胞) 向n 1 型分化来调节免疫应答。有研究显示，干扰素吖 在排斥反应中可能发挥重要的作用。本实验通过进行不同种系间大鼠主动脉血管 补片移植建立简化的排斥反应模型，来研究同种异体血管移植后免疫排异反应对 血管移植物的影响及移植后干扰素吖( i f n - 7 ) 表达的变化；同时研究免疫抑制剂 对干扰素吖的影响。 材料与方法 制作动物模型，将深低温保存的供体s d 大鼠的主动脉补片异位植入受体 w i s t a r 大鼠的腹主动脉，设立移植非干预组、移植干预( c s a ) 组、对照组。在移 植后3 、7 、1 4 、2 1 天取出血管移植物，常规甲醛固定，石蜡包埋，待切片行h e 染色，光镜下观察血管移植物的病理改变，并测定其增厚内膜与中层比值；采用 免疫组织化学的方法检测移植后干扰素吖( i f n q ) 表达的变化。 挂甲 二日7 i 弋 移植非干预组、移植干预组移植1 周后内膜均增厚，移植非干预组较移植干 预组明显，二者之间差异显著( p o 0 5 ) ，且二者与对照组间均有显著性差异 ( p o 0 5 ) 。主动脉补片移植1 周后，干扰素吖的表达情况为移植非干预组， 移植干预组及对照组依次减弱。 结论 1 、排斥反应发生后，干扰素- 丫在血管移植物的表达升高。 2 、环孢霉素a 可降低大鼠同种异体主动脉补片移植后干扰素吖的表达。 关键词 同种异体血管移植免疫排斥反应干扰素一y 2 英文论著摘要 t h e e x p r e s s i o no fi n t e r f e r o n 一丫a f t e r a l l o g e n i ca o r t i cp a t c ht r a n s p l a n t a t i o n o b j e c t i v e t h ei m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o na f t e ra l l o g e n l cv a s o t r a n s p l a n t i o ni sp o o r e rt h a n h e t e r o t o p i ct r a n s p l a n t i o n a l l o g e n i c v e s s e l sh a v et h e p r o p e r t y o fp h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i sc o m p a r e 谢t l la r t i f i c i a lm a t e r i a l ，i na d d i t i o n ，t h e yh a v et h eg o o de f f e c t so f a n t i i n f e c t i o u sa n dt h e yd on o tu s et h ea n t i c o a g u l a r ，a n ds of o r t l l s o ，t 1 1 e yh a v em o r e u s e f u lo np r a c t i c a lv a l u ei nt h ec l i n i c a l b u ti tm a yc a u s et h ei m m u n o l o g i c a lr e je c t i o n a f t e ra f t e ra l l o g e n i cv a s o t r a n s p l a n t i o n ，s u c ha sn e o i n t i m a l 、a t h e r o s e l e r o s i s 、f i b r o s i sa n d c a l c i f y a sac o n s e q u e n c e ，t h er e s u l ti s t h a tt h eg r a f t sb e c o m en a r r o wa n do c c l u s i v e a s w ea l lk n o w n , i n t e r f e r o n - ti sai m p o r t a n tf a c t o ri ni m m u n o r e g u l a t i o nt ot h eb o d y i t r e g u l a t ei m m u n er e s p o n s e ，m a i n l yp a r t i c i p a t i n gi nt r a n s f o r m a t i o nf r o mt hc e l l t ot h l c e l l s o m es t u d i e sr e v e a l e dt h a ti n t e r f e r o n - ) , m a yp l a yam a i nr o l ei ni m m u n o l o g i c a l r e j e c t i o n t os t u d yt h ei n f l u e n s eo fv a s o t r a n s p l a t i o n sa n dt h ee x p r e s s i o no fi n t e r f e r o n 吖 c a u s e db yi m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o na f t e ra l l o g i n i cv a s o t r a n s p l a t i o n ，r a tm o d e lo f c r y o p r e s e r v e da o r t i cp a t c hh o m o g r a f lh e t e r o t o p i ct r a n s p l a n t a t i o nw a se s t a b l i s h e d ，a tt h e s a m et i m e ，t os t u d yt h ee f f e c to fi m m u n o s u p p r e s s i v et r e a t m e n to nt h ee x p r e s s i o no f i n t e r f e r o n - t m a t e r i a l sa n dm e t h o d s i nt h i s s t u d y , l i q u i dn i t r o g e nc r y o p r e s e r v a t i o n m e t h o d w a s a d o r e d i nt h e l o n g - t e r ms t o r a g eo ft h ea o r t i cp a t c hh o m o g r a f l t h ea n i m a lm o d e l so fa o r t i cp a t c h h o m o g r a rt r a n s p l a n t a t i o nw e r ee s t a b l i s h e db yh e t e r o t o p i ci n s e r t i o no fa o r t i co fs d r a t s i n t oa b d o m i n a la o r t a l ，o fw i s t a rr a t s i m p l a n t a t i o no fh o m o g r a f l ，o b j e c t sw e r e c l a s s i f i e dr a n d o m l yi n t oi n t e r v e n t i o ng r o u p 、i m m u n o l o g i c a lc o m p a r e dg r o u pa n de m p t y c o m p a r e dg r o u p s p e c i m e n sw e r ei m m e d i a t e l yf i x e db yf o r m a l i na n di m b e d d e db y p a r a f f i na ss o o na se x c i s i o nb yt h r e ed a y s ，s e v e nd a y s ，f o u r t e e nd a y sa n dt w e n t y o n e d a y sa f t e ri m p l a n t a t i o n a f t e rt h a t ，w eu s et h em e t h o do fh e - c o l o u r a t i o nt oc o l o u rt h e s p e c i m e n s ，a n dt h e no b s e r v e t h ep a t h o l o g i c a lc h a n g e so ft h e v a s o t r a n s p l a t i o n a n d m e s u r et h er a t i oo fi n n e rl a y e rt h i c k n e s st om e d i al a y e rt h i c k n e s so ft h et r a n s p l a n t e d v e s s e l s i m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o d sw e r eu s e dt od e t e c ti n t e r f e r o n - 丫e x p r e s s i o ni n g r a f t e db l o o dv e s s e l s r e s u l t s i n t e r v e n t i o ng r o u pa n di m m u n o l o g i c a lc o m p a r e dg r o u pw e r ea l lt h i c k e n di nt h e i n n e rl a y e ro ft h et r a n s p l a n t e dv e s s e l sb y7 d a y s ；i ni n t e r v e n t i o ng r o u p ，t h ec h a n g e sw a s g r e a t e rt h a ni nt h ei m m u n o l o g i c a lc o m p a r e dg r o u p ( p 0 0 5 ) ，a n dt h e r ew a ss t a t i s t i c s i g n i f i c a n c e ( p 0 0 5 ) t h ee x p r e s s i o no fi n t e r f e r o n 吖w a st h a tt h ep o s i t i v ee x p r e s s i o n w a sd e c r e a s e do n eb yo n e c o n c l u s i o n 1 t h e e x p r e s s i o no fi n t e r f e r o n - y w a sh i g hi n t h e v a s o t r a n s p l a t i o n s a f t e r i m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o n 2 t h et r e a t m e n to fc s ac a ns u p p r e s s i v et h ee x p r e s s i o no fi n t e r f e r o n - to l l i m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o n k e y w o r d s a l l o g e nv a s o t r a n s p l a n t a t i o ni m m u n o l o g i c a lr e j e c t i o ni n t e r f e r o n - t 4 英文缩略语 5 论文 同种异体主动脉补片移植后干扰素吖 ( i f n 丫) 表达的变化 刖吾 近2 0 年来，血管移植在治疗血管源性疾病及器官移植的循环重建中发挥着至 关重要的作用，临床上对血管替代物的需求越来越多【1 1 ，按照来源这些血管替代 物可分为了3 类：自体血管，人造血管和同种异体血管。利用自体血管无疑是最 佳的选择，其不存在排异问题，且可随身体的成长而生长，如冠状动脉旁路移植 术中应用的自体大隐静脉、胸廓内动脉、胃网膜右动脉等，但这些血管的直径通 常不超过6 m m 2 ；而人造血管工艺复杂、价格昂贵，其在末稍血管重建手术中的 结果不佳【3 】。同种异体血管，在理论上具有结构相同、取材方便、管径匹配等优 点，可随器官供体大量获取。随着组织保存技术的进步，血管库的不断完善，近 2 0 年以来，人们对异体血管的使用逐渐增多h 5 】 应用同种异体血管在心脏外科方面对复杂先天性心脏病具有重要意义。近年 来，同种血管管道以及带瓣血管补片甚至异种带瓣补片( 牛心包带瓣补片等) 在临 床上的应用越来越广泛，它们具有人工血管材料无可比拟的优势。但其远期效果仍 受到血管钙化、中层变性坏死，应力减低等影响【们。为研究血管移植后干扰素吖 表达的情况，我们通过进行不同种系间大鼠主动脉血管补片移植建立简化的排斥 反应模型，来了解同种异体血管移植后的病理变化。 材料与方法 。 一、实验动物 供体：s d 大鼠2 0 只，雌雄不限，体重3 0 0 4 0 0 9 。( 由中国医科大学动物实验 科提供) 受体：w i s t a r 大鼠8 0 只，雌雄不限，体重3 0 0 4 0 0 9 。( 由中国医科大学动物实 验科提供) 6 二、实验材料与试剂 p m i 1 6 4 0 培养基( 赛默飞世尔生物化学制品有限公司) ；胎牛血清( 天津市 灏洋生物制品科技有限责任公司) ；二甲基亚枫( a r n r e s c o ) ；青霉素( 哈药集团制 药总厂) ；链霉素( 石家庄峰华医药化工科技有限公司) ；两性霉素b ( 华北制药 集团有限责任公司) ；1 0 0 的显微外科缝线( 宁波医用缝针有限公司) ；环孢霉素 a ( s w i t z e r l a n d ) ；奥林巴斯b c 6 0 光学显微镜( 台湾) ；s h h w 2 1c r 6 0 0 电热恒温水 浴箱( 北京长安科学仪器厂) ；f o r m a 7 2 5 型深低温冷冻冰箱( f o r m a s c i e n t i f i c ，i n cu s a ) ；b i o f u g e 离心机；b m v 型石蜡包埋机；a a 2 5 0 电子分析天 平；s h a n d o n t h e r m o 型全自动切片机( 英国) ；液氮罐( 中国医科大学附属盛京 医院实验动物部) ；多功手术显微镜( 中国医科大学附属盛京医院实验动物部) ；显 微手术器械( 中国医科大学附属盛京医院实验动物部) ；1 0 水合氯醛( 中国医科 大学附属盛京医院药剂科) ；蒸馏水( 中国医科大学附属盛京医院检验科) ；兔抗 大鼠干扰素吖免疫组化试剂盒( 北京宝信生物技术有限公司) 。 三、实验分组及给药 4 8 只w i s t a r 大鼠随机分为移植非干预组，移植干预组，对照组：移植非干预组 ( 1 6 只) ：液氮低温保存的s d 大鼠主动脉补片移植组，术后不给予免疫抵制剂。 移植干预组( 1 6 只) ：移植液氮低温保存的s d 大鼠主动脉补片后给予免疫抑制 剂环孢霉素a ，剂量为5 m g k g d a y 。对照组( 1 6 只) ：假移植组，将腹主动脉纵行 切开后直接吻合。 四、构建大鼠同种异体主动脉补片移植模型 ( 一) 灭菌液及冷冻液的配制 灭菌液的配制：r p m i 1 6 4 0 培养液、胎牛血清( 1 0 ) 、青霉素5 0 u m l 、链霉 素5 0 u m l 、两性霉素b 2 5 m g m l 。冷冻液的配n - 冷冻液i ，r p m i 1 6 4 0 培养液、 胎牛血清( 1 0 ) 、二甲基亚枫( 2 5 ) ，冷冻液i i ，r p m i 1 6 4 0 培养液、胎牛血清( 1 0 ) 、 二甲基亚枫( 5 ) ，冷冻液i i i ，r p m i 1 6 4 0 培养液、胎牛血清( 1 0 ) 、二甲基亚枫( 1 0 ) 。 ( 二) 动物模型的手术方法 7 1 、供体手术及处理 s d 大鼠经1 0 水合氯醛( 2 m l k g ) 腹腔注射麻醉后，纵向切开胸部，左心室 注入肝素( 1 m g k g ) ，待肝素在体内循环1 分钟后将心脏连同升主动脉和胸主动脉 同时取出，置4 c 含肝素的生理盐水中冲洗，并剪除心脏。然后在4 c 含肝素生理 盐水的无菌培养皿中，分离修剪，剥离动脉外结缔组织。再将标本置于灭菌保存 液中，4 c 条件下孵育2 4 h 。液氮深低温保存方法采用k i r k l i n 和r a r r a t t b o y e s 8 1 的 方法，将灭菌的主动脉管道置于冷冻液i 中4 c 条件下平衡1 5 m i n ，再置于冷冻液 中4 平衡1 5 m i n ，最后将主动脉管道制备成6 m m 长的小段，连同冷冻液装 入双层塑料袋中封口。用梯度降温仪降至4 c ，然后快速降至4 ，之后缓慢降温 ( 1 m i n ) 至4 0 ，达到4 0 后将保存物置于液氮中( 1 9 6 ) 长期保存。标 本使用之前将冷冻保存的同种异体血管从液氮中取出，置于4 0 恒温水浴中迅速 解冻【9 】，解冻后将标本依次在、i i 、i 冷冻液中平衡1 5 m i n ，将d m s o 置换出， 然后用生理盐水反复冲洗备用。 2 、受体手术 将受体w i s t a r 大鼠用1 0 水合氯醛( 2 m l k g ) 腹腔注射麻醉，然后将大鼠四 肢固定在实验台上，腹腔注入肝素( 1 m g k g ) ，在无菌条件下纵切腹部，显露腹 主动脉，于显微镜下分离出腹主动脉，在肾动脉分支以下和左右髂总动脉分支以 上确定移植点。移植点近端与远端用血管夹阻断血流，纵行切开腹主动脉，长度约 3 m m 。将经液氮低温保存的s d 大鼠主动脉在手术放大镜下修剪为2 m m x 3 m m 的 血管补片，在手术放大镜下以连续缝合的方式将主动脉补片与受体大鼠切开的腹 主动脉进行吻合，吻合线为1 0 0 的显微外科缝线。对照组将腹主动脉纵行切开3 m m 后直接吻合。术后均给予烤灯照射复温1 3 h 。移植干预组在移植后第一天开始腹 腔注射环孢霉素a ( 5 m g k g d a y ) ，术后继续饲养大鼠，存活大鼠按计划处死。 ( 三) 取材 每组分别于术后3 天、7 天、1 4 天、2 1 天取材，每组每次处死4 只大鼠。 在取出移植物之前，实验大鼠用1 0 水合氯醛液2 m l k g 麻醉，在无菌条件下 开腹取出大鼠腹主动脉，于盛有无菌肝素盐水的器皿中充分冲洗，然后在显微镜 8 下进行分离取出移植物。再经生理盐水冲洗后，置入4 多聚甲醛固定6 - 2 4 h ，常 规脱水，石蜡包埋，待h e 染色和免疫组化检测。 本实验动物模型采用同种主动脉补片移植方法，移植物直接与血液成分接触， 并掺入了血液动力学因素，基本符合同种血管移植的实际情况。 五、观察指标 l 、标本病理检查，比较各组移植物内膜中层比值变化 移植物制成石蜡切片，常规h e 染色，在带有标尺的2 0 0 倍光镜下随机测量 血管壁5 个点的内膜中层厚度比值，取其平均值【i o 】。 2 、免疫组织化学检测 细胞核呈棕色或棕黄色的为阳性表达，计算出阳性细胞百分比。其方法为： 在电子显微镜下将切片放大4 0 0 倍，每张随机选择1 0 个视野，分别计数第个视野中 阳性细胞数( p ) 和观察细胞总数( a ) 的比值，即阳性细胞百分率( p a ，) ， 求其平均值【1 1 1 。 六、统计分析 采用s p s s l 3 0 统计软件进行数据处理，计量资料以均数4 - 标准差( x s ) 表 示，组问比较采用重复测量数据的方差分析，两两比较用多重比较t 检验，p 0 0 5 为差异有统计学意义。 结果 一、组织学检查结果 标本病理结果显示：移植非干预组移植3 天后血管内膜可见炎性细胞附着，7 天后内膜开始增厚，1 4 天后内膜明显增厚，并逐渐加重，2 1 天后内膜显著增厚，内 膜中主要为短梭形平滑肌细胞和部分炎性细胞，其间为胶原纤维和细胞外基质。与 此同时，部分移植血管补片在内膜增厚的基础上同时还有附壁血栓形成，导致血 管管腔变小狭窄。移植物中层细胞则表现为细胞坏死、部分弹性纤维玻璃样变性、 断裂等。对照组试验后各时间点内膜没有明显变化。移植非干预组与对照组之间 差异显著( p o 0 5 ) 。移植干预组移植后7 天血管内膜亦开始增厚，并逐渐加重， 9 与对照组比较有显著差异( p 如0 5 ) 。移植非干预组、移植干预组两组移植7 天 后内膜均增厚，但移植非干预组较移植干预组严重，移植非干预组与移植干预组 之间差异显著( 阳o 0 5 ) ，见表l 及图1 图4 。 表l ，移植血管补片内膜与中层厚度比值 与对照组比较p o 0 5撑与移植干预组比较p o 0 5 图l ，血管补片移植3 天后内膜增厚病理改变( x 2 0 0 ) ( 左：移植非干预组中：移植干预组右：对照组) 图2 ，血管补片移植7 天后内膜增厚病理改变( 2 0 0 ) ( 左：移植非干预组中：移植干预组右：对照组) 1 0 张磐、蕊惑 嚣刘篱 麓一沁“ 蕊一巍爹 图3 ，血管补片移植1 4 天后内膜增厚病理改变( x 2 0 0 ) ( 左：移植非干预组中：移植干预组右：对照组) 图4 ，血管补片移植2 l 天后内膜增厚病理改变( x 2 0 0 ) ( 左：移植非干预组中：移植干预组右：对照组) 二、干扰素一y 表达的免疫组织化学分析 干扰素吖免疫组化结果显示，主动脉补片移植3 天后，移植非干预组呈阳性表 达，与同时段对照组相比，阳性细胞数的百分率明显增高，与移植干预组及对照 组之间有明显差异( p o 0 5 ) ，对照组干扰素吖在各时间点表达不明显。此外， 移植后3 天，移植干预组阳性细胞数的百分率增高，在各时间点与对照组之间有 显著差异( p ，0 0 5 ) 。见表2 及图5 图1 6 。 表2 ，术后不同时间点干扰素吖表达的阳性细胞数的百分率( ) 。 与对照组比较p o 0 5i ；i 与移植干预组比较p o 0 5 图5 ，移植非干预组血管补片移植3 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 图6 ，移植非干预组血管补片移植7 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 图7 ，移植非干预组血管补片移植1 4 天后干扰素吖表达情况( 4 0 0 ) 1 2 图8 ，移植非干预组血管补片移植2 l 天后干扰素一y 表达情况( x 4 0 0 ) 图9 ，移植干预组血管补片移植3 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 图1 0 ，移植干预组血管补片移植7 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 1 3 图1 l ，移植干预组血管补片移植1 4 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 图1 2 ，移植干预组血管补片移植2 l 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 图1 3 ，对照组血管补片移植3 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 1 4 p 够歹 图1 4 ，对照组血管补片移植7 天后干扰素吖表达情况( x 4 0 0 ) 挚 瑚 、”一； 1 5 讨论 一、关于同种异体血管的临床应用及保存的探讨 同种异体血管现已广泛应用于临床，因其排斥反应较异种血管弱，与人工血 管相比更符合生理特点，而且具有抗感染效果好、勿需终身抗凝等优点【1 1 】，受到 临床医生及患者的亲赖。应用同种异体血管可以解决各种血管损伤、动脉瘤、动 脉粥样硬化、多种复杂性心脏病及建立血液透析通路等问题，有着很大的临床意义 【1 3 1 。随着现代免疫学、冷冻生物学、分子生物学的发展，冷冻保护剂、免疫抑制剂 的应用以及注重移植结构及功能的完整，冷冻保存同种异体血管无论是基础研究 还是临床实践都获得了相当的经验。 在临床上，一般同种异体血管应来自于成年脑死亡者，年龄 4 0 岁，无动脉粥样 硬化等心血管疾病，无肿瘤及传染疾病的新鲜供体。所有操作均应在无菌条件下进 行。应在死亡后4 - - 6h 之内完成取材。从供体获取血管应严格遵循无创伤技术。 获取血管前1 5 - 3 0m i n 供体给予平滑肌松弛剂( 罂粟碱) 及抗凝药物( 肝素) ，以防止 血管痉挛和血栓形成，保持制备液和室温3 7 。c 、灌注压 1 0 0m m h g 1 4 1 。理论上以 3 7 c 自身含罂粟碱肝素化血液低压灌注可最好保持血管的生物活性，但通常从供 体获取血液是困难的。目前常采用3 7 的生物培养液。 随着现代心血管外科的发展，很多复杂的先天性心脏病手术需应用同种异体 血管，深低温保存技术是血管保存的有效方法【1 5 】。同种血管的保存与热缺血时间、 保护液的构成、冷冻速率、复温方法等关系密切。 1 、热缺血时间是指供体失去血液供应到在o 4 保存之间的时间，一般不超 过4h 。热缺血时间是决定供体活性的重要因素。热缺血时间越短，越有利于保持供 体的活性。随热缺血时间延长，血管损伤加重，内皮细胞坏死，脱落增多。即使4 c 保 存超过2 4h ，血管的组织力学较新鲜血管也明显下降【l6 1 。 2 、目前对血管灭菌主要有两种办法：一种是抗生素法【1 7 1 ，将血管置于含一定浓 度抗生素的营养液中，4 c 冰箱中过渡后置液氮中冻存以达到清洁目的。另一种是 无菌操作法，即在整个保存过程中，严格无菌操作达到清洁目的。冷冻保存能有效地 维持血管组织的基本结构和功能，但是冷冻过程中，细胞周围冰晶形成，大量离子析 1 6 出，细胞外的高渗状态造成细胞的脱水死亡。目前常用的方法是在营养液中加入一 定浓度的冷冻保护剂，此类物质通过与细胞内水分结合，减轻细胞内脱水。目前常用 的冷冻保护剂是甘油和二甲基亚砜( d m s o ) 。d m s o 浓度对组织活性及组织的热 应力影响较明显【1 引。目前认为浓度为1 5 的d m s o 对血管保护作用最佳，浓度低于 最佳浓度，保护作用不充分；而浓度过高也会使毒性作用增强，破坏了血管的结构和 功能。浓度为1 5 时保存的血管组织平滑肌细胞内可见少量空泡，但胶原纤维排列 基本正常【1 9 1 ，大部分内皮细胞保存完好，浓度为1 0 或3 0 时血管内皮细胞、平滑肌 细胞胞内结构及内皮细胞完整性均破坏明显。但d m s o 有利于钠离子进入组织细 胞内对细胞产生损害，在溶液中用维生素b 复合体取代钠盐可阻止d m s o 发挥其毒 性作用，平滑肌细胞的功能损害可从5 6 下降至1 3 ，内皮细胞损伤从4 0 下降至 1 8 t 2 0 1 。 3 、在冷冻保存过程中，水的冻结特征是影响保存效果的最重要因素。细胞周 围冰晶形成，大量离子析出，细胞外的高渗状态造成细胞的脱水死亡。血管内的水分 相变发生在0 2 0 之间。合理控制降温速度可以减轻血管的损伤。但是对于 合理的降温速度却没有统一的标准，血管组织不同，降温速率也不同。以1 0 m i i l 降温保存兔主动脉其机械应力明显高于以3 或5 c 保存的组织。降温速率越快， 复温后血管热膨胀系数越大1 1 5 】。而l e h l e 等川的研究却发现以1 0 c m i n 降温保存 的脐静脉内皮细胞复温后繁殖能力从7 8 士5 降至6 4 士3 ，这些提示不同的血 管组织所需的适当降温速率不同。 4 、组织冷冻保存不同于单细胞，由于细胞成分多样，细胞间质存在，在复温过程 中，使热量交换不均匀，外周组织内冰晶融化可从内部吸收热量，使内部组织再结晶 加重，可造成细胞严重的机械性损伤。另外，低温蛋白质的变性，脂质的丢失，细胞膜 通透性的改变以及细胞膜上小孔的形成，使水分子易通过细胞膜，引起细胞水肿，超 过一定时间或程度时，细胞便会破裂。不同的复温速率对血管组织均有破坏，复温速 率也应根据组织不同而不同。3 7 或4 0 恒温水浴箱快速复温法复温速率不均匀， 细胞再结晶重，高水负荷状态持续时间长，细胞损害重。在复温过程中控制复温速率， 采用4 c m i n 的复温速率对主动脉瓣活性影响最小【2 2 】。在保存脐静脉过程中发现以 1 2 c m i n 降温及1 5 m i n 升温时对复温后脐静脉收缩性能影响最小【2 3 】，近年来兴 1 7 起的玻璃化冷冻是血管保存的重大进展。玻璃化法是一种快速冷冻法。活细胞在 冷冻过程中，完全避免冰晶形成产生玻璃化固化的过程。与慢冷冻法相比其优势在 于冷冻过程是在瞬间完成的，通过迅速降温，形成透明的玻璃状固体，黏度很高，但细 胞内无冰晶形成，从而减少了冷冻过程中渗透压和激冷对细胞脂质膜及细胞骨架 结构的损伤，保留细胞内外液体正常的分子和离子分布。 低温保存后的血管在其组织结构、功能方面均取得令人满意的保存效果。低 温保存能保持血管内皮细胞的完整性及较高的繁殖能力【2 4 】。血管的黏弹性物质是 血管得以发挥作用的重要原因【2 5 1 ，低温保存后血管的黏弹性物质含量及热机械应 力均较新鲜血管无明显差另l j t 2 6 1 ，可以保留动脉管壁的功能特点，接近于新鲜血管，能 很好的发挥血管的灌注及缓冲功能【2 7 1 ，对血管活性物质保持着良好的反应性闭。尽 管目前深低温保存同种异体血管在临床应用越来越广泛，但是深低温保存并未改 变供体人组织相溶抗原i ( h l a i ) 的原位表达t 2 9 1 ，远期的退行性变及钙化仍是临 床中面临的一个问题。如何降低移植物的抗原性，提高远期通畅率值得进一步研 究。 二、关于干扰素吖在免疫排斥反应中的探讨 2 0 世纪初，病毒学家发现，当两种病毒感染同一宿主细胞的时候，两种病毒 间普遍存在相互拮抗的现象，于是提出了病毒间存在着干扰的概念。1 9 7 3 年y o n g e r 和s l a v i n 发现来自淋巴细胞培养上清液中存在一种干扰素，但抗原性不同于以往 发现的干扰素，遂命名为i i 型i f n 3 0 】。干扰素吖是由多种细胞因子组成的异源家族， 诱导细胞对病毒感染产生抗性是干扰素家族共有的生物学活性，大多数的干扰素 可归属于三个亚类，即a 、p 和丫干扰素，其中丫干扰素( i f n 丫) 又称免疫干扰素， 与a 、d 亚类的干扰素相比，i f n 吖具有更强的免疫调节功能和抗细胞增殖效应【3 1 。2 1 。 现已证实，干扰素是一类高活性、多功能的诱生蛋白，具有调节机体免疫功 能、抗病毒、抗肿瘤等多种药理【3 3 1 ，是生物制品中基础研究和临床应用最快、最广 泛的细胞激活素此外，有研究证明，i l 1 0 和干扰素吖在一定条件下均可抑制血管平 滑肌细胞的增殖，抑制血管内膜增生p 4 j 。已知，干扰素吖具有较强的免疫调节功 能，已有一些关于器官移植的研究发现干扰素吖及其诱导基因在同种异体器官移 植物急性排斥反应中起了重要作用【3 5 1 ，其在移植物中的表达水平与炎性细胞在移 1 8 植物中的浸润的时相性密切相关，即随着炎症细胞的增多而增高，随着移植物出 现组织坏死、血管炎等病理学改变而降低研究发现，i f n 吖是可通过防止血栓形成、 充血、坏死等病理改变而阻止急性排斥移植物组织损伤的进一步发展【3 6 1 说明 i f n 吖是排斥反应的保护性因素在缺乏i f n 吖和i f n - t r 系统的受体大鼠异基因移 植物中静脉血栓、小血管充血、铸型以及大片细胞坏死明显增加，此时移植物内t 细胞浸润，m h c i 和i i 类分子的表达以及各种i f n - t 诱导产物基因表达降低【3 7 1 另外，大鼠皮肤移植研究显示，与免疫耐受相关的c d 4 + 、c d 2 5 + 的调节性t 细 胞较c d 4 + 、c d 2 5 + 的t 细胞表达更高水平的i f n _ 丫，表明t i f n - t 在调节性t 细胞诱导 的抗原特异性免疫耐受中起了特殊的作用【3 引目前认为，i f n - 丫在排斥反应中的作 用是多方面的，如它可以使巨噬细胞活化、促进t 细胞增殖、诱导促炎细胞因子的 分泌等3 9 1 。近年来的研究生表明，在阻断t 细胞活化通路，延长移植物生存时间 的同时，常伴有i f n 吖表达的降低，然而在i f n y 缺乏的情况下，c d 4 + t 细胞也可通 过间接途径识别抗原，从而介导排斥反应f 矧 结论f耋口匕 l 、排斥反应发生后，干扰素吖在血管移植物的表达升高。 2 、环孢霉素a 可降低大鼠同种异体主动脉补片移植后干扰素吖的表达。 1 9 本研究创新性的自我评价 大鼠主动脉腹腔移植模型已被许多学者应用于动脉硬化发病机制及器官移植 的慢性排斥反应等疾病的研究。但建立传统的大鼠胸主动脉移植模型需要分别进 行上下吻合口的端端吻合，吻合时间长，腹主动脉阻断时间长，对受体大鼠损伤 大，且容易产生吻合口出血和狭窄，限制其广泛应用。我们的动物模型则采用了 血管补片移植的方法，只需一次缝合即可完成补片移植，吻合时间缩短，腹主动 脉阻断时间短，对受体大鼠损伤进一步减小，可提高受体大鼠的存活率。并且主 动脉补片移植物直接与血液成分接触，并掺入了血液动力学因素，基本符合同种 血管移植的实际情况。希望本模型能为医学实验研究提供新的动物模型，为科学 研究服务。 2 0 参考文献 1l e ekw ：l e eds , l e ehh ，e t a 1 i n t e r p o s t i o n v e i n g r a f t i n l i v i n g d o n o rl i v e r t r a n s p l a n t a t i o n t a n s p l a n tp r o c 2 0 0 4 ，3 6 ( 8 ) ：2 2 61 2 2 6 2 2m a s t r e sca ，m u l e tj , p o m a rji l a r g ec a l i b e rc r y o p r e s e r v e da r t e r i a la l l o g r a f t si nv a s c u l a r r e c o n s t r u c t i v eo p e r a t i o n ：e a r l ye x p e r i e n c e a n nt h o r a cs u r g ，2 0 0 5 ，6 0 ( s u p p12 ) ：10 5 - 121 。 3a l b e r sm ，b a t t i s t e l l avm ，r o m i t im ，e ta 1 m e t a - a n a l y s i so fp o l y t r a f l u o r o e t h y l e n eb y p a s sg r a f i s t oi n f r a p o p l i t e a la r t e r i e s jv a s cs u r g , 2 0 0 3 3 7 ( 6 ) ：12 6 3 - 12 6 9 4f a l i n e rpj , i d um m ，v a ng u l i ktm ，e ta 1 s y s t e m a t i cr e v i e wo fp r e s e r v a t i o nm e t h o d sa n d c l i n i c a lo u t c o m eo f i n f r a i n g u i n a lv a s c u l a ra l l o g r a f l s jv a s cs u r g 2 0 0 6 4 4 ：5 1 8 - 5 2 4 5李剑，沈中阳，郑虹移植血管的低温保存技术中国组织工程研究与临床康 复2 0 0 8 ，12 ( 4 0 ) ：7 8 9 2 - 7 8 9 5 6 常青，李守先，徐平等同种异体大鼠主动脉移植后影响移植物钙化的因素分析c h i nj c e l l m o ll m m u n 0 1 2 0 0 6 ，2 2 ( 1 ) ：1 0 6 1 0 9 7 李东玉，张仁福，李新民等大鼠低温保存同种主动脉和肺动脉移植模型中华实验外科杂 志1 9 9 9 ；1 6 ( 1 ) ；9 3 8k i r k l i nj w ，b a r r a t t - b o y e sb g c a r d i a cs u r g e r y ，n e wy o r k , 1 9 8 6 , j o h nw i l e y & s o n s ，19 8 6 ， 3 6 3 3 6 4 9 陈晓慨，朱兵，徐世安等同种异体血管移植后肿瘤坏死因子表达的变化中国组织化学与细 胞化学杂志2 0 0 6 ，15 ( 6 ) ：6 2 3 - 6 2 7 10c l a r kd c a m o p b e l ld n d e g e n e r a t i o no fa o r t i cv a l v ea l l o g r a f t si ny o u n gr e c i p i e n t s jt h o r a c c a r d i o v a s cs u r g1 9 9 3 ；1 0 5 ：9 3 4 - 9 4 2 1 l 裴晓阳，冯建章，徐亚伟等转导c 型钠尿肽基因对血管成形术后血管平滑肌细胞增殖的影 响中国动脉硬化杂志2 0 0 6 ，1 4 ( 3 ) ：2 0 1 2 0 4 12 l a d a g ed ，b r i x i u sk ，s e i n g e nc ，e ta 1 m e s e n c h y m a ls t e mc e l l si n d u c ee n d o t h e l i a la c t i v a t i o n v i ap a r a c i n em e c h a n i s m s 【j 】e n d o t h e l i u m ，2 0 0 7 ，4 ( 2 ) ：5 3 - 6 3 1 3 彭辉，阳富春同种异体血管移植的研究及临床应用微创医学2 0 0 9 ，4 ( 1 ) ：5 1 5 3 14c o s t am a ，s i m o ndi m o l e c u l a rb a s i so fr e s t e n o s i sa n dd r u ge l u t i n gs t e n t s j 】c i r c u l a t i o n ， 2 0 0 5 ，111 ( 17 ) ：2 2 5 7 - 2 2 7 3 2 1 1 5 张文霞，刘典晓，董圣军等同种血管深低温保存研究生进展临床和实验医学杂志2 0 0 9 ，8 ( 8 ) ：1 4 2 1 4 3 16 s t e m p e rb d ，y o g a n a n d a nn ，s t i n e m a n m r ，e ta 1 m e c h a n i c so ff r e s h ，r e f r i g e r a t e d ，a n df r o z e n a r t e r i a lt i s s u e j 】js u r gr e s ，2 0 0 7 ，13 9 ( 2 ) ：2 3 6 2 4 2 17j a s h a r i 心t a b a k um ，v a nh o e c kb ，e ta 1 d e c o n t a m i n a t i o no fh e a r