（果树学专业论文）“海湾红宝石”李茎段离体培养研究.pdf

“海湾红宝石”李茎段离体培养研究 “海湾红宝石 李茎段离体培养研究 摘要 李( p r u n u ss a l i c i n a ) 为我国重要的多年生落叶果树，果实色、香、味俱佳，栽 培历史悠久。但李具有童期较长、雌蕊败育率高、遗传高度杂合及易受病毒病危害 等特性。李离体培养及再生技术体系的建立，不仅是苗木快速繁殖和无病毒苗木培 育的新途径，而且也是开展李生物技术研究如种质资源离体保存、提高育种效率及 遗传转化和创新种质资源等技术的基础。 本研究以“海湾红宝石”李( p r u n u ss a l i c i n al i n d l c v og u l f - r u b y ) 茎段为外植 体进行离体再生体系的建立，着重研究了“海湾红宝石”李茎段培养的最佳取材时 期、消毒方法、培养基配方和培养程序，以及影响快速繁殖的关键性因素，初步建 立了一套较为系统完整的快速繁殖技术体系。主要研究结果如下： 1 通过周年外植体消毒试验，结果表明4 - - - 5 月为最佳取材时期，此时外植体 正处于春季萌发生长阶段，带菌较少，成活率高，易诱导成苗。此时期外植体采用 7 0 酒精3 0s + ( 0 5 n a c i o + 吐温2 02 - - - 3 滴) 1 2m i n 消毒效果较好。 2 若要进行周年生产，应针对不同的外植体取材时期采用不同的消毒方法：生 长前期( 4 - - 5 月) 外植体采用7 0 酒精3 0s + ( 0 5 n a c i o + 吐温2 02 - - - 3 滴) 1 2 m i n 消毒效果较好；生长后期( 6 1 1 月) 外植体采用7 0 酒精3 0s + ( 1 n a c i o + 吐温2 02 3 滴) 1 5m i n 消毒效果较好；休眠期( 1 2 - - 3 月) 外植体采用7 0 酒 精3 0s + ( 5 n a c l 0 + 吐温2 02 - - - 3 滴) 1 5m i n 消毒效果较好。 3 经过筛选，初代培养适宜的培养基配方为：w p m + i b a0 0 5 - - 0 1m g l + b a o 5 - - 1 0m g l + 葡萄糖3 0 l + 琼脂5 l + v c1 0g l 。黑暗或弱光条件下( 外植 体用报纸覆盖) 培养5d 后转移到白光下培养，能达到较为满意的效果。 4 继代培养中以增殖为目的时，适宜的培养基配方为w p m + i b a0 0 5 - - - 0 1 m g l + b a 0 2m g l + k t0 3m g l + 葡萄糖3 0g l + 琼脂5 l + v c1 og l + c h1 0 l 。末次继代( 生根前) 时，为加快嫩茎伸长生长为诱导生根做准备，同时考虑 到节约成本，适宜的壮苗培养基配方为w p m + i b a0 0 5 - 0 1m g l + b a0 3m g l + 葡萄糖3 0 l + 琼脂5 l + v c1 0 l + c h1 0 l 。 5 生根培养中，适宜的培养基配方为：1 2 m s + i b a0 2 - 0 5m g l + 蔗糖1 5 l + p g2 0 - 4 0m g l 。暗培养放置7d 后转移到白光下培养，能达到较为满意的效果。 6 炼苗移栽试验中，将生根苗从恒温培养室移出，封口膜半开置于自然光下炼 苗2d 后，去封口膜，在培养基中加入少量蒸馏水后继续在自然光下炼苗3d ，再将 生根苗取出用温水洗净，移入基质中。移栽基质：菜园土：珍珠岩：蛭石= l ：l ： “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 1 ( v ：v ：v ) 。 关键词：“海湾红宝石”李；茎段；离体培养 3 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 s t u d i e so ns t e ms e g m e n t nv i t r oc u l t u r eo fc h i n e s ep l u m ( p r u n u ss a l i c i n al i n d l c v g u l f - r u b y ) a b s t r a c t p r u n u ss a l i c i n a ，ac e n t u r i e s - o l dc u l t i v a t e dh i s t o r yt r e e ，i so n ek i n do fi m p o r t a n tf r u i t t r e e si nc h i n a , a n di t sf r u i t sh a v eg o o dc o l o r , s w e e t - s m e l l i n ga n ds a p o r h o w e v e r ，p l u m p o s s e s s e sn o to n l yl o n g e rj u v e n i l i t yb u ta l s oh i g h e rp i s t i ls t e r i l ea n dh e t e r o z y g o s i t y p l u m i so f t e ni n f e c t e db yv i r u s a d v a n c e si nt i s s u ec u l t u r ea n dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o no fp l u m h a v eo f f e r e dt h eo p p o r t u n i t yt oa c q u i r et h en e wg e r m p l a s mr e s o u r c e s ，s h o r t e nt h e b r e e d i n gc y c l ea n dp r o d u c et h es e e d i n g sf l e ef r o mt h ev i r u s e s t h eo b j e c t i v eo ft h ep r e s e n ts t u d yw a st oe s t a b l i s ht h er e g e n e r a t i o ns y s t e m so fc h i n e s e p l u m ( p r u n u ss a l i c i n al i n d l c v g u l f - r u b y ) t h ei m p o r t a n tf a c t o r ss u c ha ss a m p l i n g s e a s o n ，m e t h o d so fs t e r i l i z a t i o n ，c o m p o n e n t so fm e d i u mu s e dw e r ei n v e s t i g a t e d t h e m a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 d u r i n gt h ea n n u a ls t e r i l i z a t i o no fe x p l a n t s ，u s i n gt h es t e ms e g m e n t so fg u l f - r u b ya s t h ee x p l a n tf o ri n i t i a lc u l t u r e ，t h eb e s ts e a s o nf o rc o l l e c t i n gs a m p l e sw a sf r o ma p r i lt o m a y , i nw h i c hg e r m i n a t i o n r a t ew a sh ig hw i t hl e s sp o l l u t i o n t h eo p t i m a lm e t h o dw a s7 0 a l c3 0s + ( 0 5 n a c l 0 + t w e e n - 2 02 - - - 3d r o p s ) 1 2m i n 2 d i f f e r e n tm e t h o d sw e r ea d o p t e df o rs a m p l e sh a r v e s t i n go fd i f f e r e n tp h a s e s a tt h e e a r l ys t a g eo fg r o w t hf r o ma p r i lt om a y ，t h eo p t i m a lm e t h o dw a s7 0 a l e3 0s + ( o 5 n a c l 0 + t w e e n - 2 02 3d r o p s ) 12m i n a tt h el a t es t a g eo fg r o w t hf r o mj u n et o n o v e m b e r , t h eo p t i m a lm e t h o dw a s7 0 a l c3 0s + ( 1 n a c l o + t w e e n 一2 02 - - 。3d r o p s ) 15m i n d u r i n gt h ed o r m a n c yf r o md e c e m b e rt om a r c h ，t h eo p t i m a lm e t h o dw a s7 0 a l c 3 0s + ( 5 n a c i o + t w e e n 一2 02 , - - 3d r o p s ) 1 5m i n 3 d u r i n gi n i t i a lc u l t u r e t h eo p t i m a lm e d i u mw a sw p m + i b a o 0 5 - - - ，0 1m g l + b a o 5 1 0m g l + g l u c o s e3 0g l + a g a r5 l + v c1 0 l t h ee x p l a n t sw e r ec u l t u r e di n d a r k n e s so rw e r ec o v e r e dw i t hn e w s p a p e r sf o r5db e f o r et r a n s f e r r e dt ow h i t el i g h t 4 d u r i n gs u b c u l t u r e t h eo p t i m a lm u l t i p l i c a t i o nm e d i u mw a sw p m + i b a o 0 5 - 0 1 m g l + b ao 2m g l + k t0 3m g l + g l u c o s e3 0g l + a g a r5 l + v c1 0g l + c h 1 o l t h eo p t i m a ls t r o n gs e e d l i n gm e d i u mw a sw p m + i b a o 0 5 - 0 1m g l + b ao 3 m e , l + g l u c o s e3 0g l + a g a r5 l + v c1 0 l + c h1 o l - 5 t h eo p t i m a lm e d i u mo fr o o t i n gw a s1 2 m s + i b a0 2 - - - 0 5m g l - i - s u c r o s e1 5g l + p g2 0 - - - 4 0m g l t h e yw e r ec u l t u r e di nd a r k n e s sf o r7db e f o r et r a n s f e r r e dt ow h i t e l i g h t 6 t h ea c c l i m a t e dm e t h o do fs e e d l i n g dw a st oo p e nm i d d l eb o t t l e n e c kf o r2da n dt h e n 4 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 o p e n e da l lb o t t l e n e c kf o ra n o t h e r3d w i t ha d d i n gs o m ed i s t i l l e dw a t e ri nm e d i u m t h e s e e d l i n g sw e r et r a n s p l a n t e di nm i x t u r em a d eo fs o i l ，v e r m i c u l i t ea n dp e r l i t e ( 1 ：1 ：1 ) k e yw o r d s ：g u l f - r u b yp l u m ( p r u n u ss a l i c i n al i n d l c v g u l f - r u b y ) ；s t e ms e g m e n t s ；n v i t r oc u l t u r e 5 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 缩略词表 缩略符号 英文 中文含义 a c a c t i v a t e dc h a r c o l活性炭 a l c a l c o h o l酒精 b a 6 - b e n z y l a d e n i n e 6 苄基腺嘌呤 c a c i t r i ca c i d柠檬酸 c hc a s e i nh y d r o l y s a t e 水解酪蛋白 i a ai n d o l e 3 a c e t i ca c i d吲哚乙酸 i b a i n d o l e 3 b u t y r i ca c i d 吲哚丁酸 k tk i n e t i n激动素 m s m u r a s h i g ea n ds k o o g m s 培养基 n a a q - n a p h t h y a l e n ea c e t i ca c i d 萘乙酸 p g p h l o r o g l u c i n o l 间苯三酚 p v p p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e 聚乙烯吡咯烷酮 v cv i t a m i n e c维生素c t d zt h i d i a z u r o n 苯基噻二唑基脲 w p m w o o d yp l a n tm e d i a 木本植物培养基 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是如需保密，解密时间2 0 0 7 年l2 月3 0 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：乡移葜守 时间：劲9 多年莎月乡日 _ j 篡篡锶茹文秒泰忻 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 1 前言 1 1 问题的提出 核果类果树包括桃、李、杏、梅、樱桃等，在我国果树生产中占有重要地位。 目前国内外对桃( 江虎军等，1 9 9 3 ；h a m m e r s c h l a g ，1 9 8 2 ) 、杏( 马锋旺等，1 9 9 9 1 h a r a d a ，1 9 9 6 ) 、樱桃( 阎贤伟，1 9 9 0 ；s w i r ，1 9 8 3 ) 等核果类果树的组织培养研究 进展较快。对李属植物的研究主要集中在一些绿化树种上，如紫叶李( 孙在红等， 2 0 0 5 ) 、欧李( 任清盛，2 0 0 5 ) 、稠李( 刘艳芝等，2 0 0 4 ) 、郁李( 石田雅士和罗勇， 1 9 9 1 ) ，而中国李的研究很少( 胡博然和徐文彪，1 9 9 9 ) 。 李( p r u n u ss a l i c i n a ) 为我国重要的多年生落叶果树，在我国已有3 0 0 0 年以上 的栽培历史，其果色、香、味、质俱佳。但李具有童期较长、雌蕊败育率高、遗传 高度杂合以及易受病毒侵染等特性。李亚属植物主要病毒病有李矮缩病、李痘病、 李坏死环斑病、李线纹斑病等( 王国平和洪霓，1 9 9 7 ；陈君帜和李青，2 0 0 1 ) 。此 外，常规的扦插或嫁接方法繁殖苗木速度较慢、易变异。这些问题已成为影响李生 产发展的重要因素。李离体培养及再生技术体系的建立，不仅是苗木快速繁殖和无 病毒苗木培育的新途径，而且也是开展李生物技术研究如种质资源离体保存、提高 育种效率及遗传转化、创新种质资源等技术的基础。 “海湾红宝石李( p r u n u ss a l i c i n al i n d l c v g u l f - r u b y ) 2 0 0 2 年2 月通过湖北 省农作物品种审定委员会审定。该品种表现为早果丰产，果实外观和内在品质优良， 耐早春( 花期) 低温阴雨，无裂果现象，未发现枝感细菌性穿孔病，特别适宜南方 高温多雨气候条件下栽培。 基于此，本试验以“海湾红宝石”李茎段为外植体，系统研究中国李离体培 养，以期建立较系统完整的离体再生体系，为李树苗木快速繁殖、培育无病毒苗木 以及开展遗传转化、创新种质资源等奠定基础。 1 2 植物组织培养技术 1 2 1 植物组织培养的研究概况 广义的组织培养( t i s s u ec u l t u r e ) 不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物 组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。根据所培养的植 物材料的不同，把组织培养分为5 种类型，即愈伤组织培养、悬浮细胞培养、器官 培养( 胚、花药、子房、根和茎的培养等) 、茎尖分生组织培养和原生质体培养。 由于培养是在脱离植物母体的条件下进行，所以也叫离体培养( nv i t r oc u l t u r e ) 或 6 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 试管培养( c u l t u r ei nt e s t t u b e ) ( 李浚明，2 0 0 2 ；高新一和王玉英，2 0 0 3 ) 。 2 0 世纪初，在细胞学说的推动下，德国植物生理学家h a b e r l a n d t 提出了高等植 物的器官组织可以不断分割，并设想离体细胞具有再生完整植株的潜力，即细胞具 有全能性( t o t i p o t e n c y ) 。由于当时科学发展和技术条件的限制，h a b e r l a n d t 仅在栅 栏细胞中观察到了细胞的生长、细胞壁的加厚和淀粉的形成等，没有观察到细胞的 分裂。但他所提出的科学假说却一直指引着许多植物学者去攀登新的高峰。 2 0 世纪3 0 年代至今，植物组织培养技术得到了迅速发展，大量植物无论是二 倍体体细胞或单倍体性细胞以及原生质体培养均可获得再生植株。近年来，在花药 培养、茎尖与茎段培养、叶片培养、胚和胚乳培养、子房培养、悬浮细胞培养及原 生质体培养上进展都十分迅速( 陈正华，1 9 8 6 ) 。一些发达国家，如美国、新西兰、 法国等分别就花旗松、杨树等主要造林树种，开始工厂化育苗生产，并广泛应用到 造林实践中去，效果良好( 崔德才和徐培文，2 0 0 3 ) 。我国在这方面工作起步较晚， 但发展迅速。目前全世界成功繁殖出试管苗的1 0 0 多个树种中，由我国培育出来的 就有l o 余种，其中杨树、相思、大岛樱、杉木等树种的组培苗技术工艺已经成熟， 进入工厂化生产。 1 2 。2 植物组织培养技术的应用 植物组织培养不仅是植物体细胞遗传学的基础，而且对理论研究和植物基因工 程以及农作物品种改良都具有重要意义。 1 2 2 。1 快速繁殖 营养繁殖是大多数果树、观赏植物及部分蔬菜作物的主要繁殖方式，能保持其 优良特性的遗传稳定性和一致性，克服童期长、种子后代变异大的缺点。传统的嫁 接、扦插等无性繁殖方法繁殖系数低、速度慢、易变异，不能适应现代化生产和市 场需求。组织培养繁殖技术作为植物营养繁殖的一个新手段，其特点是用较短的时 间和较少的空间，由一个微小的器官、组织在很短的周期内产生大量的植株，繁殖 系数大。目前在很多园艺植物如非洲紫罗兰、香蕉、桉树、菊花、兰花及杜鹃等植 物中形成了较大的产业。此外，微繁可以不受季节的影响，进行周年生产，苗相整 齐，收益期一致，且在一定程度上改良了植物性状。因此，离体培养方法已成为一 些园艺植物良种繁育的有力手段，产生了可观的经济效益( 邓秀新和胡春根，2 0 0 5 ) 。 1 2 2 2 苗木脱毒 长期以来，人们已意识到病毒对农作物造成的严重危害，并探讨了各种解决方 法，但收效甚微。随着植物组织培养技术的不断发展和完善，人们已将这一技术应 用到植物脱病毒的生产实践中，并取得了十分理想的效果。目前，通过植物组织培 养技术生产的果树、蔬菜、花卉等脱毒苗，已在国内外的农业生产中得到普遍应用。 病毒在植物体内的分布是不均匀的。在受侵染的植株中，顶端分生组织一般是 不含病毒的，或者是只携带浓度很低的病毒，而在较老的组织中，病毒数量随着与 7 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 茎尖距离的加大而增加( 及华和张海新，2 0 0 1 ) 。分生组织之所以能逃避病毒的侵 染，可能的原因是：( 1 ) 在一个组织内，病毒易于通过维管系统移动，而在分生组 织中不存在维管系统。病毒在细胞间移动的另一个途径是通过胞问连丝，但它的移 动速度很慢，难以赶上活跃生长的茎尖的生长速度。( 2 ) 在分裂旺盛的分生细胞中， 细胞内代谢活跃性很高，从而使病毒无法进行复制。( 3 ) 在植物体内存在着病毒钝 化系统，它在分生组织中应比在任何其他区域都有更高的活性，因而分生组织不受 侵染。( 4 ) 在茎尖中存在高水平的生长素，抑制病毒的复制( 石晓东，2 0 0 5 ) 。 由于这些原因，可以通过茎尖培养脱除病毒。植物脱毒技术和快速繁殖技术的 有机结合，不仅解决了病毒对苗木侵染问题，同时解决了脱毒苗的快速繁殖问题， 而且获得了非常好的经济效益。我国用茎尖脱毒技术控制了马铃薯( 王正新，2 0 0 3 ) 的退化问题，还得到了苹果( 罗晓芳等，1 9 9 6 ) 、梨( 张尊平等，2 0 0 1 ) 、葡萄( 范 丽华和叶旭东，1 9 9 5 ) 、柑桔( 李隆华和黄治远，1 9 9 6 ) 、香蕉( 元谋，2 0 0 0 ) 、草 莓( 刘庆忠等，2 0 0 0 ) 等植物的脱毒苗木，提高了果品的产量和品质。 1 2 2 3 提高育种效率，改良品种 通过对花粉、花药及未授粉子房、胚珠进行培养获得单倍体，可以加速遗传育 种材料的纯合。通常杂种材料须经过4 - 5 代以上的分离和选择才能获得主要性状 纯合的基因型，而获得单倍体后进行人工加倍，只需一个世代就可获得纯合的二倍 体，缩短了育种年限，同时也节省了人力、物力。 园艺植物如一些落叶树种，一般冬季休眠期较长，通过胚培养，可使休眠期缩 短或打破休眠，像蔷薇科植物通过胚培养一年可多繁殖1 代，使桃、杏等杂种后代 早开花。此外，胚培养还用于挽救败育胚。在果树、蔬菜等园艺作物中，远缘杂交、 二倍体作母本与四倍体杂交、一些树种早熟品种及品种内自交或人工杂交等，合子 胚往往在发育的早期阶段就败育或退化，而利用胚抢救技术则可有效地克服这种现 象。柑橘属及其近缘属大多树种和品种存在珠心胚现象，导致在杂交育种中受精胚 退化或败育严重，育种效率极低，但结合幼胚离体培养技术可极大地提高育种效率。 一般来说，以二倍体作母本与四倍体杂交，合子胚有早期退化现象，但通过胚抢救 可获得高比例的三倍体杂种植株。 胚乳是双受精的产物，通过胚乳培养可获得三倍体植株，为获得三倍体丌辟了 一条新途径( 陆瑞菊等，2 0 0 3 ) 。三倍体加倍后得到六倍体植株，此方法可育成多 倍体新品种( 刘世强等，1 9 9 2 ) 。 1 2 2 4 种质资源保存 世界种质资源同益枯竭，大量有用基因丢失，特别是那些无籽或种子寿命短的 植物更严重。植物种质保存已引起科学家和各国政府极大重视。近年来，采用组织 和细胞培养法低温保存种质，给保存和抢救有用基因带来希望。如将胡萝b 和烟草 等植物的细胞悬浮物，在2 0o c 1 9 6o c 的低温下贮藏数月，尚能恢复生长，再生 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 成植株( 潘瑞炽，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 5 生理生化、细胞学、遗传学等领域的基础研究 利用组织培养技术，在人工控制的环境条件下进行植物生理生化、细胞学、遗 传学的研究比较普遍。在园艺作物中体细胞突变是一种比较常见的现象，利用体细 胞突变是主要育种途径之一。但对体细胞突变机制的研究十分薄弱。而离体培养过 程中产生的变异即体细胞无性系变异由于材料来源广泛、发现早、母本清晰，因而 其机制的研究进展也相对地较为迅速，这为体细胞的变异研究提供了有益的借鉴。 1 3 李及核果类果树组织培养研究进展 1 3 1 茎尖和茎段培养 茎尖培养是培育无病毒植株的一个重要途径。根据茎尖培养的目的和取材大小 可分为茎尖分生组织培养和普通茎尖培养两种类型。2 0 世纪9 0 年代以后大量采用 热处理和茎尖培养相结合培育无病毒苗木的方法在核果类果树上得到了广泛的应 用( 伍克俊等，1 9 9 6 ) 。 在李茎尖培养中，外植体可选用当年生幼嫩枝条和休眠季枝条。胡博然等 ( 1 9 9 9 ) 选用中国李“红美丽”和“晚红李 休眠枝条通过茎尖和带芽茎段培养成 苗。覃兰英等( 1 9 9 7 ) 在樱桃和桃休眠后取材进行培养，结果其成活率均高于生长 期和休眠前期。王然等( 1 9 9 5 ) 试验表明：矮樱桃在3 - - 一5 月份取材，只需消毒一 次，外植体的污染率可控制在8 3 以下，且在继代培养时，芽的增殖情况优于其 他时期取材的芽。 消毒方法因植物材料的种类和采集时期而异。一般先将外植体浸入稀释的肥皂 液中浸泡，再用软刷子轻轻刷去表面的尘土和部分细菌，然后用自来水冲洗肥皂液 和污物( 朱广廉，1 9 9 6 ) 。接种前先用7 0 的酒精表面消毒2 0s ，再用o 1 o 2 的升汞消毒8m i n ，或者用0 5 的次氯酸钠表面杀菌1 5m i n 。f o u a d 等( 1 9 9 5 ) 研 究表明，外植体采用o 5 次氯酸钠表面杀菌1 5 - - 一2 0m i n 比用1 0 的次氯酸钙或0 2 的升汞处理芽的成活率高。h a m m e r s c h l a g ( 1 9 8 2 ) 比较了5 种消毒方法的效果， 结果是使用o 5 次氯酸钠+ o 0 1 吐温浸泡1 5 一- 2 0m i n ，然后用1 0 0m g r 青霉素 和链霉素混合液处理1 5m i n ，无菌水冲洗3 次的消毒方法污染最轻。消毒处理时间 过长会对材料本身产生杀伤作用，使外植体变褐，影响成活率( 钟晓红等，2 0 0 3 ) 。 严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区内长度不超过0 1m m 的范围，但操 作难以进行，也不容易培养成功。因此，实际工作中绝大多数的试验所取茎尖均超 过了该范围( 张宇和，1 9 8 4 ) 。综合目前研究，中国李茎尖或茎段培养操作程序是： 切取o 3c m 左右的茎尖和带芽茎段，接种于改良m s ( 1 2n h 4 n 0 3 ) 附加0 5 琼 脂粉、3 葡萄糖或蔗糖及不同浓度b a 的增殖培养基中，每3 5d 继代一次。进行 生根培养时，切取 1 0c m 的新梢接种于1 2 m s 附加不同浓度i b a 和1 5 蔗糖的 9 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 生根培养基中。为促进生根，先进行7d 左右的暗培养，然后置于光下培养。整个 培养过程中，培养基的p h 值在高压灭菌前用n a o h 或h c i 调至5 8 ，培养温度为 ( 2 54 - 1 ) oc ，光周期为1 5h 光照9h 黑暗，光照强度为3 0 0 0l x 。 1 3 2 胚培养 自t u k e y 进行甜樱桃幼胚培养研究以来，其培养基( t u k e y 培养基) 和研究方 法后来被广泛应用并扩大到其他作物( 王玉柱等，2 0 0 4 ) 。 李胚培养一般采用成熟胚( 即子叶期后至发育完全的胚) 较易成功。在含有大 量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。因此，对成熟胚的培养来说，不是 寻找合适的培养基和培养条件，而主要是用胚培养来研究胚发育过程的形态建成、 生长物质的作用、各部分的相互关系及营养要求等生理问题。胚龄大小( 胚的发育 指数) 与胚培养成苗率存在正相关关系。幼胚培养成功仅限于少数植物，如番茄、 大麦等。国内外目前对李树幼胚培养的报道很少。r a m m i n g 和刘用生曾诱导盛花后 7 1 0d 的桃胚珠( 胚处于二细胞原胚期) ，结果仅达到1 7 的成活率，充分说明 胚龄是胚培养成功的关键因素之一( r a m m i n g ，1 9 9 0 ；刘用生等，1 9 9 1 ) 。 取硬熟期的果实种子，无菌条件下7 0 的酒精消毒1m i n ，o 1 升汞消毒1 0 m i n ，无菌水冲洗4 次，拨开种皮取出胚直接接种于含有不同生长调节剂与活性炭 ( a c ) 组合的改良m s 培养基中，不经过低温处理直接放在培养室中进行培养。刘 用生等( 1 9 9 3 ) 试验表明，凡是不含6 b a 或g a 3 的组合均无胚的萌发，说明6 - b a 或g a 3 均可打破胚休眠。通常桃、李胚培养前需要在2 - - 一4 o c 下放置3 - - 一5 个月才 能打破胚的休眠，萌发成正常的试管苗( 中国科学院北京植物研究院五室形态组和 北京市农业科学研究所林业室果树组，1 9 7 4 ；m a n t ee ta 1 ，1 9 9 0 ) ，不经过低温处理 的胚，也能越过休眠萌发成苗，但茎顶端呈莲座状，植株矮化。 1 3 3 原生质体培养 关于核果类果树原生质体培养的研究很少，仅马锋旺等( 1 9 9 8 ，1 9 9 9 ) 报道了 对中国李原生质体分离培养及山杏原生质体培养。整个原生质体培养过程分为三 步：( 1 ) 材料准备：供试材料在改良m s ( 1 2 n h 4 n 0 3 ) 附加b a1 0m g l ，i b a0 0 5 m g l ，p v p ( 聚乙烯吡咯烷酮) 1 0m g l ，琼脂粉5m g l ，蔗糖3 0m g l 的培养基 上生长的茎尖培养新梢，在改良m s 附加2 ，4 d1 0 m g l 、b a0 5m g l 的培养基 上生长的种胚愈伤组织，以及在相同成分液体培养基上培养在1 2 0r m i n 的摇床上 培养的悬浮培养物。( 2 ) 原生质体的分离和培养：先用1 0 0 目不锈钢丝网过滤，收 集滤网上的细胞团，按材料：酶液= l ：1 0 的比例放入己抽滤的混合酶液中。3 0 0 c 保温4 - - 一6h ，酶解过程轻轻摇动数次。酶解液用2 0 0 目不锈钢丝网过滤，滤液以5 0 0 r m i n 离心1 0m i n ，弃上清液，原生质体用含有o 6 5m o l l 甘露醇、o 。0 1m o l lc a c l 2 、 0 7m m o l lk h 2 p 0 4 和0 3 葡聚糖硫酸钟原生质体洗液洗2 次，再用原生质体培养 液洗1 次。混合液组成为原生质体洗液加2 o 纤维素酶和o 5 果胶酶，p h 值为 l o “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 5 8 ，0 4 5i x r n 滤膜微孔过滤。采用液体浅层培养法在黑暗下培养，培养基为k m 8 p 和改良m s 附加不同种类和浓度的激素及渗透压调节剂。每1 0d 加入原培养基量 1 3 的新鲜培养基，培养1 0d 和3 0d 分别统计原生质体分裂频率和植板率( 马锋旺 和李嘉瑞，1 9 9 8 ) 。在原生质体分离期间，酶解液会对细胞膜产生伤害作用( 王丽 莉和贾敬芬，1 9 9 4 ) 。悬浮培养物可能更易承受酶的作用，在酶解分离后原生质体 活性高，细胞分裂能力强，因此，以悬浮培养物为材料，可获得更多的具活力的原 生质体。( 3 ) 植株再生：p h 值5 8 ，培养温度为( 2 5 1 ) o c ，光周期为1 5h 光照 9h 黑暗。除愈伤组织的分化在4 0 0 0l x 的光强下，其余需光的材料均在3 0 0 0l x 光强下培养。 尽管原生质体培养为品种选育和创新开辟了新途径，但通过原生质体培养获得 再生植株的周期较长，其原生质体能分化成植株的难度较大，难以满足生产上的需 要。此外，核果类果树原生质体分离和培养过程中褐化严重，影响了原生质体的产 量和质量。目前这些是制约原生质体培养的重要因素，也是今后研究的方向。 1 3 4 叶片培养 b a r b a r a 等( 2 0 0 4 ) 采用欧洲李无菌试管苗上第2 3 片完全展开的带叶柄叶片， 将叶片末梢部分去掉，剩下的部分用刀垂直于中脉横切三刀，远轴面放在附加有硫 胺1m g l 、维生素b 6o 5m g l 、烟酸0 5m g l 、肌醇1 0 0m g l 、柠檬酸1 0m g l 、 氨基乙酸2 0m g l 、2 ，4 一d0 2m g l 、t d z1 6 5m g l ，酪蛋白水解物1 0 0m g l ， 维生素c ( v c ) 1 0m g l 的改良m s 培养基上进行培养，并得到试管苗。在培养的 过程中，首先要迸行大约3 周的连续黑暗培养，然后转到光下培养3 周，光周期为 1 6h 光照8h 黑暗，每月继代一次。 1 3 5 李及核果类果树组织培养的影响因子 1 3 5 1 培养基 ( 1 ) 基本培养基：李离体培养主要以m s 或改良m s 为基本培养基( 马锋旺和 李嘉瑞，1 9 9 8 ) ，但也有用l s 培养基( 孙清荣和孙洪雁，1 9 9 9 ) 。石田雅士等( 1 9 9 1 ) 认为培养基中高浓度的硝态氮和氨念氮降低郁李的增殖率和成活率。e m e r s h a d 等 ( 1 9 9 4 ) 采用c 2 d 、m m s 和w p m 培养基对李属桃、油桃和中国李5 1 0m i l l 幼 胚进行培养，结果c 2 d 和w p m 培养基能够使所有供试材料都有高的成苗率。对于 中国李的胚进行培养时采用c 2 d 培养基更为理想。 ( 2 ) 碳源种类：蔗糖是常用的碳源。b a r b a r a 等( 2 0 0 4 ) 对欧洲李离体叶片培 养的研究表明，在器官形成的过程中，适宜的蔗糖浓度作为碳源的效果优于葡萄糖， 2 ( w v ) 的蔗糖浓度能使叶片的器官再生率达到6 5 5 ，而相同浓度的葡萄糖器 官再生率仅为5 0 ，且随着浓度的升高，器官再生率降低。目前，在组织培养中碳 的吸收和新陈代谢的机理尚不清楚。有报道认为糖的吸收利用是通过质膜质子泵 a t p a s e 作用完成的，也有人提出是通过磷酸化作用以不同的途径进入细胞液( d e “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 r i e ke ta 1 ，1 9 9 7 ) 。山梨醇是蔷薇科果树主要的光合产物和运输形态( 李嘉瑞和马 锋旺，1 9 9 1 ) 。与蔗糖相比，山梨醇作碳源时芽的增殖倍数大，而生根率低( 马锋 旺和王飞，1 9 9 6 ) 。胡博然等( 1 9 9 9 ) 研究结果表明，山梨醇作碳源生根率( 4 0 1 ) 和根条数( 1 4 ) 均显著低于蔗糖的生根率( 8 2 4 ) 和根条数( 2 8 ) 。郁李茎 尖培养时山梨醇作碳源比蔗糖作碳源生长率高，且新芽发生数量也多，鲜重多5 ( 石田雅士和罗勇，1 9 9 1 ) 。马锋旺等( 1 9 9 6 ) 也认为尽管山梨醇作碳源时芽的增 殖倍数虽高于蔗糖，但新梢生长不良。以上充分说明山梨醇和蔗糖只是在器官发生、 生长和形态建成方面具有不同作用，考虑到山梨醇的成本较高，适当降低蔗糖浓度， 对生根无不良影响且可以降低成本，故中国李离体繁殖时用蔗糖为宜。 ( 3 ) 植物激素：为了促进组织和器官的生长，有必要在培养基中加入相应的 生长调节物质。影响不定芽生根的生长调节物质有n a a 、i a a 和i b a ( f o u a de ta 1 ， 1 9 9 5 ；h a m m e r s c h l a ge ta 1 ，1 9 8 7 ) 等。从中国李茎尖培养的增殖倍数和生长两方面 来看，b a1 0m g l 和i b a0 0 5 - - 0 1 m g l 是最适用的。若单用b a 时增殖倍数较低， 加长生长很差。在b a1 0m g l 和i b a0 0 5m g l 的基础上，附加0 5 - - 2 0m g l 的 g a 3 ，可促进新梢的伸长生长，但对增殖无明显影响，其中以1 0m g l 效果最好， 大于1 0c m 的新梢为3 4 6 ，比对照( 2 1 8 ) 提高了1 2 8 ( 胡博然和徐文彪， 1 9 9 9 ) 。种胚的低温处理也是影响桃、杏和李等核果类胚培养成功的关键因素之一。 刘用生等( 1 9 9 3 ) 曾经用g a 3 、6 b a 、i b a 和a c ( 活性炭) 对不经过低温处理直 接培养的李胚进行研究，结果表明g a 3 、6 b a 均可打破胚的休眠，胚可以正常萌 发。在桃上进一步研究得到培养的试管苗不如低温处理7 0d 的生长的好( 刘用生等， 1 9 9 3 ) 。a c 对试管苗根、茎的生长有良好的促进作用( b u s t a m a n t ea n dp a y r o ，1 9 9 1 ； 贾春兰等，1 9 9 2 ) ，可能是通过吸附而发生作用的，每毫克a c 大约能吸附1 0 0 g 的生长调节物质( b 学贤和陈维伦，1 9 8 8 a ) 。有关a c 吸附何种物质和吸附能力尚 缺乏直接和确切的证据。t d z 具有极高的细胞分裂素活性，能促进芽的增殖。t d z 在对木本植物的离体芽增殖时具有很显著的促进作用( 徐华松等，1 9 9 6 ) 。曾有人 用5 1 2 5g m t d z 诱导欧洲李子叶，获得了再生芽( m a n t ee ta 1 ，1 9 8 9 ) 。 1 3 5 2 培养环境条件 在李的组织培养中，培养温度通常采用( 2 5 _ - - 4 - 1 ) o c ，1 5 1 6h 光照8 - - 一9h 黑 暗的光周期，3 0 0 0l x 光强。在此培养条件下有利于组培苗芽的增殖分化、新梢生 长和生根。m u l e o 等( 1 9 9 7 ) 采用不同光源对芽的分化进行了研究，结果表明不同 光源对樱桃李茎的伸长没有影响，但在蓝光和白光培养条件下，芽的数量明显增多， 节间距变短。在红光和远红光条件培养下，侧芽的生长量高于白光、蓝光和黑暗条 件下，这种作用是因为红光和远红光可以打破顶端优势，促进光敏色素的合成。总 之，在蓝光和白光生长条件下，生长不如红光和远红光条件下。在顶端光敏色素的 形成中，蓝光有时候还起相反作用。受试验条件的影响，在培养期间，通常采用日 1 2 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 光灯进行光培养，在培养前期，应进行适当时间的黑暗培养，尤其是在欧洲李叶片 培养中( b a r b a r ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 此外培养基的p h 值、无机盐浓度、母本树的树龄、胚龄等都会影响李树组织 培养的效果。 1 3 5 3 存在的问题 在中国李及其他核果类果树的组织培养过程中，外植体褐变死亡是常见的问题 之一，给诱导脱分化和芽再生造成重大障碍。这是由于外植体中存在酚类物质，被 多酚氧化酶激活，产生棕褐色的醌类物质使组织变褐。其次，在离体培养中“玻璃 化”现象极为常见，这是一种生理病变。再者，生根困难也是李树组织培养过程中 常见的问题，许多研究结果均表明核果类果树的组织培养中存在着生根困难的问题 ( 钟晓红等，2 0 0 3 ) 。 1 4 本试验研究目的与内容 综上所述，前人在桃、杏、樱桃等核果类果树组织培养方面已经做了大量工作， 不但成功建立离体再生体系，而且有些已进行转基因技术的研究。但目前对中国李 离体再生研究较少，尤其是对栽培种组织培养的研究更少。“海湾红宝石”李特别 适宜南方高温多雨气候条件下栽培，目前在这方面的研究尚未见报道。鉴于此，本 试验以“海湾红宝石”李茎段为试材，期望建立较完善的离体再生技术体系，丌辟 苗木快速繁殖和无病毒苗木培育的新途径，并为今后种质资源离体保存、遗传转化 和种质资源创新等奠定基础。主要研究内容如下： ( 1 ) 外植体消毒； ( 2 ) 初代培养基的筛选和优化； ( 3 ) 对继代培养中增殖、伸长进行研究； ( 4 ) 针对褐化现象进行防褐变研究； ( 5 ) 对生根进行研究； ( 6 ) 试管苗的移栽。 “海湾红宝石”李茎段离体培养研究 2 材料与方法 2 1 试验材料 外植体取自华中农业大学果树试验园3 年生“海湾红宝石 李( p r u n u ss a l i c i n a l i n d l c v g u l f - r u b y ) 枝条。 2 2 技术路线 外节一黼赠一融种7 弋t i l土 图1 中国李茎段离体培养技术路线 f i g 1t e c h n i c a lp r o c e s so fc h i n e s ep l u ms t e ms e g m e n