（植物病理学专业论文）山东沿海岸海洋木生真菌的研究.pdf

莱阳农学院硕士学位论文摘要 山东沿海岸海洋木生真菌的研究 摘要 海洋环境十分独特，包罗了高压、低营养、低温、无光照以及局部高温、高盐等所 谓的生命极限环境。海洋真菌适应了海洋独特的生活环境，必然造就了海洋真菌独特的 代谢途径和遗传背景，其蕴藏的巨大潜力已被人们认识和关注。目前世界已发现海洋真 菌产生的多种独特的生物活性物质。若想获得更多有价值的生物活性物质，研究和发现 海洋真菌是首要任务。 我国对海洋真菌的调查和研究较少。本文对山东沿岸海洋木生真菌的种类、分布及 多样性进行研究，同时对检查到的海洋真菌进行保存，为海洋真菌资源的进一步利用开 发提供依据。 三年研究期问，从威海、荣成、文登、乳山、海阳、青岛、日照近海岸的2 2 个地 点，进行了海洋漂流木、固着木的采集，装入无菌的塑料袋中带回实验室，采用直接检 查法和湿室诱培法进行检查，共检查了6 0 0 余份材料，得到了海洋木生真菌3 3 属、4 4 种( 子囊菌2 6 种，担子菌1 种，半知菌1 7 种) ，其中新种5 个，中国新记录属2 个， 中国新记录种1 2 个，中国已报道种2 3 个，不确定种2 个，3 种首次在海洋环境中报道。 新种：缢缩暗球腔菌p h a e o s p h a e r i ac o n s t r i c t u m 、中华格孢腔菌p l e o s p o r ac h i n e n s i s 、 歧小球腔菌l e p t o j p h a e r i ad i v e r g e n t a 、纵生圆孢壳菌a m y l o c a r p u sl o n g i t u d i n a e 、胡须桨 孢属r e m i s p o r aw h i s k e f l | ，l m 。 中国新报道属： 嗜根霉属r h i z o p h i l a 、螺旋孢霉属h e l i c o r h o i d i o n 。 中国新报道种：围膜透孢黑团壳菌m a s s a r i n av e l a t a s p o r a 、极孢透孢黑团壳菌 m a s s a r i n aa c r o s t i c h i 、卵形短梗蠕孢菌t r i c h o c l a d i u mn y p a e 、褐色少孢圆孔壳菌j u l e l l a a v i c e n n i a e 、褐花冠霉c o r o l l o s p o r af u s c a 、海嗜根霉菌r h i z o p h i l am a r i n a 、茎秆海球菌 h a l o s a r p h e i ac u l m i p e r d a 、纤维状海球菌h a t o s a r p h e i af i b r o s a 、缢缩短梗蠕孢菌 t r i c h o c l a d i u mc o n s t r i c t u m 、刺黑乌霉m e m n o n i e l l ae c h i n a t a 、无鞘暗球腔菌p h a e o s p h a e r i a m o u n c e a e 、尼皮卡拉螺旋孢霉h e l i c o r h o i d i o nn y p i c o l a 。 在海洋环境中首次报道种：坚硬粘束梗霉g r a p h i u mr i g i d u m 、禾生色串孢t o r u l a h e r b a r u m 、尼皮卡拉螺旋孢霉h e l i c o r h o i d i o nn y p i c o l a 。 关键词：山东海岸海洋真菌木生鉴定新种生物多样性 莱阳农学院硕士学位论文摘要 s t u d i e so nt h em a r i n el i g n i c o l o u sf u n g if r o mt h ec o a s to f s h a n d o n g a b s t r a c t m a r i n ee n v i r o n m e n tw a sv e r yu n i q u e ，i n c l u d i n gt h eh i g h p r e s s u r e ，l o w n u t r i t i o n ，l o w t e m p e r a t u r e ， n oi l l u m i n a t i o n ，h i g ht e m p e r a t u r ea n dh i g hs a l i n i t ya tl o c a ls o c a l l e de n v i r o n m e n to fu t m o s tl i f e m a r i n e f u n g ia d a p t e dt h eu n i q u em a r i n ee n v i r o n m e n ta n di n e v i t a b l yh a du n i q u em e t a b o l i cr o u t ea n dg e n e t i c b a c k g r o u n d m a r i n ef u n g iw e r eb e i n ga w a r e do fa n dc o n c e r n e da sab i o l o g yc o n t a i n n i n gv a s tp o t e n t i a l g r a d u a l l ya n dm a n ya c t i v es u b s t a n c e sh a db e e nf o u n df r o mm a r i n ef u n g ii nt h ew o r l dp r e s e n t l y i tw a st h e m o s ti m p o r t a n tm i s s i o nt oi n v e s t i g a t ea n df i n dm a r i n ef u n g ii fw ew a n t e dt og a i nm o r ev a l u a b l ea c t i v e s u b s t a n c e sf r o mm a r i n ef u n g i s t u d i e so nt h em a r i n ef u n g iw e r el i m i t e di nc h i n a t a x o n o m i cs t u d i e so nt h em a r i n el i g n i c o l o u sf u n g i f r o mt h ec o a s to fs h a n d o n g ，b a h a is e aa n dy e l l o ws e ab yp h dj i n j i n gi n2 0 0 2 2 0 0 4 ，3 5g e n e r aa n d4 9 s p e c i e sw e r eo b t a i n e d t h em a i np u r p o s eo ft h ep r e s e n tt h e s i sw a st oi n v e s t i g a t et h es p e c i e s ，d i s t r i b u t i o n a n db i o d i v e r s i t yo f m a r i n ef u n g ii ns h a n d o n gc o a s t ，a n dp r e s e r v e dt h ec u l t u r e si no r d e rt op r o v i d em a t e r i a l s f o rt h ef u r t h e ru s eo f m a r i n ef u n g ir e s o u r c e ss i m u l t a n e i t l y a b o u t6 0 0d r i f l w o o d sa n di n t e r t i d a lw o o d si nt h es e aw e r ec o l l e c t e df r o mw e i h a i ，w e n d a n g , r o n g c h e n g ，r u s h a n ，h a i y a n g ，q i n g d a na n dr i z h a oc o a s t sw h i c hw e r es e l e c t e dt h e2 2s t u d i e ds p o t si nt h e p a s tt h r e ey e a r s t h es p e c i m e n sw e r eb r o u g h tb a c kt ot h el a b o r a t o r yi nt h es t e r i l ep l a s t i cb a g sa n dw e r e e x a m i n e dd i r e c t l yw h i l et h e yw e r es t i l lf r e s ha n dm o i s tu n d e rs t e r e o - m i c r o s c o p eo ri n c u b a t e di nt h em o i s t b o x e s 3 3g e n e r aa n d4 4s p e c i e so fm a r i n el i g n i c o l o u sf u n g if r o ms h a n d o n gc o a s tw e r ei d e n t i f i e dw h i c h b e l o n g sa s c o m y c o t a ( 2 6 ) ，b a s i d i o m y c o t a ( 1 ) a n dm i t o s p o r i cf u n g i ( 17 ) r e s p e c t i v e l ya m o n gt h e m ，5t a x a w e r ei d e n t i f i e da sn e ws p e c i e s ，i2t a x aw e r er e g a r d e da st h en e wr e c o r df o rc h i n a , 3s p e c i e sw e r ef o u n di n s e af o rt h ef i r s tt i m e ，o t h e r sh a db e e nr e p o r t e di nc h i n a ， n e w s p e c i e s ：p h a e o s p h a e r i ac o n s t r i c t u m ，p l e o s p o r ac h i n e n s i s ，l e p t o s p h a e r i ad i v e r g e n t a ， a m y l o c a r p u sl o n g i t u d i n a e ，r e m i s p o r aw h i s k e u m n e w l yr e c o r d e dg e n e r aw e r e ：r h i z o p h i l a ，h e l i c o r h o i d i o n n e w l yr e c o r d e ds p e c i e sw e r e ：m a s s a r i n av e l a t a s p o r a ，m a s s a r i n aa c r o s t i c h i ，t r i c h o e l a d i u mn y p a e j u l e l l aa v i e e n n i a e ，c o r o l l o s p o r a ，b c 口，r h i z o p h i l am a r i n a ，h a l o s a r p h e i ac u l m i p e r d a ，h a l o s a r p h e i a i i 莱阳农学院硕士学位论文 摘要 f i b r o s a ，t r i c h o c l a d i u mc o n s t r i c l u m ，m e m n o n i e l l ae c h i n a t a ，p h a e o s p h a e r i am o u n c e a e s p e c i e sw e r ef o u n di ns e af o rt h ef i r s tt i m e ：g r a p h i u mr i g i d u m ，t o r u l ah e r b a r u m ，h e l i c o r h o i d i o n n y p i c o l a k e yw o r d s ：s h a n d o n gc o a s t ；m a r i n ef u n g i ；l i g n i c o l o u s ；i d e n t i f y ；n e ws p e c i e s ；b i o d i v e r s i t y 1 1 1 莱阳农学院硕士学位论文 月i j舌 海洋真菌是海洋微生物的重要组成部分，不少动植物体内、体表都有海洋真菌存在。 海洋真菌最常见的种类是沉木表面的木生类群。海洋木生真菌( 1 i g n i c o l o u sm a r i n e f l m g u s ) 为一类数量最多，分布最广的高等海洋真菌，能强烈的分解木材和其他纤维物 质( 中国大百科全书1 9 8 7 ) 。海洋木生真菌广义上包括那些分离于海洋藻类、红树林、 海草以及腐木等具有降解纤维素能力的海洋真菌。在热带海域的分布较温带和极地广 泛，在浅海环境的分布较深海广泛( r i t c h l e1 9 5 4 ) 。 海洋真菌的存在和研究，使我们对生物多样性有了很深的了解和认识，为我们开辟 了一个新视角、新天地，极大地丰富了微生物资源，并对我们开发利用微生物资源提供 了重要的价值。深入开展对海洋真菌的研究，了解海洋真菌的多样性，无论从基础理论 研究本身，或从应用前景考虑，都具有重要的意义。 1 海洋真菌的定义 从严格的意义上来讲，只有完全能在海洋环境中生长繁殖，完成生活周期的真菌才 能称之为海洋真菌。但是，由于海洋是一个开放的环境，不但有大量的淡水真菌从河流 进入海洋，土壤和空气的真菌也会进入海洋中，尚有部分真菌既能适应海洋环境，也能 在陆生环境中很好地生长。因此，要界定纯粹意义上的海洋真菌是很困难的。 海洋真菌不是一个分类系统学上的概念，而是一个生态生理学意义上的一大类真 菌的总称。海洋真菌的定义在不同的文献中有所不同，有些研究人员根据真菌在特定浓 度的海水中的生长能力来定义( j o h n s o na n ds p a r r o w ，t 9 6 1 ；t u b a k i ，1 9 6 9 ) ，也有研究 人员测定海洋真菌在海水中生长的生理需要，尤其是氯化钠的浓度，以此试图给海洋真 菌下一个准确的定义( m e y e r s ，1 9 6 8 ；j o n e sa n dj e n n i n g s ，1 9 6 4 ) 。目前普遍被人们所接 受的观点是，指在海洋环境中分离，又能在海水盐度( 或略低于海水盐度) 的培养基上 正常生长的真菌类群，都可以称为海洋真菌或海洋生真菌( m a r i n e d e r i v e df u n g i ) ，但是 对于不能在自然的环境中萌发的种类则不包括在内( m o o r e & m e y e r s ，1 9 5 9 ；j o h n s o n & s p a r r o w , 1 9 6 1 ；k o h l m e y e r & k o h l m e y e r , 1 9 7 4 ) 。按照这一界定，可以把海洋真菌分为两 大类：第一类为专性海洋真菌，即只能在海洋和河口环境中生长和产生孢子的种类；第 二类为兼性海洋真菌，即来自于淡水或陆栖但能在海洋环境中生长( 和产孢) ( k o h l m e y e r j 1 9 7 9 ) 。 这里的海洋环境是指海洋及与海洋相连的海岸线、海湾、盐池和海洋能冲刷到得盐 莱阳农学院硕士学位论文 刚舌 碱滩、盐水沼泽等( k o h t m e y e r & k o h h n e y e r , 1 9 7 1 ) 。不包括那些从不与海洋相连的盐湖 中得到的真菌。从那些有盐分的内陆湖得到真菌与从海洋环境中得到真菌是有很明显的 区别的( a n a s t a s i o u ，1 9 6 3 ) 。 2 海洋真菌的研究历史 由于海洋特殊的环境条件，人类对海洋真菌的认识相对较晚。在1 8 4 6 年， d e a m a z i e r e s 报道了第一个兼性海洋真菌s p a e r i at y p h a r u m 。1 8 6 4 年，m o n z o n n e u v o & m o n m g n e 又在眼子菜科波喜荡属( p o s i d o n i a ) 一植物上报道了一种子囊菌波喜荡球 壳菌( s p h a e r i a p o s i d o n i a ) ( 金静，2 0 0 4 ) 。c r o u a n 兄弟在1 8 6 7 年描述了5 种海洋真菌。 在1 8 6 9 年，法国的cd u r i e ud em o n z o n t a g n e 和m o n t a g n e 报道了从海草中分离到的第一 个专性海洋真菌s p a e r i ap o s i d o n i a e 。s u t h e r l a n d 在1 9 1 5 1 9 1 6 年陆续报道的对海洋真菌 的研究。1 9 3 4 年，fks p a r r o w 研究了丹麦海域的藻状菌类。1 9 4 4 年esb a r g h o o m & d hl i n d e r 发表了研究海洋木生真菌的论文，共描述了2 5 种木生海洋真菌。在1 8 5 0 1 9 4 9 年，被发现的海洋真菌的数目很少，还不到目前发现的海洋真菌总数的1 0 ( hp m o l i t o r i s ，1 9 9 5 ) 。 1 9 6 1 年twj o h n s o n & fks p a r r o w 发表的论文“f u n g ii no c e a n sa n de s t u a r i e s ” ( 海洋与河口真菌) 论述了海洋真菌的分类与生物学特性，总结了海洋真菌的积累资 料和海洋及毗邻海洋的水文情况。e m e r s o n ( 1 9 6 2 ) 对这篇文章进行了评价，他认为海 洋真菌的时代已经到来了。1 9 7 5 年h u g h e s 综述了1 9 6 1 1 9 7 5 年间对海洋和河口地区真 菌的研究，内容着重于木生的( 1 i g n i c o l o u s ) ，茎生的( c a u l i c o l o u s ) 和寄生在叶子上的 ( f o l i i c o l o u s ) 海洋真菌。1 9 7 6 年ebgj o n e s 主编的“r e c e n ta d v a n c e si na q u a t i c m y c o l o g y ”( 水生真菌学进展) ，论述了高等、低等海洋真菌以及淡水真菌在形态、 生理和生态方面的研究进展。k o h l m e y e r & k o h l m e y e r 在1 9 7 9 年出版“m a r i n e m y c o l o g y t h el l i g h e l - f u n g i ”( 海洋菌物学高等真菌) 一书，书中第一次详细 的论述了海洋真菌的分类特征，除此之外还综述了海洋真菌的各个方面，包括系统发育、 个体发育、生理、垂直分布和地理分布以及生态群等，是海洋真菌的本权威书。1 9 7 9 年jk o h l m e y e r 等的“t h eb i o l o g yo f m a r i n ef u n g i ”( 海洋真菌学高等海洋真菌) ， 系统阐述了高等海洋真菌的研究成果。1 9 8 6 年m o s s 将第四届国际海洋真菌研讨会的论 文编辑成“t h eb i o l o g yo f m a r i n ef u n g i ”( 海洋真菌生物学) 一书( 海洋真菌代谢产 物的研究，2 0 0 4 ) 。 但到1 9 9 1 年，只对3 2 1 种海洋真菌( 包括2 5 5 种子囊菌，6 种担子菌，6 0 种无性 态的真菌) 进行了相关比较研究，而同期研究过的陆栖真菌己达6 90 0 0 种，由于海洋真 莱阳农学院硕士学位论文日u 鬲 菌在医药方面的独特作用，越来越多的研究者投入到海洋真菌的研究中。 j o n e s 和m i t c h e l l ( 1 9 9 6 ) 估计，海洋真菌至少有1 5 0 0 种( 海洋动物2 0 0 0 0 0 种，海 洋植物2 0 0 0 0 种) ，但到2 0 0 0 年止，被描述的海洋真菌仅有4 4 4 种，包括子囊菌类、担子 菌类及半知菌类三种类型的真菌，还不到陆地真菌种数的1 。在这些分类单位中，有 1 7 7 属3 6 0 种属于子囊菌类，占高等海洋真菌的8 1 ；7 属1 0 种属于担子菌，仅有2 2 ： 5 1 属7 4 种属于半知菌，占到1 6 7 。海洋真菌是一个仍处于被探索和研究的阶段，随 着研究的不断深入，新的种属也还会不断地被发现。 我国只在2 0 世纪8 0 9 0 年代初于黄海、渤海做过酵母菌的调查及在深圳、香港、 海南等地海岸红树林及其他样品做过一些调查及分类，大部分海域未见有真菌研究。我 国周与良教授领导的研究小组对我国渤海海区的海洋酵母菌进行了比较系统的研究，他 们从海水及沿岸不同基物上分离到了6 1 种酵母，其中隐球酵母科有4 6 种，酵母菌科有 1 5 种。近年来中山大学研究小组从南海海水、红树林、海洋藻类及海洋动物中分离到了 不少酵母菌。香港城市大学关利平教授等在香港一带海岸的红树林腐木上也分离到了许 多海洋真菌，而且还研究发现一些真菌会产生结构新颖独特的化合物。2 0 0 4 年，金静博 士在渤、黄海海域得到4 9 种海洋木真菌。值得一提的是有一类似真菌的海洋原生生物 称破囊壶菌，它属于水霉科，破囊霉属( t h r a u s t o t h e c a ) 真菌，分布于海洋多种不同的 环境如海水、红树林、沉积物等。这类菌有一些种富含不饱和脂肪酸d n a 、e p a 等， 目前已有多个不同国家的研究小组在研究它的实际应用，国内也有人从事这一研究。随 着近年来对海洋微生物的日益重视，不断有新的海洋真菌被分离和鉴定，因此，海洋真 菌的总数在不断的增加。 表l 不同时期描述的高等海洋真菌的数量 t a b l e1n u m b e r so fh i g h e rm a r i n ef u n g id e s c r i b e da tv a r i o u st i m e 注：+ a s c o m y c e t o u ss t a g e sa r ei n c l u d e d 。 莱阳农学院硕士学位论文刖鬲 丝状子囊菌( f i l a m e n t o u sa s c o m y c e t e s ) 和半知菌( f u n g ii m p e r f e c t i ) 是被描述过的 海洋真菌中的主要种属。它们以腐生菌和寄生菌的形式出现在海岸或浅海环境中的海草 ( s e a w e e d ) 、漂浮木或高等海洋生物上。但是，这些真菌在深海环境里不是重要的，大 部分子囊菌属于两大类：h a l o s p h a e r i a l e s 和l o c u l o a s c o m y c e t e s ( p l e o s p o r a l e s ) 。 h a l o s p h a e r i a l e s 主要在外海和海岸的水域，l o c u l o a s c o m y c e t e s 则主要在潮间带，例如红 树林。子囊菌的h a l o s p h a e r i a l e s 包含了大量的海洋种属：4 3 属和约1 3 3 个种。木生真 菌( 1 i g n i c o l o u s ) 和红树林真菌，尤其是高等海洋真菌在过去的近4 0 年里得到了很大的 重视，这反映在大量的种属被发现和描述。其他的类群则未得到足够的重视。 3 海洋真菌的代谢产物 在过去的6 0 年，从陆地真菌发现了大量的结构独特的天然产物，其中很多用作生 物医药发展的潜在工具。自从青霉素( p e n i c i l l i n ) 引入了医学，就标志着真菌抗生素的 时代已经开始。 海洋环境十分独特，包罗了高压、低营养、低温( 特别是深海) 、无光照以及局部 高温、高盐等所谓的生命极限环境。海洋真菌适应了海洋独特的生活环境，必然造就海 洋真菌具有独特的代谢途径和遗传背景。但由于各种原因，对海洋真菌的化学研究起步 比较晚。 在1 9 5 7 年，s c h a f e r 等第一次报道了海洋子囊菌的定性化学研究，用纸色谱鉴定了 l u l w o r t h i a f l o r i d a n a 中的1 2 种氨基酸。1 9 5 8 年，d i e t r i c h 分析了真菌c e r a t o s t o m e l l as p 中油的成分，该真菌有可能是兼性海洋真菌。1 9 6 6 年，b u r k h o l d e r 从海洋含溴假单胞菌 ( p s e u d o m o n a s b r o m o t i l i s ) 分离到抗生素t i 自u t l 咯菌素( p y r o l n i t r i n ) 后，海洋微生物活性物质 的探索研究才真正开始。1 9 7 0 年，瞄r k 等用组织化学的( h i s t o c h e m i c a l ) 方法以不同的 精确度测定了子囊孢子的大致组成，确证了麦角甾醇( e r g o s t e r 0 1 ) 和胆碱( c h o l i n e ) 在 几种子囊菌和一些其他半知菌的出现。这些早期研究发现，在海洋和陆地高等真菌中主 要的氨基酸、糖、甾醇和甘油脂肪酸是类似的。 麦角甾醇在海洋真菌的代谢产物中广泛存在。1 9 9 8 年，w a t s o n 等报道了麦角甾醇 在酵母应激反应中的作用，结果表明，细胞中麦角甾醇的含量较高，细胞耐热和耐乙醇 的能力就越强。 早期对海洋真菌的研究主要涉及盐的忍耐度，营养需求或具有潜在经济价值和生物 学意义的分解纤维素的活性。到2 0 世纪8 0 年代，海洋微生物以其种类繁多、所处环境 得天独厚逐渐引起人们的重视。1 9 8 8 年后，海洋微生物的培养与发酵技术以及其代谢产 物的研究成为海洋药物研究的热点。但从国内外的报道来看，海洋微生物活性的研究主 4 莱阳农学院硕士学位论文前言 要集中在海洋细菌与放线菌上，并已开发出一些抗生素以及抗肿瘤药物，如日本开发的 氨基糖苷类抗生素天神霉素( i s t a m y c i n s ) 是由海泥中分离的链霉菌 f s t r e p t o m y c e s t e n j i m a r i e n s i s ) 所产生的。 海洋真菌次级代谢产物研究从1 9 8 8 年后陆续有文献报道。1 9 8 8 年，p i e t r a 和同事 报道了海洋半知菌( d e u t e r o m y c e t e ) d e n d r y p h i e l l as a u n a ( s u t h e r l a n d ) p u g he tn i e o t 的代谢产物，后来又研究了ds a l i n a 的提取物。直到1 9 9 2 年，从海洋真菌中发现的新 化合物只有15 个。在1 9 9 4 年之后有所增加，最近几年，海洋真菌的代谢产物研究发展 很快。1 9 9 5 年p i e t r a 等报道培养了1 5 0 0 株海洋真菌和1 4 5 0 株陆源真菌，以评估它们的 抗微生物活性。1 9 9 9 年，意大利的fs p o n g a 等报道了从海洋沉积物和海绵中分离到8 0 0 株菌株，其中3 9 5 株为丝状菌，另外的为放线菌，测定了这些菌的产生抗生素的活性， 结果令人鼓舞( 见表2 ) 。1 9 9 6 年，日本的hm i y a o k a 等首次报道了p h o m a c t i n d 的全合 成。2 0 0 0 年k 0 n i g 等研究了从绿藻u i v as p 中分离到的专性海洋真菌a s c o c h y t a s a l i c o r n i a e ，发现该菌能产生新的生物碱，具有抗肿瘤活性和中等强度的抗真菌活性。 同年，gnb e l o f s k y 等报道了从海洋背囊动物中分离到的真菌d c r e m o n i u ms p 分离到5 种新的化合物，具有良好的抗炎症活性和弱的抗真菌活性。 表2 产生抗微生物活性的菌株的百分比 t a b l e 2 p r o d u c ea n t i - m i c r o b i a ls t r a i n so f t h ep e r c e n t a g eo f r e a c t i v e 菌株 ( s t r a i n s ) 真菌 不常见种属 链霉菌 产生活性的百分比( ) ( p e r c e n t a g eo f r e a c t i v e ) e f a e c i u m 1 2 3 5 6 e c o l i 0 6 0 1 3 ca l b i c a n s 2 2 o 3 0 7 目前对海洋木生真菌的研究主要集中在其降解木质素、纤维素和半纤维素的功能 上，国内外鲜见对其产生的生物活性物质的研究报道s t r o n g m a n 等( 1 9 8 7 ) 检测了2 7 株木生真菌的抗菌活性，有4 株具明显抗菌活性，并从1 株木生真菌中分离到倍半类萜 二羧基化合物，具有抗真菌活性。李越中( 2 0 0 0 ) 认为在竞争有限的木生基质中，化学 。保护是一种重要的适应机制，因而从木生真菌中有可能筛选获得多种类型的抗菌活性物 质。 真菌菌株的代谢产物具有不同的结构类型，有萜类化合物、肽类及生物碱类化合物、 莱阳农学院硕士学位论文前言 酮类及酯类化合物和其他化合物。海洋真菌能产生各种各样结构类型的代谢产物，包括 新的骨架和各种类型的取代基。粗略的统计表明，从海洋真菌分离的新化合物8 0 具有 各种生理活性。海洋真菌正逐渐成为具生物医学意义的化合物的丰富的来源。 4 海洋木生真菌的研究方法 4 1 海洋真菌的附着基质及其生态类型 海洋真菌常常以寄生、共生或腐生的方式在海洋或与海洋相关的港湾生态环境中 生长。目前已经从浅海和深海的海水，海底泥，海洋植物表面，内部组织，海藻，海 洋动物如鱼类、贝壳、螃蟹和珊瑚，红树林，漂流腐木( d r i f t w o o d ) 和其他死亡的 生物体等样品中分离到海洋真菌，有一些则与地衣共生。海洋酵母菌和低等真菌附生 于浮游微生物和动物体上，因而在大洋中也有分布。 表3 海洋真菌的生态类型 t a b l e3t h ee s c o t y p e so fm a r i n ef u n g i 由于海洋真菌营腐生或寄生生活，所以其地理分布的特点取决于寄主的地理分布范 围。但海水中溶解氧的浓度和海水水温旭是影响海洋真菌存在与发展的重要因子( gc h u g h e s & v a nd e nh o e k ，1 9 7 4 ) 。h u g h e s ( 1 9 7 4 ) 将海洋分成5 个真菌生物地理分布区域， 6 莱阳农学院硕士学位论文刚舌 即寒带( 一年中最暖月份的海水表面温度为1 0 c ) 、温带( 一年中最暖月份的海水表面 温度为朝向地球两极处为1 0 和朝向赤道处最冷月份为1 7 ) 、亚热带( 一年中最冷月 份的海水表面温度在1 7 c 和2 0 之间) 、热带( 赤道两边一年中最冷月份的海水表面温 度为2 0 。c ) 和南极带( 同寒带) 。大多数海洋真菌依赖某种基物而自由生活，只有少数真 菌不依赖基物而自由生活。根据海洋真菌的栖生习性可划分为如下几种生态类型：木生真 菌、寄生藻体真菌、红树林真菌、海草真菌、寄生动物体真菌( 见表3 ) 。 h u g h e s ( 1 9 6 8 ) 8 旨出木生海洋真菌的基质可归纳为“漂流木”( d r i f t w o o d ) 和“潮间带木” ( i n t e r t i d a l ) 。“漂流木”指正在漂流或能够漂流的木块；“潮间带木”分为两种情况，一 种为松动的潮间带木块，即没有以任何方式附着的木块，能小范围移动的木块：另一种 为附着的潮间带木块，即以某种方式附着的木块，其位置通常不能够被海浪或水流改变。 4 2 海洋木生真菌的采集和检查 收集海岸边漂流的和固定的植物碎屑，包括木块、枝条、茎杆等，装入无菌的塑料 袋并用标签注明采集地点以及采集时间等事项，带回实验室。对采集回来的材料要注意 保湿，因为材料变干，子囊有可能破裂，孢子可能变形。有些木材可能是从陆地上进入 海洋中不久，将其上存在的陆生真菌一并带入海洋中，这就需要我们判断到底材料是否 存在于海洋环境中一段时间，对于木材一般看它的软腐度，若表面已变软且附有沙粒、 钙质贝壳或虫洞，则说明此木材在海水中存在的时间已足够长，其上长有的真菌一定为 海洋真菌；若表面仍较硬，则木材上的真菌一般不能算作海洋真菌；对于秸秆则认为秸 秆颜色变暗的材料上分离到的真菌属于海洋真菌。 检查采集的材料时应先将采回的木材放于灭菌的超净工作台上，待木材表面的水膜 蒸发完后再检查，因为有些真菌的菌落，由于水膜的覆盖而被忽视，只有当基质上水分 挥发完后才能看得清楚，所以应先将采回的材料稍风干后，再进行检查。 对于不能及时检查的材料应放于4 冰箱中直到检查完为止。对于检查到有子实体 的地方最好用油性笔做上记号，? 放入塑料袋中，贴好标签，并将采集地、采集时间以及 该菌所在的位置、形状、颜色等做一描述，一并放入袋中，以便以后很快再找到该菌。 对于那些检查未发现有子实体的材料，采用湿室诱培法，放于铺有湿沙或湿滤纸的玻璃 盒或塑料盒中，室温下培养一段时间后再定期检查。 4 3 海洋木生真菌的显微检查 ，制片观察时用海水做附载剂，以便于在光学显微镜下观察和测量孢子大小，对于有 附属丝和胶质鞘的孢子，须用染色液( 如棉兰、蓝墨水等) 对附属丝或胶质鞘染色，以 便于清晰观察。对于己经做完观察、测量、描述的片子，就可以贴上标签( 记录下采集 莱阳农学院硕士学位论文 刖磊 地和采集时间) ，制成永久片进行保存了。制永久片时，先在盖玻片的边缘滴一滴乳甘 油( 乳油：甘油：海水为1 ：2 ：1 ) ，随着水分的挥发，乳甘油会慢慢渗入到盖玻片下代替 海水做浮载剂，然后将片子放入5 0 5 5 。c 的烘箱中进行烘烤，让多余的浮载剂挥发后取 出，最后用中性胶进行封片，待封片剂完全干后，即可放入玻片盒中进行保存了。 4 4 海洋木生真菌的分离纯化 为得到海洋真菌的培养物，需对海洋真菌进行分离，常用的方法是稀释分离法，这 种方法是最有效的准确获得海洋真菌的方法。具体做法为：将在体视镜下观察到的子实 体用灭菌挑针挑起后放入滴有5 m l 灭菌海水的表面皿中，然后用灭菌玻璃棒压开子实 体，使其内部的子囊孢子释放，然后用移液枪吹吸几次，使孢子均匀分散到海水中形成 悬浮液，用移液枪吸取l m l 悬浮液加入到已加入抗生素并冷却的培养基平板上，然后用 灭菌的三角刮铲摊平悬浮液，使悬浮液布满整个培养基表面，做好标记，然后无菌环境 下放置2 小时，让水分蒸发一部分后用封口膜封起，放入2 0 2 5 的温箱中进行培养。 定期观察长出的菌落，确保形态一致的菌落在5 个以上，可断定此菌即为要得到的菌， 然后转移到斜面试管中，保藏。 子囊菌长得很慢，有的需要1 个月左右才慢慢有菌落长出。对于已长出的菌落，应 将三个皿从菌落形态、颜色和生长速度进行相互比较，看哪一种菌是真正需要分离得到 的菌。准确判断之后，即可进行纯化、保存了。需注意的是有的子囊菌在培养基上需要 半年以上才产生子实体，所以就需将培养皿用封口膜封好，避免水分散失使培养培养基 干燥；另外要定期进行仔细观察描述，以免错过观察子实体形成的时期。 用于培养海洋真菌的培养基种类很多，h y d ee ta 1 ( 1 9 8 7 ) 已总结了所有已分离培 养成功的海洋真菌所用的培养基的种类。 海洋真菌的培养基： ( 1 ) 2 0 葡萄糖，1 o 蛋白胨，0 5 酵母膏，a s w ，p h 7 5 。 ( 2 ) 2 0 蔗糖，o 5 k 2 h p 0 4 ，1 o 蛋白胨，1 0 马铃薯，a s w ，p h 8 5 。 ( 3 ) 1 o 葡萄糖，0 5 蛋白胨，o 5 酵母膏，o 2 蟹壳粉，海水。 ( 4 ) 1 o 甘油，o 5 大豆蛋白胨，0 i c a c 0 3 ，海水。 4 5 海洋木生真菌的保存 将已经纯化的真菌菌丝或孢子接种到斜面培养基上，进行培养，待长到一定程度后， 拧紧盖子，放入4 。c 的冰箱，可以短期保存。如果需要长期保存，则往斜面中加入无菌 的液体石蜡直至盖过斜面，室温保存。另外，也可以进行低温保存，不过低温保存的价 格昂贵，一般不采用。 莱阳农学院硕士学位论文 h 舌 5 展望 海洋是一个巨大而丰富的生物资源库，海洋生物技术作为海洋生物资源开发利用的 关键技术，蕴藏着巨大的潜力，是2 l 世纪海洋经济腾飞的支柱之一。海洋生物技术的 发展将对传统的食品、医药、化工、能源和环保的发展必将产生深远的影响，深入开展 对海洋真菌的研究，了解海洋真菌的多样性，无论从基础理论研究本身，亦或从应用前 景考虑，都具有重要意义。对海洋生物大分子的深入研究，有助于揭示海洋这个生命摇 蓝的秘密；另一方面利用海洋真菌生态环境的复杂和多样性，生产各种种类繁多、结构 新颖且生理活性独特的海洋天然产物，无疑是海洋真菌研究与开发的主要方向。细胞培 养技术、基因工程技术以及真菌遗传工程的迅速发展，使我们可以分离各种有价值的海 洋药物和酶类，在分子水平上分离和保存有价值的基因，研究基因表达调控和代谢调控 的规律，这是一个富有旺盛生命力的新兴产业，利用基因工程技术，利用适宜的海洋真 菌作为宿主，生产人类所需的药品与生物活性物质，较之利用原核系统更有其独特的优 点，当采用原核系统生产来自真核生物的基因产物时，原核系统常常存在转录后不能正 确地加工、修饰和进行糖基化等缺陷，因而产物可能存在生物活力较低或无活力的问题， 另外我们也可以设想，把陆地上有价值的药用基因转移到海洋真菌中表达，同样也可把 分离出的海洋真菌的药用基因转移到海水养殖生物中去表达，这样不但解决了海洋天然 生理活性物质的药源问题，而且还会开发出一些新药源，这将带动现代养殖业的纵深发 展。总之，海洋真菌多样性研究是研究海洋生物多样性研究的重要的、不可缺少的组成 部分，海洋真菌研究与开发的前景是光明远大的，加大对海洋真菌研究的投入，加快对 海洋真菌研究的步伐必将有利于推进对海洋开发的深度和广度，并有希望成为2 1 世纪 海洋生物技术产业的重要组成部分。 6 本研究的目的和意义 目前对木生真菌的研究主要集中在其降解木质素、纤维素和半纤维素的功能上，国 内外鲜见对其产生的生物活性物质的研究报道李越中( 2 0 0 0 ) 认为在竞争有限的木生 基质中，化学保护是一种重要的适应机制，因而从木生真菌中有可能筛选获得多种类型 的抗菌活性物质。 本研究主要对山东沿海岸已分离到的海洋木生真菌进行鉴定，旨在初步调查山东沿 海岸的海洋木生真菌的种类和分布。并对检查到的真菌进行菌种保存，为海洋木生真菌 资源的进一步利用提供材料和依据。 莱阳农学院硕士学位论文 材料与方法 1 材料 材料与方法 2 0 0 4 年6 月至2 0 0 5 年1 2 月在山东沿岸威海( 刘公岛、国际海水浴场、海水浴 场、海滨公园、威海湾) 、荣成( 成山头、天鹅湖、爱连湾、桑沟湾、滨岛) 、文登( 前 岛) 、乳山( 银滩) 、海阳( 凤城、潮里) 、青岛( 栈桥、黄岛、琅琊台) 、日照( 大沙洼、 山海天、万平口海水浴场、日照港一东北咀) 等海域的2 2 个点，进行了海洋漂流木、潮 间带固着木、植物秸秆等材料的采集，装入无菌的压口塑料袋中带回实验室。 2 海洋木生真菌的检查方法 2 1 直接检查法 将采集回来的木材放于灭菌的超净工作台上，待木材表面的水膜蒸发完后，在 o l y m p u s s z i i 体视镜下检查，对于检查到的真菌直接分离做片，观察、描述、测量 大小并照相，在材料上真菌的位置要用彩笔做上记号，已备以后能很容易找到，将材料 放入无菌自封袋中，并将采集地、采集时间等做好纪录后，贴好标签。对于已经干燥的 木材要重新喷洒海水保湿后再检查。 2 2 湿室诱培法 对于检查未发现有子实体或是孢子没有形成、子囊发育不完全的材料，放入消毒的 保湿缸中，底部铺上灭菌的湿滤纸或湿沙，室温下培养，加入对二氯苯 ( p a r a d i c h l o r o b e n z e n e ) 防螨污染。6 周后开始定期检查，持续一年。定期检查保湿情况， 以防止木材干燥( 金静，2 0 0 4 ) 。 3 海洋木生真菌的分离方法 3 1 直接挑取法 对于检查到的子实体用灭菌的挑针挑下，放入加有抗生素的分离培养基中，室温下 培养。这适用于很大的孢子，可以采取直接挑取，进行单孢分离。 3 2 稀释分离法 1 0 用灭菌的挑针挑起子实体放入滴有5 m l 灭菌海水的表面皿中，用玻璃棒压开子实 莱阳农学院硕士学位论文材料与方法 海壤公园、威海湾 体，使内部的子囊孢子释放出，然后用移液枪吹吸几次，使孢子均匀分散到海水中形成 悬浮液，重复几