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文档简介

d i s s e r t a t i o nf o rd o c t o r a ld e g r e e y 1 7 4 u n i v e r s i t yc o d e :lu z 0 9 s t u d e n ti d :5 2 0 6 1 3 0 0 0 1 3 ea s tc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y a s t u d y o nm o l e c u l a r p h y l o g e n yo f e n g r a u l i d a ea n dp o p u l a t i o ng e n e t i c d i v e r s i t yo fcm y s t u sa n dc e c t e n e s d e p a r t m e n t :c o l l e g eo fl i f es c i e n c e m a j o r :z o o l o g y r e s e a r c ha r e a :a q u a t i ca n i m a l d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r : z h a oy u n l o n g c a n d i d a t e :m a c h u n y a n a p r i l 2 0 1 0 华东师范大学学位论文原创性声明 郑重声明:本人呈交的学位论文鲲科鱼类分子系统进化及风鲚、刀鲚遗传多样 性研究,是在华东师范大学攻读硕士壤知( 请勾选) 学位期问,在导师的指导下 进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含其 他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名:磅抱日期:劢眸厂月7 自 华东师范大学学位论文著作权使用声明 鲲科鱼类分子系统进化及风鲚、刀鲚遗传多样性研究系本人在华东师范 大学攻读学位期间在导师指导下完成的硕士博,士( 请勾选) 学位论文,本论文 的研究成果归华东师范大学所有。本人同意华东师范大学根据相关规定保留和使 用此学位论文,并向主管部门和相关机构如国家图书馆、中信所和“知网”送交 学位论文的印刷版和电子版;允许学位论文进入华东师范大学图书馆及数据库被 查阅、借阅;同意学校将学位论文加入全国博士、硕士学位论文共建单位数据库 进行检索,将学位论文的标题和摘要汇编出版,采用影印、缩印或者其它方式合 理复制学位论文。 本学位论文属于( 请勾选) ( ) 1 经华东师范大学相关部门审查核定的“内部”或“涉密”学位论文水, 于年月 日解密,解密后适用上述授权。 ( ) 2 不保密,适用上述授权。 导师签名 易力缸 , l 本人签名弓摊 劲f 汐年莎月7 日 c “涉密”学位论文应是已经华东师范大学学位评定委员会办公室或保密委员会审定过的学 位论文( 需附获批的华东师范大学研究生申请学位论文“涉密”审批表方为有效) ,未 经上述部门审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的,默认为公开学位论文, 均适用上述授权) 。 呈鲞垫博士学位论文答辩委员会成员名单 姓名职称单位备注 叶金云教授湖卅ii ) 订0 范学院主席 庄平研究员东海水产研究所 陈亚瞿研究员东海水产研究所 顾志敏高级工程师浙江淡水水产研究所 华修国教授上海交通大学 李家乐教授上海海洋大学 孙心德教授华东师范大学 iil, 【。一 华东师范大学博士学位论文 摘要 本研究通过线粒体1 6 s r r n a 和c y t b 基因序列变异,初步探讨了我国鲤科鱼 类的系统发生关系,分析了属间及近缘种间的分类地位等。同时以我国的刀鲚和 风鲚为研究对象,通过线粒体基因序列变异,研究分析了3 个群体的凤鲚和1 0 个群体的刀鲚的遗传多样。 l鲲科鱼类系统进化研究 以鲲科鱼类为研究对象,分析其线粒体1 6 s r r n a 基n 和c y t b 基因片断序列, 探讨y 5 属1 1 种中国鲲科鱼类的亲缘关系。得到1 6 s r r n a 可比序列长度为4 7 2b p 一 5 0 1 b p ,共存在2 0 个插入缺失,1 2 5 个变异位点,总体上看,序列中转换多于颠 换,转换颠换之比为1 4 。得到c y t b 序列长度为11 3 8 b p ,共编码3 7 9 个核苷酸, 其中有4 5 2 个变异位点,5 5 个核苷酸变异,但没有发现缺失和终止密码子,变异 位点百分率为3 9 7 2 。根据1 6 s r r n a 基因片段差异计算的种间遗传距离从 0 2 2 ( 黄吻棱鲲与中颌棱鲲,刀鲚和风鲚) 到1 8 5 4 ( 长颌棱鲲和康氏侧带小公 鱼) ,c y t b 基因片段差异计算的种间遗传距离从0 6 ( 黄吻棱鲲与中颌棱鲲) 到 2 3 8 ( 长颌棱鲲和康氏侧带小公鱼) 。1 6 s r r n a 基因片断构建的系统树中,支持 杜氏棱鲲和汉氏棱鲲互为姐妹种,而在c y t b 基因片断构建的系统树中,黄吻棱鲲 和中颌棱鲲聚类后,先与汉氏棱鲲相聚,再与长颌棱鲤聚类,然后再与杜氏棱鲲 相聚。另外,在1 6 s r r n a 基因片段构建的系统树中,棱鲤属依次和鲚属,黄鲫属 相聚,再与棱鲲属的赤鼻棱鲲相聚;最后与鲲属和侧带小公鱼属形成的分支相聚。 而在c y t b 基因片断构建的系统树中棱缇属先与和黄鲫属相聚,然后与鲚属相聚, 再与棱鲲属的赤鼻棱鲲相聚;最后与侧带小公鱼属和鲲属相聚。将1 6 s r r n a 和 c y t b 序列进行合并,得到支持率比较高的n j 树,属间关系与根据c v t b 序列得到的 n j 树比较一致。赤鼻棱鲲自成单独的一支,将赤鼻棱鲲从棱鲲属中划分出来是合 理的。 2凤鲚群体遗传多样性研究 为研究凤鲚的长江群体、闽江群体和珠江群体的序列变异和遗传多样性,对 线粒体的1 6 s r r n a 和c y t b 基因片段序列进行分析。共收集了6 5 尾鱼的样本( 长 江2 1 尾,闽江和珠江各2 2 尾) 。结果表明: f1 6 s r r n a :6 5 个序列中共检测到1 9 种单倍型。获得三群体一致序列片断长 l t 缱不墨鱼类分子系统进化次强鲚。刀鲚遗传多撵性研究 4 7 0 b p ,其中3 8 个为变异位点,1 6 个为简约位点;a + t 的含量( 5 6 3 ) 大于g + c 的含量( 4 3 7 ) 。长江、闽江、珠江三个群体的核苷酸多态性指数分别为0 1 0 8 、 0 8 4 3 和0 0 9 7 ,其中闽江群体的遗传多样性指数最高。长江群体内遗传距离 在0 2 0 4 之间,闽江群体内遗传距离在0 2 - 4 1 之间,珠江群体内遗传距 离在0 2 0 6 之间。长江和闽江、珠江群体间的遗传距离相对较大,分别为1 9 和1 5 ,而闽江和珠江群体间的遗传距离相对较小为0 5 。a m o v a 分析显示 群体间的变异占总变异的7 4 6 1 ,提示三群体可能有相互隔离的遗传结构。 2 ) c y t b - 共获得3 群体c y tb 基因片断6 0 7b p 的一致序列。序列有1 0 2 个变异位 点,总变异率为1 6 8 ,其中6 8 个为简约位点。各单倍型的变异全部是转换或 颠换,无插入和缺失。( a + t ) 含量为5 7 6 ,大于( g + c ) 4 2 4 的含量。核苷酸 多态性以闽江群体最高,其它两群体较低。自然选择检验显示3 群体内部在分子 水平上存在自然选择作用。在所获得的6 5 个序列中,共检测到3 4 种单倍型。群 体内的遗传距离为0 3 。1 2 之间,群体间遗传距离在0 8 1 0 8 之间。长江群 体与珠江群体之间的遗传距离较大为1 0 8 ,长江群体与闽江群体间的遗传距离 为1 0 6 ,而珠江和闽江群体之间的遗传距离最小为0 8 。a m o v a 分析显示, 群体间遗传变异占总变异的9 0 2 5 ,群体内的遗传变异占总变异的9 7 5 ,提 示群体间变异是总变异的主要来源。研究结果提示长江群体和闽江以及珠江群体 间的分化可能已达亚种水平。 3刀鲚群体遗传多样性研究 为研究刀鲚的群体遗传多样性和遗传结构,分别对m t d n ac y t b 基因、d 1 0 0 p 区片段序列进行分析。结果表明: 1 ) c y t b 2 7 9 个序列中共检测到9 7 种单倍型。获得1 0 个群体刀鲚的c y t b 基因 全序列,单倍型多样性为0 6 4 3 3 ( d t ) 0 9 5 1 7 ( a q ) ,核苷酸多样性为0 1 6 ( l y g ) 1 2 3 ( w h ) 。群体内遗传距离为o 1 6 ( l y g ) 1 2 6 ( w h ) ,群体间遗传距离为 0 1 8 ( l y g 和t h ) 2 6 6 ( f z 和s j g ) ,其中f z 群体与其他群体间的遗传距离均 在2 以上,l y g 群体和t h 群体间的遗传距离最小。f s t 分析结果表明不同地理 组群间具有显著的遗传分化水平。单倍型间的n j 系统进化树和网络关系图也表 明显著的地理分化格局。a m o v a 分析显示群体间的变异显著,提示刀鲚群体可 能有相互隔离的遗传结构。同时,中性检验和错配分布表明刀鲚历史上曾经历过 种群扩张,扩张时间大约在11 0 ,0 0 0 年前。 2 ) d - l o o p :共获得刀鲚1 0 个群体的2 4 6 条d 1 0 0 p 序列,共定义了1 8 4 个单倍型, i i 华东师范大学博士学位论文 单倍型多样性为0 6 4 3 3 ( d t ) 0 9 5 1 7 ( a q ) ,核苷酸多样性为0 1 6 ( l y g ) 1 2 3 ( w h ) 。表明群体具有相对较高的单倍型多样性和较低的核苷酸多样性水 平。许多单倍型为群体特有单倍型,n j 系统进化树表明f z 群体与其它群体间具 有显著的地理结构格局。同样,a m o v a 分析和f s t 统计分析表明群体间的变异 显著,地域间基因流动有限。基于d 1 0 0 p 序列变异的中性检验和错配分布表明 刀鲚可能经历过种群扩张。 4 刀鲚多态微卫星标记的开发及3 个群体遗传多样性分析 采用f i a s c o ( f a s ti s o l a t i o nb ya f l po fs e q u e n c e sc o n t a i n i n gr e p e a t s ) 方法构建 了刀鲚基因组富集文库( a c 重复) ,通过克隆、测序获得了9 7 条含有微卫星重 复序列,成功设计了7 0 对微卫星引物,最终获得1 6 个多态的微卫星位点。微卫 星引物的跨种扩增结果表明,除d 1 3 9 外,其它均能在凤鲚中稳定的扩增到清晰 的目的条带,1 3 对引物能够扩增到多态的目的条带,每个位点的等位基因数目 在2 - 6 个之间。这些微卫星标记可为刀鲚的种质资源评估、遗传多样性和遗传结 构分析、遗传连锁图谱构建等提供候选标记。 利用微卫星技术对刀鲚3 个地理群体的遗传多样性进行了分析。对7 个微卫星 位点进行了扩增,共产生5 8 个等位基因,每个位点产生的等位基因数从4 到1 1 个 不等。3 个群体的多态信息含量p i c 值从0 5 1 6 至u 0 6 3 3 ,以d d 群体最高,f z 群体 最低,说明这7 个微卫星位点在刀鲚中具有较高的信息含量。3 个群体的s h a n n o n 多样性指数为1 0 8 9 2 1 4 0 6 8 ,基因多样性指数为2 9 8 8 7 - 4 1 0 9 6 ,均以f z 群体最低, d d 群体最高。平均观测杂合度( h o ) 为0 2 5 1 8 0 6 6 5 5 ,其中f z 最低,w h 最高,平 均期望杂合度( h e ) 为0 5 7 9 4 0 6 7 8 3 。3 个刀鲚群体h a r d y w e i n b e r g 平衡偏离常数均 发生了不同程度的偏离。通过检测,在3 个群体中均未发现位点间连锁不平衡。 群体间遗传距离最大的为w h 群体与f z 群体( 0 3 0 3 ) ,说明这两个群体间遗传差异 最大;d d 群体与、硼群体的遗传距离最小( o 2 0 0 ) 。由u p g m a 聚类图可以看出: 刀鲚d d 群体与w h 群体聚成一支,然后再与f z 群体聚类。 关键词:鲲科;刀鲚;凤鲚;1 6 s r r n a :c y t b ;d 1 0 0 p ;s s r ;遗传多样性;遗 传结构;分子系统进化 i i i a b s t r a c t m i t o c h o n d r i a ld n aw a su t i l i z e d t o a n a l y z et h em o l e c u l a rp h y l o g e n yo f e n g r a u l i d a ea n de v a l u a t e dt h eg e n e t i cd i v e r g e n c ea n dg e n e t i cs t r u c t u r eo fc m y s t “s a n dc e c t e n e s i na d d i t i o n ,p o l y r n o r p h i cm i c r o s a t e l l i t em a r k e r sw e r ei s o l a t e d 行o m c e c t e n e sa n du s e dt oa n a l y z et h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fc e c t e n e s 1 m o l e c u l a rp h y l o g e n yo f e n g r a u l i d a ei n f e r r e df r o mm i t o c h o n d r i a ld n a t oe v a l u a t et h ep h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po f11 s p e c i e so fe n g r a u l i d a ei nc h i n a , t h em i t o c h o n d f i a l16 s r r n aa n dc y t bg e n e sw e r ea m p l i f i e du s i n gp c r t e c h n i q u e s a b o u t6 0 0 b pl e n g t h16 s r r n a g e n ef r a g m e n t sa n d13 0 0 b pc y t bg e n ef r a g m e n t sw e r e o b t a i n e da n ds e q u e n c e d a f t e ra l i g n e d ,af r a g m e n to f 4 7 2 b p 5 01b p ( 16 s r r n a ) a n d 1138 ( c y t b ) n u c l e o t i d es e q u e n c ew h i c hc o u l db eu s e df o r s e q u e n c ea n a l y s i sw a s o b t a i n e d t h eg e n e t i ci n f o r m a t i o ni n d e x e s ,i n c l u d i n gk i m u r a 2 p a r a m e t e rg e n e t i c d i s t a n c e ,b a s a lc o m p o s i t i o na n dp h y l o g e n e t i ct r e e sw e r eg e n e r a t e du s i n gm e g a 3 1 s o f t w a r e o ft h e16 s r r n aa l i g n e db a s ep a i r s ,2 5i n s e r t i o n s d e l e t i o n sw e r ed e t e c t e d a n d12 5s i t e sw e r ev a r i a b l e t h em u t a t i o n s i t e sw e r e m a i n l yt r a n s i t i o na n d t r a n s v e r s i o n t r a n s i t i o n sw e r ef o u n dt ob em o r ec o m m o nt h a nt r a n s v e r s i o n s t h e g e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e ns p e c i e sr a n g e df r o m0 2 2 ( zv i t r i r o s t r i sa n dz m y s t a x , c e c t e n e sa n dc m y s t u s ) t o18 5 4 假c o m m e r s o n i ia n dz s e t i r o s t r i s ) o ft h ec y t b a l i g n e db a s ep a i r s ,n oi n s e r t i o n s d e l e t i o n sw e r ed e t e c t e da n d4 5 2s i t e sw e r ev 撕a b l e m a i n l yd u et ot r a n s i t i o na n dt r a n s v e r s i o n t h ef r a g m e n te n c o d e s3 7 9a c i d s ,5 5o f w h i c hw e r ev a r i a b l e t h eg e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e ns p e c i e sr a n g e df r o m0 6 ( z v i t r i r o s t r i sa n dzm y s t a x ) t o2 3 8 c o m m e r s o n i ia n dz s e t i r o s t r i s ) m o l e c u l a r p h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e db yn jm e t h o d sb a s e do nt h e5 7 2b p ( 1 6 s r r n a ) , 11 3 8 b p ( c y t b ) a n d5 7 2 b p ( 1 6 s r r n a ) + 1 1 3 8 b p ( c y t b ) s e q u e n c e s ,w i t hs a r d i n p l l a l e m u r ua st h ed e s i g n a t e do u t g r o u p t h et r e eb a s eo n16 s r r n a g e n ei n d i c a t e dac l o s e r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nzd u s s u m i e r ia n dzh a m i l t o n i i t h eg e n u st h r y s s 口s h o w e d c l o s er e l a t i o n s h i pw i t hc o i l i a ,a n dt h e nc l u s t e r e dw i t hs e t i p i n n a t h ef o r m e rc l u s t e r g a t h e r e dw i t hzk a m m a l e n s i s f i n a l l y ,t h e yc l u s t e r e dw i t ht h es t o l e p h d 船a n d e n g r a u l i s t h et r e eb a s eo nc y t bg e n ei n d i c a t e dzv i t r i r o s t r i sa n dz m y s t a xw e r e i v s i s t e rs p e c i e s t h e yc l u s t e r e dw i t hzh a m i l t o n i ia n dz s e t i r o s t r i s ,t h e nc l u s t e rw i t hz d u s s u m i e r i t h eg e n u st h r y s s a g a t h e r e dw i t hs e t i p i n n a ,c o i l i a ,zk a m m a l e n s i s ( t h r y s s a ) ,s t o l e p h o r u sa n de n g r a u l i si nt u r n t h en jt r e eb a s eo n16 s r r n a + c y t b s e q u e n c es h o w e dh i g hb o o t s t r a ps u p p o r t t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ng e n u sw a s c o n s i s t e dw i t ht h et r e eb a s e do nc y t bs e q u e n c e i na l l ,zk a m m a l e n s i sw a s s e p a r a t e d f r o mt h r y s s a w es u g g e s t e dt h a tzk a m m a l e n s i ss h o u l db ec o n s i d e r e da san e w g e n u s 2 m i t o c h o n d r i a ld n a d i v e r s i t yo fcm y s t u si nt h r e ep o p u l a t i o n s s e q u e n c ev a r i a t i o na n dg e n e t i cd i v e r s i t yi nt h r e ep o p u l a t i o n so fcm y s t u s ,i e y a n g t z er i v e rp o p u l a t i o n ,m i n j i a n gr i v e rp o p u l a t i o n ,a n dp e a r lr i v e rp o p u l a t i o n , w e r ei n v e s t i g a t e db y u s i n gm t d n a16 s r r n a a n dc y t bg e n es e q u e n c ei nt h i ss t u d y a t o t a lo f6 5f i s h ,i e ,21i n d i v i d u a l sf r o my a n g t z er i v e re s t u a r y , 2 2f r o mm i n j i a n g r i v e re s t u a r y , a n d2 2f r o mp e a r lr i v e re s t u a r yr e s p e c t i v e l y , w e r ec o l l e c t e d t h e r e s u l t ss h o w e dt h a t : 1 ) 16 s r r n a :i nt h et o t a l6 5s e q u e n c e s ,19d i s t i n c th a p l o t y p e sw e r ed e t e c t e d w e o b t a i n e d4 7 0b a s ep a i rc o n s e n s u ss e q u e n c e so f16 s r r n a t h e r e i n t o ,3 8w e r ev 撕a l b l e s i t e s ,a n d16w e r ep a r s i m o n ys i t e s t h ec o n t e n to fa + t ( 5 6 3 ) i sb i g g e rt h a ng + c ( 4 3 7 ) t h ei n d e x e so fn u c l e o t i d ed i v e r s i t yi nt h e s et h r e ep o p u l a t i o n sw e r ey a n g t z e o 10 8 ,m i n j i a n g0 8 4 3 ,a n dp e a r lr i v e r0 0 9 7 m i n j i a n gi st h el a r g e s ta m o n g t h e s et h r e ep o p u l a t i o n s g e n e t i cd i s t a n c e sw i t h i nt h ey a n g t z er i v e r p o p u l a t i o nw e r e b e t w e e n0 2 a n d0 4 ,w i t h i nt h em i n j i a n gr i v e rp o p u l a t i o nw e r eb e t w e e n0 2 a n d4 1 ,w i t h i nt h ep e a r lr i v e rp o p u l a t i o nw e r eb e t w e e n0 2 a n do 6 a n dt h e g e n e t i cd i s t a n c e sb e t w e e nt h ey a n g t z er i v e rp o p u l a t i o na n dt h em i n j i a n gr i v e r p o p u l a t i o nw a s1 9 ,b e t w e e nt h ey a n g t z er i v e rp o p u l a t i o na n dt h ep e a r lr i v e r p o p u l a t i o nw a sl 5 ,b u tt h a tb e t w e e nt h ep e a r lr i v e rp o p u l a t i o na n dt h em i n j i a n g r i v e rp o p u l a t i o nw a so n l yo 5 a m o v aa n a l y s i sd i s c l o s e dt h a tv a r i a t i o nb e t w e e n p o p u l a t i o n sa c c o u n t i n gf o r7 4 61 o ft o t a lv a r i a t i o n ,s u g g e s t i n gb e t w e e n p o p u l a t i o n s v a r i a t i o n sa r et h em a i ns o u r c eo ft o t a lv a r i a t i o n t h i sr e s u l ts u g g e s t st h a tt h e s et h r e e p o p u l a t i o n sm a yh a v ei s o l a t e dg e n e t i cs t r u c t u r er e s p e c t i v e l y 2 ) c y t b :w eo b t a i n e d6 0 7b pc o n s e n s u ss e q u e n c e so fc y t b t h e r e i n t o ,10 2w e r e v a r i a b l es i t e s ,a c c o u n t i n gf o r16 8 o ft o t a ls e q u e n c e ,a n d6 8w e r ep a r s i m o n ys i t e s v t h e yw e r ea l lt r a n s i t i o n a la n dt r a n s v e r s i o n a lv a r i a t i o n s ,a n dn oi n d e l sw e r ef o u n d t h ec o n t e n to fa + t ( 5 7 6 ) i sb i g g e rt h a ng + c ( 4 2 4 ) t h ei n d e xo fn u c l e o t i d e d i v e r s i t yi sl a r g e s ti nt h em i n j i a n gp o p u l a t i o na m o n gt h e s et h r e e p o p u l a t i o n s s e l e c t i o nt e s t sd i s c l o s et h a tn a t u r a ls e l e c t i o no p e r a t e sa tm o l e c u l a rl e v e lw i t h i nt h e s e t h r e ep o p u l a t i o n s i nt h et o t a l6 5s e q u e n c e s ,3 4d i s t i n c th a p l o t y p e 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