（微生物与生化药学专业论文）抗癌融合蛋白egfsea的构建与表达.pdf

i 煳幽 天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成 果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经发表或 撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 同期：年月同 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科技 大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 同期：年月同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权天 津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密il ( 请在方框内打“j ”) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密i g ( 请在方框内打“”) 。 作者签名：爱分氏同期：7 p p 尹年伍月 同 导师签名：日期：年月同 摘要 本论文选用人体表皮生长因子( e g f ) 与金黄色葡萄球菌肠毒素a ( s e a ) 为材料，通 过基因工程手段构建一种新型的抗癌融合蛋白e g f s e a 。主要研究内容及结果如下： ( 1 ) 人工合成人体表皮生长因子( e g f ) 基因与金黄色葡萄球菌肠毒素a ( s e a ) 基 因，s e a 基因前面添加一段连接肽序y u 0 i n k e r ) ，两基因的两端均添加了限制性酶切位 点，以便进行融合和克隆到合适的载体上，并对两基因进行密码子优化，以适合在大 肠杆菌中进行表达。 ( 2 ) 选用p e t 4 0 b 作为表达载体，将人工合成的s e a 与e g f 基因经过酶切、连 接反应克隆至p e t 4 0 b 上，然后对构建的重组质粒进行菌落p c r 和双酶切鉴定，最后 进行序列测定，结果分析表明成功构建重组表达质粒p e t 4 0 b e g f s e a 。 ( 3 ) 选用p e t 2 2 b 作为表达载体，从p e t 4 0 b e g f s e a 上切下e g f s e a 片段克 隆至p e t 2 2 b 载体上，菌落p c r 、双酶切鉴定以及序列测定表明成功构建重组质粒 p e t 2 2 b e g f - s e a 。 ( 4 ) 将构建的两种重组质粒分别电转化大肠杆菌b l 2 1 ，融合蛋白在宿主菌中以 包涵体的形式表达，表达量约占总蛋白量的3 0 以上。对包涵体进行洗涤、变性与透 析复性，复性回收率达6 2 与6 7 。 ( 5 ) 用h i s b i n dk i t 试剂盒分别对两载体表达的融合蛋白进行纯化，蛋白纯度达 9 0 以上，用e t a g 抗体纯化柱对p e t 2 2 b 表达的融合蛋白进行纯化，抗体亲和柱饱 和度过低，但蛋白纯度达9 5 。 ( 6 ) 委托大连宝生物工程公司构建重组质粒p e g f p n 1 e g f s e a ，用脂质体转染 法将其转入乳腺癌细胞m c f 7 ，融合基因在真核细胞中进行了表达，并能观察到荧光。 用g 4 1 8 筛选出稳定转染细胞并分离出单克隆菌株。 关键词：e g f 基因；s e a 基因；融合蛋白；原核表达：包涵体；纯化；真核表达 a b s t r a c t i nt h i sr e s e a r c h ，t h ee p i d e r m i sg r o w t hf a c t o r ( e g f ) g e n ea n ds t a p h y l o c o c c a l e n t e r a t o x i na ( s e a ) g e n ew e r ec h o s e nt oc o n s t r u c tf u s i o np r o t e i ne g f - s e ab yg e n e t i c e n g i n e e r i n gm e t h o d t h em a i n l ys t u d yc o n t e n ta n dr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) e g fa n ds e as e q u e n c ew e r eo p t i m i z e da n ds y n t h e s i z e da n dal i n k e rw a sa d d e dt o n - t e r m i n a lo fs e a s t i l l ，a p p r o p r i a t er e s t r i c te n z y m es i t e sw e r ed e s i g n e dt ob o t he n d so f t w og e n e st oc o n s t r u c te g f - l i n k e r - s e aa n dc l o n et op l a s m i d sw eh a v ec h o s e n ( 2 ) e g fa n ds e aw e r eb o t hc l o n e dt op l a s m i dp e t 4 0 ba n dp e t 2 2 br e s p e c t i v e l yt o g i v eb i r t ht or e c o m b i n a n tp l a s m i d sp e t 4 0 b - e g f - s e aa n dp e t 2 2 b e g f - s e a p c ra n d r e s t r i c t i o ne n z y m ed i g e s t i o na n a l y s i sp r o v e dt h a tw eh a v ec o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n t p l a s m i d ss u c c e s s f u l l y f u r t h e r ， g e n es e q u e n c i n gr e s u l th a v ec o n f o r m e dt h a t ( 3 )r e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s f o r m e di n t ob l 21a n ds d s p a g ea s s a y r e v e a l e dt h a tf u s i o np r o t e i nw e r em a i n l ye x p r e s s e di ni n c l u s i o nb o d y ，a c c o u n t i n gf o r3 0 o fc e l lt o t a lp r o t e i n a f t e rw a s h i n ga n dd e n a t u r a t i o n ，i n c l u s i o nb o d yw a sr e n a t u r e di n s u i t a b l eb u f f e ra n dr e c y c l er a t ec o u l dg e t6 2 a n d 6 7 ( 4 ) h i s b i n dk i tw a su s e dt op u r i f i e dt h ef u s i o np r o t e i nw h i c he x p r e s s e db yp l a s m i d p e t 4 0 ba n dp e t 2 2 b f i n a l l y ，t h ep r o t e i np u r i t yc o u l dr e a c ha b o u t9 0 e t a gk i tw a sa l s o e m p l o y e dt or e f i n ef u s i o np r o t e i ne x p r e s s e db yp e t 2 2 bt od i s c o v e rt h a ts a t u r a t i o no fe t a g w a sl o wb u tp r o t e i np u r i t yw a sh i 曲l ya b o u t9 5 ( 5 ) p e g f p n 1 e g f s e aw a sc o n s t r u c t e db yt a k a r ab i o t e c h n o l o g yc o m p a n y ( d a l i a n ) a n dt r a n s f e c t e di n t om a m m a r yc a r c i n o m ac e l lm c f - 7b yl i p f e c t a m i n e f u s i o n p r o t e i nc o u l de x p r e s si nt h i se u k a r y o t i cc e l la n df l u o r e s c e n c ec o u l db es e ew i t hf l u o r e s c e n t m i c r o s c o p e g 4 18w a su s e dt os c r e e ns t a b l et r a n s f c c t e dc e l la n ds i n g l ec l o n ew a ss e p a r a t e d b yd i l u t i o n k e yw o r d s ，e g fg e n e ：s e ag e n e ：f u s i o np r o t e i m i n c l u s i o nb o d y ；p u r i f i c a t i o n 目录 l1 辩言“1 1 1 超抗原的发现1 1 2s e a 的结构及其重要功能位点l 1 3s e a 的生物学活性”3 1 4 超抗原s e a 的免疫识别机制：3 1 5t 细胞v p 受体在s e a 介导的病理中的作用4 1 6s e a 抗肿瘤作用机制”5 1 7s e a 抗肿瘤研究进展”6 1 8 超抗原抗肿瘤应用现状7 1 8 1 单独使用超抗原7 1 8 2 单抗靶向性8 1 8 3 超抗原的抗肿瘤基因治疗9 1 8 4 超抗原修饰的肿瘤细胞疫苗9 1 9 表皮生长因子的研究进展”1 0 1 1 0 融合蛋白e g f s e a 的抗癌机制”1 2 1 1 1 立项背景12 1 1 2 研究内容1 3 2 材料与方法1 4 2 1 材料1 4 2 1 1 菌株与质粒1 4 2 1 2 试剂”l4 2 1 3 工具酶及试剂盒”1 4 2 1 4 抗生素l5 2 1 5 主要仪器1 5 2 1 6 相关溶液l6 2 1 7 培养基l7 2 2 方法17 2 2 1 重组基因的克隆1 7 2 2 2 重组基因在b l 2 1 ( d e ) 中的表达”2 2 2 2 3 目的基因在m f c 7 中的表达2 5 3 结果与讨论2 8 3 1 基因合成2 8 3 2 基因的克隆。，o 3 2 1 重组质粒p e t 4 0 b e g f s e a 的构建2 9 3 2 2 质粒p e t 2 2 b e g f s e a 的构建3 3 3 2 3 小结3 6 3 3 目的基因在大肠杆菌b l 2 1 中的表达3 6 3 3 1 目的蛋白的表达3 6 3 3 2 表达蛋白的定位3 7 3 3 3 包涵体的洗涤与溶解3 9 3 3 4 包涵体的复性4 0 3 3 5 目的蛋白的纯化4 1 3 3 6 小结4 2 3 4 目的基因在乳腺癌细胞m c f 7 中的表达4 2 3 4 1 质粒p e g f p n l 的选取4 2 3 4 2 目的基因在m c f 7 中的表达4 3 3 4 3 小结。4 6 4 结论4 7 5 展望j 4 8 6 参考文献4 9 7 论文发表情况5 5 8 致谢5 6 n 天津科技大学硕士学位论文 前言 1 1 超抗原的发现 超抗原( s u p e r 肌t i g c n ) 是一类能直接激活某些t 细胞亚型或b 细胞亚型的结构上相 似的一类蛋白质。早在1 9 7 0 年，p e a v y t l 】等发现有些分子具有丝裂原样作用，能激活 的t 细胞数量远远超过一般抗原。但又发现它们与一般的抗原相似，刺激t 细胞时需 与m h ci i 类分子结合。十余年后，随着这类抗原的不断发现及其作用机制研究的不 断深入，人们发现这是一类很独特的抗原。w h i t e 2 等( 1 9 8 9 年) 将具有这种性质的抗原 称为“超抗原 。超抗原作为一类强大的免疫激活因子，可激活t 、b 、a p c 、n k 等 细胞，引起众多细胞因子释放。另一方面，也可导致免疫抑制、免疫耐受和无能应答。 迄今已发现两类形式的超抗原，一类为内源性超抗原，由病毒产生；另一类为外 源性超抗原，绝大多数为细菌分泌的外毒素，其中研究较为广泛的有由葡萄球菌产生 的葡萄球菌肠毒素( s t a p h y l o c o c c a le n t e r a t o x i n s s e s ) 。 葡萄球菌肠毒素是一类重要的细菌超抗原，于1 9 5 9 年被首次鉴定【3 】。它们由某些 金黄色葡萄球菌产于胞外，可溶于水，分子量在2 7 3 0 k d 之间，能够作用于免疫系 统，是导致革兰氏阳性菌所引起的中毒性休克、食物中毒和自身免疫性疾病的重要原 因之一。根据血清学反应，可把s e s 分为s e a ，s e b ，s e c i ，s e c 2 ，s e c 3 ，s e d 和 s e e 七种类型。自本世纪3 0 年代以来，许多学者分别对肠毒素进行了生化、病理、 生理、分子遗传学等方面的大量研究，积累了丰富的资料。近年来，随着研究的不断 深入，人们发现葡萄球菌肠毒素还是非常有价值的工具药物，是极好的免疫调节剂和 高效细胞因子诱导剂【4 】。它可作为淋巴细胞的促有丝分裂原，能够刺激淋巴细胞产生 白介素、干扰素和肿瘤坏死因子等【5 j ，这对分子免疫学及抗肿瘤的研究均有很重要的 意义。 1 2s e a 的结构及其重要功能位点 。 s e a 是金黄色葡萄球菌分泌到胞外的一种单亚基蛋白质，它的前体由2 5 7 个氨基 酸组成，包括n 末端2 4 个残基构成的信号肽序列。前体经信号肽酶加工后转变成具 有2 3 3 个氨基酸的成熟s e a 分子，分子量约2 7 k d ，对酸和热稳定。在其分子中心有 一个由二硫键构成的环，该环的完整性是s e a 活化t 细胞所必需的。s e a 的二级结 构( 如图1 1 所示) 含有较低比例的a 螺旋和高比例的p 片层以及p 转角结构，通常认 为这种丰富的d 片层结构将有利于它和细胞表面受体之间附着。 s e a 激活t 细胞的功能与和m h c1 1 分子的相互作用密切相关。为了确定s e a 与 m h c1 1 分子的作用位点，s e h a d t 6 】等将s e ac 末端和n 末端的多个位点进行了丙氨酸 ( a ) 替代突变，结果发现s e a 与m h ci i 有两个不同的结合部位。第一个高亲和力作用 位点是由s e ac 末端的h 1 8 7 ，h 2 2 5 ，d 2 2 7 与m h c i ib 链的h 8 1 组成的，并有z i l 2 + 离子的参与，它们的相互作用主要影响t 细胞增殖能力的强弱。第二个低亲和力作用 i 前言 d o m m 嬲：。l2 ： j e i c z i i 蹦烈仉纛棵曩氙o a f 再l a 讯脚lw 垤双 冀t 科鬈1 3 霄扎q 孵t l 取钟孵 x v ，l 帆飘弼髀一 u t w r n 俄甏啊懈l 翻l q 劓l 托g 啊c n 亿 w 零矽n 智婚麓硐，飘a l - i 籽礤r 酉弋嚣、f 1 矿司r 奄r 蕊1 葡1 万气r 湘- ，矧_ 自h 椭- 图1 - 1s e a 的二级结构模拟图 f i g ) l - ls e c o n d a r ys t r u c t u r em o d e lo fs e a 位点类似于s e b ，是通过s e a 的f 4 7 与m h c l l 0 l 链的q 1 8 和k 3 9 构成的，它们之间 的相互作用将影响受刺激t 细胞的t c r 谱的范围。具体过程是s e a 的c 末端先与 m h ci id 链结合，然后触发第二个s e a 的n 末端与m h ci i 仅链结合，形成 s e a 2 m h ci i 或s e a m h c i i2 三聚体。最终在抗原递呈细胞的表面形成 m h ci in s e a n 多聚体。从而发挥强大的激活能力，加速抗原的递呈。进一步的研究 结果证实 7 1 ，s e a 的两个结合位点必须同时与m h ch 连接才能获得最大的超抗原活 图1 2s e a 的三级结构 f i g 1 - 2t e r t i a r ys t r u c t u r em o d e l o fs e a 2 ， 天津科技大学硕r 上学位论文 性。如h 2 2 5 ，d 2 2 7 被a 替代将导致与m h c i i 亲和力下降1 0 0 0 倍；f 4 7 敬a 替代可 导致与m h ci i 亲和力降低1 0 倍；c 末端和n 末端的几个位点同时被替换将完全失去 结合能力，将导致m h c i i 依赖的t 细胞增殖能力减弱或消失。 s e a 上另一个重要功能区是它和t c r 相互作用的部位，m o l l i c k i s 等人利用 s e a s e e 嵌合基因法，确定了s e a 诱发t 细胞v p 特异性的部位主要在c 末端的1 6 0 - - 2 1 9 位之间，1 6 0 - 1 6 7 ，1 8 7 1 9 6 ，2 0 0 - 2 0 7 三个区域可能单独或联合决定v d 的特 异性。进一步的研究发现【9 】，c 末端的个别位点对t c r 的选择也有协同作用，它们可 能在空间构象水平上影响t c r 的选择。 1 3s e a 的生物学活性 s e a 及其他金黄色葡萄球菌肠毒素具有共同的生物学活性，它们都引起灵长目动 物胃肠道毒性，鼠细胞抗体应答的抑制以及对人和鼠淋巴细胞的多克隆刺激【1 0 1 。其临 床症状表现为人的食物中毒，休克，皮肤灼伤，对鼠则引起快速失重甚至死亡【l i 】。 所有的金黄色葡萄球菌肠毒素具有相同的作用机制。它们都能与人或鼠的抗原呈 递细胞表面的m h ci i 抗原结合，形成s e s m h ci i 抗原复合物【1 2 1 。此复合物对t c r 上的v p 部位有特异性识别【1 3 】，并通过v b 激活t 细胞【川。s e a 的病理效应部分或全 部地由它们快速激活大量t 细胞所引起。 1 4 超抗原s e a 的免疫识别机制； 超抗原是强大的免疫激活剂，可以激活5 - , 2 0 的t 细胞。超抗原结合手t 细胞表 面t c r 可变区的p 链( v p ) u 绷。与普通抗原不同，超抗原不需要抗原递呈细p 孢( a p c s ) 的内化和处理，以完整蛋白形式结合于m h c i i 肽结合槽的外侧( 图1 2 ) 。超抗原具有 m h c i i 依赖性，但没有m h ci i 限制性 2 0 - 2 1 1 。即a p c 的m h ci i 等位基因不一定要与 t 细胞的等位基因相符，甚至异基因的m h c1 1 分子也可起作用。超抗原通常与m h ci i 相连后以更大的亲和力与t c r 相结合，m h ci i s a g - t c r 三合体的形式使每一个二 合体的相互联系更加稳定。尽管有报道称超抗原如s e b 可以直接激活m h ci i t 细胞 克隆和杂交瘤中的v d 。t 细胞亚群，但总的来说，m h c i i 在与超抗原结合和随后t 细 胞的激活中起到非常重要的作用【捌。， ： s e a 的两端有两个独立的m h c1 1 分子结合位点【2 3 - 2 4 】，二者间存在协同作用。在 锌离子介导下，s e a 的c 末端h 1 8 7 ，h 2 2 5 和d 2 2 7 与h l a 分子多态d r l p 链的h 8 1 以高亲和力结合。n 末端的f 4 7 与h l a d r l a 链以低亲和力结合，此结合位点与s e b 的m h ci i 结合位点一致，二者可竞争结合。s e a 的最佳免疫激活作用需要两个结合 位点的共同参与。两个s e a 分子可结合于一个a p c 上，一个s e a 分子可以结合两个 a p c s ，或者连接一个a p c 表面上的两个m h c1 1 分子，从而不仅可使s e a t c r 稳定 结合，还可同时激活a p c 【2 5 l 。s a g - m h c1 1 交联的性质和数量可能影响受超抗原刺激 t 细胞的结局，包括t 细胞v b 亚群的活化、增殖、克隆删除或免疫无能【捌。锌离子 结合的丧失与h l a - d r l 亲和力的下降及淋巴细胞增殖能力的降低有着直接的关系 1 1 0 - 1 川。s e a 与h l a - d r l 高亲和力结合位点亲和力的降低不影响s e a 激活t c rv d 吞 i 前言 亚群的特异性【2 7 1 。而与c 末端点突变相比，s e a 的n 末端m h c i i 的结合位点的点突 变对s e a 与m h c i i 的结合力及t 细胞激活能力影响较小，但对t c r v p 特异性选择 有较大影响。这提示了低亲和力结合位点对t c r 结合较重要，而高亲合力结合位点 对m h ci i s e a 结合稳定性较重要8 1 。 表1 1 超抗原与普通抗原的比较 t a b l e 1 - 1s u p e r a n t i g e n s 、，sc o n v e n t i o n a la n t i g e n s 如果将位于s e a 第2 2 5 位的组氨酸和第2 2 7 位的天门冬氨酸分别用丙氨酸代替， s e a 与m h c i i 的结合力可以下降1 0 0 0 倍。用基因工程的方法制备单抗与s e a 突变 体的融合蛋白f a b m s e a ，结果显示f a b m s e a 保留了非m h c i i 依赖性的细胞毒作用， 证实了f a b - m s e a 并未影响s e a 的t c r 的结合能力【3 2 】。并不是所有的超抗原对t 细 胞的刺激都引起相应的v b 亚群活化和增殖。h e w i t t 等【3 3 】研究显示与普通抗原一样， s e a 激活t 细胞需要双信号，一个通过t c r ，另一个通过辅助信号( c d 2 8 m 7 ： l f a 1 i c a m 1 ) 。如果缺乏共刺激信号，可以引起t 细胞的免疫无能。m h ci i 促进 a p c 与t 细胞的结合，从而促使共刺激信号的产生【3 4 1 。a p c 的活化引起共刺激分子 l f a 1 和b 7 表达的上调，从而优化s e a 活化t 纽胞的能力。细胞因子的环境也可影 响t c r s a g 作用的结果，在t n f a 和i f n 吖存在情况下，超抗原对t c r 的再次刺激 可以引起t 细胞亚群的凋亡1 3 5 - 3 6 1 。 1 5t 细胞v 1 3 受体在s e a 介导的病理中的作用 t 细胞上能识别结合到m h ci i 抗原上的抗原肽的受体共分为五种部分：、j a 及v p 、d p 、邛。s e a 只通过t 细胞受体的v 1 3 区刺激t 细胞，说明s e a 对t 细胞具 有v b 特异性。 ， 在m h ci i 抗原分子完全缺乏的条件下i 很难用s e a 刺激t 细胞。这可能是由于 s e a 结合m h ci i 抗原时诱导了t 细胞分子构象的变化，使之露出v b 结合位点，或 是因为t 细胞受体与毒素m h ci i 抗原分子相结合所需的大部分结合能是由s e a 结合 m h ci i 抗原分子提供的【2 ”1 1 。m h c i i 抗原分子，s e a ，v d 相互作用的模式见图1 3 。 4 天津科技大学硕士学位论文 一 一_ 一一_ - _ - _ - - - _ _ l = _ - _ - _ _ 。- - _ 。一 ? 在这一模型中s e a 象钳子一样，通过与m h ci i 抗原分子和v p 的侧面作用，达 蓟与m h c i i 抗原表面和t c r 表面的最大近似结合。当然，这一模型的进- 步证实尚 需x 射线晶体衍射图谱的获得【1 7 】。 ： ceil 图1 3 超抗原与t 细胞，m h c i i 作用示意图 f i g 1 - 3s k e t c hm a po f t h ea c t i o nb e t w e e ns u p e r a n t i g e n ，tc a l la n dm h c i i 1 6s e a 抗肿瘤作用机制 超抗原s e a 主要是通过大量激活t 淋巴细胞来介导杀伤肿瘤效应，被激活的t 细胞可通过以下几种途径发挥其对肿瘤细胞的杀伤作用： ( 1 ) 超抗原依赖的细胞介导的细胞毒作用( s d c c ) ：这是超抗原抗肿瘤的主要途 径。一般认为s a g 先激活c d 4 + t 细胞( 辅助性t 细胞) ，使之释放i l 2 ，礤n 吖和t n f a 等多种细胞因子，进而诱导c d 8 + t 细胞( 杀伤性t 细胞) 活化。c d 4 + t 细胞能够经 t c r v i b s a g m h ci i 类分子与m h ci i 阳性的肿瘤细胞相偶联产生强烈的杀瘤作用【3 7 1 ， 进而c d 8 + t 细胞具有直接杀伤表达m h ci i 类分子的肿瘤细胞的功能【4 0 1 。h c d l u n d 等 将s e a 接种到鼠体内观察到，这种s a g 引起的t 细胞激活、增殖和细胞毒作用呈剂 量依赖性【4 ，在所用剂量为o 1 ：o o “g 小鼠，最大效应出现在注射后2 4 h ，9 6 h 后渐渐 消失，最大效应浓度是l “g 4 , 鼠，4 8 h 达到s d c c 效应的高峰 3 7 】。一般认为这种s d c c 是特异性的，它只引起表达m h ci i 类抗原的靶细胞溶解破坏【3 9 】。 ( 2 ) 细胞因子的直接和间接杀伤作用：超抗原活化的c d 4 + t 细胞能分泌多种足 量的细胞因子，包括t n f a ，t n f p ，i n f - q ，i l - 2 ，i l 6 ，1 i - 1 2 等【4 1 1 ，它们作为t 细胞免疫应答过程中的效应因子，一方面可以直接或间接地杀伤肿瘤细胞，上调肿瘤 细胞表面m h c 抗原分子的表达，增强癌细胞刺激宿主免疫系统的能力；另一方面， 这些细胞因子又刺激t 细胞进一步增殖分化，而增殖分化的t 细胞又将产生更多的细 胞因子与s d c c 作用共同导致肿瘤细胞的破坏溶解。 ( 3 ) l a k 细胞样细胞毒作用：通常n k 细胞不能直接为s e a 所激活，而是通过 被s e a 活化的t 细胞释放的i l 2 ，i l 1 2 ，i f n - y 等多种细胞因子的刺激【4 2 4 3 1 ，从而 5 杏、 1 前言 大大强化了n k 细胞的杀伤力度，使n k 细胞得以杀伤原先对n k 细胞有耐受性的肿 瘤细胞，成为淋巴因子激活的杀伤( l y m p h o k i n ea c t i v a t e dk i l l e r ) 细胞，并产生l a k 样 细胞毒作用，抑制肿瘤生长，有人称超抗原的这种作用为超抗原强化的杀伤作用f 4 5 1 。 1 7s e a 抗肿瘤研究进展 金黄色葡萄球菌肠毒素a 是_ 种受到广泛研究的超抗原。它能够以与普通抗原不 同的方式，与人类主要组织相容性复合体m h c i i 类分子结合，激活大量具有某些特 异v s 片段的t 细胞，并释放大量细胞因子，是一种极好的免疫调节剂和增效剂，自 发现以来一直备受国内外各学者的关注。 随着s a g 激活t 细胞理论的深入研究，学者们开始尝试着将金葡菌肠毒素用于肿 瘤免疫治疗研究，希望其能够激活抗肿瘤的特异性t 细胞，达到排斥肿瘤的目的。1 9 8 9 年，s h c h e g l o v i t o r a 4 6 首先研究了体外s e a 敏化的鼠脾细胞对鼠l e w i s , 瘤分布效果的 影响。他用s e a 处理鼠脾细胞6 小时，将此脾细胞多次，间歇地接种后，鼠肺内转 移瘤数量大大降低，肺重也大大降低。 1 9 9 3 年，h e d l u n dg 等【4 7 】人分析了s e a 作为一种免疫激活剂在体内的使用情况。 他们发现，s e a 能诱导c d 4 + 和c d 8 + 细胞的i l 2 受体的表达和这两种细胞的增殖， 免疫反应在4 天内降至背景水平。第二次注射产生与第一次注射相同的动力学性质。 这些结果为在体内使用s e a 处理m h c i i + 癌细胞提供了实验依据。 为了使效应细胞集中于肿瘤部位，a k e r b l o me t 4 8 】利用化学试剂将s e a 和单克隆 抗体连接起来，构建成具有导向作用的人工缀合物。这种物质保持了s e a 和单抗的 生物学活性，对肠癌，卵巢癌，乳腺癌，肾癌都具有细胞毒性。随着基因工程技术的 普遍应用，化学偶联物被基因工程菌所表达的融合蛋白替代，此融合蛋白同样具有单 抗的导向性和保持s e a 的生物学活性。d o h l s t e nm 小组【4 9 】在这方面做了大量的工作。 他们首先制备了能识别肠癌表面抗原c 2 1 5 的c 2 1 5 f a b s e a 融合蛋白。利用s c i d 小 鼠进行的抗肿瘤实验发现，c 2 1 5 f a b s e a 能诱导单核细胞t n f - a ，t n f b 和t n f - y 的释放，杀伤肠癌细胞。用此融合蛋白处理携带转染了c 2 1 5 抗原的b 1 6 黑素瘤小鼠， 会抑制8 5 9 9 的肿瘤生长，并使动物长期存活。此融合蛋白能高效地将t 细胞导向 c 2 1 5 m h c i i 癌细胞，利用融合蛋白中单抗对肿瘤的特异性替代了s e a 对m h c i i 的 天然依赖性，增强了s e a 抗癌作用的范吲5 0 5 1 s 4 。 s e a 可与正常组织细胞的m h ci i 抗原结合而使机体受到伤害，为了降低s e a 对 机体的伤害作用，针对s e a 中与m h c i i 抗原的结合位点进行突变，使突变后的s e a 与m h c i i 抗原的结合能力降低，大大降低了它在m h c i i + 抗原组织的滞留和系统毒 性，而由于肿瘤中非m h c i i 抗原的异常大量表达及s e a 对单核细胞的刺激，致使 s e a m 对肿瘤的局部免疫激活作用仍然保留。突变后的f a b - s e a m 与肿瘤组织结合力 比一般组织高l 万倍。这就将有害细菌毒素转变成可以耐受的肿瘤特异的制剂。j o h a n h a n s s o n 等【5 2 】人构建了c 2 1 5 f a b s e a d 2 2 7 a ( 2 2 7 位氨基酸由天冬氨酸突变成丙氨酸) 。 用此融合蛋白处理带瘤小鼠导致显著的抗肿瘤效应，与c 2 1 5 f a b s e a 相比，突变融- 6 天津科技大学硕士学位论文 合蛋白对机体的毒性大大降低。这种变化就是由于融合蛋白在机体正常的m h c i i 抗 原组织中弱分布和机体低水平细胞因子造成的。 为了扩展肿瘤杀伤的范围，人们根据癌细胞表面抗原的特异性，设计了多种导向 s e a 融合蛋白。h o l z c ru 【”】将s e a 介导的细胞毒性扩展至m h ci i 。神经母细胞瘤细胞 ( n e u r o b l a s t o m ac e l l s ) 。把s e a 连在抗g a n l i o s i d e g d 2 鼠嵌合单抗c h l 4 18 上制成融 合蛋白，在体外实验中可以诱导t 细胞对o d 2 + 细胞的毒性。引入点突变以降低对m h c i i 抗原的结合力，导致t 细胞对机体正常组织中的m h c i i + 抗原细胞杀伤能力降低 1 0 0 0 倍。m l ej 【蚓制造了蛋白a s e a 融合蛋白，根据蛋白a 能结合抗体f c 片段的特 性，利用此融合蛋白与抗c d 7 单抗或c d 8 单抗及其它抗c d 族抗体共同在急性淋巴 白血症中介导t 细胞依赖性的m h ci i m o l t 0 4 和c c r f c e m 细胞系的裂解。为降低 融合蛋白与m h c i i 抗原的亲和力，在s e a 上引入点突变( p r o a s e a m ) ，它与m h c i i + 抗原细胞亲和力降低1 0 0 倍，却保持同样的裂解m o l t - 4 能力，循环白细胞和脾细 胞被大量的杀灭。这一结果为治疗白血病提供了潜在的途径。 为了克服特异性杂交瘤周期长，技术要求高，阳性筛选困难等缺点，近两年来人 们采用抗体库技术，直接筛选特异性抗体j 用于s e a 的导向。1 9 9 9 年日本学者s a k u r a i n 【”】在细菌中表达了s e a s c f v 可将s e a 导向带上皮粘蛋白核心蛋白m u c i 的人胆导 管癌细胞系t f k 1 细胞，对癌细胞产生毒性。t o r d s s o nj m t 5 6 】从猴噬菌体抗体库中筛 选一个s c f v 片段k 3 0 5 ，能与高分子量黑素瘤相关抗原( h m w m a a ) 反应，它高效亲 和h m w m a a 上一个唯一的人类决定簇，且比鼠单抗与平滑肌交叉反应更小。将k 3 0 5 与s e a m 融合得到的s e a d 2 2 7 a k 3 0 5 ，此融合蛋白能引起s c i d 小鼠中h m w m a a 特异性瘤的减少【5 5 5 7 】。 二 1 8 超抗原抗肿瘤应用现状 1 8 1 单独使用超抗原 直接使用超抗原或用超抗原在体外刺激p b m c 后回输给肿瘤病人，均可产生较强 的抗肿瘤活性，且具有操作方法简单易行的优点。l a n d o 等【鲳】实验表明：s e a 刺激人 外周血单核细胞( p b m c ) 3 天，后者就可产生很强的肿瘤细胞杀伤活性，在效应细胞： 靶细胞( e ：t ) 即p b m c ：肿瘤细胞之比低到2 5 ：1 时，s e a 诱生这种抗肿瘤作用所需 最低浓度仅为l o p g m l ，半数最大抗肿瘤作用的浓度也只需1 0 0 1 0 p g m l 。这足以说明， 超抗原诱生抗肿瘤效应是惊人的。p e r a b o 等【”】用膀胱灌注s e b 的方法治疗大鼠膀胱 癌模型，发现s e b 最高无副作用浓度为l o o p g m l 。当采用1 0 p g m l s e b 膀胱内灌注时， 治疗组仅3 只动物肿瘤存留，仅对照组1 5 只动物肿瘤存留。治疗组中的残存肿瘤出 现明显的凋亡及炎细胞浸润。 超抗原活化的p b m c 对肿瘤细胞的杀伤作用与肿瘤细胞是否表达m h c1 1 分子无 关，只是强度不同，其杀伤m h c l i + 肿瘤细胞的程度明显大于m h c i i 。肿瘤细胞，因 为后者无一种效应的参与，即s d c c 作用。由于s d c c 作用的存在，超抗原在淋巴造 血系统肿瘤的治疗中有其独特的优越性。b 细胞慢性淋巴细胞白血病( c h r o n i c 7 l 前言 l y m p h o c y t i cl e u k e m i ao fb c e l lo r i g i n ，b c l l ) 是一种对n k 细胞和l a k 细胞杀伤作用 不敏感的恶性肿瘤。w a l l g r e n 等【6 0 】实验显示b c l l 细胞对s d c c 作用较敏感，将靶 细胞经佛波醇( t e t r a d e c a n o y lp h o r b o l a c e t a t e ，t p a ) 活化后，对s e a 反应性t 细胞的敏 感性大大增强，即使在效靶比低至3 ：l 的情况下，仍可有4 7 0 硅6 的杀伤率。t p a 增强b - c l l 对s d c c 作用的敏感性主要机制是，t p a 激活b c l l 细胞，使其表面 m h c i i 、c d 7 2 、c d 4 0 、b b l 、b 7 及黏附分子i c a m 1 、l f a - 1 等表达均增高。 在国内，超抗原提取物抗肿瘤已应用于临床【6 。高聚生注射液为金黄色葡萄球菌 滤液制剂，其主要成分为s e c 。临床应用发现高聚生使用后，可明显激活t 细胞并使 其增殖，单独抗肿瘤效率为4 2 5 ，用于恶性胸腹水治疗有效率为5 0 ，联合化疗药 物后，疗效可进一步提高：此外高聚生临床应用中表现出较强的升高白细胞浓度，尤 其适用于因放化疗引起的白细胞下降。其独副作用主要为发热和局部红肿，均可自行 消退。 = 单纯的s e a 能够通过诱导t 细胞的抗肿瘤活性，能有效的抑制肿瘤细胞的生长。 但单纯的s e a 应用于肿瘤治疗存在着两个方面的限制。因s d c c 作用是通过 m h c i i 类分子介导的，故$ e a 在对m h c i i 阳性肿瘤细胞发挥杀伤作用的同时，对 m h ci i 阳性的非肿瘤细胞如b 细胞、活化的t 细胞、树突状细胞、单核一巨噬细胞 等也会产生杀伤作用。大多数肿瘤细胞的m h ci i 类分子表达有限，还有一些肿瘤 低表达甚至不表达m h ci i ，s d c c 无法对其产生明显的杀伤作用，这是s d c c 发挥 肿瘤细胞杀伤作用的主要障碍。要克服这些障碍，就要提高s e a 对肿瘤细胞的亲合 力而减弱对m h c i i 类分子